CN117925547A

CN117925547A - 经改造的萤火虫萤光素酶、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN117925547A
Application number: CN202310958770.6A
Authority: CN
Inventors: 李升建; 赵昕妍; 汤艳楠
Original assignee: Shanghai Beyotime Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Beyotime Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-08-01
Filing date: 2023-08-01
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明提供了一系列底物结合口袋经改造的高酶活性、高热稳定性的萤火虫萤光素酶，及其制备方法及应用。本发明人通过对萤火虫萤光素酶底物结合口袋空间结构的分析，考虑了萤火虫萤光素酶涉及酶活性与热稳定性的大量氨基酸位点，设计、构建并检测了一系列萤火虫萤光素酶突变体，所述萤火虫萤光素酶具有高的酶活性以及热稳定性。

Description

经改造的萤火虫萤光素酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种经改造的萤火虫萤光素酶、其制备方法及应用；所述萤火虫萤光素酶具有高的酶活性及热稳定性。

背景技术

萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)在有氧环境下催化萤火虫萤光素(firefly luciferin)的氧化，并伴随着生物发光。此反应需要镁离子和ATP，在过量的萤火虫萤光素酶和萤火虫萤光素存在的条件下，反应所产生的萤光强度与ATP的量成正比，因此，萤火虫萤光素酶被广泛应用于生物技术领域，用于测定ATP。本发明人在先研究中，通过在野生型萤火虫萤光素酶的基础上引入突变，可以提高萤光素酶的酶活性与热稳定性。

随着技术的进步，本领域对于细胞活力检测等应用提出了更高的要求。为了更好地应用这项技术，亟待对萤火虫萤光素酶的酶活性、热稳定性进行进一步地提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一系列底物结合口袋经改造的萤火虫萤光素酶突变体、及其制备方法和应用；所述萤火虫萤光素酶具有高的酶活性及热稳定性。

在本发明的第一方面，提供一类萤火虫萤光素酶底物结合口袋经改造的突变体，其空间结构上邻近底物结合口袋，对底物的识别与结合或蛋白空间构象的稳定具有贡献，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，进行以下突变(包括组合的突变)：

A.选自(a)-(t)的突变或其组合：

(a)第293位氨基酸F突变为L(M1)；

(b)第254位氨基酸Y突变为S(M2)；

(c)第239位由V突变为A(M5)；

(d)第137位由N突变为K，第235位由A突变为T，第280位由K突变为R，第333位由N突变为D，第422位由I突变为V(M13)；

(e)第57位由K突变为R(M14)；

(f)第42位由T突变为A，第282位由E突变为D，第392位由K突变为I，第426位由D突变为V(M15)；

(g)第525位由S突变为P(M17)；

(h)第231位氨基酸N突变为A，R或K(M20、M21或M22)；

(i)第229位氨基酸A突变为R或K(M23或M24)；

(j)第229位由A突变为K，第231位由N突变为K(M25)；

(k)第231位由N突变为K，第293位由F突变为L(M27)；

(l)第229位由A突变为R，第231位由N突变为R(M29)；

(m)第231位由N突变为R，第293位由F突变为L(M30)；

(n)第229位由A突变为K，第231位由N突变为A(M31)；

(o)第231位由N突变为A，第293位由F突变为L(M33)；

(p)第229位由A突变为K，第231位由N突变为K，第293位由F突变为L(M34)；

(q)第229位由A突变为R，第231位由N突变为K，第293位由F突变为L(M35)；

(r)第229位由A突变为K，第231位由N突变为R，第293位由F突变为L(M36)；

(s)第229位由A突变为R，第231位由N突变为R，第293位由F突变为L(M37)；

(t)第229位由A突变为K，第231位由N突变为K，第293位由F突变为L(M38)；

B.将A蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(t)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)；

C.与A蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(t)所限定的位点是保守的(氨基酸序列不变化)。

在本发明的另一方面，提供一种提高萤火虫萤光素酶的酶活性和/或热稳定性的方法，所述方法通过点突变进行，包括：将萤火虫萤光素酶进行突变改造，形成所述萤火虫萤光素酶突变体。

在一种或多种优选实施方式中，所述的稳定性包括：热稳定性。

在一种或多种优选实施方式中，所述温度稳定性或热稳定性包括37℃以上，较佳地40℃以上，更佳地42℃以上，更佳地45℃以上，更佳地48℃以上，更佳地50℃或以上的较高温度下的温度稳定性或热稳定性。

在一种或多种优选实施方式中，突变的萤火虫萤光素酶包括：SEQ ID NO:2中不携带信号肽的序列区段。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的萤火虫萤光素酶突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体或含有该载体的遗传工程化的宿主细胞，所述载体含有所述的多核苷酸；或，所述宿主细胞中含有所述载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一种或多种优选实施方式中，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述真核宿主细胞包括：酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等；所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等。

在一种或多种优选实施方式中，所述宿主细胞为酵母细胞。

在一种或多种优选实施方式中，所述载体中，所述的多核苷酸的5’端，还包括信号肽、标签多肽、荧光蛋白和/或启动子。所述的多核苷酸的3’端，还包括标签多肽、荧光蛋白和/或终止子。

在一种或多种优选实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的萤火虫萤光素酶相比，所述经改造的萤火虫萤光素酶的酶活性提高20％以上；较佳地提高50％以上；更佳地提高100％以上；更佳地提高150％以上。

在一种或多种优选实施方式中，与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的萤火虫萤光素酶相比，所述经改造的萤火虫萤光素酶的热稳定性显著提高1.6倍以上，较佳地提高2.5倍以上，更佳地提高2.6倍以上，更佳地提高2.7倍以上，如2.8倍。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的萤火虫萤光素酶的突变体的方法，包括步骤：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的萤火虫萤光素酶突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的萤火虫萤光素酶突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于催化氧化萤火虫萤光素酶底物、产生ATP依赖性生物发光、用于检测细胞数量或细胞活力。

在本发明的另一方面，提供一种催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的方法，包括：利用所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行催化氧化、在ATP存在的条件下产生生物发光。

在一种或多种实施方式中，所述催化在适于反应的体系中进行，所述适于反应的体系中例如包括：金属离子(如二价金属离子)和氧；具体地所述金属离子例如包括：镁离子、钙离子、锌离子和/或锰离子。

在一种或多种实施方式中，所述的适于反应的体系中还包括例如选自下组的试剂：反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES、季铵盐如CTAB、NaF、螯合剂如EDTA、消泡剂如DF204、含硫醇化合物如DTT、磷酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。

在一种或多种实施方式中，所述的用途或方法用于体外ATP检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，测定包含于溶液体系中的ATP的量。

在一种或多种实施方式中，所述的用途或方法用于细胞活力检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，与细胞培养物混和，测定细胞活力。

在一种或多种实施方式中，所述的用途或方法用于细胞数量检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，与细胞培养物混和，测定细胞数量。

在本发明的另一方面，提供一种用于催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的检测体系或检测试剂盒，其中含有所述的萤火虫萤光素酶突变体，或所述的宿主细胞或其培养物或裂解物。

在一种或多种实施方式中，所述的检测体系或检测试剂盒中还包括萤火虫萤光素。

在一种或多种实施方式中，所述检测体系中还包括金属离子(如二价金属离子)；较佳地所述金属离子包括：镁离子、钙离子、锌离子和/或锰离子。

在一种或多种实施方式中，所述检测体系中还包括选自下组的试剂：反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES、季铵盐、螯合剂、消泡剂、含硫醇化合物、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。

在一种或多种实施方式中，所述检测体系中还包括细胞裂解试剂。

在一种或多种实施方式中，所述检测体系中还包括ATP提取试剂。

在本发明的另一方面，提供一种ATP测试仪，其中包括：容器，包含于容器中的所述的萤火虫萤光素酶突变体；容器，包含于容器中的萤光素酶底物；采样、加样及反应装置，用于添加待测样品，该待测样品是需要进行ATP测定的样品；较佳地，还包括气体供应装置，所述气体包含氧气。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶的三维结构预测与整体结构对比图。

图2、萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶三维结构分析与底物结合口袋展示图。

图3、野生型、146-1H2、突变体粗酶的酶活性检测对比图。

图4、粗酶的酶活性检测有显著效果的各萤火虫萤光素酶以及WT和146-1H2表达纯化后的电泳图。

图5、纯化后的萤火虫萤光素酶的酶活性检测对比图。

图6、纯化后的萤火虫萤光素酶的信号热稳定性检测对比图。

图7、纯化后的146-1H2、M1、M2用于不同浓度ATP检测的对比图。

图8、纯化后的146-1H2、M1、M2用于不同浓度ATP检测时的信号热稳定性对比图。

图9、纯化后的M1、M2用于不同数量Hela细胞酶活性检测时的对比图。

具体实施方式

萤火虫萤光素酶为具有545aa的蛋白，与其酶活性或热稳定性密切相关的位点至今仍然没有完全探索明确。在对其进行空间结构分析及突变改造的前期工作中，考虑了大量的氨基酸位点，设计、构建并筛选了一系列与萤火虫萤光素酶底物结合口袋相关的突变体。经过初筛，对其中酶活性较高的23个突变体进行了蛋白表达纯化、酶活测定及热稳定性检测。与对照(146-1H2)相比，这一系列萤火虫萤光素酶的酶活性均呈现不同程度的提高，且热稳定性良好。其中两个突变体M1(F293L)和M2(Y254S)的酶活性均有显著提高，分别比对照(146-1H2)的酶活性提高了182％和172％。同时，50℃孵育处理24小时不会影响两个突变体蛋白的酶活性，说明这两个突变体热稳定性较高。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“萤火虫萤光素酶突变体”、“突变型萤火虫萤光素酶”、“萤光素酶突变体”、“突变型萤光素酶”可互换使用，是指对应于突变前的萤火虫萤光素酶，在本发明人确定的一些与酶的酶活性/热稳定性具有相关性的位点发生突变后构成的酶(多肽/蛋白)，较佳地相应于SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，突变选自下组的位点或其组合：第293位、第254位、第229位或第231位，共23个萤火虫萤光素酶突变体。

若需要表示突变前的萤火虫萤光素酶(146-1H2)，其可以为氨基酸序列如SEQ IDNO:2的酶。除非另外说明，本发明中的突变体的突变位点基于该SEQ ID NO:2所示的序列。

本发明中，除非另外说明，萤火虫萤光素酶突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示萤火虫萤光素酶突变体中突变的氨基酸，如F293L，表示位置293位的氨基酸由出发酶的F替换为L。

如本文所用，“分离的萤火虫萤光素酶”是指萤火虫萤光素酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化获得萤火虫萤光素酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“提高酶活性或信号热稳定性”是指与改造前的萤火虫萤光素酶出发多肽相比，发生突变的萤火虫萤光素酶的酶活性或信号热稳定性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，酶活性或信号热稳定性提高的突变型萤火虫萤光素酶在一定时间的反应后，酶活性或信号热稳定性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。

如本文所用，“萤火虫萤光素酶突变体或编码其的多核苷酸的文库”是指含有本发明提供的一系列突变型萤火虫萤光素酶的多肽集合体或多核苷酸集合体。多条酶活性有不同或信号热稳定性有不同的萤火虫萤光素酶突变体或编码其的多核苷酸被组装于一个库中，有利于本领域技术人员根据其所需的反应条件，选择合适的萤火虫萤光素酶或其编码核酸。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

如本文所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或酶活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。

萤火虫萤光素酶突变体、其编码核酸及构建体

本发明人利用蛋白空间结构预测工具对萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶进行三维结构预测，并与PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)中已公布的萤火虫萤光素酶与底物结合的复合物结构进行对比分析，确定了本发明的萤火虫萤光素酶突变体的独特性。

本发明的萤火虫萤光素酶突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述萤火虫萤光素酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然萤火虫萤光素酶突变体相同的生物学功能或酶活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的萤火虫萤光素酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变。

在本发明中，术语“萤火虫萤光素酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括萤火虫萤光素酶突变体的酶活性片段和酶活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变。

在本发明中，术语“萤火虫萤光素酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的萤火虫萤光素酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白酶活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在至少一个本发明上面所述的突变。

发明还提供所述萤火虫萤光素酶突变体的类似物。这些类似物与所述萤火虫萤光素酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了编码本发明萤火虫萤光素酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或萤火虫萤光素酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的萤火虫萤光素酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码萤火虫萤光素酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，萤火虫萤光素酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含萤火虫萤光素酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。在本发明的优选方式中，所用的表达载体为pET22b；所述表达载体转化的微生物宿主细胞均为大肠杆菌。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

萤火虫萤光素酶突变体的应用

在适合的反应条件下，萤火虫萤光素酶可催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光；也即，本发明的萤火虫萤光素酶可应用于三磷酸腺苷生物发光法，作为催化剂。三磷酸腺苷生物发光法是一种经过简化的生物化学方法，利用ATP与萤光素-萤光素酶复合物的反应来测定是否存在三磷酸腺苷(ATP)，该法可用于体外环境或细胞的ATP量的测定。生物发光反应需要ATP、萤光素和萤火虫萤光素酶。反应期间萤光素被氧化并发出荧光，光子的数量可采用ATP荧光仪进行测量，光子的数量的ATP含量成正比。应用于细胞活力测定时，由于每种细胞中的ATP含量是恒定的，样品中ATP含量与样品中细胞的数量有关。这一方法可在非常快的时间内(例如数秒)进行ATP量的测定。利用本发明的萤火虫萤光素酶突变体，可以更为高效、灵敏地实现检测。

在获得了本发明的萤火虫萤光素酶突变体酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥催化氧化萤火虫萤光素、在ATP存在的条件下产生生物发光的作用。在优选的方式中，所述催化在适于反应的体系中进行，所述适于反应的体系中包括：金属离子(如二价金属离子，具体如镁离子)和氧；较佳地，所述的适于反应的体系中还包括(但不限于)选自下组的试剂：反应缓冲液，氯化钠，去垢剂，Gelatin，MES，季铵盐(如CTAB)、NaF、螯合剂(如EDTA)、消泡剂(如DF204)、含硫醇化合物(如DTT)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。

基于萤火虫萤光素酶的ATP生物发光法的应用范围十分广泛，可被应用于食品(如微生物检测)、药品、电子和化妆品等众多领域。例如，用生物发光法测定肉类食品中细菌污染情况。ATP生物发光法还可用于乳制品中乳酸菌的测定、啤酒中菌落总数测定、调味品及脱水蔬菜的细菌学测定等。ATP生物发光法还可用于食品生产环境的清洁度检测；例如，用ATP生物发光法检测食品生产线及厨房、冰箱、食品操纵台、铁路站车食品器具等处的清洁度。ATP生物发光法还可用于医疗环境中的清洁度检测；例如，对于手术用具、医用耗材的微生物检测。

对于动植物组织样品或细胞样品，也可应用如本发明的方法来进行ATP量的检测，以研究生物代谢性能等。例如，在涉及转基因研究的植物学领域中，可对于植物的愈伤组织进行ATP含量的测定，以研究其中的细胞能量代谢的特点。

应理解，本发明的具有更高酶活性及热稳定性的萤火虫萤光素酶突变体，适用于多种多样本领域已知或正在发展的ATP检测方法中，具有广泛的可应用性。

在本发明的具体实施例中，在Luc146-1H2的基础上通过建立许多宾夕法尼亚萤火虫萤光素酶突变体，并构建了相应的原核表达质粒。突变体质粒经过测序确认后，与野生型(wild-type,WT)和对照(146-1H2)质粒同时转化大肠杆菌感受态细胞，经过培养和诱导，获得表达萤火虫萤光素酶的大肠杆菌菌液；裂解细胞，释放萤火虫萤光素酶，并比较不同突变体的酶活性；将酶活性较高的23个突变体和对照进行培养和诱导表达，并纯化获得萤火虫萤光素酶蛋白。比较突变体和对照的Luc146-1H2酶活性和信号热稳定性。

本发明采用分子理论设计和功能筛选相结合的方法，获得多个具有更高酶活性的萤火虫萤光素酶突变体，均可以很好地用于ATP的定量检测。其中，突变体M1(F293L)的酶活性比对照萤火虫萤光素酶的酶活性高约182％，突变体M2(Y254S)的酶活性比对照萤火虫萤光素酶的酶活性高约172％；将纯化后的突变体和对照同时在50℃加热24小时，并比较加热前和加热后的酶活性，发现，50℃处理24小时不会显著影响萤火虫萤光素酶的酶活性。进一步测试发现，这一系列萤光素酶突变体还可用于细胞数量和酶活性的检测。

萤火虫萤光素酶突变体的组合物/试剂盒

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的萤火虫萤光素酶突变体以及在检测中所需的其它组分。这类组分包括(但并不限于)选自下组的组分：萤火虫萤光素(作为底物)，金属离子(如二价金属离子)，反应缓冲液，氯化钠，去垢剂，Gelatin，MES，季铵盐(如CTAB)、NaF、螯合剂(如EDTA)、消泡剂(如DF204)、含硫醇化合物(如DTT)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。本领域技术人员可根据组合物的实际用途确定组合物中萤火虫萤光素酶突变体的有效量。所述的组合物中还可添加进一步调节本发明的萤火虫萤光素酶突变体酶活性或促进反应进程的其它物质。

本发明还提供了一种检测体系，其中包括：本发明的萤火虫萤光素酶突变体、萤火虫萤光素(作为底物)；较佳地还包括选自下组的组分：金属离子(如二价金属离子)、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES、季铵盐(如CTAB)、NaF、螯合剂(如EDTA)、消泡剂(如DF204)、含硫醇化合物(如DTT)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。该检测体系中，当加入待测样品后，可以在很短的时间内发生反应，获得测定结果。

为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种检测体系或检测试剂盒，其中包括：本发明的萤火虫萤光素酶突变体、萤火虫萤光素(作为底物；较佳地还包括选自下组的组分：金属离子(如二价金属离子)、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES、季铵盐(如CTAB)、NaF、螯合剂(如EDTA)、消泡剂(如DF204)、含硫醇化合物(如DTT)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。其中，所述的萤火虫萤光素酶突变体、萤光素、金属离子(如二价金属离子)、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES等试剂，独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。

作为本发明的优选方式，所述的检测试剂盒中还可包括：细胞裂解试剂，和/或ATP提取试剂。

作为本发明的优选方式，所述的检测试剂盒中，还可包括使用说明书，以指导人们以正确的方法应用本发明的试剂盒。

为了便于扩大化应用或商业应用，本发明还提供了一种ATP测试仪，其中包括：容器，包含于容器中的所述的萤火虫萤光素酶突变体；容器，包含于容器中的萤光素酶底物(如萤光素)；采样(如拭子)、加样及反应装置，用于添加待测样品，该待测样品是需要进行ATP测定的样品；气体供应装置，所述气体包含氧气。或者，也可以自然状态下存在的空气(氧气)来替代该气体供应装置。

作为本发明的优选方式，所述的ATP测试仪中还包括：容器，以及包含于容器中的：金属离子(如二价金属离子)(溶液)、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES、季铵盐(如CTAB)、NaF、螯合剂(如EDTA)、消泡剂(如DF204)、含硫醇化合物(如DTT)、磷酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、除Gelatin外的BSA、甘油等蛋白质稳定剂。所述的ATP测试仪中，所述的萤火虫萤光素酶突变体、萤光素、金属离子(如二价金属离子)、反应缓冲液、氯化钠、去垢剂、Gelatin、MES等试剂，独立地置于不同的容器中，或其中的两种或多种被混合于同一容器中。所述的ATP测试仪内可设置有一些计算程序，以及设置有输出屏，从而直观地向人们展示测定结果。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.实验材料、试剂与仪器

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、基因定点突变试剂盒、内切酶DpnⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ，LB培养基相关试剂、抗生素、诱导剂、质粒小量抽提试剂盒、Ni亲和层析柱填料、ATP标准品、萤火虫萤光素酶检测试剂、96孔板等材料和试剂均为上海碧云天生物技术有限公司的商品化材料/试剂。

基因随机突变试剂盒购自Takara。

PCR仪购自Bio-Rad。

超声波细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

高压细胞破碎仪购自安拓思纳米技术(苏州)有限公司。

Clinx凝胶成像仪购自上海勤翔科学仪器有限公司。

多功能酶标仪Varioskan LUX购自ThermoFisher。

II.实验方法

1、野生型宾夕法尼亚萤火虫(Photuris pensylvanica)荧光素酶和Luc146-1H2突变体结构预测与分析

蛋白质三维结构能直观展示蛋白与底物相互作用的区域，底物结合与释放的方式，参与底物特异性识别的关键氨基酸位点等信息，对于定向设计突变改造萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶具有极大地指导意义。目前并没有已解析的萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶空间结构数据，借助蛋白质三维空间结构预测工具对其整体结构进行预测，并进行关键酶活性位点分析以及实验分析。根据分析的结果，推测可能涉及底物识别与结合，影响萤光素酶热稳定性的氨基酸位点。再以此为基础，在Luc146-1H2突变体的基础上构建一系列定点突变体，并对这些定点突变体进行酶活性与热稳定性检测，以期望从中筛选出能明显改善酶活性与热稳定性的突变体。对照野生型和Luc146-1H2突变体萤火虫萤光素酶的蛋白序列前述的“序列信息”部分。

2、萤光素酶定点突变体的构建

通过基因合成的方法获得146-1H2基因(序列见“序列信息”部分)，并通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点克隆至pET22b表达载体，并在蛋白的C末端添加6X His纯化标签和终止密码子，即获得pET22b-luc146-1H2质粒。

再以pET22b-luc146-1H2质粒为模板，设计并合成基因定点突变PCR引物，使用QuickMutation^TM基因定点突变试剂盒(碧云天，D0206)进行基因定点突变PCR。

50μl反应体系中包括：29μl nuclease-free water，5μl 10X BeyoFusion^TMBuffer(含Mg²⁺)，10μl dNTP mix(每种2.5mM)，2μl正向引物(10μM)，2μl反向引物(10μM)，1μlpET22b-luc146-1H2质粒(200ng)，和1μl BeyoFusion^TMDNA聚合酶。

PCR程序为：95℃预变性3min；20个循环：95℃30s，55℃30s，68℃3min(30s/kb)；68℃继续延伸15min；4℃暂时存放。

PCR反应结束后，在PCR反应体系中加入1μl内切酶DpnⅠ(碧云天，D6257)，混匀后37℃孵育1小时以消化模板质粒。

消化后的PCR产物各取10μl，加到100μl DH5α超级感受态细胞(碧云天，D1031)中，混匀后冰上放置30min，42℃热激90s，冰上孵育2min。

加入900μl无抗性的LB培养基，37℃摇菌1小时。离心收集菌体，用100μl无抗性的LB培养基重悬后，将菌液均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(碧云天，ST007)的LB平板上，将平板倒置在37℃培养箱中，培养过夜。

次日，挑单个菌落至10ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养过夜。用质粒小量抽提试剂盒(碧云天，D0003)提取各突变体菌液中的质粒，并测定质粒浓度。

利用T7和T7-Terminator通用引物对目的基因进行测序。对于引入多个突变位点的突变体，需要进行多轮定点突变，每轮引入1个或多个位点突变，且每轮都需要经过测序验证确保成功后、进行下一轮。

3、萤光素酶随机突变体的构建

为尽可能最大程度上改善Luc146-1H2突变体的性能，筛选到更多更优质的突变体，在进行定点突变的同时，以pET22b-luc146-1H2质粒为模板，使用PCRRandom Mutagenesis Kit进行基因随机突变PCR，构建随机突变体，并进行随机突变体酶活性与热稳定性筛选。

随机突变PCR的50μl反应体系中包括：35μl PCR Grade Water，5μl 10x TITANIUMTaq Buffer，4μl MnSO₄(8mM)，1μl dGTP(2mM)，1μl 50x Diversify dNTP Mix，1μl正向引物(10μM，序列为5’-gtgctcgagttagtggtgatggtg-3’(SEQ ID NO:6))，1μl反向引物(10μM，序列为5’-agatatacatatggcagataagaatattt-3’(SEQ ID NO:7))，1μl pET22b-luc146-1H2质粒(1ng)，和1μl TITANIUM Taq聚合酶。

PCR程序为：94℃预变性30s；25个循环：94℃30s，45℃30s，68℃2min；68℃继续延伸1min；4℃暂时存放。

片段酶切：50μl反应体系中包括：PCR Grade Water，5μl 10x Buffer R，1μl NdeⅠ(碧云天，D6485)，1μl XhoⅠ(碧云天，D6721)，PCR产物(2μg)。37℃酶切过夜。

将过夜酶切的产物连接到经NdeⅠ和XhoⅠ酶切线性化的pET22b载体上，并将连接产物转化BL31(DE3)感受态细胞。

从平板上挑取单克隆进行蛋白表达，利用Bac-Lumi^TM细菌萤火虫萤光素酶检测试剂(碧云天，RG039)检测不同突变体luciferase粗酶的酶活性。

4、萤光素酶突变体粗酶的酶活性检测

提前将Bac-Lumi^TM细菌萤火虫萤光素酶检测试剂(碧云天，RG039)解冻，并平衡至室温。为避免信号值过高，超出酶标仪检测的线性范围，用LB将诱导后的菌液稀释10倍，然后取100μl至BeyoGold^TM全白96孔细胞培养板(平底带盖,独立包装)(碧云天，FCP968)中，以100μl LB作为空白对照。每孔加入100μl细菌萤火虫萤光素酶检测试剂，将96孔板置于水平脱色摇床上，室温震荡孵育10min，然后利用多功能酶标仪检测化学发光，每2分钟读一次，共检测2小时。化学发光信号值RLU的高低，可大致反应不同突变体酶活性的高低。

5、高酶活性萤火虫萤光素酶突变体的表达

利用超级感受态细菌制备试剂盒(碧云天，D0302)将大肠杆菌BL21(DE3)甘油菌(碧云天，D0337)制备成感受态。将测序正确的突变体、野生型和对照质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并在含氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜。次日，挑单菌落至10ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm的摇床中培养至OD600值介于0.6-0.8之间，加入终浓度为0.1mM的IPTG(碧云天，ST098)，18℃，220rpm震荡培养16小时，诱导蛋白表达。分别取10ml诱导前和诱导后的菌液，离心收集菌体，用10ml PBS重悬。超声细胞破碎仪中破碎10min后，12000rpm离心10min。分别取50μl离心后上清，加入10μl 6X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天，P0015F)，100℃沸水浴中加热10min后，12000rpm离心10min。各取20μl进行SDS-PAGE电泳检测，观察上清中有无萤火虫萤光素酶蛋白的表达。

6、高酶活性萤火虫萤光素酶突变体的纯化

根据粗酶活性检测的结果，筛选酶活性有显著提高的23个萤火虫萤光素酶突变体，和对照(146-1H2)在BL21(DE3)菌株中各表达1L。以下纯化步骤均在4℃环境下进行。收集诱导后的菌体，分别用100ml裂解液(50mM NaH₂PO₄ pH8.0,300mM NaCl,10％glycerol,1mM PMSF)重悬菌体，以850bar的压力在高压细胞破碎仪中破碎3遍。12000rpm离心30min后收集上清，使用BeyoGold^TMHis-tag Purification Resin(耐还原螯合型)(碧云天，P2218)亲和纯化柱纯化目的蛋白，并将纯化后的萤火虫萤光素酶透析到酶储存液(25mM Tris-acetate pH7.8,1mM EDTA,1mM DTT,0.2M(NH₄)₂SO₄,15％glycerol，30％ethylene glycol)中。利用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)(碧云天，P0006)测定蛋白浓度，并通过SDS-PAGE进行确认。分装好的蛋白经液氮速冻后储存在-80℃。

7、纯化后萤火虫萤光素酶突变体的酶活性与ATP定量检测

去掉已有商品CellTiter-Lumi^TM发光法细胞活力检测试剂盒(碧云天，C0065)中的萤光素酶组分，获得新的检测试剂，简称CTL。用CTL将萤火虫萤光素酶突变体和对照稀释至1mg/ml，用PBS将ATP标准品(碧云天，D7378)稀释至2，1.5，1,0.5,0.25，0.125μM。在96孔板中配置200μl反应体系：5μl 1mg/ml萤火虫萤光素酶蛋白，95μl CTL，100μl 0-2μM不同浓度的ATP标准品(最后加入)。将96孔板置于水平脱色摇床上，室温震荡孵育10min，然后利用多功能酶标仪检测化学发光，每分钟读一次，共检测20min。

8、纯化后萤火虫萤光素酶突变体的热稳定性检测

用酶储存液将萤火虫萤光素酶突变体和对照稀释至1mg/ml，各取100μl(50μl×2)置于PCR仪中，50℃孵育24小时。孵育结束后，12000rpm离心10min取上清，与未加热的蛋白同时测定酶活性。比较加热和未加热萤火虫萤光素酶的酶活性。

9、纯化后萤火虫萤光素酶突变体用于检测细胞活力

纯化后的M1、M2用于不同数量Hela细胞内ATP含量的检测，以反应细胞活力。将培养好的Hela细胞使用培养液按比例稀释成一系列浓度梯度，并加入1％Triton X-100孵育，使Hela细胞完全裂解。在进行化学发光检测的96孔板中，每孔接种100μl不同浓度的Hela细胞，使每个反应体系中分别含有10，20，50，100，200，500，1000，2000，5000，10000，20000，50000个细胞，同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照，用于细胞内ATP含量的检测。在含有终浓度为25μg/ml萤光素酶突变体的200μl发光反应中，进行发光反应以检测细胞活力。

10、序列信息

WT氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MEDKNILYGPEPFHPLADGTAGEQMFYALSRYADISGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENGLQFFLPLIASLYLGIIAAPVSDKYIERELIHSLGIVKPRIIFCSKNTFQKVLNVKSKLKYVETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDINLDVKKFKPNSFNRDDQVALVMFSSGTTGVSKGVMLTHKNIVARFSHCKDPTFGNAINPTTAILTVIPFHHGFGMTTTLGYFTCGFRVALMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFFPKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPDTDVRPGSTGKIVPFHAVKVVDPTTGKILGPNETGELYFKGDMIMKSYYNNEEATKAIINKDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQNFVSSQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMFEKHKSKL

146-1H2氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVASIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGYFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPLHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG

146-1H2核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：

atggcagataagaatattttatatgggcccgaaccattttatcccttggaagatgggacggctggagaacagatgtttgacgcattatctcgttatgcagctattccgggctgcatagcattgacaaatgctcatacaaaagaaaatgttttatatgaagagtttctgaaactgtcgtgtcgtttagcggaaagttttaaaaagtatggattaaaacaaaacgacacaatagcggtgtgtagcgaaaatagtctgcaatttttccttcctgtaattgcatcattgtatcttggaataattgtggcacctgttaacgataaatacattgaacgtgaattaatacacagtcttggtattgtaaaaccacgcatagttttttgctccaagaatacttttcaaaaagtactgaatgtaaaatctaaattaaaatctattgaaactattattatattagacttaaatgaagacttaggaggttatcaatgcctcaacaactttatttctcaaaattccgatagtaatctggacgtaaaaaaatttaaaccctattcttttaatcgagacgatcaggttgcgtcgattatgttttcttctggtacaactggtctgccgaagggagtcatgctaactcacaagaatattgttgcacgattttctattgcaaaagatcctacttttggtaacgcaattaatcccacgtcagcaattttaacggtaatacctttccaccatggttttggtatgatgaccacattaggatactttacttgtggattccgagttgttctaatgcacacgtttgaagaaaaactatttctacaatcattacaagattataaagtggaaagtactttacttgtaccaacattaatggcatttcttgcaaaaagtgcattagttgaaaagtacgatttatcgcacttaaaagaaattgcatctggtggcgcacctttatcaaaagaaattggggagatggtgaaaaaacggtttaaattaaactttgtcaggcaagggtatggattaacagaaaccacttcggctgttttaattacaccgaaaggtgacgccaaaccgggatcaactggtaaaatagtaccattacacgctgttaaagttgtcgatcctacaacaggaaaaattttggggccaaatgaacctggagaattgtattttaaaggcccgatgataatgaagggttattataataatgaagaagctactaaagcaattattgataatgacggatggttgcgctctggtgatattgcttattatgacaatgatggccatttttatattgtggacaggctgaagtcactgattaaatataaaggttatcaggttgcacctgctgaaattgagggaatactcttacaacatccgtatattgttgatgccggcgttactggtataccggatgaagccgcgggcgagcttccagctgcaggtgttgtagtacagactggaaaatatctaaacgaacaaatcgtacaagattatgttgccagtcaagtttcaacagccaaatggctacgtggtggggtgaaatttttggatgaaattcccaaaggatcaactggaaaaattgacagaaaagtgttaagacaaatgttagaaaaacacaccaatggg

M1(F293L)氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVASIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGYFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMALLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPLHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG

M2(Y254S)氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：

MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVASIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGSFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPLHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG

M3(Q73H)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第73位由Q突变为H。

M4(G158E,N402S,Y462N)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第158位由G突变为E，第402位由N突变为S，第462位由Y突变为N。

M5(V239A)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第239位由V突变为A。

M6(K379R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第379位由K突变为R。

M7(I145V,M248K,T351S,K532I)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第145位由I突变为V，第248位由M突变为K，第351位由T突变为S，第532位由K突变为I。

其中，野生型145位为V，I145V相当于突变回至WT相应位点的残基。

M8(N130S,K212E)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第130位由N突变为S，第212位由K突变为E。

M9(F293L,V365I,G378V)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第293位由F突变为L，第365位由V突变为I，第378位由G突变为V。

M10(M208T,I311F,E321G,L538F)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第208位由M突变为T，第311位由I突变为F，第321位由E突变为G，第538位由L突变为F。

M11(N74K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第74位由N突变为K。

M12(Q277L,K379R,N413S,T488S,N543Y)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第277位由Q突变为L，第379位由K突变为R，第413位由N突变为S，第488位由T突变为S，第543位由N突变为Y。

其中，WT的413位为K，146-1H2的413位为K413N，此处N413突变为S。

WT的543位为S，146-1H2的543位为S543N，此处N543突变为Y。

M13(N137K,A235T,K280R,N333D,I422V)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第137位由N突变为K，第235位由A突变为T，第280位由K突变为R，第333位由N突变为D，第422位由I突变为V。

M14(K57R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第57位由K突变为R。

M15(T42A,E282D,K392I,D426V)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第42位由T突变为A，第282位由E突变为D，第392位由K突变为I，第426位由D突变为V。

M16(E110G,V281E,I364V,E404G)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第110位由E突变为G，第281位由V突变为E，第364位由I突变为V，第404位由E突变为G。

M17(S525P)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第525位由S突变为P。

M18(E64V,N186S)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第64位由E突变为V，第186位由N突变为S。

M19(V79M,D374N,Q536R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第79位由V突变为M，第374位由D突变为N，第536位由Q突变为R。

M20(N231K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第231位由N突变为K。

M21(N231R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第231位由N突变为R。

M22(N231A)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第231位由N突变为A。

M23(A229R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为R。

M24(A229K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为K。

M25(A229K,N231K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为K，第231位由N突变为K。

M26(A229R,N231K)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为R，第231位由N突变为K。

M27(N231K,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第231位由N突变为K，第293位由F突变为L。

M28(A229K,N231R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为K，第231位由N突变为R。

M29(A229R,N231R)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为R，第231位由N突变为R。

M30(N231R,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第231位由N突变为R，第293位由F突变为L。

M31(A229K,N231A)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为K，第231位由N突变为A。

M32(A229R,N231A)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为R，第231位由N突变为A。

M33(N231A,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第231位由N突变为A，第293位由F突变为L。

M34(A229K,N231K,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为K，第231位由N突变为K，第293位由F突变为L。

M35(A229R,N231K,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为R，第231位由N突变为K，第293位由F突变为L。

M36(A229K,N231R,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为K，第231位由N突变为R，第293位由F突变为L。

M37(A229R,N231R,F293L)氨基酸序列：

SEQ ID NO:2基础上，第229位由A突变为R，第231位由N突变为R，第293位由F突变为L。

M38(A229K,N231A,F293L)氨基酸序列：

实施例1、萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶的三维结构预测与整体结构对比。

使用蛋白结构预测工具成功预测获得了萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶的整体空间结构。为进一步挖掘到更多有用信息，以指导深入研究分析萤光素酶与底物的结合方式，将其与PDB数据库中已公布的萤光素酶与底物的复合物结构(PDB号：5dwv)进行比对与分析。

结果如图1：从两个不同的方向对萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶结构与5dwv结构比对进行展示。结果显示两者整体上具有相同的拓扑构象，结构相似性较高(RMSD＝0.0731)，且负责底物结合的空间区域一致。

实施例2、萤火虫(Photuris pensylvanica)萤光素酶三维结构分析与底物结合口袋展示。

根据结构得知，一个萤光素酶分子结合一个底物分子。底物结合在由萤光素酶的1个α-helix，1个loop，4个β-sheet所组成的疏水口袋中。位于此疏水口袋附近的一些氨基酸通过其侧链，为底物的锚定提供有效的相互作用力，参与稳定底物的特异性识别与结合。除此之外，位于底物结合口袋的出入口处的氨基酸，其侧链可以将口袋进行封闭，共同作用下可防止结合的底物溢出和释放。

结果如图2：底物结合口袋的细节展示。左侧展示了萤火虫(Photurispensylvanica)萤光素酶的整体三维结构。萤光素酶与底物相互作用的局部细节图呈现在右侧。

实施例3、突变体的构建及萤光素酶的表达

根据结构分析的结果，对萤光素酶进行一系列定点突变位点设计。定点突变PCR产物经DpnⅠ消化后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别挑取3个单克隆进行小量培养并提取质粒。测序验证序列，获得实现成功定点突变的克隆。

最终，设计的定点突变体都获得阳性克隆，质粒序列都经过测序验证，确保正确；而随机突变体则是使用随机突变试剂盒直接筛选并测序验证得到的克隆。

38个萤火虫萤光素酶突变体和对照WT、146-1H2均在上清中有显著表达。

实施例4、野生型、146-1H2和各突变体粗酶的酶活性检测

Bac-Lumi^TM细菌萤火虫萤光素酶检测试剂中同时含有大肠杆菌细胞裂解成分和萤火虫萤光素酶活性检测成分，无需收集和裂解细胞，可一步法测定细菌内萤火虫萤光素酶的酶活性。在96孔板中，将10倍稀释的诱导后菌液(100μl)与检测试剂(100μl)以1:1的比例混合，水平摇床上，室温震荡孵育10min，然后利用多功能酶标仪检测化学发光。取反应1小时的萤光信号值作图(WT的信号衰减迅速，取第10min的信号值作图)。

结果如图3：野生型(WT)的信号值为1.7×10³RLU，对照(146-1H2)的信号约为1.7×10⁸RLU，M1-M38的酶活信号介于8.1×10⁷-4.8×10⁸RLU之间。

实施例5、粗酶活性检测时有显著效果的各萤火虫萤光素酶蛋白表达、纯化与定量

根据粗酶活性检测的结果，获得23个酶活相对较高的突变体，和对照(WT、146-1H2)在BL21(DE3)菌株中各表达了1L，并利用Ni亲和层析柱进行了亲和纯化。将纯化后的蛋白经Bradford法测定蛋白浓度，用酶储存液稀释至相同浓度1mg/ml，并通过SDS-PAGE确认25个萤光素酶蛋白样品的浓度是否相同。

结果如图4：各样品的上样体积均为1μg，各样品间的蛋白量基本一致。

实施例6、纯化后的萤火虫萤光素酶的酶活性检测对比

本实施例中，用酶储存液稀释至1mg/ml的各萤光素酶突变体用于酶活性检测。

在200μl反应体系中，萤火虫萤光素酶各种突变体和对照(WT、146-1H2)的蛋白终浓度为25μg/ml，并取检测第10min的信号值作图。

结果如图5：与对照(146-1H2)相比，其余23个萤火虫萤光素酶突变体的酶活性均有明显提高，约为对照的1.6-2.8倍。此酶活性检测结果与前期粗酶活性检测结果基本一致。

实施例7、纯化后的萤火虫萤光素酶的信号热稳定性检测对比

在200μl反应体系中，萤火虫萤光素酶各种突变体和对照(WT、146-1H2)的蛋白终浓度为25μg/ml。将标定好蛋白浓度的萤火虫萤光素酶蛋白样品进行50℃孵育前和50℃孵育后两种方式处理，再进行酶活性的检测。并根据50℃孵育前后酶活性的变化程度，分析各萤光素酶突变体的热稳定性。

结果如图6所示：经50℃孵育处理后，野生型萤光素酶的酶活性几乎完全丧失；萤光素酶突变体146-1H2的酶活性略有下降，酶活性较孵育前下降约10％；其余萤光素酶突变体经50℃孵育处理后，酶活呈现1-27％等不同程度的下降，各突变体均呈现较高或很高的热稳定性。

实施例8、高酶活性的萤火虫萤光素酶突变体用于ATP的定量检测

根据前期检测结果，从中挑选出M1(F293L)、M2(Y254S)两个萤火虫萤光素酶突变体测试是否可以用于ATP的定量检测。

在200μl反应体系中，萤火虫萤光素酶突变体M1(F293L)、M2(Y254S)和对照(146-1H2)的蛋白终浓度为25μg/ml；ATP的终浓度为0、0.125、0.25、0.5、1、1.5、2μM。

取检测第10min的信号值作图，结果如图7：M1(F293L)和M2(Y254S)突变体的萤光信号值均显著高于对照(146-1H2)。

计算突变体在各个ATP浓度(不包括0μM)下信号值与对照的倍数关系，M1(F293L)的酶活性约是对照(146-1H2)的2.82±0.09倍，M2(Y254S)的酶活性约是对照(146-1H2)的2.72±0.05倍；即突变体M1(F293L)和M2(Y254S)的酶活性分别比对照(146-1H2)高182％和172％左右。

实施例9、高酶活性的萤火虫萤光素酶突变体50度加热处理后仍然可以用于ATP的定量检测

将1mg/ml的各萤火虫萤光素酶样品进行50℃孵育24小时的热处理后，离心取上清，比较上清和未经热处理的萤火虫萤光素酶的酶活性。取检测第10min的信号值作图。

结果如图8：所有样品信号值与ATP的浓度成均呈正相关，说明突变体M1(F293L)和M2(Y254S)与对照(146-1H2)一样，都可以用来检测溶液中ATP的浓度。整体看来，M1(F293L)的酶活性大致是对照(146-1H2)的酶活性的2.8倍，M2(Y254S)的酶活性接近对照(146-1H2)酶活性的2.7倍。

该结果与图6中的结果一致，说明实验的重复性较好。

比较同一蛋白热处理前和热处理后的数据，发现50℃处理24小时不会影响蛋白的酶活性，说明M1(F293L)和M2(Y254S)的热稳定性良好。

实施例10、高酶活性的萤火虫萤光素酶突变体用于细胞酶活性检测时的效果对比

将纯化的高酶活性萤火虫萤光素酶突变体M1和M2通过化学发光法测定不同数量Hela细胞的ATP含量，以反映细胞活力，从而达到用于超高灵敏度、超宽线性范围定量检测活细胞数目的用途。细胞用1％ Triton X-100裂解后进行ATP浓度检测。取检测第10min的信号值作图。

结果如图9：萤光素酶突变体可以用于细胞酶活性检测，检测灵敏度高，线性范围宽，至少可以在0个至5万个细胞范围内呈现良好的线性关系。

实验结论

通过结构预测与比较分析，结合定点与随机突变，通过本发明人深入的分析与实验研究，设计并筛选构建了一系列萤火虫萤光素酶突变体。经过初筛，对其中23个酶活性较高的突变体进行了表达纯化和酶活测定。

经检测，与对照(146-1H2)相比，所有23个纯化的突变体的酶活性都显著提高；50℃孵育处理24小时后，23个突变体都能较好地保留较高的酶活性。其中M1(F293L)和M2(Y254S)的酶活性和热稳定性相对比较好，选择以这两个酶突变体为例，发现可以很好地用于ATP的定量检测，并且这两个突变体50℃孵育处理24小时后仍然能很好地用于ATP的定量检测。更进一步地，发现这样的突变体还可以用于检测细胞数量或细胞活力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种萤火虫萤光素酶突变体，其特征在于，其空间结构上邻近底物结合口袋，对底物的识别与结合或蛋白空间构象的稳定具有贡献，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列，进行以下突变：

A.选自(a)-(t)的突变或其组合：

(a)第293位氨基酸F突变为L(M1)；

(b)第254位氨基酸Y突变为S(M2)；

(c)第239位由V突变为A(M5)；

(e)第57位由K突变为R(M14)；

(g)第525位由S突变为P(M17)；

(h)第231位氨基酸N突变为A，R或K(M20、M21或M22)；

(i)第229位氨基酸A突变为R或K(M23或M24)；

(j)第229位由A突变为K，第231位由N突变为K(M25)；

(k)第231位由N突变为K，第293位由F突变为L(M27)；

(l)第229位由A突变为R，第231位由N突变为R(M29)；

(m)第231位由N突变为R，第293位由F突变为L(M30)；

(n)第229位由A突变为K，第231位由N突变为A(M31)；

(o)第231位由N突变为A，第293位由F突变为L(M33)；

B.将A蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(t)所限定的位点是保守的；

C.与A蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性且具有A蛋白功能的由A衍生的蛋白，但对应于A中(a)-(t)所限定的位点是保守的。

2.一种提高萤火虫萤光素酶的酶活性和/或热稳定性的方法，其特征在于，所述方法通过点突变进行，包括：将萤火虫萤光素酶进行突变改造，形成权利要求1所述萤火虫萤光素酶突变体。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的萤火虫萤光素酶突变体。

4.一种载体或含有该载体的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸；或，所述宿主细胞中含有所述载体或其基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种生产权利要求1所述的萤火虫萤光素酶的突变体的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)培养权利要求4所述的宿主细胞；

(ii)收集含有所述的萤火虫萤光素酶突变体的培养物；

(iii)从培养物中分离出所述的萤火虫萤光素酶突变体。

6.权利要求1所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物的用途，用于催化氧化萤火虫萤光素酶底物、产生ATP依赖性生物发光、用于检测细胞数量或细胞活力。

7.一种催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的方法，包括：利用权利要求2所述的萤火虫萤光素酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其裂解产物进行催化氧化、在ATP存在的条件下产生生物发光。

8.如权利要求6所述的用途或权利要求7所述的方法，其特征在于，用于包括下组的反应：

体外ATP检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，测定包含于溶液体系中的ATP的量；

细胞活力检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，与细胞培养物混和，测定细胞活力；

细胞数量检测；较佳地，利用所述萤火虫萤光素酶突变体、萤光素酶底物，与细胞培养物混和，测定细胞数量。

9.一种用于催化氧化萤火虫萤光素、产生生物发光的检测体系或检测试剂盒，其中含有：权利要求2所述的萤火虫萤光素酶突变体，或权利要求4所述的宿主细胞或其培养物或裂解物。

10.一种ATP测试仪，其中包括：

容器，包含于容器中的权利要求2所述的萤火虫萤光素酶突变体；

容器，包含于容器中的萤光素酶底物；

采样、加样及反应装置，用于添加待测样品，该待测样品是需要进行ATP测定的样品；

较佳地，还包括气体供应装置，所述气体包含氧气。