JP7531865B2 - 新規のアッカーマンシア・ムシニフィラａｋ３２菌株の発見および腸損傷の予防または治療のための応用 - Google Patents

新規のアッカーマンシア・ムシニフィラａｋ３２菌株の発見および腸損傷の予防または治療のための応用 Download PDF

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Description

KCTC KCTC 14172BP
本発明は、新規のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株およびこれを含む腸損傷の予防または治療用組成物などに関する。
本出願は、２０２０年０５月１１日に出願された韓国特許出願第１０－２０２０－００５６０３４号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示された全ての内容は本出願に援用される。
炎症性腸疾患は、特発性疾患であり、消化器官に慢性および再発性炎症と腸粘膜の組織に損傷が誘発される疾患である。
通常、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＤ）と潰瘍性大腸炎（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ，ＵＣ）を炎症性腸疾患と命名し、その原因は、明確に明らかにされていないが、遺伝的所見、免疫と環境的要因および一部微生物（病原菌）により発病すると提示されている。
より具体的には、障壁の免疫機能異常または腸内環境的抗原の侵入による炎症性サイトカインの増加と病原菌の感染などによる腸内細菌叢の腸内不均衡（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）が主要な原因として提示されている。特に腸内細菌の多様性が低下し、特定の共生細菌であるプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）中、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の過剰増殖および付着、および侵襲性大腸菌（ＡＩＥＣ）とマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のような特定病原菌の感染によって腸内不均衡が引き起こされると知られている。
一方、乳酸菌の抗菌効果および体内免疫調節作用を通した炎症性疾患の緩和効果が確認され、乳酸菌を用いた大腸炎の予防または症状を改善しようとする研究が行われた。
特にプロバイオティクス乳酸菌は、病原性細菌の腸内付着を防止し、乳酸、バクテリオシンのような自体抗菌物質を生産して病原性細菌の侵入を防ぐ。このような病原性微生物により腸内不均衡（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）が生じた腸内菌叢を調節して、宿主の特定器官に影響を与えることができ、腸内菌叢と腸粘膜間の相互作用に影響を与えることができる。また、腸粘膜付着能と粘液質分泌量、ムチン（ｍｕｃｉｎ）のような防御物質の生成および腸粘膜の密着結合保全（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を増加させて、腸粘膜の機能を改善させることができる。
ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）、サッカロマイセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ１９１７および複合乳酸菌製品ＶＳＬ＃３が、最も普遍的に炎症性腸疾患の治療に使用されている。特にプロバイオティクスの炎症性腸疾患に対する効果は、外科手術を終えた潰瘍性大腸炎患者の嚢炎治療で最も優れていた。
しかしながら、このようなプロバイオティクス微生物の潜在的効果にもかかわらず、まだプロバイオティクスの作用機序が明確に明らかにされておらず、さらなる研究結果が求められている。
本発明が達成しようとする技術的課題は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株を提供することにあり、本発明者らは、本発明の新規のＡＫ３２菌株が小腸陰窩（ｃｒｙｐｔ）の高さおよび杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ ｃｅｌｌ）の数を増加させるだけでなく、小腸上皮細胞の増殖と分化に関連した遺伝子発現を促進させ、小腸組織の再生および成長に効果的であることを確認した。
これより、本発明の目的は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸損傷の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸損傷の予防または改善用食品組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸機能改善用食品組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含むプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む整腸用組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む生菌剤組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む食品添加用組成物を提供することにある。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当該技術分野における通常の技術者が明確に理解することができる。
前記課題を解決するために、また、本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸損傷の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸損傷の予防または改善用食品組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸機能改善用食品組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含むプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む整腸用組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む生菌剤組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む食品添加用組成物を提供する。
本発明の一実施例において、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２は、腸損傷を予防または改善することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の他の実施例において、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２は、配列番号３からなるアミノ酸配列を含むＭＭＤ（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ／ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ）酵素を生産することができるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の実施例において、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２は、腸上皮細胞の増殖を促進することができるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の実施例において、前記腸損傷は、放射線照射による腸損傷、薬物による腸損傷、アルコール性腸損傷および炎症性腸疾患による腸損傷からなる群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の実施例において、前記炎症性腸疾患は、十二指腸潰瘍、腸閉塞症、急性消化管出血、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ）、腸管型ベーチェット病、回腸嚢炎（ｐｏｕｃｈｉｔｉｓ）、過敏性大腸症候群、および潰瘍性大腸炎からなる群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含む組成物を個体に投与する段階を含む腸損傷の予防、改善または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含む組成物の腸損傷の予防、改善または治療用途を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液の腸損傷に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株は、小腸陰窩の高さおよび杯細胞の数を増加させるだけでなく、小腸上皮細胞の増殖に関連した遺伝子発現を促進させ、小腸組織および小腸オルガノイドの再生および成長に効果があるので、これを用いた食品、薬学的、整腸用、生菌剤、プロバイオティクスなどの製造に効果的である。
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＢＡＡ－８３５または便から採集したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ菌株ＡＫ１４、ＡＫ２１またはＡＫ３２の培養上清液で処理された小腸オルガノイドの明視野像および表面積を示す図である。ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝５０μｍ。 Ｇｐｒ４１／Ｇｐｒ４３拮抗剤の存在または不存在下に培養上清液で処理された小腸オルガノイドの明視野像および表面積を示す図である。ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝５０μｍ。 ＰＤＨ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）Ｅ１ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔおよびＭＭＤ（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ／ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ）のｍＲＮＡ発現レベルを測定した結果を示す図である。 Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＢＡＡ－８３５またはＡＫ３２給餌マウスの小腸オルガノイドの明視野像および表面積を示す図である。ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝５０μｍ。 Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＢＡＡ－８３５またはＡＫ３２給餌マウスの小腸における杯細胞の数および陰窩の高さを示す図である。ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝１０μｍ。 ＡＫ３２菌株給餌マウスの小腸組織でＬｇｒ５、Ｌｙｚ１、Ｍｕｃ２、Ｗｎｔ３、Ａｘｉｎ２およびＣｔｎｎｂ１のｍＲＮＡレベルを測定した結果を示す図である。 ＡＫ３２菌株の全ゲノムマップを示す図である。 ＡＫ３２菌株とＢＡＡ－８３５菌株のＰＤＨアミノ酸配列を比較して示す図である。 ＡＫ３２菌株とＢＡＡ－８３５菌株のＭＭＤアミノ酸配列を比較して示す図である。 ＡＫ３２菌株とＢＡＡ－８３５菌株の菌培養液におけるＳＣＦＡを比較した結果を示す図である。 ＡＫ３２菌株とＢＡＡ－８３５菌株それぞれをマウスに４週間経口投与後、盲腸内容物でＳＣＦＡを比較した結果を示すものである。
本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株を提供する。
本発明者らは、前記新規の菌株をアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）と命名し、２０２０年０４月２０日付けで韓国生命工学研究院の生物資源センターに受託番号ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰで寄託した。
本発明の前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２は、腸損傷を予防または改善することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２は、配列番号３からなるアミノ酸配列を含むＭＭＤ（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ／ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ）酵素を生産することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２は、腸上皮細胞の増殖を促進することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施例では、本発明のＡＫ３２菌株が、従来の他の菌株と比較して、小腸オルガノイド増殖能に優れていることを確認した。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸損傷の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明において用語「培養」とは、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させるために行う全ての行為を意味し、本発明では、「発酵」を含む概念である。
前記「アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２」の菌体は、培養培地から収得した生菌それ自体だけでなく、当業者に知られた乳酸菌に対する任意の加工形態を含むものであり、例えば、菌体破砕物、乾燥物、凍結物などを含み、これに限定されない。また、前記用語「培養液」とは、「発酵液」を含む意味であり、液体培地で培養した培養液自体、前記培養液をろ過または遠心分離して菌株を除去したろ液（遠心分離した上清液）などの培養液自体から派生する加工物を含む。
本発明において、前記腸損傷は、放射線照射による腸損傷、薬物による腸損傷、アルコール性腸損傷および炎症性腸疾患による腸損傷からなる群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、放射線は、細胞内の水と反応して活性酸素を生成し、これによって誘発された毒性が細胞および組織に影響を与え、炎症反応を引き起こす。正常組織が放射線に露出すると、正常組織内に存在する放射線感受性の高い細胞、特に血管細胞および免疫細胞が影響を受ける。この血管細胞と免疫細胞は、炎症反応に関与する代表的な細胞である。したがって、放射線によって現れる副作用の中で最も高い頻度を占めるものが、腸炎症、例えば、腸炎、肺炎のような炎症反応である。本発明によれば、前記腸損傷は、急性消化管症候群（ａｃｕｔｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＧＩＳ）である。
本発明において、前記炎症性腸疾患は、十二指腸潰瘍、腸閉塞症、急性消化管出血、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ）、腸管型ベーチェット病、回腸嚢炎（ｐｏｕｃｈｉｔｉｓ）、過敏性大腸症候群、および潰瘍性大腸炎からなる群から選ばれた１つ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、腸機能の改善は、例えば、腸内菌叢を改善すること；腸内有益菌の増殖を促進すること；腸内短鎖脂肪酸の含有量を増加させること；有害菌の増殖を抑制すること；または腸内上皮細胞の増殖を誘導することからなる群から選ばれた１つ以上の効果が現れるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物内の前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液の含有量は、疾患の症状、症状の進行程度、患者の状態などによって適切に調節可能であり、例えば、全体組成物の重量を基準として０．０００１～９９．９重量％、または０．００１～５０重量％であってもよいが、これに限定されるものではない。前記含有量比は、溶媒を除去した乾燥量を基準とした値である。
本発明による薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含んでもよい。前記賦形剤は、例えば、希釈剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、吸着剤、保湿剤、フィルム－コーティング物質、および制御放出添加剤からなる群から選ばれた１つ以上であってもよい。
本発明による薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤、液剤、点眼剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁液剤、酒精剤、トローチ剤、芳香水剤、リモナーデ剤、錠剤、徐放性錠剤、腸溶性錠剤、舌下錠、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、丸剤、チンキ剤、軟エキス剤、乾燥エキス剤、流動エキス剤、注射剤、カプセル剤、灌流液、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、噴霧剤、吸入剤、パッチ剤、滅菌注射溶液、またはエアロゾルなどの外用剤などの形態で剤形化して使用でき、前記外用剤は、クリーム、ゲル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤などの剤形を有していてもよい。
本発明による薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。
製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
本発明による錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤の添加剤としてトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、小麦デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、果糖、 Ｄ－マンニトール、沈降炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、リン酸一水素カルシウム、硫酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、精製ラノリン、微結晶セルロース、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カオリン、尿素、コロイド状シリカゲル、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）１９２８、ＨＰＭＣ２２０８、ＨＰＭＣ２９０６、ＨＰＭＣ２９１０、プロピレングリコール、カゼイン、乳酸カルシウム、プリモジェルなど賦形剤；ゼラチン、アラビアガム、エタノール、寒天粉、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ブドウ糖、精製水、カゼインナトリウム、グリセリン、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、微結晶セルロース、デキストリン、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシメチルセルロース、精製セラック、デンプン糊、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの結合剤が使用でき、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トウモロコシデンプン、寒天粉、メチルセルロース、ベントナイト、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、無水ケイ酸、1－ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、イオン交換樹脂、酢酸ポリビニル、ホルムアルデヒド処理カゼインおよびゼラチン、アルギン酸、アミロース、グアーガム（Ｇｕａｒ ｇｕｍ）、重曹、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、ゲル化デンプン、アラビアガム、アミロベクチン、ペクチン、ポリリン酸ナトリウム、エチルセルロース、白糖、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、Ｄ－ソルビトール液、硬質無水ケイ酸など崩解剤；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、水素化植物油（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌ）、タルク、石松子、カオリン、ワセリン、ステアリン酸ナトリウム、カカオ脂、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸マグネシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００、ＰＥＧ６０００、流動パラフィン、水素添加大豆油（Ｌｕｂｒｉ ｗａｘ）、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸亜鉛、ラウリル硫酸ナトリウム、酸化マグネシウム、マクロゴール（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、合成ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン油、パラフィン油、ポリエチレングリコール脂肪酸エーテル、デンプン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ＤＬ－ロイシン、硬質無水ケイ酸などの滑沢剤；が使用できる。
本発明による液剤の添加剤としては、水、希塩酸、希硫酸、クエン酸ナトリウム、モノステアリン酸スクロース類、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル類（ツインエステル）、ポリオキシエチレンモノアルキルエテール類、ラノリンエテール類、ラノリンエステル類、酢酸、塩酸、アンモニア水、炭酸アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、プロラミン、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが使用できる。
本発明によるシロップ剤には、白糖の溶液、他の糖類あるいは甘味剤などが使用でき、必要に応じて芳香剤、着色剤、保存剤、安定剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤などが使用できる。
本発明による乳剤には、精製水が使用でき、必要に応じて乳化剤、保存剤、安定剤、芳香剤などが使用できる。
本発明による懸濁剤には、アカシア、トラガカンタ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ＨＰＭＣ１８２８、ＨＰＭＣ２９０６、ＨＰＭＣ２９１０など懸濁化剤が使用でき、必要に応じて界面活性剤、保存剤、安定剤、着色剤、芳香剤が使用できる。
本発明による注射剤には、注射用蒸留水、０．９％塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース＋塩化ナトリウム注射液、ピイジー（ＰＥＧ）、乳酸リンゲル注射液、エタノール、プロピレングリコール、非揮発性油－ゴマ油、綿実油、落花生油、ダイズ油、とうもろこし油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンゼンのような溶剤；安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、尿素、ウレタン、モノエチルアセトアミド、ブタゾリジン、プロピレングリコール、ツイン類、ニコチン酸アミド、ヘキサミン、ジメチルアセトアミドのような溶解補助剤；弱酸およびその塩（酢酸と酢酸ナトリウム）、弱塩基およびその塩（アンモニアおよび酢酸アンモニウム）、有機化合物、タンパク質、アルブミン、ペプトン、ガム類のような緩衝剤；塩化ナトリウムのような 等張化剤；重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）二酸化炭素ガス、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、窒素ガス（Ｎ２）、エチレンジアミンテトラ酢酸のような安定剤；ソジウムビサルファイト０．１％、ソジウムホルムアルデヒドスルホキシレート、チオウレア、エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム、アセトンソジウムビサルファイトのような抗酸化剤；ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩酸プロカイン、ブドウ糖、グルコン酸カルシウムのような無痛化剤；ＣＭＣナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ツイン８０、モノステアリン酸アルミニウムのような懸濁化剤を含んでもよい。
本発明による坐剤には、カカオ脂、ラノリン、ウイテプゾール、ポリエチレングリコール、グリセロゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸とオレイン酸の混合物、スバナル（Ｓｕｂａｎａｌ）、綿実油、落花生油、ヤシ油、カカオバター＋コレステロール、レシチン、ラネットワックス、モノステアリン酸グリセロール、ツインまたはスパン、イムハウゼン（Ｉｍｈａｕｓｅｎ）、モノレン（モノステアリン酸プロピレングリコール）、グリセリン、アデプスソリダス（Ａｄｅｐｓ ｓｏｌｉｄｕｓ）、ブチラムテゴ－Ｇ（Ｂｕｙｔｙｒｕｍ Ｔｅｇｏ－Ｇ）、セベスファーマ１６（Ｃｅｂｅｓ Ｐｈａｒｍａ １６）、ヘキサライドベース９５、コトマー（Ｃｏｔｏｍａｒ）、ヒドロコテＳＰ、Ｓ－７０－ＸＸＡ、Ｓ－７０－ＸＸ７５（Ｓ－７０－ＸＸ９５）、ヒドロコテ（Ｈｙｄｒｏｋｏｔｅ）２５、ヒドロコテ７１１、イドロポスタル（Ｉｄｒｏｐｏｓｔａｌ）、マッサエストラリウム（Ｍａｓｓａ ｅｓｔｒａｒｉｕｍ、Ａ、ＡＳ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｔ）、マッサ－ＭＦ、マスポル、マスポル－１５、ネオスポスタル－エン、パラマウンド－Ｂ、スポシール（ＯＳＩ、ＯＳＩＸ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｌ）、坐剤基剤ＩＶタイプ（ＡＢ、Ｂ、Ａ、ＢＣ、ＢＢＧ、Ｅ、ＢＧＦ、Ｃ、Ｄ、２９９）、スポスタル（Ｎ、Ｅｓ）、ウェコビー（Ｗ、Ｒ、Ｓ、Ｍ、Ｆｓ）、テゲスタートリグリセライド基剤（ＴＧ－９５、ＭＡ、５７）のような基剤が使用できる。
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与される。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、 薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定できる。
本発明による組成物は、個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与することができ、単一または多重投与されうる。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、本発明の属する技術分野における当業者により容易に決定することができる。
本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与されうる。投与の全ての方式は、予想可能であるが、例えば、経口服用、皮下注射、腹腔投与、静脈注射、筋肉注射、脊髄周囲空間（硬膜内）注射、舌下投与、頬粘膜投与、直腸内挿入、膣内挿入、眼内投与、耳への投与、鼻腔投与、吸入、口または鼻を通した噴霧、皮膚投与、経皮投与などにより投与されうる。
本発明の薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重および疾患の重症度などの様々な関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。
本発明において「個体」とは、疾患の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの哺乳類であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
本発明において「予防」とは、目的とする疾患の発病を抑制したり遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により目的とする疾患とそれによる代謝異常症状が好転したり有益に変更される全ての行為を意味し、「改善」とは、本発明による組成物の投与により目的とする疾患に関連したパラメーター、例えば、症状の程度を減少させる全ての行為を意味する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸損傷の予防または改善用食品組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む腸機能改善用食品組成物を提供する。
本発明の前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を食品添加物として使用する場合、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液をそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用でき、通常の方法によって適切に使用できる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）によって好適に決定することができる。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液は、原料に対して１５重量％以下、または１０重量％以下の量で添加することができる。しかしながら、健康および衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合、前記量は、前記範囲以下であってもよく、安全性の観点から何らの問題もないので、有効成分は、前記範囲以上の量でも使用できる。
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味における健康機能食品を全部含む。
本発明による健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖および果糖のようなモノサッカライド、マルトースおよびスクロースのようなジサッカライド、デキストリンおよびシクロデキストリンのようなポリサッカライド、およびキシリトール、ソルビトールおよびエリトリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、ソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用できる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍＬ当たり一般的に約０．０１～０．２０ｇ、または約０．０４～０．１０ｇである。
上記以外に、本発明の組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用できる。このような添加剤の割合は、大きく重要なことではないが、本発明の組成物１００重量部当たり０．０１～０．２０重量部の範囲で選択されることが一般的である。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含むプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む整腸用組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む生菌剤組成物を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む食品添加用組成物を提供する。
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株は、生菌やプロバイオティクスであり、ヒトおよび動物の腸健康増進のための用途、すなわち、整腸用、生菌剤または食品添加用組成物に使用できる。前記組成物は、前記菌株自体、その破砕物および前記菌株培養物などを有効成分として含んでもよいし、賦形剤または担体をさらに含んでもよい。
前記組成物は、液体培地で培養した培養液自体、前記培養液をろ過または遠心分離して菌株を除去したろ液（遠心分離した上清液）などを含む。組成物内前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株の含有量は、組成物の用途および剤形によって変わることができる。本発明による整腸用または生菌剤組成物は、多様な剤形と方法で製造および投与することができる。例えば、アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２、その破砕物およびその培養物を薬剤学的分野において通常使用する担体および香料と混合して、錠剤（ｔａｂｌｅｔ）、トローチ（ｔｒｏｃｈｅ）、カプセル（ｃａｐｓｕｌｅ）、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、シロップ（ｓｙｒｕｐ）、散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、懸濁剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）または顆粒剤（ｇｒａｎｕｌｅ）などの形態で製造および投与することができる。
担体としては、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤などを使用できる。投与方式は、経口、非経口または塗布法を使用できるが、好ましくは、経口投与することが好ましい。また、投与用量は、体内で活性成分の吸収度、不活性率および排泄速度、被投与者の年齢、性別、状態などによって適切に選択することができる。また、本発明による飼料用組成物は、発酵飼料、配合飼料、ペレット形態およびサイレージ（ｓｉｌａｇｅ）などの形態で製造することができる。前記発酵飼料は、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株と様々な微生物菌または酵素を添加することによって、有機物を発酵させて製造することができ、前記配合飼料は、様々な種類の一般飼料と本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２を混合して製造することができる。ペレット形態の飼料は、前記発酵飼料または配合飼料をペレット形態に剤形化して製造することができ、サイレージは、青刈り飼料を本発明によるアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２で発酵させることによって製造することができる。
本発明による本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２またはその培養物は、キムチ、飲料、離乳食、発酵乳、パンなどの食品に対する食品添加剤に使用できる。また、本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２またはその培養物は、発酵製品の製造のためのスターター（ｓｔａｒｔｅｒ）として使用できる。前記発酵製品は、チーズ、キムチ、発酵生食製品などを含む。本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２またはその培養物を用いた発酵製品は、当業界において公知となった通常の方法により製造することができる。例えば、玄米と鳩麦などの穀類粉末に本発明によるアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２またはこれを含む２～３種の混合乳酸菌を処理して適正温度で発酵させた後、大豆、もち米、キビなどの多様な農産物を栄養的な均衡と優れた嗜好性を有する適切に配合して、発酵生食製品を製造することができる。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含む組成物を個体に投与する段階を含む腸損傷の予防、改善または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を含む組成物の腸損傷の予防、改善または治療用途を提供する。
また、本発明は、前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液の腸損傷に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明は、多様な変換を加えることができ、様々な実施例を有することができるところ、特定実施例を図面に例示し、詳細な説明に詳細に説明する。しかしながら、これは、本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想および技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに際して、関連した公知技術に関する具体的な説明が本発明の要旨を不明にすることができると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
実験例１．実験方法
実験例１－１．マウス準備
本発明の実施例で使用された全ての動物は、８～１０週齢の雌マウスであり、無菌食品と水を自由に摂食した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ（Ｋｏｒｅａ）から購入した。マウスは、アサン病院（Ｋｏｒｅａ）の動物施設に収容し、特定の病原体のない条件で飼育した。全ての動物実験は、Ａｓａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの機関動物管理および使用委員会（承認番号２０１９－１２－２５１）から承認を受けた。全ての実験は、関連指針および規定によって行われた。
実験例１－２．ヒトの便からＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ菌株の分離
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの新しい１１個の菌株を３２人の支援者健康人の便から分離した。便をＰＢＳで溶解し、ＧａｓＰａｋ １００システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して嫌気性条件下で３７℃でデキストロースが含まれていない０．４％ムチン添加ＢＨＩ寒天培地（ＫｉｓａｎＢｉｏ）に分注した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを単離し、プライマーセット５’－ＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣ－３’（配列番号１）および５’－ＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＴ－３’（配列番号２）を使用してＰＣＲで確認した。
実験例１－３．Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａの経口投与
Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔ）および新しく分離したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２菌株を０．４％ｍｕｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）が補充された脳心臓注入培地（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で培養し、３７℃でＧａｓＰａｋ１００システム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して嫌気性培養した。培養した培養物を濃縮させ、嫌気性ＰＢＳに懸濁させた後、経口用Ｚｏｎｄｅニードルで４週間毎日マウス（容量当たり８×１０８ＣＦＵ）に投与した。
実験例１－４．陰窩（ｃｒｙｐｔ）の分離
小腸（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ，ＳＩ）を縦方向に開放し、ＰＢＳで洗浄した。陰窩を分離するために、組織をＰＢＳ中の１ｍＭ ＥＤＴＡで４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、４℃でさらに１時間の間インキュベートするために、ＰＢＳで５ｍＭ ＥＤＴＡに移した。次に、サンプルをＰＢＳに懸濁させた後、７０μｍ細胞ストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）でろ過した。
実験例１－５．オルガノイド培養
オルガノイド培養のために、ウェル当たり２００～５００個の陰窩をＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に浮遊させた（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ）。
Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）、×１００ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ Ｎ－アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｂ２７補充剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎ２補充剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥＧＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｎｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ－１調節培地を含む完全ＥＮＲ培地（ノギンが補充されたＥＲ培地）で培養した。ＥＮＲ培地は、２～３日ごとに交替した。オルガノイドの表面積は、反転顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用してウェルでオルガノイドの任意の重ならない写真を撮ることによって顕微鏡で測定した。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）およびＺｅｎイメージプログラム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を使用して各写真を分析した。面積測定のためのオルガノイド周囲は、手動および自動化ＩｍａｇｅＪソフトウェアで測定した。
実験例１－６．組織学
小腸回腸を除去し、縦方向に開放した。次に、スイスロールにより組織を製造し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定させた後、パラフィンに包埋させた。組織セクションは、ヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）またはＰｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ－Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）で染色した。
実験例１－７．オルガノイドに対する盲腸（ｃｅｃｕｍ）内容物の処理
各１００ｍｇの盲腸内容物を１ｍｌの無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）培地に希釈し、１時間の間ボルテックスで回転させた。内容物を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培養する前に上清液を０．２２μｍ注射器フィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を通過させた。盲腸内容物の構成に対する効果を扱うために、高級ＤＭＥＭ／Ｆ１２で浮遊された盲腸内容物の０．０１％上清液でＥＮＲ培地を補充した。Ｇｐｒ４３拮抗剤（ＧＬＰＧ０９７４、０．１μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）およびＧｐｒ４１拮抗剤（βヒドロキシブチラート、３ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）を使用した。
実験例１－８．全ゲノムシーケンシング
アガロースゲル電気泳動を実行して、ｇＤＮＡの完全性を点検し、Ｑｕａｎｔ－ＩＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｇＤＮＡを定量化した。次に、配列ライブラリーは、ＰａｃＢｉｏ ＤＮＡテンプレート準備キット１．０を使用するＢｌｕｅＰｉｐｐｉｎ（登録商標）サイズ選択システムを使用した２０ｋｂテンプレート製剤の指針書によって製造した。ライブラリーは、Ｑｕａｎｔ－ＩＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用して定量化し、高感度ＤＮＡチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して検証した。次に、ライブラリーをＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩの８ウェル－ＳＭＡＲＴ ｃｅｌｌ ｖ３でＰａｃＢｉｏ Ｐ６Ｃ４ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用してシーケンシングした。ＡＫ３２のゲノムは、新しいＰａｃＢｉｏシーケンシングデータで構築された。次に、Ｃｈｕｎｌａｂ，Ｉｎｃ．でシーケンシング分析を行った。ＰａｃＢｉｏシーケンシングデータは、ＨＧＡＰ２プロトコル（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＰａｃＢｉｏ ＳＭＲＴ Ａｎａｌｙｓｉｓ ２．３．０で収集した。ＰａｃＢｉｏシーケンシングデータから得られた結果物は、サーキュレーター１．４．０（Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して円形化した。全ゲノムの遺伝子検索および機能注釈パイプライン（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）は、ＥｚｂｉｏＣｌｏｕｄゲノムデータベースを使用した。タンパク質コーディング配列は、Ｐｒｏｄｉｇａｌ ２．６．２によって予測された。ｔＲＮＡをコードする遺伝子をｔＲＮＡｓｃａｎ－ＳＥ １．３．１を使用して検索した。ｒｆａｍおよびその他非コーディングＲＮＡは、Ｒｆａｍ １２．０データベースで検索した。比較全ゲノムは、平均ヌクレオチド同一性塩基ＢＬＡＳＴ（ＡＮＩｂ）で研究した。ＡＮＩｂ値は、Ｋｏｓｔａｓ ｌａｂ（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｖｅ－ｏｍｉｃｓ．ｃｅ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ａｎｉ）のＡＮＩ計算機で計算した。
実験例１－９．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ
小腸およびオルガノイドからのトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出し、ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｃｒｉｐｔII逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して合成した。Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａのトータルＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出した。バクテリアＲＮＡを使用したｃＤＮＡ合成のために、ｇＤＮＡリムーバー（Ｔｏｙｏｂｏ）とＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用した。ｃＤＮＡは、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳＹＢＲグリーン化学（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して行われたＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲの鋳型として使用された。
使用したプライマーは、次の通りである：Ｍｕｃ２、５’－ＣＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＧＧＣＴＣＧＧＡＡ－３’（配列番号４）および５’－ＧＧＣＣＣＧＡＧＡＧＴＡＧＡＣＣＴＴＧＧ－３’（配列番号５）；Ｌｙｚ１、５’－ＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＡＡＡ－３’（配列番号６）および５’－ＧＣＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＣ－３’（配列番号７）；Ｗｎｔ３、５’－ＣＴＴＣＴＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＴ－３’（配列番号８）および５’－ＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＧＣ－３’（配列番号９）；Ａｘｉｎ２、５’－ＡＡＣＣＴＡＴＧＣＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣＴ－３’（配列番号１０）および５’－ＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＣＡ－３’（配列番号１１）；Ｃｔｎｎｂ１、５’－ＡＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣ－３’（配列番号１２）および５’－ＴＧＧＧＡＧＧＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣ－３’（配列番号１３）；Ｌｇｒ５、５’－ＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＡＧ－３’（配列番号１４）および５’－ＣＴＧＴＧＧＡＧＴＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡ－３’（配列番号１５）；β－ａｃｔｉｎ、５’－ＴＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＡＡＣ－３’（配列番号１６）および５’－ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣＧ－３’（配列番号１７）；ｐｄｈ、５’－ＡＡＣＣＧＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＧＧＣＡ－３’（配列番号１８）および５’－ＡＴＡＴＴＧＧＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡ－３’（配列番号１９）；ｍｍｄ、５’－ＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＴＣＡ－３’（配列番号２０）および５’－ＧＴＴＣＣＧＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＴＴＣＧ－３’（配列番号２１）；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ、５’－ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号２２）および５’－ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’（配列番号２３）；Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ １６Ｓ ｒＤＮＡ、５’－ＣＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣ－３’（配列番号２４）および５’－ＣＣＴＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＡＴ－３’（配列番号２５）。
実験例１－１０．ＳＣＦＡ（Ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）の定量的測定
代謝産物の分析のための全ての試薬および溶媒は、Ｓｉｇｍａから購入した。マウス盲腸内容物の場合、１０～２０ｍｇの盲腸内容物を４００μｌの内部標準溶液（１ｍＭのプロピオン酸（Ｃ３）－ｄ６、１００μＭの酪酸（Ｃ４）－ｄ７）で激烈に均質化させた。菌培養上清液の分析のために、１００μｌの培養上清液を２００μｌの内部標準溶液と混合した。遠心分離後、上清液をろ過除去した。ＡＡＢＤ－ＳＨ（２０μｌ、２０ｍＭ）、ＴＰＰ（Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、２０μｌ、２０ｍＭ）およびＤＰＤＳ（２，２－ｄｉｐｙｒｉｄｙｌ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ、２０μｌ）が含まれたジクロロメタンをろ液に添加した。ボルテックスしながら、前記溶液を室温で１０分間培養し、真空乾燥させた。サンプルを８０μＬメタノールで再構成し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を準備した。１２９０ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｑｔｒａｐ ５５００（ＡＢＳｃｉｅｘ）および逆相カラム（Ｐｕｒｓｕｉｔ ５ Ｃ１８ １５０×２．０ｍＭ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が装着されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムを使用した。各代謝産物に対する特定転移に該当する抽出されたイオンクロマトグラム（ＥＩＣ，Ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ）を定量に使用した。各ＥＩＣの曲線下面積は、内部標準のＥＩＣ面積で正規化した。それぞれの代謝産物：内部標準物のピーク面積比をサンプルでの血清体積または組織重量を使用して標準化した後、相対的比較のために使用した。
実験例１－１１．統計分析
統計分析は、プリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して行った。Ｐａｉｒｗｉｓｅおよび２個の独立的なグループの比較のためにｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔを使用した。データは、平均±ＳＥＭで提示し、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１は、統計的に有意なものと見なした。
実施例１．Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２菌株の分離および寄託
ＩＳＣ媒介上皮発達で一般的に使用される類型菌株（すなわち、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔ）よりさらに良いＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ菌株を発見するために、健康人の便からＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａを分離した。選択的培地および種特異的ＰＣＲを使用して、３個のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ菌株（ＡＫ１４、ＡＫ２１、ＡＫ３２）を収得した。
ＩＳＣ媒介上皮発達に対する単離したＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ菌株の効果を評価するために、それぞれの単離した菌株から収得した培養上清液の存在下で腸オルガノイドを使用するスクリーニングシステムを採択した。
図１ａに示されたように、３個の新しく分離した菌株のうち、ＡＫ３２の培養上清液のみが従来のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａまたは他のアイソタイプ菌株と比較して、オルガノイドのサイズが有意に増加することを確認した。
すなわち、分離した３個の菌株のうち、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２菌株を下記実施例によって最も優れた菌株として最終的に決定し、アッカーマンシア・ムシニフィラエイケイ３２（Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２，ＡＫ３２）と命名した（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）。
実施例２．Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２菌株の腸損傷の改善効果の確認
まず、ＡＫ３２により増加したＩＳＣ媒介上皮発達がＳＣＦＡに依存するか否かを確認するために、Ｇｐｒ４１／４３拮抗剤を採択した。
図１ｂに示されたように、Ｇｐｒ４１／４３拮抗剤を使用した群においてＡＫ３２の培養上清液により上向き調節された小腸オルガノイドのサイズが非常に減少した。
また、図１ｃに示されたように、従来のＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔ菌株と比較して、ＡＫ３２菌株でＳＣＦＡ分泌に影響を与える酵素ｐｄｈ（ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｅ１ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）およびｍｍｄ（Ｎａ＋ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ／ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）の発現が有意に高いことを確認した。
また、図１ｄに示されたように、生体内ＡＫ３２菌株の上向き調節機能をさらに確認するために、マウスに４週間ＡＫ３２または典型的なＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔを給餌した。
興味深いことに、従来のＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔ給餌マウスと比較して、ＡＫ３２菌株給餌マウスにおける小腸オルガノイドのサイズが非常に増加したことが分かった。
また、図１ｅに示されたように、ＡＫ３２給餌マウスは、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔと比較して、小腸で陰窩の高さおよび粘液生成杯細胞の数を増加させることが示された。
また、図１ｆに示されたように、ＡＫ３２給餌マウスは、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－８３５Ｔより小腸でＬｇｒ５、Ｌｙｚ１、Ｍｕｃ２、Ｗｎｔ３、Ａｘｉｎ２およびＣｔｎｎｂ１のｍＲＮＡ発現レベルを有意に増加させることが示された。
また、図２にＡＫ３２菌株の全ゲノムマップを示した。
また、図３ａおよび図３ｂにＡＫ３２菌株とＢＡＡ－８３５菌株のＰＤＨ（図３ａ）およびＭＭＤ（図３ｂ）のアミノ酸配列を比較したところ、ＭＭＤ配列が異なっていることが示された。
また、下記表１にＡＫ３２菌株とＢＡＡ－８３５菌株のゲノム機能情報（ｇｅｎｏｍｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を分析した結果を示した。
前記結果から、新しく発見されたＡＫ３２菌株がＩＳＣ媒介上皮発達の観点から、特徴的なゲノムを有し、従来のＡ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ菌株と比較して、その効果に優れていて、ｓｔｒａｉｎの中でもその効果が最も優れていることが分かった。
実施例３．Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２菌株のＳＣＦＡ分泌促進効果の確認
微生物由来代謝産物は、腸の恒常性を維持するための主な要因の１つであるから、Ａ．ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２およびＢＡＡ－８３５菌培養液におけるＳＣＦＡを比較し、マウスに４週間経口投与後、盲腸内容物でＳＣＦＡの量を比較した。
その結果、図４ａおよび図４ｂに示されたように、本発明のＡＫ３２菌株は、ＢＡＡ－８３５Ｔ菌株と類似しているか、それよりも優れたＳＣＦＡ分泌促進効果を示すことを確認した。
上述した本発明の説明は、例示のためのものであって、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
産業上利用の可能性
本発明のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（寄託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株は、腸損傷の予防、改善、または治療のための食品、薬学的、整腸用、生菌剤、プロバイオティクスなどの製造に有用に用いられると期待される。

Claims (10)

  1. アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ ＡＫ３２）（受託番号：ＫＣＴＣ １４１７２ＢＰ）菌株。
  2. 前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株は、腸損傷を予防または改善することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
  3. 前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むＭＭＤ（ｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ／ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｂｅｔａ ｓｕｂｕｎｉｔ）酵素を生産することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
  4. 前記アッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株は、腸上皮細胞の増殖を促進することを特徴とする請求項１に記載の菌株。
  5. 請求項１に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として、有効な量を、非ヒト被検体に投与する工程を含む、腸損傷の予防または治療方法。
  6. 請求項１に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液を有効成分として含む、腸損傷の予防、改善、または治療用組成物。
  7. 前記腸損傷は、放射線照射による腸損傷、薬物による腸損傷、アルコール性腸損傷および炎症性腸疾患による腸損傷からなる群から選ばれた１つ以上であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
  8. 前記炎症性腸疾患は、十二指腸潰瘍、腸閉塞症、急性消化管出血、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ）、腸管型ベーチェット病、回腸嚢炎（ｐｏｕｃｈｉｔｉｓ）、過敏性大腸症候群、および潰瘍性大腸炎からなる群から選ばれた１つ以上であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
  9. 医薬組成物、食品組成物、整腸用医薬組成物、プロバイオティクス製品組成物、または食品添加物である、請求項６に記載の組成物。
  10. 請求項１に記載のアッカーマンシア・ムシニフィラＡＫ３２菌株またはその培養液の、腸損傷の予防、改善又は治療の為の薬剤を製造するための使用。
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