JP7586810B2 - ダノン病治療用遺伝子療法ベクター - Google Patents

Description

関連出願
本願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる、２０１８年７月１２日に出願された米国特許仮出願番号６２／６９７，３０２の優先権を主張する。

配列表
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、テキスト形式で電子的に提出された配列表が含まれている。テキストファイルは、２０１９年７月１１日に作成された、「ＲＯＰＡ＿０１１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題の、約６２キロバイトのサイズを有する配列表を含む。このテキストファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、概して、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、ＣＤ１０７ｂとしても知られる）における変異に関連する疾患の遺伝子療法に関する。

背景
リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２、ＣＤ１０７ｂとしても知られる）は、リソソーム関連膜糖タンパク質をコードする遺伝子である。遺伝子の選択的スプライシングによって、３つのアイソフォーム：ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、及びＬＡＭＰ－２Ｃが生成される。ＬＡＭＰ－２における機能欠失変異は、オートファジー障害に関連する家族性心筋症であるダノン病をはじめとするヒトの疾患と関連する。

国際特許出願公開第ＷＯ２０１７１２７５６５Ａ１号（特許文献１）は、Ｈａｓｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３３（７）：２３４３－５０（非特許文献１）で記載されているような、ＬＡＭＰ－２変異を有する患者由来のヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）におけるＬＡＭＰ－２の過剰発現の結果、酸化的ストレスレベル及びアポトーシス細胞死が減少し、疾患病態生理学におけるＬＡＭＰ－２Ｂの重要性が確認されることを開示している。

当該技術分野では依然としてＬＡＭＰ－２の遺伝子療法ベクターに関するニーズがある。本開示は、そのような遺伝子療法ベクター、その使用方法、医薬組成物などを提供する。

国際特許出願公開第ＷＯ２０１７１２７５６５Ａ１号

Ｈａｓｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１５ Ｊｕｌ；３３（７）：２３４３－５０

本開示は、ＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む改善された遺伝子療法ベクター、その使用方法、医薬組成物などを提供する。

一態様では、本開示は、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）のアイソフォーム又はその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターを提供し、導入遺伝子は、ヒト宿主細胞における発現についてコドン最適化されている。

一実施形態において、発現カセットは配列番号２よりも少ないＣｐＧ部位を含む。

一実施形態において、発現カセットは配列番号２よりも少ないクリプティックスプライス部位を含む。

一実施形態において、発現カセットは配列番号２よりも少ない代替オープンリーディングフレームをコードする。

一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３～５から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。

一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３～５から選択される配列に対して少なくとも９９％の同一性を共有する。

一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３～５から選択される配列を含む。

一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。

一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３に対して少なくとも９９％の同一性を共有する。

一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３と同一の配列を含む。

一実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子に機能的に連結されたコンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列を含み、任意選択的に、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列は配列番号６を含む。

一実施形態において、発現カセットは導入遺伝子に機能的に連結された完全長ポリＡ配列を含み、任意選択的に、完全長ポリＡ配列は配列番号７を含む。

一実施形態において、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子に対して５’の開始部位を含まない。

一実施形態において、発現カセットは、５’から３’方向で、機能的に連結された、第一逆末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、導入遺伝子、完全長ポリＡ配列を含む３’未翻訳領域、及び第二逆末端反復を含む。

一実施形態において、エンハンサ／プロモータ領域は、５’から３’方向で、ＣＭＶ ＩＥエンハンサとニワトリβアクチンプロモータとを含む。

一実施形態において、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。

一実施形態において、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列に対して完全同一性を共有する。

第二の態様において、本開示は、それを必要とする対象においてダノン病又は別のオートファジー障害の一つ以上の症状を防止、軽減、改善、減少、阻害、除去及び／又は逆転する方法であって、対象に本開示の任意の遺伝子療法ベクターを投与することを含む方法を提供する。

一実施形態では、ベクターを、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、及び筋肉内からなる群から選択される経路により投与する。

一実施形態において、オートファジー障害は、末期心不全、心筋梗塞、薬物中毒、糖尿病、末期腎不全、及び老化からなる群から選択される。

一実施形態において、対象はヒトである。

一実施形態において、対象は、ダノン病又は別のオートファジー障害の症状を呈している。

一実施形態において、対象は、減少しているか又は検出不能なＬＡＭＰ－２発現を有すると特定されている。

一実施形態において、対象は、変異ＬＡＭＰ－２遺伝子を有すると特定されている。

第三の態様において、本開示は、ダノン病又は別のオートファジー障害の一つ以上の症状の防止、軽減、改善、減少、阻害、除去、及び／又は逆転において使用するための医薬組成物であって、本開示の任意の遺伝子療法ベクターを含む、医薬組成物を提供する。

[本発明1001]
リソソーム関連膜タンパク質2（ＬＡＭＰ－2）のアイソフォーム又はその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターであって、前記導入遺伝子がヒト宿主細胞における発現のために最適化されている、遺伝子療法ベクター。
[本発明1002]
前記導入遺伝子が、ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、本発明1001の遺伝子療法ベクター。
[本発明1003]
前記発現カセットが、配列番号2よりも少ないＣｐＧ部位を含む、本発明1001又は本発明1002の遺伝子療法ベクター。
[本発明1004]
前記発現カセットが、配列番号2よりも少ないクリプティックスプライス部位を含む、本発明1001～1003のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1005]
前記発現カセットが、配列番号2よりも少ない代替オープンリーディングフレームをコードする、本発明1001～1004のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1006]
前記導入遺伝子が、配列番号3～5から選択される配列に対して少なくとも95％の同一性又は少なくとも99％の同一性を共有する、本発明1001～1004のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1007]
前記導入遺伝子が、配列番号3～5から選択される配列を含む、本発明1006の遺伝子療法ベクター。
[本発明1008]
前記導入遺伝子が、配列番号3と少なくとも95％の同一性を共有するか、又は配列番号3と同一である、本発明1007の遺伝子療法ベクター。
[本発明1009]
前記発現カセットがコンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列を含み、任意選択的に、前記コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列が配列番号6を含む、本発明1001～1008のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1010]
前記発現カセットが完全長ポリＡ配列を含み、任意選択的に、前記完全長ポリＡ配列が配列番号7を含む、本発明1001～1009のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1011]
前記発現カセットが、代替ｍＲＮＡを生成することができる前記導入遺伝子に対して5’の開始部位を含まない、本発明1001～1010のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1012]
前記発現カセットが、5’から3’の方向で、第一の逆方向末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、イントロン、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、前記導入遺伝子、完全長ポリＡ配列を含む3’未翻訳領域、及び第二の逆方向末端反復を含む、本発明1001～1011のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1013]
前記エンハンサ／プロモータ領域が、5’から3’の方向で、ＣＭＶ ＩＥエンハンサとニワトリβアクチンプロモータとを含み、任意選択的に、前記エンハンサ／プロモータ領域が、ニワトリβアクチン遺伝子の第一エクソン及び第一イントロンと、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプタとをさらに含む、本発明1012の遺伝子療法ベクター。
[本発明1014]
前記発現カセットが、配列番号8～10から選択される配列に対して少なくとも95％の同一性を共有する、本発明1001～1013のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1015]
前記発現カセットが、配列番号8～10から選択される配列に対して完全同一性を共有する、本発明1014の遺伝子療法ベクター。
[本発明1016]
前記発現カセットが、配列番号3に対して少なくとも95％の同一性を共有するか、又は配列番号8と同一である、本発明1014の遺伝子療法ベクター。
[本発明1017]
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、本発明1001～1016のいずれかの遺伝子療法ベクター。
[本発明1018]
本発明1001～1017のいずれかの遺伝子療法ベクターを含む、医薬組成物。
[本発明1019]
それを必要とする対象においてダノン病又は別のオートファジー障害を治療又は防止する方法であって、
前記対象に対して、本発明1001～1017のいずれかの遺伝子療法ベクター又は本発明1018の医薬組成物を投与すること
を含む、方法。
[本発明1020]
前記ベクター又は医薬組成物が、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、及び筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記オートファジー障害が、末期心不全、心筋梗塞、薬物中毒、糖尿病、末期腎不全、及び老化からなる群から選択される、本発明1019又は本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記対象がヒトである、本発明1019～1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記対象が、ダノン病又は別のオートファジー障害の症状を示している、本発明1019～1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記対象が、減少しているか又は検出不能なＬＡＭＰ－2発現を有すると特定されている、本発明1019～1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記対象が、変異ＬＡＭＰ－2遺伝子を有すると特定されている、本発明1019～1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が増加する、本発明1019～1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、少なくとも約1．2倍、少なくとも約1．3倍、少なくとも約1．4倍、少なくとも約1．5倍、少なくとも約1．6倍、少なくとも約1．7倍、少なくとも約1．8倍、少なくとも約1．9倍、少なくとも約2．0倍、少なくとも約2．2倍、少なくとも約2．3倍、少なくとも約2．4倍、少なくとも約2．5倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍増加する、本発明1019～1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、最大で約1．1倍、最大で約1．2倍、最大で約1．3倍、最大で約1．4倍、又は最大で約1．5倍増加する、本発明1019～1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
対象においてＬＡＭＰ－2Ｂを発現する方法であって、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを前記対象に対して全身投与すること
を含み、
前記ＡＡＶベクターが、配列番号3と少なくとも95％の同一性を共有する導入遺伝子を含む発現カセットを含むか、又は配列番号3と同一であり、
前記導入遺伝子が、エンハンサ／プロモータ領域に機能的に連結され、
前記ＡＡＶベクターを前記対象に対して全身投与すると、前記ＡＡＶベクターの投与前のＬＡＭＰ－2Ｂの発現又は未処置の対照対象におけるＬＡＭＰ－2Ｂの発現と比較して、ＬＡＭＰ－2Ｂの発現が増加する、方法。
[本発明1030]
前記全身投与が静脈内投与を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記ＡＡＶベクターを、前記対象の全体重1キログラム（ｖｇ）あたり、約1×10 ¹² ～5×10 ¹⁴ ベクターゲノム（ｖｇ）の前記ＡＡＶベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与する、本発明1029又は本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記ＡＡＶベクターを、約1×10 ¹³ ～5×10 ¹⁴ ｖｇ／ｋｇの用量で投与する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記ＡＡＶベクターを、約5×10 ¹³ ～3×10 ¹⁴ ｖｇ／ｋｇの用量で投与する、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記ＡＡＶベクターを、約5×10 ¹³ ～1×10 ¹⁴ ｖｇ／ｋｇの用量で投与する、本発明1031の方法。
[本発明1035]
前記エンハンサ／プロモータ領域が、5’から3’の方向で、ＣＭＶ ＩＥエンハンサとニワトリβアクチンプロモータとを含み、任意選択的に、前記エンハンサ／プロモータ領域が、ニワトリβアクチン遺伝子の第一エクソン及び第一イントロンと、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプタとをさらに含む、本発明1029～1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
前記発現カセットが、前記導入遺伝子に機能的に連結されたコンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列を含み、任意選択的に、前記コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列が配列番号6を含む、本発明1029～1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記発現カセットが、前記導入遺伝子に機能的に連結された完全長ポリＡ配列を含み、任意選択的に、前記完全長ポリＡ配列が配列番号7を含む、本発明1029～1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記発現カセットが、代替ｍＲＮＡを生成することができる前記導入遺伝子に対して5’の開始部位を含まない、本発明1029～1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記発現カセットが、5’から3’の方向で、機能的に連結された、第一の逆方向末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、イントロン、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、前記導入遺伝子、完全長ポリＡ配列を含む3’未翻訳領域、及び第二の逆方向末端反復を含み、前記発現カセットが、前記導入遺伝子の開始コドンに対して5’の開始コドンを含まない、本発明1029～1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記対象が霊長類である、本発明1029～1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記対象が、減少しているか若しくは検出不能なＬＡＭＰ－2発現を有すると特定されているか、又は有する疑いがある、本発明1029～1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記対象が変異ＬＡＭＰ－2遺伝子を有する、本発明1029～1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記対象がダノン病の症状を示している、本発明1029～1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記対象が、ダノン病にかかっているか、またはダノン病のリスクがある、本発明1029～1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が増加する、本発明1029～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、少なくとも約1．2倍、少なくとも約1．3倍、少なくとも約1．4倍、少なくとも約1．5倍、少なくとも約1．6倍、少なくとも約1．7倍、少なくとも約1．8倍、少なくとも約1．9倍、少なくとも約2．0倍、少なくとも約2．2倍、少なくとも約2．3倍、少なくとも約2．4倍、少なくとも約2．5倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍増加する、本発明1029～1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、最大で約1．1倍、最大で約1．2倍、最大で約1．3倍、最大で約1．4倍、又は最大で約1．5倍増加する、本発明1029～1047のいずれかの方法。
[本発明1048]
配列番号3～5又はその機能的変異体のいずれか一つに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1049]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号3又はその機能的変異体に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有する、本発明1048のポリヌクレオチド。
[本発明1050]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号3に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有する、本発明1049のポリヌクレオチド。
[本発明1051]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号3からなる、本発明1050のポリヌクレオチド。
[本発明1052]
ＬＡＭＰ－2Ｂ又はその機能的変異体をコードする導入遺伝子である、本発明1048～1051のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1053]
本発明1048～1052のいずれかのポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
[本発明1054]
ＣＡＧプロモータ（配列番号22）に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有するエンハンサ／プロモータ領域を含む、本発明1053の発現カセット。
[本発明1055]
ＣＭＶプロモータ（配列番号23）、ＳＶ40プロモータ（配列番号24）、ＰＧＫプロモータ（配列番号25）、及び／又はヒトβアクチンプロモータ（配列番号26）から選択される配列に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有するエンハンサ／プロモータ領域を含む、本発明1053の発現カセット。
[本発明1056]
配列番号27に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する3’ＵＴＲを含む、本発明1053～1055のいずれかの発現カセット。
[本発明1057]
ＣＡＧプロモータ（配列番号7）に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有するポリアデニル化配列を含む、本発明1053～1056のいずれかの発現カセット。
[本発明1058]
5’から3’の順で：
（ａ）ＣＡＧプロモータ（配列番号22）に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する、エンハンサ／プロモータ領域；
（ｂ）配列番号3に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有する、ＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号27に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する、3’ＵＴＲ；及び
（ｄ）ＣＡＧプロモータ（配列番号7）に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する、ポリアデニル化配列
を含む、発現カセット。
[本発明1059]
前記機能的ＬＡＭＰ－2Ｂが、配列番号1に対して少なくとも少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有する、本発明1058の発現カセット。
[本発明1060]
ＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号2に対して最大で90％、最大で91％、最大で92％、最大で93％、最大で94％、最大で95％、最大で96％、最大で97％、最大で98％、最大で99％、又は最大で100％の同一性を共有する、本発明1058又は本発明1059の発現カセット。
[本発明1061]
（ｉ）配列番号11に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する5’ＩＴＲと、（ｉｉ）配列番号12に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する5’ＩＴＲと、に隣接している本発明1053～1069のいずれかの発現カセットを含む、ＡＡＶベクター。
[本発明1062]
ＡＡＶ9カプシドを含む、本発明1061のＡＡＶベクター。
[本発明1063]
前記ＡＡＶ9カプシドが、配列番号27のアミノ酸1～736、配列番号27のアミノ酸138～736、及び／又は配列番号27のアミノ酸203～736に対して少なくとも95％の同一性を共有する、本発明1062のＡＡＶベクター。
[本発明1064]
配列番号8～10のいずれか一つに対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
[本発明1065]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号8に対して少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は少なくとも100％の同一性を共有する、本発明1064のポリヌクレオチド。
[本発明1066]
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号8からなる、本発明1065のポリヌクレオチド。
[本発明1067]
ＬＡＭＰ－2Ｂ又はその機能的変異体をコードする発現カセットを含む、本発明1065～1066のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1068]
（ｉ）配列番号11に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有する5’ＩＴＲと、（ｉｉ）配列番号12に対して少なくとも80％の同一性、90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有する5’ＩＴＲと、のいずれか又は両方を含む、本発明1065～1067のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1069]
本発明1065～1068のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ＡＡＶベクター。
[本発明1070]
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ9カプシドを含む、本発明1069のＡＡＶベクター。
[本発明1071]
前記ＡＡＶ9カプシドが、配列番号27のアミノ酸1～736、配列番号27のアミノ酸138～736、及び／又は配列番号27のアミノ酸203～736に対して少なくとも95％の同一性を共有する、本発明1071のＡＡＶベクター。
[本発明1072]
それを必要とする対象においてダノン病を治療する方法であって、
本発明1061～1063又は本発明1069～1071のいずれかのＡＡＶベクターを前記対象に静脈内投与すること
を含む、方法。
[本発明1073]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、少なくとも約1．2倍、少なくとも約1．3倍、少なくとも約1．4倍、少なくとも約1．5倍、少なくとも約1．6倍、少なくとも約1．7倍、少なくとも約1．8倍、少なくとも約1．9倍、少なくとも約2．0倍、少なくとも約2．2倍、少なくとも約2．3倍、少なくとも約2．4倍、少なくとも約2．5倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約4倍増加する、本発明1072の方法。
[本発明1074]
前記遺伝子療法ベクターを投与すると、未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／又はＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、最大で約1．1倍、最大で約1．2倍、最大で約1．3倍、最大で約1．4倍、又は最大で約1．5倍増加する、本発明1072又は本発明1073の方法。
発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであり、これに含まれる。

図１Ａは、本開示のウイルスベクターの例示的実施形態の図を提供する。 図１Ｂは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子療法ベクターの発現カセットの例示的実施形態の図を提供する。 図２は、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ構築物対コドン最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ構築物を試験し比較するために使用されるプラスミドベースの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータ系の発現カセットを示す。 図３は、プラスミドベースのＧＦＰレポータ系のトランスフェクションを使用して試験し、ウェルごとのＧＦＰ＋細胞として測定された、ＬＡＭＰ－２Ｂ構築物のトランスフェクション発現効率を示すグラフである。野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ構築物（ＷＴ）を３つのコドン最適化（「ＣＯ」）構築物であるＣＯ１、ＣＯ２、及びＣＯ３、並びに無ベクター対照（「ＶｉａＦｅｃｔ Ｏｎｌｙ」と表示）と比較する。 図４は、ＬＡＭＰ－２Ｂ構築物を試験するために使用されるプラスミドベースのＧＦＰレポーティングシステムでトランスフェクトされた細胞における遺伝子発現レベルであって、吸光度単位（Ａ．Ｕ．）でＧＦＰ＋細胞の平均ＧＦＰ強度として測定される、遺伝子発現レベルを示すグラフである。野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ構築物（ＷＴ）でトランスフェクトされた細胞によるＧＦＰ発現を３つのコドン最適化（「ＣＯ」）構築物であるＣＯ１、ＣＯ２、及びＣＯ３、又は無ベクター対照（「ＶｉａＦｅｃｔ Ｏｎｌｙ」と表示）によるＧＦＰ発現と比較する。 図５は、プラスミドベースのＧＦＰレポータ系でのトランスフェクションの２日後の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の心筋細胞の免疫蛍光画像を示す。細胞を、ＤＮＡ無し、又は野生型ＬＡＭＰ－２Ｂを発現するＬＡＭＰ－２Ｂ構築物、ＣＯ１変異体、ＣＯ２変異体、又はＣＯ３変異体でトランスフェクトした。 図６は、プラスミドベースのＧＦＰレポータ系でのトランスフェクションの７日後のｉＰＳＣ由来の心筋細胞の免疫蛍光画像を示す。細胞を、ＤＮＡ無し、又は野生型ＬＡＭＰ－２Ｂを発現するＬＡＭＰ－２Ｂ構築物、ＣＯ１変異体、ＣＯ２変異体、又はＣＯ３変異体でトランスフェクトした。 図７Ａは、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂｖ１．０導入遺伝子（ＡＡＶ９ １．０）、最適化変異体ＬＡＭＰ－２Ｂｖ１．２導入遺伝子（ＡＡＶ９ １．２）又はＧＦＰ導入遺伝子（ＡＡＶ９ＧＦＰ）を含むＡＡＶ９ウイルスベクターで形質導入されたＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞におけるヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の免疫ブロットを示す。分子量マーカー（ＭＷ）及び対照ＬＡＭＰ－２Ｂ組換えタンパク質サンプル（ＬＡＭＰ２Ｂ（＋ｖｅ対照））も含まれていた。図７Ｂは、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）又はＡＡＶ９－ＧＦＰ（ＧＦＰ）ベクターで形質導入されたＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞におけるＥＬＩＳＡによるＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の定量化を示す。 図８Ａは、表示された量のＡＡＶ９－Ｌｕｃ（Ｌｕｃ）、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ＬＡＭＰ２Ｂ ｖ１．０）又はＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ＬＡＭＰ２Ｂ ｖ１．２）ベクターで形質導入されたダノン患者ｉＰＳＣ由来の心筋細胞の免疫蛍光画像を示す。 図８Ｂは、ＡＡＶ９－Ｌｕｃ、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）又はＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）ベクターで形質導入されたダノン患者ｉＰＳＣ由来の心筋細胞におけるヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の免疫蛍光の定量化を示す。 図８Ｃは、ＡＡＶ９－Ｌｕｃ、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）又はＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）ベクターで形質導入されたダノン患者ｉＰＳＣ由来の心筋細胞におけるヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の免疫ブロットを示す。 図９Ａは、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）又はＡＡＶ９ビヒクル対照で処置されたＬＡＭＰ－２欠損マウスから単離された心臓組織におけるウイルスベクターＤＮＡのＰＣＲ定量化を示す。ベクターコピー数は、心臓組織におけるＶＣＮ／二倍体核として定量化した。ベクターを注射していない対照野生型マウスを対照（ＷＴ）として含めた。 図９Ｂは、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）又はＡＡＶ９ビヒクル対照（ビヒクル）で処置されたＬＡＭＰ－２欠損マウスから単離された心臓組織において、ＷＰＲＥ要素に対して特異的なプローブを使用したＲＴ－ＰＣＲによって測定される、導入遺伝子ｍＲＮＡの定量ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。コピー数をベクターゲノムに換算するための標準曲線を使用して全細胞ＲＮＡ１μｇあたりのベクターゲノム（ｖｇ）としてｍＲＮＡの発現を定量した。 図９Ｃは、未処置野生型マウス（未処置）と比較して、ＡＡ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）又はＡＡＶ９ビヒクル対照（ビヒクル）で処置したＬＡＭＰ－２欠損マウスから単離された心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の免疫ブロットを示す。 図９Ｄは、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．０）、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２）又はＡＡＶ９ビヒクル対照で処置したＬＡＭＰ－２欠損マウスから単離された心臓組織におけるヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の免疫蛍光画像を示す。 図１０Ａは、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ（処置）ベクター又は無ベクタービヒクル対照（未処置）で処置された霊長類から単離された心臓、筋肉、肝臓及び脳組織におけるウイルスベクターＤＮＡのＰＣＲ定量化を示す。個体は、黒又は白色の四角で示す。 図１０Ｂは、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクター（処置）又は無ベクタービヒクル対照（未処置）で処置した霊長類から単離された心室中のウイルスベクターＤＮＡのＰＣＲ定量化を示す。個体を、Ｂ０５９（オス、Ｍ）、Ａ９９１（メス、Ｆ）、及びＡ６０２（オス、Ｍ）として示す。 図１０Ｃは、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクター（処置）又は無ベクタービヒクル対照（未処置）で処置された霊長類から単離された心臓、筋肉、肝臓及び脳組織における、ＷＰＲＥ要素について特異的なプローブを使用したＲＴ－ＰＣＲによって測定した、導入遺伝子ｍＲＮＡの定量ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。 図１０Ｄは、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクター（処置）又は無ベクタービヒクル対照（未処置）を注射した霊長類から単離された心室における導入遺伝子ｍＲＮＡの定量ＲＴ－ＰＣＲ分析を示す。 図１０Ｅは、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクター（処置）又は無ベクタービヒクル対照（未処置）を注射した霊長類から単離された心臓、筋肉及び肝臓組織におけるインサイチュで導入遺伝子ｍＲＮＡを発現する細胞のパーセンテージを示す。個体を、Ｂ０５９（オス、Ｍ）、Ａ９９１（メス、Ｆ）、及びＡ６０２（オス、Ｍ）として示す。 図１０Ｆは、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクター又は無ベクタービヒクル対照（未処置）を注射した霊長類から単離された心臓組織におけるインサイチュでの導入遺伝子ｍＲＮＡ染色を示す。個体を、Ｂ０５９（オス、Ｍ）、Ａ９９１（メス、Ｆ）、及びＡ６０２（オス、Ｍ）として示す。 図１０Ｇは、無ベクター（未処置）に対して、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクターで処置された霊長類から単離された心臓、筋肉及び肝臓組織における、ウェスタンブロットによって評価されたＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の倍数変化を示す。 図１０Ｈは、無ベクター（未処置）に対して、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクターで処置された霊長類から単離された心室における、ウェスタンブロットによって評価したＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の倍数変化を示す。 図１０Ｉは、無ベクター（未処置）に対して、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクターで処置された霊長類から単離された心臓、筋肉及び肝臓組織における、ＥＬＩＳＡによるＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の定量化を示す。 図１０Ｊは、無ベクター（未処置）に対して、ＡＡＶ９最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂベクターで処置した霊長類から単離された心室における、ＥＬＩＳＡによるＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の定量化を示す。

発明の詳細な説明
本開示は、ＬＡＭＰ－２のアイソフォーム（例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ）をコードする、改善されたポリヌクレオチド配列、発現カセット、及びベクター、並びに関連する医薬組成物、及びＬＡＭＰ－２欠乏又は変異に関連する疾患及び障害を治療するためのそれらの使用を提供する。本発明者らは、ＬＡＭＰ－２Ｂの遺伝子配列に対する修飾の結果、導入遺伝子発現が増大することを見出した。加えて、ＬＡＭＰ－２Ｂを発現する遺伝子療法ベクターの発現カセット中に特定配列要素が存在することで、導入遺伝子発現が改善される。したがって、本明細書中で開示されているＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド配列、発現カセット、及びベクターは、以前の遺伝子療法ベクターよりも高レベルのＬＡＭＰ－２発現を治療上関連する組織において達成できることをはじめとする利点を提供する。

ヒトＬＡＭＰ－２Ｂの野生型ポリペプチド配列（配列番号１）及びヒトＬＡＭＰ－２Ｂをコードする野生型ポリヌクレオチド配列（配列番号２）は、それぞれ以下のとおりである。

本明細書中で開示するのは、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）のアイソフォーム又はその機能的変異体をコードする修飾ポリヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態において、修飾ポリヌクレオチド配列は、ＬＡＭＰ－２のアイソフォームをコードする野生型ポリヌクレオチドと比較して、以下の修飾のうちの一つ以上を含む：コドン最適化、ＣｐＧ枯渇、クリプティックスプライス部位の除去、又は代替オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）数の減少。いくつかの実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、ＬＡＭＰ－２Ｃ又はこれらのアイソフォームのいずれかの機能的変異体をコードする。実施形態において、本開示は、配列番号２と比較して、一つ以上のヌクレオチド置換を含むＬＡＭＰ－２Ｂ又はその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド配列又は導入遺伝子を提供する。実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５から選択される配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。本開示は、少なくとも三つの、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする例示的変異体導入遺伝子配列（配列番号３～５）を提供する。

一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５から選択される配列に対して少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３～５から選択される配列を含む。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。

いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか一つの部分配列と類似または同じである。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか一つの部分配列を含む。様々な実施形態において、部分配列は、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１５０ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、少なくとも約４５０ｎｔ、少なくとも約４００ｎｔ、少なくとも約４５０ｎｔ、少なくとも約５５０ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約６５０ｎｔ、少なくとも約６００ｎｔ、少なくとも約６５０ｎｔ、少なくとも約７００ｎｔ、少なくとも約７５０ｎｔ、少なくとも約８００ｎｔ、少なくとも約８５０ｎｔ、少なくとも約９００ｎｔ、少なくとも約９５０ｎｔ、又は少なくとも約１０００ｎｔの長さを有する、完全配列中の任意の連続ヌクレオチド（ｎｔ）セットを含み得る。

いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか一つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか一つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対して少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか一つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む配列を含む。実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか一つのヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３のヌクレオチド１～５００、２５０～７５０、５００～１０００、又は７５０～１２４０を含む部分配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。

ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、若しくはＬＡＭＰ－２Ｃのいずれかを含むＬＡＭＰ－２の様々なアイソフォームのいずれか、又はこれらのアイソフォームのいずれかの機能的フラグメント若しくは変異体をコードする。したがって、特定の実施形態において、発現カセットは、ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、若しくはＬＡＭＰ－２Ｃのいずれか、又はその機能的フラグメント若しくは変異体をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列であって、対応する野生型ポリヌクレオチド配列と比べて、以下から選択される一つ以上の修飾をはじめとする一つ以上の修飾を含む：ＬＡＭＰ－２Ａ、ＬＡＭＰ－２Ｂ、又はＬＡＭＰ－２Ｃをコードする導入遺伝子配列のコドン最適化；発現カセット又は導入遺伝子配列は、その対応する野生型配列よりも少ないＣｐＧ部位を含む；発現カセット又は導入遺伝子配列は、その対応する野生型配列よりも少ないＣｐＧ部位を含む；発現カセット又は導入遺伝子配列は、その対応する野生型配列よりも少ないクリプティックスプライス部位を含む；及び／又は発現カセット又は導入遺伝子配列は、その対応する野生型配列よりも少ないオープンリーディングフレームを含む。特定の実施形態において、最適化配列は、ヒト細胞における増大した発現のために最適化される。ＬＡＭＰ－２Ａ及びＬＡＭＰ－２Ｃアイソフォームをコードする野生型ヒトポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２９及び３０に示されている。ヒトＬＡＭＰ－２Ａ及びＬＡＭＰ－２Ｃタンパク質の野生型配列は、それぞれ配列番号３４及び３５に示されている。また、野生型ＬＡＭＰ－２アイソフォームの配列及びコーディング配列は、公開されている。本明細書はＬＡＭＰ－２Ｂに関して具体的な実施形態を記載しているが、ＬＡＭＰ－２Ａ又はＬＡＭＰ－２Ｃを各実施形態において代替的に使用できると理解される。

野生型ＬＡＭＰ－２Ａ（配列番号２９）及び野生型ＬＡＭＰ－２Ｃ（配列番号３０）のコーディング配列は、少なくともヌクレオチド１～１０８０にわたって野生型ＬＡＭＰ－２Ｂのコーディング配列（配列番号２）に対して１００％同一である。したがって、本明細書中で開示する導入遺伝子、発現カセット、及びベクターが、ＬＡＭＰ－２Ａ（配列番号２９）又は野生型ＬＡＭＰ－２Ｃ（配列番号３０）のいずれかの３’末端（ヌクレオチド１０８１～末端）を、ＬＡＭＰ－２Ｂ（例えば、配列番号３～５のいずれかの最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ）のヌクレオチド１０８１～１２３３の代わりに置換することによって、ＬＡＭＰ－２のこれらのアイソフォームの発現に適合させることができることは、当業者には容易に理解されるであろう。例えば、本発明の実施形態は、配列番号３～５の最適化されたＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子配列、それぞれ配列番号３１～３３、のヌクレオチド１～１０８０を利用する。

一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３１～３３から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３１～３３から選択される配列に対して少なくとも９９％の同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は配列番号３１～３３から選択される配列を含む。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３３に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は完全同一性を共有する。場合によっては、導入遺伝子は、基準配列、例えば、「天然」又は「野生型」ＬＡＭＰ－２Ｂ配列のポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、基準配列と最大で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態において、基準配列は配列番号２である。例えば、配列番号３は、配列番号２に対して７８．５％の同一性を共有する。

場合によっては、導入遺伝子は、基準配列、例えば、「天然」又は「野生型」ＬＡＭＰ－２Ａ配列のポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、基準配列と最大で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態において、基準配列は、配列番号２９に示される野生型ヒトＬＡＭＰ－２Ａ配列である。

場合によっては、導入遺伝子は、基準配列、例えば、「天然」又は「野生型」ＬＡＭＰ－２Ｃ配列のポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、基準配列と最大で７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％の同一性を共有する。いくつかの実施形態において、基準配列は、配列番号３０に示される野生型ヒトＬＡＭＰ－２Ａ配列である。

一実施形態において、導入遺伝子はヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。一実施形態において、導入遺伝子コーディング配列は、低頻度で表されるコドンを高頻度で表されるコドンで置換することによって、発現を増強するように、修飾、又は「コドン最適化」される。コーディング配列は、翻訳のためにアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の一部である。翻訳中、６１のトリヌクレオチドコドンの各々が２０のアミノ酸のうちの１つに翻訳され、遺伝子コードの縮重、又は重複性をもたらす。しかしながら、異なる細胞型、及び異なる動物種は、同じアミノ酸を異なる頻度でコードするｔＲＮＡ（それぞれアンチコドンを有する）を利用する。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡによって低頻度で表されるコドンを含む場合、リボソーム翻訳機構は遅く、効率的な翻訳を妨げる可能性がある。発現は、コーディング配列が同じタンパク質配列であるが、高度に表されるコドンを利用する、及び／又は高度に発現されたヒトタンパク質によって利用されるように、改変される、特定の種についての「コドン最適化」によって改善することができる（Ｃｉｄ－Ａｒｒｅｇｕｉ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。

いくつかの実施形態において、導入遺伝子のコーディング配列は、哺乳動物又は霊長類において低頻度で発現されるコドンを、霊長類において高頻度で発現されるコドンで置換するように修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、基準ポリペプチド（例えば、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ；配列番号３）に対して少なくとも８５％の配列同一性－例えば、基準ポリペプチドに対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の同一性、又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする－ここで、コーディング配列の少なくとも一つのコドンは、上記または本明細書中で開示される配列において、対応するコドンよりもヒトにおいて高いｔＲＮＡ頻度を有する。

一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２よりも少ない代替オープンリーディングフレームを含む。一実施形態において、導入遺伝子は、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の停止又は除去によって発現を増強するように修飾される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンに続くものであり、終止コドンを含まない核酸配列である。ＯＲＦは、順方向又は逆方向であり得、関心対象の遺伝子と比較して、「フレーム内」又は「フレーム外」であり得る。そのようなオープンリーディングフレームは、発現カセットにおいて関心対象の遺伝子と共に発現される可能性を有し、望ましくない悪影響をもたらし得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、コドン使用頻度をさらに改変することによってオープンリーディングフレームを除去するように修飾されている。これは、コードされたアミノ酸配列を保存し、任意選択的に、関心対象の遺伝子中の高度に利用されたコドンを維持（すなわち、２０％未満の頻度のコドンを回避）しつつ、一つ以上の開始コドン（ＡＴＧ）を除去すること、及び／又は一つ以上の終止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ、若しくはＴＧＡ）を逆方向若しくはフレーム外で所望のＯＲＦに導入することによって行うことができる。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンに対して５’の、最大で１つ、最大で２つ、最大で３つ、最大で４つ、又は最大で５つの開始コドンを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンに対して５’の開始コドンを含まない。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲ中の一つ以上のＡＴＧコドン、プロモータ、エンハンサ、プロモータ／エンハンサエレメント、又は導入遺伝子の開始コドンに対して５’の他の配列が、一つ以上のクリプティック開始部位を除去した後も残存する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、誤ったｍＲＮＡを生成する導入遺伝子の上流のクリプティック開始部位を含まない。

本開示の変形では、導入遺伝子コーディング配列は、非導入遺伝子ＯＲＦのコドン最適化若しくは除去又は両技術を使用することによって最適化することができる。場合によっては、コドン最適化の間に導入されたＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ＯＲＦを除去又は最小化する。

一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２よりも少ないＣｐＧ部位を含む。理論によって拘束されないが、ポリヌクレオチド配列中のＣｐＧ部位の存在は、ポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターに対する宿主の望ましくない免疫応答と関連すると考えられる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＣｐＧ部位の数を減少させるように設計される。例示的方法が、米国特許出願公開第ＵＳ２００２００６５２３６Ａ１号に提示されている。

一実施形態において、導入遺伝子は、配列番号２よりも少ないクリプティックスプライス部位を含む。最適化のために、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ソフトウェアを使用して、例えば、ＧＣ含有量を増加、及び／又はクリプティックスプライス部位を除去して、転写サイレンシングを回避し、したがって導入遺伝子発現を増加させることができる。あるいは、当該技術分野で公知の任意の最適化法を使用することができる。クリプティックスプライス部位の除去は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４０１５１０６Ａ１号で記載されている。

また、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする発現カセット及び遺伝子療法ベクターも本明細書中で開示する。ある特定の実施形態において、発現カセット及び遺伝子療法ベクターは、本明細書中で開示されているコドン最適化又は変異体ＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド配列又は導入遺伝子配列を含む。

特定の実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードする発現カセット又は遺伝子療法ベクターは：コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列と、完全長ポリアデニル化（ポリＡ）配列（又は完全長ポリＡの切断されたポリＡでの置換）とを含み、上流（すなわち、５’）又はクリプティック開始コドン（すなわち、ＡＴＧ部位）はほとんど又は全く含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子に対して５’の開始部位を含まない。ある特定の実施形態において、発現カセット又は遺伝子療法ベクターは、ＬＭＡＰ－２Ｂをコードする配列、例えば、本明細書中で開示するコドン最適化若しくは変異体ＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド配列又は導入遺伝子配列を含む。

場合によっては、発現カセットは、第一の逆方向末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、導入遺伝子（例えば、本明細書中で開示するＬＡＭＰ－２Ｂをコードする導入遺伝子）、完全長ポリＡ配列を含む３’未翻訳領域、及び第二の逆方向末端反復の２つ以上を含む。いくつかの実施形態において、逆方向末端反復（ＩＴＲ）の一方又は両方は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、若しくはＡＡＶ９ ＩＴＲ、又は当該技術分野で公知のいずれか一つのＩＴＲである。いくつかの実施形態において、発現カセットは、正確に２つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは両方ともＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はＡＡＶ９ ＩＴＲである。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは両方ともＡＡＶ２ ＩＴＲである。

一実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子に機能的に連結されたＫｏｚａｋ配列を含む。一実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号６を含むか又は配列番号６からなるコンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列である。

様々な実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子に機能的に連結された代替Ｋｏｚａｋ配列を含む。一実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号１４～１８のいずれか一つを含むかまたは配列番号１４～１８のいずれか一つからなる代替Ｋｏｚａｋ配列である。

いくつかの実施形態において、発現カセットはＫｏｚａｋ配列を含まない。

配列番号１４において、小文字は、塩基が変わり得る場所で最も一般的な塩基を示し；大文字は高度に保存された塩基を示す；アデニン又はグアニンを示す。配列番号１４において、括弧中の配列（ｇｃｃ）は任意選択的である。配列番号１５～１７において、「Ｎ」は任意の塩基を示す。

様々な配列をこのコンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列の代わりに翻訳開始部位として使用することができ、他の配列を特定し試験することは、当業者の技術範囲内である。Ｋｏｚａｋ Ｍ．Ａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｉｎｔｉｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１５（４）：８８７－９０３（１９９１）を参照。

一実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子に機能的に連結された完全長ポリＡ配列を含む。一実施形態において、完全長ポリＡ配列は、配列番号７を含む。

制限なく、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）（配列番号１９）、ＳＶ４０初期／後期ポリアデニル化シグナル（配列番号２０）、及びヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリアデニル化シグナル（配列番号２１）を含む様々な代替ポリＡ配列を、本開示の発現カセットで使用することができる。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、ポリＡ配列の活性フラグメントを含む。特定の実施形態において、ポリＡ配列の活性フラグメントは、２０塩基対（ｂｐ）未満、５０ｂｐ未満、１００ｂｐ未満、又は１５０ｂｐ未満の、例えば、本明細書中で開示するポリＡ配列のいずれかを含むか、またはこれらからなる。

場合によっては、導入遺伝子の発現は、発現カセットが競合するＯＲＦを含まないことを確実にすることによって増大する。一実施形態において、発現カセットは、導入遺伝子の開始コドンの５’の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、又は５００塩基対以内の開始コドンを含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは導入遺伝子の開始コドンの５’に開始コドンを含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子に対して５’の開始部位を含まない。

一実施形態において、発現カセットは、５’から３’の方向で、機能的に連結された、第一の逆方向末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、イントロン、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、導入遺伝子、完全長ポリＡ配列を含む３’未翻訳領域、及び第二の逆方向末端反復を含み、発現カセットは、代替ｍＲＮＡを生成することができる導入遺伝子に対して５’の開始部位を含まない。

いくつかの実施形態において、エンハンサ／プロモータ領域は、５’から３’の方向で：ＣＭＶ ＩＥエンハンサ及びニワトリβアクチンプロモータを含む。一実施形態において、エンハンサ／プロモータ領域はＣＡＧプロモータ（配列番号２２）を含む。本明細書中で使用する場合、「ＣＡＧプロモータ」は、ＣＭＶ初期エンハンサエレメント、ニワトリβアクチンプロモータ、ニワトリβアクチン遺伝子の第一エクソン及び第一イントロン、並びにウサギβグロビン遺伝子からのスプライスアクセプタを含むポリヌクレオチド配列を指す。

いくつかの実施形態において、エンハンサ／プロモータ領域は偏在性プロモータを含む。いくつかの実施形態において、エンハンサ／プロモータ領域は、ＣＭＶプロモータ（配列番号２３）、ＳＶ４０プロモータ（配列番号２４）、ＰＧＫプロモータ（配列番号２５）、及び／又はヒトβアクチンプロモータ（配列番号２６）を含む。いくつかの実施形態において、エンハンサ／プロモータ領域は、配列番号２３～２６のいずれか一つと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有するポリヌクレオチドを含む。

さらなる例示的プロモータとしては、限定されるものではないが、ヒト伸長因子１αプロモータ（ＥＦＳ）、ＳＶ４０初期プロモータ、マウス乳がんウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ；アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモータ、関心対象の遺伝子に対して異種の内因性細胞プロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、例えばＣＭＶ前初期プロモータ領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ、合成プロモータ、ハイブリッドプロモータなどが挙げられる。

いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号２７と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を共有するポリヌクレオチド（ＷＰＲＥ要素）を含む。

いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列に対して少なくとも９５％の同一性を共有する。一実施形態において、発現カセットは、配列番号８～１０から選択される配列に対して完全同一性を共有するか、または配列番号８～１０から選択される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を共有する。

ある特定の実施形態において、発現カセットは、限定されるものではないが、本明細書中で開示する修飾のいずれかを含む配列番号８～１０から選択される配列と比較して、一つ以上の修飾を含む。特定の実施形態において、一つ以上の修飾は：一つ以上（例えば、全部）の上流ＡＴＧ配列の除去、Ｋｏｚａｋ配列の、限定されるものではないが、本明細書中に開示されているもののいずれかを含む最適化コンセンサスＫｏｚａｋ配列又は別のＫｏｚａｋ配列での置換、及び／又はポリアデニル化配列の、限定されるものではないが、本明細書中に開示されているもののいずれかを含む完全長ポリアデニル化配列若しくは別のポリアデニル化配列での置換、の一つ以上を含む。これらの例示的発現カセット内の遺伝要素の例示的構造を図１Ｂに示す。

一実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一実施形態において、発現カセットは、配列番号１１及び１２から選択される逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。

関連する実施形態において、本開示は、本明細書中で開示する発現カセットを含む遺伝子療法ベクターを提供する。概して、本明細書中で記載する遺伝子療法ベクターは、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）の一つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含み、ＬＡＭＰ－２の発現が、それを必要とする対象（例えば、ダノン病又は少なくとも一つにはＬＡＭＰ－２発現欠損に起因するオートファジーフラックス欠損によって特徴づけられる別の障害に罹っている対象）において、ＬＡＭＰ－２タンパク質発現レベル及び／又はオートファジーフラックスの欠損を部分的又は全体的に矯正することを可能にする。特定の実施形態において、発現カセットは、本明細書中で開示するＬＡＭＰ－２、例えば、配列番号３～５、又はその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、変異体配列は、配列番号３～５のいずれかに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態において、変異体は、配列番号３～５のいずれかの配列のフラグメント、例えば、配列番号３～５のいずれかの配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を有するフラグメントである。遺伝子療法ベクターはウイルスまたは非ウイルスベクターである。例示的非ウイルスベクターとしては、例えば、裸のＤＮＡ、カチオン性リポソーム複合体、カチオン性ポリマー複合体、カチオン性リポソーム－ポリマー複合体、及びエクソソームが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。

ある特定の実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶは４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡウイルスである。野生型ＡＡＶは非病原性であり、任意の公知疾患と病因学的関連性を有さないので、ＡＡＶに基づいた組換えベクターは優れた臨床的安全性と関連する。加えて、ＡＡＶは、多数の組織における非常に効率的な遺伝子送達及び持続的導入遺伝子発現の可能性を提供する。「ＡＡＶベクター」によって、制限なく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４などを含む、アデノ随伴ウイルス血清型由来のベクターを意味する。ＡＡＶベクターは、全体又は一部で欠失しているＡＡＶ野生型遺伝子の一つ以上、例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を有し得るが、機能的隣接逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を保持する。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンの救済、複製及びパッケージングに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、少なくとも、ウイルスの複製及びパッケージングのためにシスで必要とされるそれら配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含むと本明細書中では定義される。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、当該配列が機能的救済、複製及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって改変されていてもよい。ＡＡＶベクターは、限定されるものではないが、一つ以上の修飾カプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３）を含む、他の修飾を含んでもよい。例えば、カプシドタンパク質は、指向性を改変する、及び／又は免疫原性を減少させるように、修飾することができる。

野生型ＡＡＶは非病原性であり、任意の公知疾患と病因学的関連性を有さないので、ＡＡＶに基づく組換えベクターは、優れた臨床的安全性と関連する。加えて、ＡＡＶは、多数の組織における非常に効率的な遺伝子送達及び持続的導入遺伝子発現の可能性を提供する。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４等を含む、ＡＡＶの様々な血清型が公知である。ＡＡＶベクターは、全体又は一部で欠失したＡＡＶ野生型遺伝子の一つ以上、例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を有し得るが、機能的隣接逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を保持する。組換えＡＡＶベクターの血清型は、そのカプシドによって決定される。国際特許公開第ＷＯ２００３０４２３９７Ａ２号は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びｒｈ１０のものを含む、様々なカプシド配列を開示している。国際特許公開第ＷＯ２０１３０７８３１６Ａ１号は、ＡＡＶｒｈ７４からのＶＰ１のポリペプチド配列を開示している。多種多様な天然に存在するか又は遺伝子組換えＡＡＶカプシド配列が当該技術分野で公知である。

例示的非限定的カプシドは、配列番号２８の配列（又はそのＶＰ１、ＶＰ２、若しくはＶＰ３フラグメント）を有するＡＡＶ９カプシドである。いくつかの実施形態において、本開示のＡＡＶベクターは、配列番号２８の全配列、又は配列番号２８のアミノ酸１３８～７３６にわたって、又は配列番号２８のアミノ酸２０３～７３６にわたって、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の同一性を共有するカプシドタンパク質を含む。

ＡＡＶ発現ベクターは、転写の方向で機能的に連結された成分として、転写開始領域、関心対象のＤＮＡ（すなわち、ＬＡＭＰ－２遺伝子）及び転写停止領域を含む制御要素を少なくとも提供する公知技術を使用して構築される。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶ９ベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターの発現カセットには、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接している。開示されたベクターの代替実施形態で使用されるＩＴＲとしては、限定されるものではないが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が挙げられる。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶ２／９ベクターである。ＡＡＶ２／９という表記は、ＡＡＶ２のＩＴＲとＡＡＶ９のカプシドとを有するＡＡＶベクターを指す。本開示の他の実施形態には、限定されるものではないが、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ５／９、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ２／ｒｈ７４、ＡＡＶ５／９、及びＡＡＶ５／ｒｈ７４ベクターが含まれる。当該技術分野で公知の他のＩＴＲを使用することができる。本開示のベクターで有用な例示的ＩＴＲ（及び他のＡＡＶ成分）としては、限定されるものではないが、米国特許第６９３６４６６Ｂ２号、米国特許第９１６９４９４Ｂ２号、米国特許出願第２００５０２２０７６６Ａ１号、米国特許出願第２０１９００２２２４９Ａ１号、及び米国特許第７２８２１９９Ｂ２号で記載されているものが挙げられ、これは、それぞれそれらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、又はより具体的には、レンチウイルスベクターである。本明細書中で使用する場合、「レトロウイルス」又は「レトロウイルスの」という語は、そのゲノムＲＮＡを線状二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、続いてそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組込む、ＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスベクターは遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５－４６０）。ウイルスは、一旦宿主ゲノムに組み込まれると、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのテンプレートしての役割を果たし、当該ウイルスによってコードされたＲＮＡ分子の発現を指示する。

例示的レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科）には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：（１）ガンマレトロウイルス属、例えば、マロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、マロニーネズミ肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ネズミ乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、及びネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、（２）スプマウイルス属、例えば、類人猿フォーミーウイルス、（３）レンチウイルス属、例えば、ヒト免疫不全ウイルス－１及び類人猿免疫不全ウイルス。

本明細書中で使用する場合、「レンチウイルスの」又は「レンチウイルス」という語は、複雑なレトロウイルスの群（又は属）を指す。例示的レンチウイルスとしては、限定されるものではないが：ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型、及びＨＩＶ２型を含む；ビスナ－マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎－脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及び類人猿免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列要素）が好ましい。

レトロウイルスベクター、及びさらに詳細には、レンチウイルスベクターは、本発明を実施する際に使用することができる。したがって、「レトロウイルスベクター」という語は、本明細書中で使用する場合、「レンチウイルスベクター」を含むことを意図し；「レトロウイルス」という語は、本明細書中で使用する場合、「レンチウイルス」を含むことを意図する。

ウイルスベクターという語は、核酸を細胞中に移動させることができるベクター若しくはウイルス粒子、又は転移核酸自体のいずれかを指す可能性がある。ウイルスベクターは、主にウイルスに由来する構造的及び／又は機能的遺伝要素を含む。「レトロウイルスベクター」という語は、主にレトロウイルスに由来する、構造的及び機能的遺伝要素、又はその部分を含むウイルスベクターを指す。「レンチウイルスベクター」という語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む構造的及び機能的遺伝要素、又はその部分を含むウイルスベクターを指す。「ハイブリッド」という語は、ベクター、ＬＴＲ、又はレトロウイルス配列、例えば、レンチウイルス配列及び非レンチウイルスウイルス配列の両方を含む他の核酸を指す。一実施形態において、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組込み及び／又はパッケージング用の、レトロウイルス配列、例えば、レンチウイルス配列を含むベクター又はトランスファープラスミドを指す。

特定の実施形態において、「レンチウイルスベクター」及び「レンチウイルス発現ベクター」という語は、レンチウイルストランスファープラスミド及び／又は感染性レンチウイルス粒子を指すために使用される場合がある。例えば、クローニング部位、プロモータ、調節要素、異種核酸などの要素について本明細書中で言及する場合、これらの要素の配列は、本発明のレンチウイルス粒子においてはＲＮＡ形態で存在し、本発明のＤＮＡプラスミドにおいてはＤＮＡ形態で存在すると理解されたい。

ある特定の実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列のほとんど又はすべては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ－１由来である。しかしながら、レンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用することができ、ある特定のレンチウイルス配列における多数の置換及び改変は、トランスファーベクターの本明細書で記載する機能を実施する能力を損なうことなく調節することができると理解されたい。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野では公知であり、以下を参照：Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び同第５，９９４，１３６号、これらの多くは、本発明のウイルスベクター又はトランスファープラスミドを産生するに適合させることができる。

本明細書中で開示されるＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子配列は、様々な実施形態において、当該技術分野で公知の、又はあらかじめ見いだされた、任意のベクター系において使用される。必要以上の実験をせずに成功の合理的期待のある他のベクター系で導入遺伝子配列を使用することは当業者の技術範囲内であるので、本発明は、本明細書中で記載される任意の特定のウイルスベクターに限定されない。

本発明の実施において有用な遺伝子導入ウイルスベクターは、分子生物学の分野で周知の方法論を利用して構築することができる。典型的には、導入遺伝子を有するウイルスベクターは、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、好適な調節要素及び細胞形質導入を媒介する、ウイルスタンパク質の産生に必要な要素からアセンブリングされる。そのような組換えウイルスは、当該技術分野で公知の技術によって、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによるか、又はヘルパープラスミド若しくはウイルスでの一過性トランスフェクションによって産生することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、限定されるものではないが、ＨｅＬａ細胞、ＳＦ９細胞（任意選択的にバクロウイルスヘルパーベクターを使用してもよい）、２９３細胞などが挙げられる。米国特許出願第２０１７０２１８３９５Ａ１号で記載されるように、ヘルペスウイルスベースの系を使用して、ＡＡＶベクターを産生することができる。そのような複製欠損の組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、国際公開第９５／１４７８５号、国際公開第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号及び国際公開第９４／１９４７８号で見出すことができ、その各々の全内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。

本開示はまた、本明細書中で開示する発現カセット又はベクター（例えば、遺伝子療法ベクター）と、一つ以上の薬剤的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書中で開示する発現カセットを含むＡＡＶベクターを含み、例えば、発現カセットは、ＬＡＭＰ－２Ｂをコードするコドン最適化導入遺伝子、例えば、配列番号３～５のいずれか及びその変異体を含む。医薬組成物、例えば、オートファジーフラックス欠損によって特徴づけられる障害（例えば、ダノン病）を防止又は治療する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量の、本明細書中で開示される発現カセット又はベクターであって、ＬＡＭＰ－２の一つ以上のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を含む、発現カセット又はベクターを含む医薬組成物が提供される。

本発明の実施で有用なＡＡＶベクターは、アデノウイルスベース及びヘルパーを含まない系を含む様々な系を使用してＡＡＶビリオン（ウイルス粒子）にパッケージすることができる。ＡＡＶバイオロジーにおける標準的方法としては、Ｋｗｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．（２００８）２５（３）：４８９－９９；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００６）１４（３）：３１６－２７．Ｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００４）１０（２）：３０２－１７；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００３）３（４）：２８１－３０４；Ｄｅｙｌｅ ＤＲ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＤＷ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００９）１１（４）：４４２－４４７；ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００１）８（１６）：１２４８－５４；及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．（２００１）４（４）：３８３－９１で記載されているものが挙げられる。ヘルパーを含まない系は、米国特許第６，００４，７９７号；米国特許第７，５８８，７７２号；及び米国特許第７，０９４，６０４号に記載されているものを含んでいた。

発現カセット又はベクターを含む医薬組成物は、選択された投与様式、例えば、脳室内、心筋内、冠動脈内、静脈内、動脈内、腎臓内、尿道内、硬膜外又は筋肉内投与に適した任意の形態であってよい。一つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、唯一の活性剤として、又は他の活性剤と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支援を用いて混合物として、動物及び人間に対して投与することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本開示の遺伝子療法ベクターのいずれかを用いてエクスビボで形質導入された細胞を含む。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、又はそのベクターを含む医薬組成物は、全身投与された場合に有効である。例えば、本開示のウイルスベクターは、場合によっては、対象（例えば、ヒト以外の霊長類又はヒトなどの霊長類）に対して静脈内投与すると有効性を示す。いくつかの実施形態において、本開示のウイルスベクターは、全身投与された場合に様々な組織で（例えば、心臓、筋肉、及び／又は肺で）ＬＡＭＰ－２Ｂの発現を誘導することができる。特定の実施形態において、配列番号３に対して実質的に同一、又は同一である導入遺伝子を含むＡＡＶ９ベクターを対象に静脈内投与すると、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現が起こる。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂの発現は、対象の心臓の左心室、右心室、左心房、及び右心房の一つ以上、又は全部で検出可能である。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂの発現は、対象の心臓の左心室の小領域１及び／又は小領域２で検出可能である。

「検出可能な発現」は、典型的には、ウイルスベクターで処置していない対照対象又は組織と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％又はそれ以上の導入遺伝子発現を指す。いくつかの実施形態において、検出可能な発現とは、無ベクター対照よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍高い発現を意味する。導入遺伝子発現は、細胞における野生型又は内在性遺伝子の発現からの増加として決定することができる（導入遺伝子の発現が内在性遺伝子の発現に影響を及ぼし得る可能性の原因となる）。導入遺伝子発現はまた、導入遺伝子ｍＲＮＡ転写物上に存在するが、内在性遺伝子のｍＲＮＡ転写物上には存在しない配列のＲＴ－ＰＣＲ検出によって決定することもできる。例えば、転写物の３’ＵＴＲを使用して、内在性遺伝子の発現と無関係の導入遺伝子の発現を決定することができる（異なる３’ＵＴＲを有し得る）。導入遺伝子によってコードされたポリペプチドの発現は、以下の実施例で記載するように、ウェスタンブロット若しくは酵素結合面根来吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、又は当該技術分野で公知の他の方法によって、評価することができる。タンパク質の野生型及び外因性コピーに対して交差反応性である抗体を使用してもよい。場合によっては、外因性タンパク質に対して特異的な抗体を特定し、使用して、導入遺伝子発現を決定することができる。当業者は、標的細胞又は組織を考慮して適切な検出方法を設計することができる。場合によっては、発現は、標準曲線を使用して定量的に測定される。標準曲線は、精製ＬＡＭＰ－２タンパク質を使用して、実施例で記載するか、または当該技術分野で公知の方法によって作成することができる。あるいは、導入遺伝子の発現は、対応するｍＲＮＡの定量化によって評価することができる。

いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ以下、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ以下、２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ以下、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ以下、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下、又は１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ以下の用量で起こる。

いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、６×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、８×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、又は３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で起こる。

いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、又は２×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で起こる。いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で起こる。いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、又は９×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で起こる。

いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、又は１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で起こる。

いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で起こる。いくつかの実施形態において、心臓組織におけるＬＡＭＰ－２Ｂの検出可能な発現は、対象の体重１キログラム（ｋｇ）あたりのベクターゲノム（ｖｇ）で、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ～１×１０^１４の用量で起こる。

様々な実施形態において、医薬組成物は、注射することができる処方用の薬剤的に許容されるビヒクル（例えば、担体、希釈剤及び賦形剤）を含む。例示的賦形剤にはポロキサマーが含まれる。ウイルスベクター（ＡＡＶを含む）用の処方緩衝液は、概して、凝集を防止する塩と、ベクターの粘着性を低減する他の賦形剤（例えば、ポロキサマー）とを含む。これらは、特に、等張液、塩溶液（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウム等、又はそのような塩の混合物）であってもよいし、又は乾燥、特に、場合によって、滅菌水若しくは生理食塩水を添加すると、注射液の復元が可能になる凍結乾燥組成物であってもよい。有利には、処方は、（例えば、０℃未満、約－６０℃、又は約－７２℃で）凍結した場合、貯蔵及び使用について安定である。

リソソーム障害及び／又はダノン病を治療する例示的方法は、国際特許公開第２０１８／１７０２３９Ａ１号で提示されており、これはその全体が本明細書中に組み込まれる。本開示の導入遺伝子、発現カセット、及びベクターは、インビボ（例えば、全身、特に、静脈内使用）及びエクスビボ使用の両方に有用である。ＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子及び機能的プロモータを使用して、患者の自家性造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）をエクスビボで遺伝子修正することができ、これを次に患者に再移植して、患者の骨髄を再配置させることができ、これは、患者の残りの人生で「正常」な細胞のリザーバーとなる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターをエクスビボ遺伝子修正のために使用するが、他の非ウイルス又はウイルスベクターをレンチウイルスベクターの代わりに使用することもできる。本開示は、ドナーＨＳＰＣを使用した同種移植を想定する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターは、自己不活型（ＳＩＮ）レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ＨＳＰＣは、例えば、顆粒球－コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）及び／又はプレリキサホルを使用して動員した末梢血由来である。

別の態様において、本開示は、それを必要とする対象において、ダノン病又は別のオートファジー障害の一つ以上の症状を防止、軽減、改善、減少、阻害、除去、及び／又は逆転する方法であって、対象に対して、本開示の遺伝子療法ベクターを投与することを含む方法を提供する。「ダノン病」という語は、多系統臨床症状を伴うＸ染色体優性骨格筋及び心筋障害を指す。ダノン病変異は、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ－２）タンパク質発現の不在をもたらす。主な臨床的特徴としては、骨格筋症及び心筋症、心伝導異常、認知的困難、及び網膜疾患が挙げられる。男性は、典型的には、女性よりも早期かつより深刻な影響を受ける。

一実施形態において、ベクターを、非経口、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、及び筋肉内からなる群から選択される経路を介して投与する。一実施形態では、ベクターを複数回投与する。一実施形態では、ベクターを、ベクターの筋肉内注射によって投与する。一実施形態では、ベクターは、骨格筋へベクターを注射することによって投与する。一実施形態では、発現カセットは、筋肉特異的プロモータ、任意選択的に、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｓｃｌｅ ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ＳＶ４０ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｍｕｓｃｌｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００７ Ｆｅｂ；１９（２）：３０９－１５で記載されているような筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ若しくはＭＣＫ／ＳＶ４０ハイブリッドプロモータを含む。一実施形態では、ベクターを、心臓内注射によって投与する。

一実施形態において、ベクター、例えば、ＡＡＶベクターを、全身投与し、さらに詳細には静脈内投与する。有利には、本来の又は野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ配列を使用する場合、ベクターを、同じ応答が観察されるのに必要な用量よりも少ない用量（１ｍＬあたりのｖｇ、ｖｇ／ｋｇ体重、又はｖｇ／ｍｉｎ／ｋｇ）で投与する。特定の実施形態において、ベクターは、本明細書中で開示するＬＡＭＰ－２Ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むＡＡＶ２／９ベクターである。

いくつかの実施形態において、本開示は、対象においてＬＡＭＰ－２Ｂを発現する方法であって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを対象に対して全身投与することを含み、ＡＡＶベクターは、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を共有する導入遺伝子を含む発現カセットを含むか、又は配列番号３と同一であり、導入遺伝子はエンハンサ／プロモータ領域に対して機能的に連結されており、ＡＡＶベクターを対象に対して全身投与すると、ＡＡＶベクターの投与又は未処置の対照対象におけるＬＡＭＰ－２Ｂの発現の前のＬＡＭＰ－２Ｂの発現と比較して、ＬＡＭＰ－２Ｂの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２／９ベクターである。特定の実施形態において、発現カセットは、本明細書中で開示される要素のいずれかを含む。いくつかの実施形態において、全身投与は静脈内投与を含む。いくつかの実施形態において、対象はダノン病の症状を示している。いくつかの実施形態において、対象はダノン病にかかっているか、またはダノン病のリスクがある。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重キログラム（ｖｇ）あたりのレンチウイルスベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で投与する。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのウイルスベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で投与する。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのレンチウイルスベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのウイルスベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で全身投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのＡＡＶベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのレンチウイルスベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１２～５×１０^１４ベクターゲノム（ｖｇ）の、対象の全体重１キログラム（ｖｇ）あたりのウイルスベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１３～５×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを、約５×１０^１３～３×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを約５×１０^１３～１×１０^１４ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ未満、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇ未満の用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、約１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、約５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は約７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターを、１×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０^１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、５×１０^１５ｖｇ／ｋｇ、又は７×１０^１５ｖｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する。

全身（又はさらに詳細には静脈内）投与の結果、いくつかの実施形態では、対象の一つ以上の組織（例えば、心臓、筋肉、及び／又は肝臓）において、導入遺伝子から発現されたｍＲＮＡの形態で、ｍＲＮＡとしてＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドが発現される。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２ＢポリヌクレオチドのｍＲＮＡとしての発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置した対象における発現と比較して、心臓において少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍増加する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、心臓において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍増加する。

いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、筋肉において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍増加する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、筋肉において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、筋肉において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍増加する。

いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子は、対象の心臓で発現され、肝臓では発現されない。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、肝臓と比較して、心臓では、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍であることが観察される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、肝臓と比較して、心臓では、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍であることが観察される。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡとしてのＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチドの発現は、肝臓と比較して、心臓では、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍であることが観察される。

いくつかの実施形態において、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍増加する。いくつかの実施形態において、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、心臓において、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態において、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、未処置の対象又は対照ベクターで処置された対象における発現と比較して、心臓において、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍増加する。

いくつかの実施形態において、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、肝臓と比較して、心臓では、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．３倍、又は少なくとも５倍であることが観察される。いくつかの実施形態において、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、肝臓と比較して、心臓では、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２．０倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、又は少なくとも４倍であることが観察される。いくつかの実施形態において、野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現は、肝臓と比較して、心臓では、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、３倍、又は４倍であることが観察される。

いくつかの実施形態において、遺伝子療法ベクターの投与の結果、未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓での野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現が最大で約１．１倍、最大で約１．２倍、最大で約１．３倍、最大で約１．４倍、最大で約１．５倍、最大で約１．６倍、最大で約１．７倍、最大で約１．８倍、最大で約１．９倍、又は最大で約２倍増加する。いくつかの実施形態において、遺伝子療法ベクターの投与の結果、未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓での野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現が最大で１．１倍、最大で１．２倍、最大で１．３倍、最大で１．４倍、最大で１．５倍、最大で１．６倍、最大で１．７倍、最大で１．８倍、最大で１．９倍、又は最大で２倍増加する。いくつかの実施形態において、遺伝子療法ベクターの投与の結果、未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓での野生型又は機能的ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現が１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、又は２倍増加する。

一実施形態において、本開示は、それを必要とする対象において、疾患又は障害、任意選択的にダノン病を治療する方法であって、細胞を本開示に係る遺伝子療法ベクターと接触させ、細胞を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態において、細胞は幹細胞であり、任意選択的に、多能性幹細胞である。一実施形態において、幹細胞は、心臓組織への分化が可能である。一実施形態において、幹細胞は、筋肉組織、例えば、心筋組織及び／又は骨格筋組織への分化が可能である。一実施形態において、幹細胞は自家性である。一実施形態において、幹細胞は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

一実施形態において、疾患又は障害はオートファジー障害である。いくつかの実施形態において、オートファジー障害は、限定されるものではないが、末期心不全、心筋梗塞、薬物中毒、糖尿病、末期腎不全、及び老化からなる群から選択される。一実施形態において、対象は哺乳動物、例えば、ヒトである。一実施形態において、対象はダノン病又は別のオートファジー障害の症状を示している。一実施形態において、対象は、減少しているか又は検出不能なＬＡＭＰ－２発現を有するとして特定されている。一実施形態において、対象は、変異ＬＡＭＰ－２遺伝子を有するとして特定されている。

本明細書中に記載する方法を使用した治療に適している対象／患者としては、限定されるものではないが、不十分なオートファジーフラックスによって特徴づけられる疾患又は障害（例えば、ダノン病並びに、限定されるものではないが、収縮期及び拡張期心不全、心筋梗塞、薬物中毒（例えば、アントラサイクリン、クロロキン及びその誘導体）、糖尿病、末期腎疾患、及び老化を含む他の公知オートファジー障害）のリスクがあるが、症状を示していない個体、並びに現在症状を示している対象が挙げられる。そのような対象は、変異ＬＡＭＰ－２遺伝子を有するとして、又は減少しているか若しくは検出不能なレベルのＬＡＭＰ－２発現を有するとして特定されていてもよい。

いくつかの実施形態において、患者はヒトである。いくつかの実施形態において、患者は、小児、青年、又は成人のヒトである。いくつかの実施形態において、患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０歳であるか、又は２０歳を超える。いくつかの実施形態において、患者は２０～５０歳である。いくつかの実施形態において、患者は５０～６５歳である。いくつかの実施形態において、患者は、１～５、２～６、３～７、４～８、５～９、６～１０、７～１１、８～１２、９～１３、１０～１４、１１～１５、１２～１６、１３～１７、１４～１８、１５～１９、又は１６～２０歳である。いくつかの実施形態において、患者は、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１２～１３、１３～１４、１４～１５、１５～１６、１６～１７、１７～１８、１８～１９、１９～２０、又は２０～２１歳である。特定の実施形態では、患者は１５～１６歳である。

いくつかの実施形態において、患者はヒト男性である。いくつかの実施形態において、患者は、小児、青年、又は成人のヒト男性である。いくつかの実施形態において、患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０歳の男性、又は２０歳を超える男性である。いくつかの実施形態において、患者は２０～５０歳の男性である。いくつかの実施形態において、患者は５０～６５歳の男性である。いくつかの実施形態において、患者は、１～５、２～６、３～７、４～８、５～９、６～１０、７～１１、８～１２、９～１３、１０～１４、１１～１５、１２～１６、１３～１７、１４～１８、１５～１９、又は１６～２０歳の男性である。いくつかの実施形態において、患者は、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、１１～１２、１２～１３、１３～１４、１４～１５、１５～１６、１６～１７、１７～１８、１８～１９、１９～２０、又は２０～２１歳の男性である。特定の実施形態では、患者は１５～１６歳である。

いくつかの実施形態において、患者はヒト女性である。いくつかの実施形態において、患者は、小児、青年、又は成人のヒト女性である。いくつかの実施形態において、患者は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０歳の女性、又は２０歳を超える女性である。いくつかの実施形態において、患者は２０～５０歳の女性である。いくつかの実施形態において、患者は５０～６５歳女性である。

いくつかの実施形態において、対象は、不十分なオートファジーフラックスによって特徴づけられる疾患又は障害（例えば、ダノン病並びに、限定されるものではないが、収縮期及び拡張期心不全、心筋梗塞、薬物中毒、糖尿病、末期腎疾患、及び老化を含む他の公知オートファジー障害）の症状を示している。症状は、活発に現れていてもよいし、あるいは（例えば、薬物治療により）抑制若しくは制御されているか又は寛解期であってもよい。対象は、例えば、資格のある医師によって障害を有していると診断されている場合もあるし、診断されていない場合もある。

定義
「リソソーム関連膜タンパク質２」及び「ＬＡＭＰ－２」という語は、同義的に：（１）ＬＡＭＰ－２核酸によってコードされるアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２２９４．２（アイソフォームＡ）．ＮＭ＿０１３９９５．２（アイソフォームＢ）、ＮＭ＿００１１２２６０６．１（アイソフォームＣ）を参照）又はＬＡＭＰ－２ポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２２８５．１（アイソフォームＡ）、ＮＰ＿０５４７０１．１（アイソフォームＢ）、ＮＰ＿００１１１６０７８．１（アイソフォームＣ）を参照）に対して、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、あるいは全長にわたって、約９０％を超えるアミノ酸配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）ＬＡＭＰ－２ポリペプチド（例えば、本明細書中で記載するＬＡＭＰ－２ポリペプチド）のアミノ酸配列；又はＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書中で記載するＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、及びそれらの保存的に修飾された変異体を含む免疫源に対する抗体、例えば、ポリクローナル抗体と結合する；（３）ＬＡＭＰ－２タンパク質をコードする核酸配列、及びそれらの保存的に修飾された変異体に対応するアンチセンス鎖に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする；（４）ＬＡＭＰ－２核酸（例えば、本明細書中で記載するようなＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド、及び本明細書中で記載するようなＬＡＭＰ－２ポリペプチドをコードするＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）に対して、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００若しくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、又は全長にわたって、約９０％超、好ましくは、約９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、又はそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸及びポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、及び種間相同体を指す。

「リソソーム関連膜タンパク質２Ｂ」及び「ＬＡＭＰ－２Ｂ」という語は、同義的に：（１）ＬＡＭＰ－２Ｂ核酸によってコードされるアミノ酸配列（例えば、ＮＭ＿０１３９９５．２を参照）又はＬＡＭＰ－２Ｂポリペプチドのアミノ酸配列（例えば、ＮＰ＿０５４７０１．１を参照）に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、３００、４００、又はそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、あるいは全長にわたって、約９０％を超えるアミノ酸配列同一性、例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する；（２）ＬＡＭＰ－２Ｂポリペプチド（例えば、本明細書中に記載するＬＡＭＰ－２Ｂポリペプチド）のアミノ酸配列；又はＬＡＭＰ－２Ｂ核酸（例えば、本明細書中で記載するＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド）によってコードされるアミノ酸配列、及びそれらの保存的に修飾された変異体を含む免疫源に対する抗体、例えばポリクローナル抗体と結合する；（３）ＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質をコードする核酸配列、及びそれらの保存的に修飾された変異体に対応するアンチセンス鎖に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズする；（４）ＬＡＭＰ－２Ｂ核酸（例えば、本明細書中で記載するようなＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド、及び本明細書中で記載するようなＬＡＭＰ－２ＢポリペプチドをコードするＬＡＭＰ－２Ｂポリヌクレオチド）に対して、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００若しくはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、又は全長にわたって、約９０％超、好ましくは約９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、又はそれ以上のヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸及びポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、及び種間相同体を指す。

タンパク質（例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ）に関する「機能的変異体」という語は、タンパク質の一つ以上の機能的属性を保持する、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、又は少なくとも約８０のアミノ酸残基を有する、ポリペプチド配列、又はポリペプチド配列のフラグメントを指す。例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的変異体は：（１）ヒト心筋細胞機能の調節（Ｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ １１６（２）５５６－５６５）；（２）ダノン病における代謝的及び生理的機能の改善（Ａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｓ０７３５－１０９７（１９）３１２９５－１）；及び／又は（３）オートファジー（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（２０１６）１２９，２１３５－２１４３）などの一つ以上の機能を保持するＬＡＭＰ－２Ｂ（本明細書中で定義するとおり）である。

ＬＡＭＰ－２Ｂは、ルーメンドメイン（残基２９～３７５）、膜貫通ドメイン（残基３７６～３９９）、及び細胞質ドメイン（残基４００～４１０）を有する。ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ１３４７３を参照。ＬＡＭＰ－２Ｂ機能としては、シャペロン媒介オートファジー、様々なストレスに応答して、また長い生物学的半減期のタンパク質の正常なターンオーバーの一部として、タンパク質のリソソーム分解を媒介するプロセス（Ｃｕｅｒｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：５０１－５０３（１９９６），Ｃｕｅｒｖｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１３：４４４１－４４５０（２０００）、Ｂａｎｄｙｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８：５７４７－５７６３（２００８），Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３２７：４８－５６（２０１４），Ｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｐｅｎ ５：１５１６－１５２９（２０１６））が挙げられる。ＬＡＭＰ－２Ｂは、リソソーム分解のためにＧＡＰＤＨ及びＭＬＬＴ１１を標的とし得る。ＬＡＭＰ－２Ｂは、オートファジーの間のオートファゴソームとリソソームとの融合に必要とされ得る。ＬＡＭＰ２が欠損している細胞は、正常なレベルのＶＡＭＰ８を発現するが、オートファゴソーム上にＳＴＸ１７を蓄積することができず、これがオートファゴソームとリソソームとの間の融合の欠損の最も説得力のある説明であることが示唆されている。ＬＡＭＰ－２Ｂは、オートファゴソームの内容物の正常な分解に必要とされ得る。ＬＡＭＰ－２Ｂは、リソソームタンパク質分解におけるその機能によって外来性抗原の効率的なＭＨＣＩＩで媒介される提示に必要とされ得る；エンドソーム／リソソーム区画においてプロテアーゼによって生成される抗原ペプチドは、発生期ＭＨＣＩＩサブユニットによって捕捉される（Ｃｒｏｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １３１：３１８－３３０（２０１０））。

ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的変異体は、したがって、前述の機能のいずれかを媒介することができるＬＡＭＰ－２Ｂのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能フラグメントは、ルーメンドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインの一つ以上を含む。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的変異体は、天然ＬＡＭＰ－２Ｂに対して一つ以上のＣ末端又はＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態において、ＬＡＭＰ－２Ｂの機能的変異体は、天然ＬＡＭＰ－２Ｂ関して一つ以上の内部欠失を含む。

二つ以上の核酸又はポリペプチド配列の関連での「同一の」又は％「同一性」という語は、同じであるか、又は特定されたパーセンテージの同じアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する二つ以上の配列又は部分配列を指す（すなわち、比較ウィンドウ、又は以下の配列比較アルゴリズムのうちの一つを使用して、又はマニュアルアラインメント及び目視検査によって測定される指定の領域にわたる最大一致について比較し整列させた場合、例えば、本明細書中で記載するようなＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して特定の領域にわたって、少なくとも約８０％の同一性、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する。そのような配列はしたがって、「実質的に同一である」とされる。この定義はまた、試験配列の補体も指す。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸若しくはヌクレオチド長にわたって、例えば、５０、１００、２００、３００、４００アミノ酸若しくはヌクレオチド長の領域にわたって、又は基準配列の全長にわたって、存在する。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が基準配列としての機能を果たし、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要ならば、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用できるか、または代替パラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムはプログラムパラメータに基づいて基準配列に対する試験配列の％配列同一性を算出する。ＬＡＭＰ－２核酸及びタンパク質に対する核酸及びタンパク質の配列比較のために、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム及びデフォルトパラメータが使用される。

「比較ウィンドウ」は、本明細書中で使用する場合、２０～６００、通常、約５０～約２００、さらに一般的には約１００～約１５０からなる群から選択される複数の連続する位置のうちのいずれか一つのセグメントであって、配列を、２つの配列を最適に整列させた後の同じ数の連続する位置の基準配列と比較することができるセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメント法は当該技術分野で周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによるかるか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似法によるか、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｌのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ制御の実施によるか、又はマニュアルアラインメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照）により、実施することができる。％配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能である。

二つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという兆候は、第一核酸によってコードされるポリペプチドが以下に記載するように、第二核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応することである。したがって、例えば、二つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、ポリペプチドは、典型的には、第二ポリペプチドに対して実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であるという別の兆候は、二つの分子又はそれらの補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。二つの核酸配列が実質的に同一であるというさらに別の兆候は、同じプライマーを使用して配列を増幅できることである。

本明細書中で使用する場合、「投与する」とは、例えば、経腸、非経口、肺、及び局所／経皮投与をはじめとする、局所及び全身投与を指す。本明細書中に記載する方法において用いられる化合物（例えば、一つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームをコードするポリヌクレオチド）の投与経路としては、例えば、対象に対する、経口（ｐｅｒ ｏｓ（Ｐ．Ｏ．））投与、経鼻若しくは吸入投与、坐剤としての投与、局所接触、経皮送達（例えば、経皮パッチを介する）、クモ膜下（ＩＴ）投与、静脈内（「ｉｖ」）投与、腹腔内（「ｉｐ」）投与、筋肉内（「ｉｍ」）投与、病巣内投与、又は皮下（「ｓｃ」）投与、又は徐放性デバイス、例えば、ミニ浸透圧ポンプ、デポー製剤などの移植が挙げられる。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、経口、経鼻、経腟、経直腸、又は経皮）をはじめとする任意の経路によることができる。非経口投与としては、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腎内、尿道内、心臓内、冠動脈内、心筋内、皮内、硬膜外、皮下、腹腔内、脳室内、イオン泳動及び頭蓋内が挙げられる。他の送達様式としては、限定されるものではないが、リポソーム製剤、点滴静注、経皮パッチなどの使用が挙げられる。

「全身投与」及び「全身的に投与」という語は、化合物又は組成物を哺乳動物に投与して、化合物又は組成物が、循環系を介して医薬作用の標的部位をはじめとする体内の部位に送達されるようにする方法を指す。全身投与としては、限定されるものではないが、経口、鼻内、経直腸及び非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、経皮及び皮下などの、消化管を介するもの以外）投与が挙げられる。

「同時投与」又は「並行投与」という語は、例えば、化合物（例えば、ＬＡＭＰ－２ポリヌクレオチド）及び／又はその類似体及び別の活性剤に関して使用される場合、化合物及び／又は類似体を活性剤との投与を、両者が生理作用を同時に達成できるように投与することを指す。しかしながら、２つの薬剤は一緒に投与する必要はない。ある特定の実施形態において、一方の薬剤の投与は、他方の投与に先だって行うことができる。同時生理作用は、必ずしも両薬剤が循環中に同時に存在することを必要とするとは限らない。しかしながら、ある特定の実施形態では、同時投与の結果、典型的には、両薬剤が体内（例えば、血漿中）に、任意の所与の用量についての最大血清濃度のかなりの割合（例えば、２０％以上、例えば、３０％又は４０％以上、例えば、５０％又は６０％以上、例えば、７０％又は８０％又は９０％以上）で同時に存在することとなる。

「有効量」又は「薬学上有効な量」という語は、所望の結果、例えば、オートファジーの障害又は欠損を特徴とする疾患（例えば、ダノン病）の極度の重篤度を減少させるために充分な量の一つ以上のＬＡＭＰ－２アイソフォームの発現の増加をもたらすために必要な一つ以上の化合物（例えば、遺伝子療法ベクター）の量及び／若しくは投薬量、並びに／又は投薬計画を指す。

「投与させる」という表現は、医療専門家（例えば、医師）、又は対象の医療を管理する人による行動であって、問題になっている薬剤（複数可）／化合物（複数可）の対象への投与を管理及び／又は可能にする行動を指す。投与させることは、適切な治療若しくは予防レジメンの診断及び／若しくは決定、並びに／又は対象に対して特定の薬剤（複数可）／化合物を処方することを含み得る。そのような処方は、例えば、処方箋を書くこと、医療記録に注釈を施すことなどが含まれ得る。

本明細書中で使用する場合、「治療する」及び「治療」という語は、この用語が適用される疾患若しくは状態のいずれか、又はかかる疾患若しくは状態の一つ以上の症状の、開始の遅延、進行の妨害若しくは逆転、重篤度の減少、又は軽減若しくは防止を指す。「治療する」及び「治療」という語はまた、疾患若しくは状態の一つ以上の症状の防止、軽減、改善、減少、阻害、除去、及び／又は逆転も含む。

「軽減する」という語は、当該病状若しくは疾患の一つ以上の症状の減少若しくは除去、及び／又は当該病状若しくは疾患の一つ以上の症状の開始若しくは重篤度の減速若しくは遅延、及び／又は当該病状若しくは疾患の防止を指す。ある特定の実施形態において、病状又は疾患の一つ以上の症状の減少又は除去は、例えば、ＬＡＭＰ－２の一つ以上のアイソフォームの発現レベルにおける測定可能で持続的増加を含み得る。

本明細書中で使用する場合、「本質的に～からなる」という表現は、方法又は組成物で記載する活性な医薬品の属又は種を指し、さらに、記載した症状又は目的について、単独では実質的な活性を有さない他の薬剤も含み得る。

「対象」、「個体」、「患者」という語は、同義的に、哺乳動物、好ましくはヒト又はヒト以外の霊長類を指すが、家畜化された哺乳動物（例えば、イヌ又はネコ）、実験用哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）及び農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）も指す。様々な実施形態において、対象は、ヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年男性、青年女性、男児、女児）であり得る。

「遺伝子導入」又は「遺伝子送達」という語は、外来ＤＮＡを宿主細胞に確実に挿入するための方法又は系を指す。そのような方法は、非統合的転移ＤＮＡの一過性発現、転移レプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外複製及び発現、又は宿主細胞のゲノムＤＮＡへの転移遺伝物質の組込みをもたらし得る。

「ベクター」という語は、本明細書中で使用する場合、別の核酸分子を移動又は輸送することができる核酸分子を指す。転移核酸は、概して、ベクター核酸分子に連結され、例えば、挿入される。ベクターは、細胞において、自律増殖を指示するか、若しくは転写を逆転する配列を含み得るか、又は宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能にするために充分な配列を含み得る。「ベクター」は、遺伝子療法ベクターを含む。本明細書中で使用する場合、「遺伝子療法ベクター」という語は、遺伝子療法を実施する際に、例えば、治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を対象に送達する際に、使用することができるベクターを指す。遺伝子療法ベクターは、治療効果のあるポリペプチドをコードする核酸分子（「導入遺伝子」）、例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ又は対象に導入された場合に補充遺伝子療法に有用な他の遺伝子を含み得る。有用なベクターとしては、限定されるものではないが、ウイルスベクターが挙げられる。

本明細書中で使用する場合、「発現カセット」という語は、発現カセットに組み込まれる治療効果のあるポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰ－２Ｂ）をコードするポリヌクレオチド（「導入遺伝子」）の発現を適切な状況で誘導することができるＤＮＡ断片を指す。宿主細胞に導入されると、発現カセットは、とりわけ、導入遺伝子をＲＮＡに転写する細胞の機構を指示することができ、通常、これはその後さらに処理され、最終的に治療効果のあるポリペプチドに翻訳される。発現カセットは遺伝子療法ベクターに含まれ得る。概して、発現カセットという語は、５’ＩＴＲに対して５’のポリヌクレオチド配列と、３’ＩＴＲに対して３’のポリヌクレオチド配列とを除外する。

本明細書で言及され特定されている全ての特許、特許公報、及び他の刊行物は、あらゆる目的のためにそれらの全体として参照により本明細書中で個別かつ明示的に組み込まれる。

実施例１：Ｌａｍｐ－２Ｂ導入遺伝子変異体を使用する強化された遺伝子発現
図２に示す遺伝子発現カセットを、ＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子発現用のプラスミドベースの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータ系中で構築した。プラスミドは、ＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子、２Ａペプチド、及び強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする単一のオープンリーディングフレームを含んでいた。２Ａペプチドの翻訳後自己切断の結果、ＬＡＭＰ－２Ｂ及びｅＧＦＰが当モル量で同時発現された。野生型ＬＡＭＰ－２Ｂコーディング配列（配列番号２）及びＬＡＭＰ－２Ｂコーディング配列の３つのコドン変異体（コドン変異体１、２及び３；それぞれ配列番号３～５）を導入遺伝子として試験した。三つのコドン変異体は、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂコーディング配列と比較して、ＣｐＧの数が減少し、クリプティック部位が除去され、オープンリーディングフレームの数が減少していた。

ＣｅｌｌＢＩＮＤ９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ ＃３３００）の４０個のウェルを、０．１％の水中ゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＳ－００６－Ｂ）で１時間室温にてコーティングした。約８８，０００の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の心筋細胞（ＶＷＲ ＭＳＰＰ－ＣＭＣ１０００１）を、各ウェル中、播種培地（ＶＷＲ ＃Ｍ１００１）中に３７℃及び５％二酸化炭素（ＣＯ_２）にて蒔いた。４時間後、培地を、３７℃及び５％ＣＯ_２にあらかじめ平衡化した、維持培地（ＶＷＲ＃Ｍ１００３）に変えた。トランスフェクション混合物は、６μＬのトランスフェクション試薬（ＶｉａＦｅｃｔ Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｅ４９８２）を１２８μＬの０．０１５μｇ／μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中プラスミド（野生型又はコドン変異体１、２、若しくは３）又はＯｐｔｉＭＥＭ＋ＶｉａＦｅｃｔのみ（陰性対照）に添加することによって調製し、１０～２０分間インキュベートした。１００μＬのこのトランスフェクション混合物を３７℃及び５％ＣＯ_２にあらかじめ平衡化した１ｍＬの維持培地に添加した。

初回播種の約２８時間後、１００μＬの、維持培地中のこのトランスフェクション混合物を各ウェルに添加した。培地へのトランスフェクション混合物の添加の約４８時間後、細胞を撮像し、自動共焦点顕微鏡（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳ、Ｈａｒｍｏｎｙ ｖｅｒｓｉｏｎ４．５ソフトウェア）で、ＧＦＰ陽性細胞（図３）及びそれらの平均蛍光強度（図４）について分析した。トランスフェクションの２又は７日後の細胞の免疫蛍光画像を、それぞれ図５及び図６に示す。

図３は、コドン変異体１（「ＣＯ１」）又は２（「ＣＯ２」）を使用すると、野生型導入遺伝子と比較して、有意に多数の細胞においてＧＦＰの発現が得られたことを示す（約９倍多い）。同様に、図４は、コドン変異体１（「ＣＯ１」）及び２（「ＣＯ２」）でトランスフェクトされた細胞における平均ＧＦＰ強度が野生型よりも１．５倍高いことを示した。

実施例２：最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ遺伝子療法ベクター
最適化ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、実施例１で記載したＬＡＭＰ－２Ｂ最適化変異体、ＣＯ１配列を組換えＡＡＶベクターの発現カセットに挿入することによって、産生した。ＡＡＶ調節カセットは、上流クリプティックＡＴＧ配列の除去、最適化コンセンサスＫｏｚａｋ配列、及び／又は完全長ポリアデニル化配列の使用によって修飾する。ベクターを、導入遺伝子の上流の一つ以上のさらなるＡＴＧ部位、非最適化Ｋｏｚａｋ配列、及び／又は非完全長ポリアデニル化配列を含む対照組換えＡＡＶベクターと比較して試験する。ベクターを、ダノン患者ｉＰＳＣ由来の心筋細胞においてインビトロで、及びダノン病のＬＡＭＰ－２^－／－ノックアウトマウスモデルにおいて試験する。最適化ＡＡＶ遺伝子療法カセット及びベクターは、対照組換えＡＡＶベクターと比較して、より高レベルの発現及び／又はより高いパーセンテージの細胞における発現をもたらすと予想される。

実施例３：ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２のインビトロ評価
ＡＡＶ遺伝子療法カセット及びベクターは、ＬＡＭＰ－２Ｂ変異体配列ＣＯ１（配列番号３）を、導入遺伝子の上流にクリプティック開始部位を有さず、最適化コンセンサスＫｏｚａｋ配列、及びウサギグロビンからの完全長ポリアデニル化（ポリＡ）配列を有する組換えＡＡＶプラスミドベクターに挿入することによって産生した（「ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ．１．２”；発現カセット：配列番号８）。ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２を、最適化Ｋｏｚａｋ配列及びミニ－ポリＡを含まず、野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子（導入遺伝子配列：配列番号２）を有する調節カセットである、ＬＡＭＰ－２Ｂ ｖ１．０と比較した。

ＨＥＫ２９３細胞を使用して、３－プラスミドを用いてウイルス粒子を生成し、無ヘルパーウイルス系を使用して、ＬＡＭＰ－２Ｂ発現カセットの側面に位置するＡＡＶ２ ＩＴＲを有する、血清型９カプシドタンパク質及びウイルスゲノムを含む組換えＡＡＶ粒子を生成させた。発現カセットは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサ（ＣＭＶ ＩＥ）、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモータ、及びＣＢＡイントロンスプライスドナーを含む上流キメラ「ＣＡＧ」プロモータによって駆動されるヒトコドン最適化ＬＡＭＰ－２Ｂコーディング配列（ｖ１．２又はｖ１．０）を含む（図１Ａ）。発現カセットはまた、下流ＷＰＲＥ要素を含み、ウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ＲＧｐＡ）で終わる。ＨＥＫ２９３細胞をＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２プラスミドベクター又はＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０プラスミドベクター、ｐＡＡＶ２／９パッケージングプラスミド、及びｐＡｄ－ヘルパーアデノウイルスヘルパープラスミドで一時的にトランスフェクトした。

ＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞を２４ウェルプレート中、１．２×１０^５細胞／ｍＬで１０％ＦＢＳ及び１％Ｎｏｒｍｏｃｉｎを含むＭＥＭ－α中に播種した。翌日、ＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞を、ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０、ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２、又はＬＡＭＰ－２Ｂ導入遺伝子の代わりにＧＦＰを有する同じベクターのいずれかを有する無血清ＭＥＭα培地中で形質導入した（ＭＯＩ ３×１０^５）。形質導入後７日に、溶解物を、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓキット（Ｓｉｇｍａ）を使用して収集し、全タンパク質を、製造業者の指示どおりにＭｉｃｒｏＢＣＡキットを使用して定量化した。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上に移し、ＬＡＭＰ－２Ｂ（１：５００）及びＧＡＰＤＨ（１：１０，０００）について免疫ブロッティングした。ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２で形質導入したＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞は、元のＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０で形質導入したＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞と比較して増加した発現を示した（図７Ａ）。ＬＡＭＰ－２Ｂは、ＡＡＶ９－ＧＦＰベクター単独で形質導入した細胞では検出されなかった（図７Ａ）。

ＬＡＭＰ－２Ｂ発現をまた、細胞溶解物中でＥＬＩＳＡにより定量した。簡単に言うと、９６ウェルプレートを抗ＬＡＭＰ－２Ｂ抗体（クローン：Ｈ４Ｂ４）でコーティングし、溶解物をウェルに添加し、抗ＬＡＭＰ－２Ｂポリクローナル抗体（１：５００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＰＡ；５－２４５７５）を使用して検出を実施し、続いてＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ抗体（１：３０００、Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベーションした。ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターでの形質導入の結果、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０で形質導入した細胞と比較して、ＬＡＭＰ－２Ｂ発現が約７倍増加した（図７Ｂ）。

心筋細胞は、ダノン病にかかっている個体から生成されたｉＰＳＣ由来であった。律動収縮及び純度についての選択後、ダノン病心筋細胞を、ＡＡＶ９－Ｌｕｃ（陰性対照）、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０又はＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２の様々なウイルスゲノムコピー（ｖｇ）で形質導入した。形質導入後１０日に、形質導入した心筋細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、透過処理し、３０分間５％無ＩｇＧ ＢＳＡ中でブロックし、マウス抗ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ抗体（１：２５、クローン：Ｈ４Ｂ４）又はウサギ抗α－アクチニン抗体（１：２００、＃Ａ７８１１、Ｓｉｇｍａ）のいずれかと共に1時間インキュベートした。細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄して残存する非結合一次抗体を除去し、適切な抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ標識二次抗体及び２００ｎｇ／ｍＬのＤＡＰＩに６０分間室温で供した。次にウェルを撮像前にＰＢＳで洗浄した。ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ発現は、最高の力価（８．４５×１０^１０ｖｇ／ウェル）のＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０で形質導入した心筋細胞と比較して、低力価（１．５６×１０^８ｖｇ／ウェル）ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターで形質導入した心筋細胞においてより高いレベルで発現された（図８Ａ及び図８Ｂ）。

ウェスタンブロット分析を形質導入したダノン病心筋細胞で実施した。０．９８３×１０^９ｖｇ／ウェルのＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２は、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭ２Ｂ．ｖ１．０（１．３４７×１０^９ｖｇ／ウェル）又はＡＡＶ９－Ｌｕｃ（１．１６７×１０^９ｖｇ／ウェル）ベクターのいずれかで形質導入した細胞においてＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が検出されないのに対して、有意なＬＡＭＰ－２Ｂの発現タンパク質を示した（図８Ｃ）。まとめると、これらの結果は、最適化ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターが、元のＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０ベクターよりも有意に高いレベルでダノン病心筋細胞においてヒトＬＡＭＰ－２Ｂ発現を媒介することを示す。

実施例４：ダノン病のマウスモデルにおけるＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２のインビボ評価
ＬＡＭＰ－２欠損マウスに、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの、元のヒトＬＡＭＰ－２Ｂ（ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０）、最適化ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ（ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２、コドン変異体１－配列番号３）又はビヒクル単独を含むＡＡＶ９ウイルスベクターを静脈内注射した。治療後６週に、マウスを処分し、ＬＡＭＰ－２Ｂ発現について分析するために心筋組織を収集した。

方法
ベクターコピー数の定量分析のために、ＤＮＡ全体を、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ及び組織キットを製造業者のガイドラインにしたがって使用して凍結組織から単離した。ＤＮＡ濃度及び完全性を分光光度法により評価した。ｑＰＣＲを実施して、ＷＰＲＥ遺伝子についてＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、
順：

及び、逆：

プライマー、並びにプローブ：

を使用してＤＮＡ１μｇあたりのウイルスゲノムコピーを計算した。ＲＮａｓｅ Ｐを内在性対照（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、＃４４０３３２８）として使用した。ウイルス産生のために使用したベクターゲノム（ＷＰＲＥ）を含む直線化プラスミドを使用して標準曲線を作成した。サンプル当たりのＤＮＡの定量化を、ＴａｑＭａｎコピー数基準アッセイを使用して計算し、二倍体核あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ／二倍体核）として表した。

ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキットを製造業者のプロトコルにしたがって使用してＲＮＡを心臓から抽出し精製した。ＲＮＡ濃度及び完全性を分光光度法により評価した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用してＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを定量リアルタイム（ｑＲＴ）－ＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ＷＰＲＥ遺伝子についてＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐマスターミックスと、
順：

及び、逆：

プライマー、並びにプローブ：

を使用してｃＤＮＡに関してｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。

タンパク質抽出のために、組織を瞬間凍結し、粉砕し、その後の組織粉末を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテルを含むタンパク質溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＮＰ－４０、０．２％ＳＤＳ）中で消化した。部分的タンパク質溶解物をガラス繊維グラインダーに通し、氷上、１０秒間隔で５秒の３バーストで、３０振幅ミクロンパワーにて超音波処理した。サンプルを１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、次いで上清を収集した。サンプル中のタンパク質の濃度を、Ｌｏｗｒｙアッセイにより決定した。タンパク質（２０μｇ／サンプル）を、１０～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分離し、急速ドライ転写技術によりＰＶＤＦ膜に移した。次に、膜を５％乳（０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中に可溶化した脱脂粉乳）中で１時間ブロックし、抗ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ（１：１００、Ｈ４Ｂ４）、抗マウスＬＡＭＰ－２Ｂ（１：１００）又は抗ＧＡＰＤＨ（１：１０００、＃３２２３３、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体と共に一晩４℃にてインキュベートした。膜を洗浄し、次いで適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：１０，０００）と共に１時間室温にてインキュベートした。ブロットを、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ（商標）Ｓｉｒｉｕｓ基質を用いて展開させ、続いてＢｉｏＲａｄゲル撮像装置で撮像した。

免疫蛍光分析のために、組織は、３０％スクロース／ＰＢＳ中４℃で凍結保護し、最適切削温度（ＯＣＴ）封入剤中に包埋し、次いで、組織を標準的クリオトームで８～１０μｍの厚さに切断した。低温切開片を次に４％ＰＦＡで５分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで５分間透過処理し、１％ＢＳＡ、３％血清、１％ＰＢＳ中冷水フィッシュゼラチンで３０分間ブロックした。セクションを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７及びウサギ抗ジストロフィン抗体に直接コンジュゲートしたマウス抗ヒトＬＡＭＰ－２Ｂ抗体（１：５０、Ｈ４Ｂ４）と共に一晩４℃にてインキュベートした。次に、スライドを、抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体及びＤＡＰＩ（１：２０００、＃Ｄ９５４２、Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間室温にてインキュベートした。スライドを次に、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用して撮像した。スキャン速度、オフセット、電圧及びゲインは、所与の日のすべての画像を得る間、一定に保った。

結果
定量ＰＣＲをＡＡＶ９で処置されたＬＡＭＰ－２欠損マウスの心臓組織に関して実施した。同様のウイルスコピー数が野生型及び最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ含有ベクターで処置されたマウスの心臓組織において観察されたが（図９Ａ）、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２の転写は、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０と比較してほぼ７倍増加した（図９Ｂ）。心臓組織におけるｖ１．０及びｖ１．２ウイルスベクターの同様の形質導入にかかわらず、ヒトＬＡＭＰ－２ＢｍＲＮＡ発現の誘導は、ｖ１．２を用いて有意に増強された。

ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターを静脈内注射したＬＡＭＰ－２欠損マウスもまた、ＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０で処置したＬＡＭＰ２欠損マウス又はビヒクル対照と比較して、心臓組織において有意に高いレベルのヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質を示した（図９Ｃ）。同様の結果が、免疫蛍光染色で得られた：ヒトＬＡＭＰ－２Ｂは、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２で処置したＬＡＭＰ－２欠損マウスの心臓組織において高度に誘導された（図９Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターを使用したウイルス形質導入は、同じ用量のＡＡＶ９－野生型ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．０と比較して、インビボで心臓組織においてヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質の発現の増加をもたらすことを示す。

実施例４：ヒト以外の霊長類におけるＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２のインビボ評価
ヒト以外の霊長類に、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇの、実施例２に記載するコドン変異体ＬＡＭＰ－２Ｂ（ｖ１．２、コドン変異体１－配列番号３）を含むＡＡＶ９ウイルスベクター、又はビヒクル対照のいずれかを静脈内注射した。治療後８週間に、ヒト以外の霊長類を人道的に処分し、心臓、筋肉、肝臓及び脳組織をＬＡＭＰ－２Ｂ発現の分析のために収集した。

方法
ベクターコピー数の定量分析のために、凍結組織から、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキットを製造業者のガイドラインにしたがって使用して、ＤＮＡ全体を単離した。ＤＮＡ濃度及び完全性を分光光度法により評価した。単離されたＤＮＡに対する定量ＰＣＲを、ＷＰＲＥ遺伝子についてＴａｑＭａｎ ＵｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックスＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、
順：

及び、逆：

プライマー、並びにプローブ：

を使用して実施した。ＲＮａｓｅＰを内在性対照（＃４４０３３２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）として使用した。ウイルス産生のために使用したベクターゲノムを含む直線化プラスミドを使用して標準曲線を作成した。サンプルごとのＤＮＡの定量化を、ＴａｑＭａｎコピー数基準アッセイを使用して計算し、二倍体核あたりのベクターコピー数（ＶＣＮ／二倍体核）として表した。

ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して心臓及び骨格筋から抽出し精製し、またＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ 組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルにしたがって使用して肝臓及び脳から、抽出し精製した。ＲＮＡ濃度及び完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して評価した。ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して逆転写し、そしてｃＤＮＡを定量リアルタイム（ｑＲＴ）－ＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ ＵｎｉｖｅｒｓａｌマスターミックスＩＩと、
ＷＰＲＥ遺伝子の、順：

及び、逆：

プライマー、並びにプローブ：

を使用してｃＤＮＡに対して実施した。ヒトＨＰＲＴ－１を内在性対照として使用した。ウイルス産生のために使用したベクターゲノムを含む直線化プラスミドを使用して標準曲線を作成した。

ＲＮＡＳｃｏｐｅ技術を用いたｍＲＮＡの半定量分析のために、心臓組織を１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、薄片にした。導入遺伝子ｍＲＮＡを、ＷＰＲＥ－Ｏ３プローブ（＃５１８６２８、ＡＣＤ）とＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＬＳ ＲＥＤを使用して検出した。１より多いドットを有する細胞は陽性とみなし、陽性細胞のパーセンテージを５つのカテゴリー：０％、１～２５％、２６～５０％、５１～７５％又は１００％にビニングした。

ウェスタンブロット分析のために、１２５ｍｇの心臓組織を、Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔ系を用いて５００μＬの溶解緩衝液中で均質化した。タンパク質濃度を、ＢＣＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定し、タンパク質（５０μｇ／サンプル）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して分離し、次いで ニトロセルロース膜に移した。膜を次いで、マウス抗ヒトＬＡＭＰ２（１：１００）で調査し、洗浄し、次いでＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体とともにインキュベートした。ＥＣＬ基質及びＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰ系を使用してブロットを展開させた。

ＬＡＭＰ－２Ｂ ＥＬＩＳＡのために、タンパク質抽出を上記のように実施した。プレートをマウス抗ＬＡＭＰ２抗体（クローン：Ｈ４Ｂ４，＃ＮＢＰ２－２２２１７，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）でコーティングし、１００μｇの組織溶解物を各ウェルに添加し、抗ＬＡＭＰ２ポリクローナル抗体（＃ＡＦ６２２８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して検出を実施し、続いてＨＲＰコンジュゲートロバ抗ヤギ抗体（＃ＡＰ１８０Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共にインキュベーションした。

結果
定量ＰＣＲをＡＡＶ９処置霊長類の様々な組織に関して実施した。ウイルスコピー数は、ビヒクル対照と比較して、ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターを１×１０^１３ｖｇ／ｋｇで注射した霊長類の心臓、筋肉及び肝臓組織で増加した（図１０Ａ）。ベクターゲノムは、左及び右心室並びに左及び右心房を含む、調べたすべての心室で検出された（図１０Ｂ）。ベクターｍＲＮＡは、未処置ビヒクル対照と比較して、処置された霊長類の心臓、骨格筋及び肝臓組織において有意なレベルで検出された（図１０Ｃ及び図１０Ｄ）。インサイチュＲＮＡ分析は、心臓及び肝臓組織の約２５～７５％がベクターｍＲＮＡを発現することを示した（図１０Ｅ及び図１０Ｆ）。これらのデータは、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９最適化ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２を霊長類に全身投与すると、インビボで心臓組織において効率的な形質導入及び発現が得られることを示す。

ウェスタンブロット分析は、１×１０^１３ｖｇ／ｋｇのＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２で全身処置した霊長類は、未処置対照と比較して、心臓の左及び右心室並びに左心房において増加したヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質を示すことを示した（図１０Ｇ及び図１０Ｈ）。ＥＬＩＳＡはまた、ヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が、未処置対照と比較して、ＡＡＶ９－ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２ベクターで処置した霊長類の心臓の左心室及び心房、並びに骨格筋組織で増加することも示した（図１０Ｉ及び図１０Ｊ）。ＡＡＶ９．ＬＡＭＰ－２Ｂ．ｖ１．２を用いたベクター形質導入によって、インビボでの霊長類の心臓組織においてヒトＬＡＭＰ－２Ｂタンパク質が発現される。

Claims (19)

1. リソソーム関連膜タンパク質2（ＬＡＭＰ－2）のアイソフォーム又はその機能的変異体をコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含む遺伝子療法ベクターであって、前記導入遺伝子が配列番号3～5から選択される配列を含む、遺伝子療法ベクター。
2. 前記導入遺伝子が、
   （a）ヒト宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている、
   （b）配列番号2よりも少ないＣｐＧ部位を含む、
   （c）配列番号2よりも少ないクリプティックスプライス部位を含む、かつ／又は
   （d）配列番号2よりも少ない代替オープンリーディングフレームを含む、
   請求項1に記載の遺伝子療法ベクター。
3. 前記発現カセットが、配列番号6を含むコンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、配列番号7を含む完全長ポリＡ配列、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1～2のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクター。
4. 前記発現カセットが、5’から3’の方向で、第一の逆方向末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、イントロン、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、前記導入遺伝子、完全長ポリＡ配列を含む3’未翻訳領域、及び第二の逆方向末端反復を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクター。
5. 前記エンハンサ／プロモータ領域が、5’から3’の方向で、ＣＭＶ ＩＥエンハンサとニワトリβアクチンプロモータとを含み、任意選択的に、前記エンハンサ／プロモータ領域が、ニワトリβアクチン遺伝子の第一エクソン及び第一イントロンと、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプタとをさらに含む、請求項4に記載の遺伝子療法ベクター。
6. 前記発現カセットが、配列番号8～10から選択される配列に対して少なくとも95％の同一性を共有するか、又は配列番号8～10から選択される配列と同一である、請求項1～5のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクター。
7. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、任意選択的にＡＡＶ９ベクター又はＡＡＶｒｈ．７４ベクターである、請求項1～6のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクター。
8. 請求項1～7のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクターを含む、医薬組成物。
9. それを必要とする対象においてダノン病又は別のオートファジー障害を治療又は防止するための、請求項1～7のいずれか一項に記載の遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物であって、任意選択的に、静脈内、動脈内、心臓内、冠動脈内、心筋内、腎内、尿道内、硬膜外、及び筋肉内から選択される経路を介して投与される、医薬組成物。
10. 前記オートファジー障害が、末期心不全、心筋梗塞、薬物中毒、糖尿病、末期腎不全、及び老化から選択される、請求項9に記載の医薬組成物。
11. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、対象においてＬＡＭＰ－2Ｂを発現するための医薬組成物であって、
    前記ＡＡＶベクターが前記対象に対して全身投与されることを特徴とし、
    前記ＡＡＶベクターが、リソソーム関連膜タンパク質2（ＬＡＭＰ－2）のアイソフォームをコードする導入遺伝子を含む発現カセットを含み、
    前記導入遺伝子が配列番号3を含み、
    前記導入遺伝子が、エンハンサ／プロモータ領域に機能的に連結され、かつ
    前記ＡＡＶベクターを前記対象に対して全身投与すると、前記ＡＡＶベクターの投与前のＬＡＭＰ－2Ｂの発現又は未処置の対照対象におけるＬＡＭＰ－2Ｂの発現と比較して、ＬＡＭＰ－2Ｂの発現が増加する、医薬組成物。
12. 前記ベクターが、静脈内投与を介して投与され、任意選択的に、
    （a）前記ベクターが、前記対象の全体重1キログラム（ｖｇ）あたり、約1×10¹²～5×10¹⁴ベクターゲノム（ｖｇ）の前記ベクター（ｖｇ／ｋｇ）の用量で投与される、
    （b）前記ベクターが、約1×10¹³～5×10¹⁴ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、
    （c）前記ベクターが、約5×10¹³～3×10¹⁴ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、又は
    （d）前記ベクターが、約5×10¹³～1×10¹⁴ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、
    請求項9～11のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記対象がヒトであり、任意選択的に、
    （a）前記対象がダノン病若しくは別のオートファジー障害の症状を示している、
    （b）前記対象が、減少しているか若しくは検出不能なＬＡＭＰ－2発現を有するとして同定されている、かつ／又は
    （c）前記対象が変異ＬＡＭＰ－2遺伝子を有するとして同定されている、
    請求項9～12のいずれか一項に記載の医薬組成物。
14. 前記医薬組成物の投与により、
    （a）未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／若しくはＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が増加する、
    （b）未処置の対象と比較して、心臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／若しくはＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、少なくとも約1．2倍、少なくとも約1．3倍、少なくとも約1．4倍、少なくとも約1．5倍、少なくとも約1．6倍、少なくとも約1．7倍、少なくとも約1．8倍、少なくとも約1．9倍、少なくとも約2．0倍、少なくとも約2．2倍、少なくとも約2．3倍、少なくとも約2．4倍、少なくとも約2．5倍、少なくとも約3倍、若しくは少なくとも約4倍増加する、かつ／又は
    （c）未処置の対象の肝臓における発現と比較して、肝臓におけるＬＡＭＰ－2Ｂポリヌクレオチド及び／若しくはＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質の発現が、最大で約1．1倍、最大で約1．2倍、最大で約1．3倍、最大で約1．4倍、若しくは最大で約1．5倍増加する、
    請求項9～13のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 前記発現カセットが、
    （a）5’から3’の方向で、ＣＭＶ ＩＥエンハンサとニワトリβアクチンプロモータとを含み、任意選択的に、ニワトリβアクチン遺伝子の第一エクソン及び第一イントロンと、ウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプタとをさらに含む、エンハンサ／プロモータ領域を含む、
    （b）配列番号6を含むＫｏｚａｋ配列を含む、
    （c）配列番号7を含む完全長ポリＡ配列を含む、
    （d）5’から3’の方向で、機能的に連結された、第一の逆方向末端反復、エンハンサ／プロモータ領域、イントロン、コンセンサス最適化Ｋｏｚａｋ配列、前記導入遺伝子、完全長ポリＡ配列を含む3’未翻訳領域、及び第二の逆方向末端反復を含み、前記発現カセットが、前記導入遺伝子の開始コドンに対して5’の開始コドンを含まない、
    請求項9～14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
16. リソソーム関連膜タンパク質2（ＬＡＭＰ－2）のアイソフォーム又はその機能的変異体をコードするポリヌクレオチドであって、
    （a）配列番号3～5のいずれか一つ、又は
    （b）配列番号3
    を含むポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
17. 請求項16に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
18. （a）配列番号22に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有するエンハンサ／プロモータ領域、
    （b）配列番号23～26から選択される配列に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有するエンハンサ／プロモータ領域、
    （c）配列番号27に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有する3’ＵＴＲ、
    （d）配列番号7に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有するポリアデニル化配列、
    （e）5’から3’の順で：
    （i）配列番号22に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有する、エンハンサ／プロモータ領域；
    （ii）配列番号3を含む、ＬＡＭＰ－2Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；
    （iii）配列番号27に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有する、3’ＵＴＲ；及び
    （iv）配列番号7に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、若しくは100％の同一性を共有する、ポリアデニル化配列
    を含む、請求項17に記載の発現カセット。
19. （ｉ）配列番号11に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する5’ＩＴＲと、
    （ｉｉ）配列番号12に対して少なくとも90％の同一性、95％の同一性、又は100％の同一性を共有する3’ＩＴＲと、
    に隣接している請求項17又は18に記載の発現カセットを含む、ＡＡＶベクターであって、任意選択的にＡＡＶ９カプシド又はＡＡＶｒｈ．７４カプシドを含み、任意選択的に、前記ＡＡＶ9カプシドが、配列番号27のアミノ酸1～736、配列番号27のアミノ酸138～736、及び／又は配列番号27のアミノ酸203～736に対して少なくとも95％の同一性を共有する、ＡＡＶベクター。

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