JP7472021B2 - ルシフェラーゼ変異体 - Google Patents
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Description
(1)配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼの変異体であって、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
(2)配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインであるアミノ酸配列を含む野生型ホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がシステイン以外の非酸性アミノ酸であるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
(3)ホタルルシフェラーゼの変異体であって、配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、グリシン、アスパラギン、リシン、トレオニン、及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
(4)配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸残基がチロシンであるアミノ酸配列を含む野生型ホタルルシフェラーゼの変異体であって、前記位置のアミノ酸がチロシン及びシステイン以外のアミノ酸配列を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。
(5)配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、及びアラニンからなる群から選択される、(1)~(4)のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
(6)配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸が、ロイシン、プロリン、又はバリンである、(5)に記載のルシフェラーゼ変異体。
(7)配列番号1の217位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、
配列番号1の490位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、及び/又は
配列番号1の252位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
(1)~(6)のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
(8)ルシフェラーゼ変異体が、以下の(i)~(iii)からなる群より選択されるアミノ酸配列:
(i)配列番号1、3、5、及び7からなる群から選択されるアミノ酸配列、
(ii)前記(i)のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号1の393位に対応する位置以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
(iii)前記(i)のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号1の以下の位置:4~5位、9~10位、13~14位、16~17位、19位、23位、25~26位、28位、35~37位、40位、42~43位、45位、47位、55位、57位、62位、65位、72~74位、80位、83~86位、90~91位、93位、98位、101位、105~106位、111位、114~116位、119位、122位、125位、129位、131~132位、137位、141位、151位、153位、155位、159位、162位、164位、169位、183位、190位、195~196位、198位、200~202位、204~205位、208~210位、212位、214位、220~223位、226~227位、230~231位、235位、237~238位、240位、242位、244~251位、253~257位、260~263位、270位、272位、275~276位、279~283位、286位、289~293位、300位、302位、305~309位、311位、313~324位、326~327位、329位、332~333位、335位、339~350位、353~355位、358位、361~362位、365~366位、368~369位、374~375位、377位、380位、382位、384~385位、387位、390~391位、396位、398位、400位、403位、406位、408~410位、414位、418~420位、423~425位、427位、429位、433~434位、436~451位、453~455位、457位、460~464位、466位、468~471位、473位、475~476位、479~483位、485位、487~488位、492~493位、497位、504位、506~508位、511~512位、514~518位、520位、522~523位、525~527位、529~531位、533位、538位、543位、及び547位のアミノ酸配列からなる領域と、ルシフェラーゼ変異体におけるこれらの位置と対応する位置のアミノ酸配列からなる領域とが90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、(1)~(7)のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体。
(9)ルシフェラーゼ変異体が、以下の(i)~(iii)からなる群より選択されるアミノ酸配列:
(i)配列番号1のアミノ酸配列、
(ii)前記(i)のアミノ酸配列において、配列番号1の393位に対応する位置以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び (iii)前記(i)のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、(8)に記載のルシフェラーゼ変異体。
(10)(1)~(9)のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
(11)(10)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(12)(10)に記載のポリヌクレオチド又は(11)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(13)(12)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法。
(14)(1)~(9)のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ATP、ADP、及びAMPの少なくとも一つを検出するためのキット。
(15)(1)~(9)のいずれかに記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ATP、ADP、及びAMPの少なくとも一つを検出する方法。
一態様において、本発明は、配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼの変異体に関する。一態様において、本発明は、配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインであるアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼ、例えば野生型ホタルルシフェラーゼの変異体に関する。一実施形態において、本発明のルシフェラーゼ変異体は、熱安定性が改善されている。
(i)配列番号1、3、5、及び7からなる群から選択されるアミノ酸配列、
(ii)前記(i)のいずれかのアミノ酸配列において、配列番号1の393位に対応する位置以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び
(iii)前記(i)のいずれかのアミノ酸配列に対して全長で70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、かつ配列番号1の以下の位置:4~5位、9~10位、13~14位、16~17位、19位、23位、25~26位、28位、35~37位、40位、42~43位、45位、47位、55位、57位、62位、65位、72~74位、80位、83~86位、90~91位、93位、98位、101位、105~106位、111位、114~116位、119位、122位、125位、129位、131~132位、137位、141位、151位、153位、155位、159位、162位、164位、169位、183位、190位、195~196位、198位、200~202位、204~205位、208~210位、212位、214位、220~223位、226~227位、230~231位、235位、237~238位、240位、242位、244~251位、253~257位、260~263位、270位、272位、275~276位、279~283位、286位、289~293位、300位、302位、305~309位、311位、313~324位、326~327位、329位、332~333位、335位、339~350位、353~355位、358位、361~362位、365~366位、368~369位、374~375位、377位、380位、382位、384~385位、387位、390~391位、396位、398位、400位、403位、406位、408~410位、414位、418~420位、423~425位、427位、429位、433~434位、436~451位、453~455位、457位、460~464位、466位、468~471位、473位、475~476位、479~483位、485位、487~488位、492~493位、497位、504位、506~508位、511~512位、514~518位、520位、522~523位、525~527位、529~531位、533位、538位、543位、及び547位のアミノ酸配列からなる領域(以下、「同一領域」とも記載する)と、ルシフェラーゼ変異体におけるこれらの位置と対応する位置のアミノ酸配列からなる領域とが90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
(i)配列番号1のアミノ酸配列、
(ii)前記(i)のアミノ酸配列において、配列番号1の393位に対応する位置以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び (iii)前記(i)のアミノ酸配列に対して90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、好ましくは95%以上、96%以上、97%以上、より好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む。
一態様において、本発明は、本発明のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド(以下、「ルシフェラーゼ遺伝子」とも記載する)に関する。ポリヌクレオチドの配列は、ホタルルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列に基づいて容易に定めることができる。例えば、配列番号1、3、5、及び7のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとして、それぞれ配列番号2、4、6、及び8のポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、
(i)配列番号2、4、6、及び8からなる群から選択されるヌクレオチド配列、
(ii)前記(i)のいずれかのヌクレオチド配列において、1又は数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列、及び
(iii)前記(i)のいずれかのヌクレオチド配列に対して全長で70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、好ましくは80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、より好ましくは90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、さらに好ましくは95%以上、96%以上、97%以上、さらにより好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでよい。
ルシフェラーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ルシフェラーゼ遺伝子又は当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触、作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;又は蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。これらのルシフェラーゼ遺伝子は、常法に従って各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。本発明において用いることのできるベクターとしてはプラスミドが挙げられるが、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。ベクターの種類は宿主細胞に応じて選択することができ、具体的には、例えばpET16-b又はpKK223-3等が好ましい。
上述のように得られたルシフェラーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体DNAを用いて、例えば、大腸菌K-12株、又は大腸菌B株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株、大腸菌BL21株、大腸菌BL21(DE3)株(ともにタカラバイオ社製)等を形質転換又はそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
一態様において、本発明は、上記宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法に関する。培養は各種公知の方法で行うことができ、固体培養法でもよいが、好ましくは液体培養法により培養する。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ATP、ADP、及びAMPの少なくとも一つを検出するためのキットに関する。本発明のキットは、ルシフェラーゼ変異体に加えて、ルシフェリンを含んでよい。この場合、マグネシウム、マンガン、カルシウムなどの金属イオンもキットに含まれうる。当業者であれば用いる酵素に応じて金属イオンの濃度を決定することができる。ルシフェラーゼによりATP、O2及びルシフェリンはAMP、ピロリン酸、CO2及びオキシルシフェリンに変換され、このとき発光がもたらされる。このとき生じる反応は、以下の通り表される。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ATP、ADP、及びAMPの少なくとも一つを検出する方法に関する。本方法は、本明細書に記載のルシフェラーゼ変異体を用いてルシフェリンの酸化反応を触媒する工程、及び該酸化反応により生じる発光を測定する工程を含んでよい。
(材料と方法)
ベクター構築
pET16-b(Novagen)のMCS(マルチクローニングサイト、Nde1-BamH1サイト)に、HLK(野生型ヘイケボタルルシフェラーゼ(配列番号1)に熱安定性向上のためのA217L、及びE490K変異を導入したもの(アミノ酸配列:配列番号9、ヌクレオチド配列:配列番号10)の遺伝子配列が挿入されたプラスミド(HLK pET-16b)をテンプレートとし、各変異体をコードする配列を増幅するためのプライマーを用いたPCRにより、C393位のシステインを各種アミノ酸に置換した各変異体をコードするプラスミドベクターを作製した。
上記で得られたPCR産物に、制限酵素DpnI(NewEngland Biolabs Japan)を1μl添加して37℃で1時間インキュベートし、反応産物を形質転換に用いた。
上記で得たコロニーを終濃度が50μg/mlとなるようにAmpを添加した2mlのLB培地において終夜振盪培養(レシプロ)した。続いて、終濃度が50μg/mlとなるようにAmpを添加した2mlのLB培地に上記培養液を2μl添加し、28℃で22時間振盪培養(レシプロ)し、振盪開始時に終濃度が0.1mMとなるようにIPTG(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド)を添加して発現誘導を行った。
調製した酵素を37℃で保存する前に、冷蔵から室温に戻すため、25℃で5分間プレインキュベートした。続いて、ウォーターバスを用いて酵素を37℃で90分間保存し、希釈buffer(500mlあたり、4.48g Tricine、185mg EDTA・Na2・2H2O、25g glycerol、5g BSA(pH7.8))を使用して、必要に応じて希釈し、ルミテスターC-110の測定範囲内に収まるように酵素を調製した。調製した粗酵素液100μl又は精製済みのHLK100μlを、以下に示す発光試薬100μlと等量混和して、ルミテスターC-110(キッコーマンバイオケミファ社製)を使用して発光量を測定した。
測定開始時間:発光試薬を酵素液に添加してから10秒後
測定時間:積算で10秒間
各ルシフェラーゼについて、3回の試験を行って測定値の平均値を求め、37℃保管時間0分のときの値を1とした場合の、37℃保管時間90分での相対値、及び変異なしの場合の90分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比(90分後残存活性比)を以下の表に示す(表2)。
(材料と方法)
野生型北米産ホタルルシフェラーゼ(アミノ酸配列:配列番号5、ヌクレオチド配列:配列番号6)の遺伝子配列をpET16-bのMCSサイト(Nde1-BamH1サイト)に導入した。得られたプラスミドは、Ppy pET16-bとした。
ゲンジボタルルシフェラーゼについて、3回の試験を行って測定値の平均値を求め、37℃保管時間0分のときの値を1とした場合の、37℃保管時間90分での相対値、及び変異なしの場合の90分後の残存活性を1とした場合の各変異体の残存活性比(90分後残存活性比)を以下の表に示す。
Claims (8)
- 以下の(i)~(iii)、すなわち
(i)配列番号1のアミノ酸配列、
(ii)前記(i)のアミノ酸配列において、配列番号1の393位に対応する位置以外の位置において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列、及び、
(iii)配列番号1のアミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼの、配列番号1の393位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ヒスチジン、及びメチオニンからなる群から選択されるアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むホタルルシフェラーゼの変異体であって、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体。 - 配列番号1の217位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はイソロイシンであり、
配列番号1の490位に対応する位置のアミノ酸がリシンであり、及び/又は
配列番号1の252位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンである、
請求項1に記載のルシフェラーゼ変異体。 - 請求項1又は2に記載のルシフェラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチド又は請求項4に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項5に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、熱安定性が改善されたルシフェラーゼ変異体の生産方法。
- 請求項1又は2に記載のルシフェラーゼ変異体を含む、ATP、ADP、及びAMPの少なくとも一つを検出するためのキット。
- 請求項1又は2に記載のルシフェラーゼ変異体を使用することを含む、ATP、ADP、及びAMPの少なくとも一つを検出する方法。
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