JP7461414B2 - Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物 - Google Patents

Description

本開示は医薬及び神経学に関する。より詳しくは、本開示は神経学的状態を治療するために有用な特異的ＲＯＣＫ２阻害剤化合物に関する。

Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）は、様々な組織における細胞骨格、運動性、及びジャンクション接点（junctional contact）の調節に中心的な役割を果たすセリン／トレオニンキナーゼである。ＲＯＣＫは小型ＧＴＰアーゼＲｈｏが活性化されたときに活性化され、かつＲＯＣＫはＲｈｏの下流にあって複雑な細胞内シグナル伝達カスケードにおける他のキナーゼのリン酸化に重要な役割を果たす。２つのＲｈｏキナーゼアイソフォーム、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２があり、これらはいずれもＲｈｏによって活性化される。ＲＯＣＫ１は広範囲の生体内分布を有する（しかし脳及び骨格筋では少ない）。ＲＯＣＫ２は、中枢神経系（特許文献１）、脳、心臓、及び肺で発現されるが、肝臓、脾臓、腎臓、及び精巣では比較的少ない。これら２つの異なる形態は生物学的活性及び機能に違いを有する可能性がある（非特許文献１～３）。

Ｒｈｏ及びＲＯＣＫはいずれも、多種類の神経外傷及び神経血管疾患において異常に活性化される。ＲＯＣＫの阻害剤は傷害後の神経突起の成長及び軸索再生を促進し、かつＲＯＣＫの阻害剤はさらに、脳卒中後の内皮細胞における、及び動脈瘤又は血管腫のような神経血管疾患における、ＲＯＣＫ活性化の低減にも有効である。

血栓又は血栓塞栓症によって引き起こされた脳卒中が血管を通る血流を遮断すると（虚血）、血管壁自体の細胞を含む組織への酸素供給が減少する（低酸素症）。血管壁の細胞に対するこの傷害は血管壁の透過性増大をもたらし、血漿成分が周囲の脳組織中に漏れ出すことが可能となる。多くの場合、血管壁の機能的な問題により血栓のエリアで脳内への明白な出血が生じる場合がある。ＲＯＣＫシグナル伝達は、この不適当な血管透過性増大の基礎を成す要素である（非特許文献４）。

くも膜下出血は緊急の治療介入を要する状態であり、患者の転帰不良を伴うことが多い。外科的切開又は血管内外科の手法のいずれかが、損傷を限定するための出血の停止又は極小化のいずれかを行うために、一般に適用される。この障害の患者を管理する際の重要な要点は、共存疾患として生じることの多い、血管攣縮及び血管緊張の変化を制御することである。ニモジピンのようなカルシウムチャネル遮断薬は、ＲＯＣＫ阻害剤ファスジルと同様に、臨床的に使用されてきた（非特許文献５）。ファスジルはこの状況で血管攣縮を制御するために使用されてきた一方、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方に対するファスジルの非選択的な効果並びに恐らくは他のキナーゼに対するファスジルのオフターゲット効果が、その使用を出血後の最初の２週間だけに制限してきた。

同様に、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が生じる場合、多数の力（例えば衝撃力又は剪断力）が、ニューロン及びグリアだけでなく出血を誘発する脳の血管系にも、直接的な一次的損傷をもたらす可能性がある。ＴＢＩに続いて、二次的損傷が生じる可能性もある。これらの損傷の多くは、血管の凝血塊の帰結としての負傷エリアにおける血液潅流の減少、及び血液脳関門を横切る血管透過性の増大に起因する組織浮腫の発症、の結果である（非特許文献６）。

脊髄損傷では、血液脳関門が崩壊する。さらに、壊れた軸索はＲｈｏキナーゼの過剰活性化のおかげで自然には再生しない。Ｒｈｏキナーゼの不活性化は脊髄損傷後の機能的な修復を促進する（非特許文献７）。

脳海綿状血管腫（ＣＣＭ）は神経系の血管系に影響を及ぼす別の障害である。ＣＣＭは、本質的に神経系内の静脈（低圧）血管床においてのみ生じる血管奇形である。血管壁を形成する細胞においてこの障害に遺伝的に関係する３つのタンパク質のうちいずれかの機能不全が、細胞間の接着低下及びＲＯＣＫの超活性化を引き起こす。究極的にはこれが上記血管壁における漏出性の増大をもたらし、血球及び他の血漿成分が調節されることなく脳に入ることを可能にする（非特許文献８）。血液脳関門は典型的には非常に強固な、かつ高度に調節された構造であり、微小血管の細胞（毛細血管内皮細胞、周皮細胞）と、星状細胞を含む神経系の他の細胞との間に形成される。血液脳関門の機能は、血液が運ぶ分子の脳への流入と、血漿中に存在する細胞が脳に入る能力とを高度に調節することである（非特許文献９）。脳組織中への血漿タンパク質及び他の分子の無秩序な放出は一般に脳内の機能的な問題をもたらし、かつ赤血球の蓄積は病的な鉄沈着を引き起こす可能性がある。

小分子キナーゼ阻害剤は典型的には、キナーゼのＡＴＰポケットへの結合についてＡＴＰと競合する。ＡＴＰポケットの構造は保存されているので、キナーゼ阻害剤は多数のキナーゼに対して非特異的に結合し、その結果不要なオフターゲットのキナーゼ阻害を引き起こす可能性がある。一部のキナーゼはオンターゲットの効果により毒性を引き起こすが、その場合にはリスク便益分析が薬剤開発の判断を推進することになろう。オフターゲット効果は心毒性を含む毒性を引き起こす可能性があり、かつこれらはキノム（kinome）スクリーニングによって検出可能である。ＡＭＰで活性化されるタンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）の不活性化は、同キナーゼが細胞代謝の調節因子であり、かつその活性化は心筋細胞がエネルギーストレス下にある時に必要とされるので、心毒性の一因となる（非特許文献１０）。数多くのキナーゼ阻害剤が、心毒性のリスク増大にもかかわらずヒトでの使用について承認されている。

ほとんどのＲｈｏキナーゼ阻害剤はＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方を標的とし、したがって非選択的である。例えば、非選択的ＲＯＣＫ阻害剤であるファスジルはＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方を阻害する。ファスジルは、脳出血後の脳血管攣縮の短期治療のために開発された（非特許文献１１）。ファスジルは脊髄損傷においても研究されてきた（非特許文献１２）。残念なことに、ファスジルは、悪心、皮下出血、くも膜下出血、発熱、腎不全、及び低血圧を含む毒性を引き起こし、従ってファスジルの長期使用は重篤な合併症を引き起こす（非特許文献１３；非特許文献１）（http://www.ehealthme.com/drug_side_effects/Fasudil-Hydrochloride-1268381）。

別の例は、乾癬の治療における効能について臨床的に試験がなされている、ＲＯＣＫ２特異的Ｒｈｏキナーゼ阻害剤のＳＬｘ‐２１１９である（https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02317627?term=kd025&rank=2）。残念なことに、ＳＬｘ‐２１１９は、脳卒中のマウスモデルでの神経保護において効能を示すためには高用量で使用しなければならず（非特許文献１４）、また、試験されたこれらの有効用量は、体表面積に基づいてヒト用量に変換すると、ヒトの耐性用量よりも多かった（非特許文献１５）。上記の比較は、全身に使用しても安全であり、かつ神経学的状態を治療するために使用可能である治療用ＲＯＣＫ阻害剤を開発する際の難しさを浮き彫りにしている。

ＲＯＣＫ２についてより高い選択性を有するＲｈｏキナーゼ阻害剤は、低血圧という関連副作用の出現率を減少させる（非特許文献３）。これは恐らく、ＲＯＣＫ１が平滑筋において主要なＲｈｏキナーゼであり（非特許文献１６）、かつ低血圧という副作用を引き起こすのは血管平滑筋の緊張を緩めることであり、従って神経障害を治療するためのファスジルのような非選択的ＲＯＣＫ阻害剤の慣性的な全身使用は防止されているからであると思われる。

ＦＳＤ‐Ｃ１０はＲＯＣＫ１よりもＲＯＣＫ２を選択的に標的とする阻害剤の例である（非特許文献３）。この阻害剤はファスジルほどは低血圧を引き起こさず、ＲＯＣＫ２と比較してＲＯＣＫ１への親和性を低減することが薬剤開発にとってより好ましいことを示している。しかしながらＦＳＤ‐Ｃ１０は、ＲＯＣＫ２について高い親和性を持たず、ＩＣ_５０はＲＯＣＫ１について１１４１μΜ及びＲＯＣＫ２について７１１μΜであって該化合物は妥当な薬らしい特性を有していない。ＦＳＤ‐Ｃ１０がファスジルと比較された時、ＦＳＤ‐Ｃ１０は多発性硬化症の実験モデルにおける神経栄養因子の発現の誘導においてファスジルほど有効ではなく、またＦＳＤ‐Ｃ１０で治療された動物は体重が減少する傾向があり、潜在的な効能対安全性の問題が示唆された。

したがって、必要とされているのは、ＲＯＣＫ２について選択性を有するが完全な特異性は備えてない、より治療効果のある高親和性のＲＯＣＫ阻害剤である。

米国特許第７，５７２，０１３号明細書

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Ｒｈｏキナーゼ阻害剤化合物ＢＡ‐１０４９の（Ｒ）鏡像異性形態（ＢＡ‐１０４９（Ｒ））、及びそのヒドロキシル代謝物は、ＲＯＣＫ２を標的とし、かつ神経血管外傷後の脳の内皮細胞におけるＲＯＣＫの活性化を解消する能力を有していることが発見された。さらに、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は神経学的外傷後のニューロンからの神経突起の成長を促進し、かつＣＮＳの外傷後のニューロンにおけるＲＯＣＫ活性化を解消する潜在能力を有することも発見されている。

これらの発見は、一部にはＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物に関し、かつＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物を用いてＣＣＭ、脳卒中、くも膜下出血後の血管攣縮、脳動脈瘤、脊髄損傷、及び外傷性脳損傷を予防及び治療する方法に関する本開示を、発展させるために活用されてきた。

１つの態様では、本開示は、ＢＡ‐１０４９のＲ鏡像異性体、その重水素化された形態、及びこれらのアジピン酸塩を提供する。
別の態様では、本発明は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の活性ヒドロキシル代謝物（１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ））及びその重水素化された形態、並びにこれらのアジピン酸塩を提供する。

本開示はさらに、脳卒中、くも膜下出血後の血管攣縮、脳動脈瘤、脊髄損傷、又は外傷性脳損傷に罹患している患者の前記疾患を治療する方法であって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性ヒドロキシル代謝物のうち少なくともいずれか一方を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を、患者に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、ヒドロキシル代謝物は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）である。いくつかの実施形態では、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）のヒドロキシル代謝物のうち少なくともいずれか一方は、重水素化されているか、アジピン酸塩であるかのうち少なくともいずれかである。

別の態様では、本開示は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、その活性ヒドロキシル代謝物、例えば１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９、又はこれらの混合物を含んでなる医薬製剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物のうち少なくともいずれか一方は重水素化されている。他の実施形態では、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物のうち少なくともいずれか一方はアジピン酸塩である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＲＡ‐１０４９（Ｒ）ではないＲｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含んでなる。

ある実施形態では、ヒドロキシル代謝物は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）である。
さらに提供されるのは、ＣＣＭに罹患している患者のＣＣＭを治療する方法であって、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、並びにその重水素化物及びアジピン酸塩のうち少なくともいずれか、のうち少なくともいずれかを含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を、患者に投与することを含む方法である。さらに他の実施形態では、医薬製剤は、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない第２のｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含んでなる。他の実施形態では、該方法は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を投与することをさらに含む。

ある実施形態では、ヒドロキシル代謝物は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）である。
さらに別の態様では、本開示は、ＣＣＭ、脳動脈瘤、脳卒中、くも膜下出血後の血管攣縮、又は脊髄損傷に罹患している患者の前記疾患の治療であって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はその活性代謝物ではない少なくとも１つのｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる医薬製剤を投与することを含む治療を提供する。ある実施形態では、医薬製剤は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない、第２のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる。いくつかの実施形態では、該方法は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はその活性代謝物ではない治療上有効な量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を、投与することをさらに含む。

本開示の先述及びその他の目的、本開示の様々な特徴、さらに本開示それ自体は、以降の説明を添付の図面と併せて読めば、より十分に理解可能である。

図１Ａは選択的ピペリジニル化合物ＢＡ‐１０４９の概略図であり、星印は不斉炭素を特定している。図１Ｂはファスジルを示す概略図である。図１ＣはＳＬｘ‐２１１９（ＫＤ‐０２５とも呼ばれる）を示す概略図である。図１Ｄは１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を示す概略図である。 図２はＢＡ‐１０４９のラセミ体合成を示す概略図であり、Ｒ鏡像異性体はラセミ体混合物からカラムクロマトグラフィーによって精製可能である。 図３は、選択性の改善のために添加されたルイス酸を用いるメチル基のジアステレオ選択的導入を利用した、光学的に純粋なＢＡ‐１０４９（Ｒ）を調製するための合成スキームを示す図である。 図４は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（「ＮＴ‐００００７７」）を調製するための代替合成スキームを示す概略図である。 図５は、エナンチオピュアなＢＡ‐１０４９（Ｒ）の合成の最後から二番目のＢｏｃ保護化合物で開始する、光学的に純粋な１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を調製するための合成スキームを示す概略図である。 図６ＡはＢＡ‐１０４９（Ｓ）についてのＲＯＣＫ１に対する結合解離曲線のプロットを示すグラフである。図６ＢはＢＡ‐１０４９（Ｒ）についてのＲＯＣＫ１に対する結合解離曲線のプロットを示すグラフである。図６ＣはＢＡ‐１０４９（Ｓ）についてのＲＯＣＫ２に対する結合解離曲線のプロットを示すグラフである。図６ＤはＢＡ‐１０４９（Ｒ）についてのＲＯＣＫ２に対する結合解離曲線のプロットを示すグラフである。 図７ＡはＲＯＣＫ１に対するＢＡ‐１０４９（Ｓ）のＩＣ_５０分析のための阻害曲線プロットを示すグラフである。図７ＢはＲＯＣＫ２に対するＢＡ‐１０４９（Ｓ）のＩＣ_５０分析のための阻害曲線プロットを示すグラフである。図７ＣはＲＯＣＫ１に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）のＩＣ_５０分析のための阻害曲線プロットを示すグラフである。図７ＤはＲＯＣＫ２に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）のＩＣ_５０分析のための阻害曲線プロットを示すグラフである。 図８は、一時的な中大脳動脈閉塞（脳卒中）が施されたマウス由来の脳ホモジネートを正常なマウス（脳卒中なし）と比較したウエスタンブロットを示す図であり、脳の左半球（Ｌ）及び右半球（Ｒ）からの組織ホモジネートについて、ＲＯＣＫ活性の下流の標的であるホスホコフィリンに対する抗体を用いて調査しており、脳卒中の脳の左側が患側であり、ホスホコフィリン発現の増加を示している。 図９は、ＭＣＡＯ及びラセミ体ＢＡ‐１０４９又はファスジルを用いた治療の後の、脳の脳卒中半球と対照半球との間のホスホコフィリン発現の左右の比率を示すグラフであり、脳の両側で同等の発現であることを示す０の近くへの比率の変化で視認できるように、ＢＡ‐１０４９はホスホコフィリン発現の比率を強力かつ顕著に低減した。 図１０Ａ～図１０Ｄ［［ＦＩＸ］］は、ＢＡ‐１０４９（Ｄ）、ファスジル（Ｃ）又はビヒクルのみ（Ａ）及び（Ｂ）で治療した脳卒中の脳の卒中側の島皮質の顕微鏡写真を示す図であり、ビヒクルのみを注射された動物では脳の卒中側（Ａ）を脳卒中の影響を受けていない反対側（Ｂ）と比較し、ホスホＭＬＣ２に対する抗体を使用する免疫組織化学法に脳切片を供した。図１０Ｅ～図１０Ｆは、Ｉｂａ‐１抗体を用いた免疫染色により検出された活性化ミクログリアの顕微鏡写真を示す図であり、ミクログリアは脳卒中側で活性化され（Ｅ）、活性化はＢＡ‐１０４９によって解消されている（Ｆ）。 図１１Ａは、成体マウスへの腹腔内注射により投与された様々な濃度のＢＡ‐１０４９（Ｒ）を使用した用量‐応答実験を示すグラフであり、ＲＯＣＫ活性化のバイオマーカーとしての左対右の脳におけるホスホコフィリンの分析は、ＲＯＣＫ活性化を正常（１の値）まで解消するための最小有効量が１ｍｇ／ｋｇであることを示している（Ａ）。図１１Ｂは、個々の動物についての右（反対側）及び左（脳卒中側）におけるホスホコフィリンレベルを、所与の動物についての右及び左の脳の値を線で接続して示すグラフである。 図１２Ａは、中大脳動脈閉塞及び再潅流開始の直後にＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はビヒクル（対照）を用いて治療した４時間後のマウス脳におけるホスホコフィリンの低減を示すグラフである。図１２Ｂは、一時的な中大脳動脈閉塞及び再潅流開始の直後にＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はビヒクル（対照）を用いて治療した２４時間後のマウス脳におけるホスホコフィリンの低減を示すグラフである。図１２Ｃは、中大脳動脈閉塞の２４時間、７２時間、及び１６８時間前にＩ．Ｐ．で投与される１０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）を用いたマウスの前処置について示すグラフである。 図１３Ａは、ＭＣＡＯの後にＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はビヒクル（対照）で処理され、次いで蛍光画像では赤色に見えるエバンスブルーを注射されたマウスの左側（Ｌ）及び右側（Ｒ）の皮質を示す写真である。図１３Ｂは図１３Ａの結果を示すグラフである。 図１４は、組織１ｇあたりのｎｇ量として計測された、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、又は経口（ＰＯ）投与後の脳内で検出されたＢＡ‐１０４９（Ｒ）の浸透を示すグラフである。 図１５Ａ～図１５Ｄは、細胞培養においてプレート培養され、（Ａ）対照としてＤＭＳＯ、（Ｂ）ラセミ体のＢＡ‐１０４９、（Ｃ）ＢＡ‐１０４９（Ｓ）、及び（Ｄ）ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を用いて処理された神経のＮＧ‐１０８細胞を示す顕微鏡写真である。 図１６Ａ～図１６Ｃは、（Ａ）５μΜのＳＬｘ‐２１１９、（Ｂ）５μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又は（Ｃ）５０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理されたＮＧ‐１０８細胞を示す顕微鏡写真である。 図１７は、培養７日後（Ｄ７）又は培養１日後（Ｄ１）にＰＴＥＮの発現をノックダウンするためにＰＴＥＮに対するＲＮＡｉを用いて３日間処理された初代ラット皮質ニューロンのホモジネートのウエスタンブロットを示す図であり、ＲＯＣＫ２、ＰＴＥＮ、及びＧＡＰＤＨの発現を示している。 図１８Ａ～図１８Ｂは、内皮細胞に対するリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）（ＲＯＣＫの活性化を誘導することが知られた化合物）の効果（Ｂ）を、対照の未処理の細胞（Ａ）と比較して示す顕微鏡写真である。 図１９Ａは、Ｒｈｏの活性化を誘導するためにＬＰＡで処理され、次にＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理され、次にストレスファイバーを示すためにファロイジンで染色された内皮細胞を示す顕微鏡写真である。図１９Ｂは、Ｒｈｏの活性化を誘導するためにＬＰＡで処理され、次にファスジルで処理され、次にストレスファイバーを示すためにファロイジンで染色された内皮細胞を示す顕微鏡写真である。図１９Ｃは、Ｒｈｏの活性化を誘導するためにＬＰＡで処理され、次にＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理され、次にジャンクション複合体を示すためにビンキュリンで染色された内皮細胞を示す顕微鏡写真である。図１９Ｄは、Ｒｈｏの活性化を誘導するためにＬＰＡで処理され、次にファスジルで処理され、次にジャンクション複合体を示すためにビンキュリンで染色された内皮細胞を示す顕微鏡写真である。 図２０は、ラット、ヒト、サル、イヌ、及びマウス由来の肝細胞の処理により生成されたＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその代謝物のクロマトグラフィーのプロファイルを示す図であり、イヌは代謝物を生産せず、ラットは他の生物種では見られない少量の代謝物（Ｍ３３６ａ）を生じることが示されている一方、７．４分のピークは１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）に相当し、７．６分より遅く溶出するピークはすべてバックグラウンドのピークである。 図２１ＡはＢＡ‐１０４９（Ｒ）の構造を示す概略図である。図２１Ｂは１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の構造を示す概略図である。図２１ＣはＮ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の構造を示す概略図である。 図２２Ａは、マウスへの５ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）の静脈内投与後の、脳内のＢＡ‐１０４９（Ｒ）（点線）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（実線）の濃度の時間経過を示すグラフである。図２２Ｂは、２．５ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）の静脈内投与の３０分後における、ラットの脳及び血管組織（下大静脈由来）のＢＡ‐１０４９（Ｒ）（白抜きのバー）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（黒塗りのバー）の濃度を示すグラフである。 図２３は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）並びに２つの代謝物１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＮ‐オキシドＢＡ‐１０４９（Ｒ）による精製ＲＯＣＫ２の阻害曲線を比較して示すグラフである。 図２４は、ヒト臍静脈内皮細胞がＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）の精製立体異性体並びにＢＡ‐１０４９（Ｒ）の２つの代謝物である１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＮ‐オキシドＢＡ‐１０４９（Ｒ）を用いて処理された時の、ｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９のイムノブロットを装荷量対照のＧＡＰＤＨと比較して示す図である。 図２５Ａ～図２５Ｆは、ＲＯＣＫの活性化を誘導するためにＬＰＡで処理され、続いて１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図２５Ｂ）、１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図２５Ｃ）、１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）（図２５Ｅ）、又は１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）（図２５Ｆ）を用いて処理されたヒト臍静脈内皮細胞を示す顕微鏡写真であり、図２５Ａは未処理（対照）の細胞を示し、図２５ＤはＬＰＡのみで処理された細胞を示す。 図２６Ａは、ヒト臍静脈内皮細胞がＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理された時のｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９のイムノブロットを装荷量対照のＧＡＰＤＨと比較して示す図である。図２６Ｂは、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を用いた処理から得られたイムノブロット（図２５Ａに示す）のデンシトメータ計測結果を示すグラフであり、ｐＭＬＣ２のデンシトメータ計測値は正規化されて未処理対照の％としてプロットされ、阻害濃度（ＩＣ_５０）が計算されている。 図２７は、動的水蒸気吸着測定（ＤＶＳ）試験が行われる前及びＤＶＳ試験が行われた後の、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）アジピン酸塩形態の粉末Ｘ線回折分析のトレースを示すグラフであり、湿気への曝露及びその後の乾燥は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）アジピン酸塩のＸ線回折によって検出されるように結晶格子を変化させないことが、示されている。 図２８は、未治療であるか、又は負傷後の最初の２週間にわたりＢＡ‐１０４９（Ｒ）で毎日治療されたか若しくは負傷後の３週目及び４週目の間にＢＡ‐１０４９（Ｒ）で毎日治療されたＳＣＩマウスのコホートから得られた、行動的転帰計測結果（オープンフィールドでの自発運動及び後肢握り行動）を示す概略図である。

上記の特許、特許出願、及び出版物の開示内容はその全体が、本明細書中に記載されかつ特許請求の範囲に述べられた本発明の日付において当業者に知られているような最先端技術についてより十分に説明するために、ここで参照により本願に組み込まれる。該特許、特許出願、及び出版物と本開示内容との間に何らかの矛盾が存在する場合は本開示内容が適用されることになる。

別途規定のないかぎり、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示内容が属する分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中の基（group）又は用語について提供された最初の定義は、別途記載のないかぎり、本明細全体にわたって個別に又は別の基の一部として、その基又は用語に適用される。

本開示は、ＢＡ‐１０４９のＲ鏡像異性体（ＢＡ‐１０４９Ｒ）、その活性代謝物、例えば１‐ヒドロキシ‐ＢＡ１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物のうち少なくともいずれか一方の重水素化された形態、並びにＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその活性代謝物のうち少なくともいずれか一方のアジピン酸塩を提供する。本開示はさらに、医薬製剤中の上記化合物を使用して様々なＣＮＳの障害及び損傷を治療する方法を提供する。

［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の合成］
ＢＡ‐１０４９（図１Ａ）すなわちラセミ混合物として存在する４‐置換ピペリジン誘導体は、それについて知られた任意の方法で作製可能であり、かつ米国特許第７，５７２，９１３号及び同第８，９５７，０９３号明細書に記載されておりまたその調製方法が述べられている（図２）。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図２２Ａ）は、（Ｒ）及び（Ｓ）鏡像異性体のラセミ混合物からの、例えばカラムクロマトグラフィーによる精製を経て調製可能である。あるいは、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、図３に示されるような光学活性的に純粋な化合物としてデノボ合成されることも、当分野で既知の任意の方法によって合成されることも可能である。

あるいは、図４に示されるように、また実施例１に記載されるように、ＢＡ‐１０４９の立体制御合成を実施することが可能である。簡潔に述べると、この方法では、市販の１‐ベンジルオキシカルボニル‐４‐ホルミルピペリジン（１）と（Ｓ）‐（－）‐２‐メチル‐２‐プロパンスルフィンアミドとの標準条件下での縮合、室温で１８時間の撹拌、ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）による濾過、有機層の分離、カラムクロマトグラフィーによる濃縮及び精製から、必要とされるキラルのイミン２が得られる。後者はその後、低温でのメチルグリニャールの選択的添加によって（Ｒ，Ｓ）ジアステレオ異性体３に変換された。キラル補助基の除去、保護基の操作、及びイソキノリン８の導入により、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のラセミ体合成（図２を参照）で使用されるのと同一の中間体７が得られる。

［１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の合成］
１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）代謝物は、肝細胞をＢＡ‐１０４９（Ｒ）に曝露した後に該肝細胞の培養物から単離され、実施例２に記載されるようにしてＬＣ‐ＭＳ法を使用して特徴解析された。

図５は、図２に例証された化合物９で開始する、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を化学合成する１つの非限定的な方法を示す。
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の結合の特異性］
ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）の特異性／選択性を測定するために、ラセミ体のＢＡ‐１０４９及びその個々の鏡像異性体についての解離定数（Ｋ_Ｄ）値が以下のようにして測定された。

ＢＡ‐１０４９が合成され、該ラセミ混合物はその鏡像異性体へとキラルカラムにて分離された。ＢＡ‐１０４９に対して構造類似性を有する６つのさらなるＲｈｏキナーゼ阻害剤（すなわちＢＡ‐１０４１、ＢＡ‐１０４２、ＢＡ‐１０４３、ＢＡ‐１０５０、ＢＡ‐１０５０Ａ、及びＢＡ‐１０５０Ｂ）も合成された。次いでこれらの化合物のＫ_Ｄが、ＲＯＣＫ２に対するそれらの選択性を測定するために、計測された（実施例２、表５を参照）。

図６Ａ～図６Ｄ及び表１は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び（Ｓ）異性体によるＲＯＣＫ１（図６Ａ及び図６Ｂ）又はＲＯＣＫ２（図６Ｃ及び図６Ｄ）への結合についてのＫ_Ｄを示している。表１はさらに、ファスジル及びＳＬｘ‐２１１９によるＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２への結合についてのＫ_Ｄ、並びにこれらの化合物の各キナーゼについての解離定数の比（すなわちＲＯＣＫ２への結合についての選択性）も示している。

上記の結果から、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＲＯＣＫ２に最も強く結合したことが明らかである。対照的に、ＢＡ‐１０４９の（Ｓ）鏡像異性体は、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に同様の親和性で結合した。

［Ｄ． ＢＡ‐１０４９のＩＣ_５０測定］
次いで、効力（ＩＣ_５０値）すなわちＢＡ‐１０４９の鏡像異性体がＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２のいずれかを阻害する能力が測定された。２つの類似した競合結合アッセイが使用され、該アッセイでは、１０μΜの標準ＡＴＰ濃度を用いてＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２についての測定を実施するためにそれぞれの化合物が固定化酵素活性部位指向性リガンドと競合する能力が計測された。

図７Ａ～図７Ｄ及び表２に示す結果は、直接的フィルタ結合放射測定キナーゼアッセイ（direct filter-binding radiometric kinase assay）（実施例２を参照）を使用して得られた。ＢＡ‐１０４９（Ｓ）（図７Ａ及び図７Ｂ）並びにＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図７Ｃ及び図７Ｄ）についてのＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対するＩＣ_５０は、いずれの酵素反応についても１０μΜのＡＴＰを使用して測定された。

結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び（Ｓ）がＲＯＣＫ２選択的であること、並びにＢＡ‐１０４９（Ｒ）が最も優れたＲＯＣＫ２ ＩＣ_５０（０．２４μΜ）を有することを示している。

実施例２に記載されたプロトコールによって得られ、表３の結果は、それぞれの所与のＲＯＣＫアイソフォームに特異的なＡＴＰのＫｍ濃度（ＲＯＣＫ１では７０μΜ及びＲＯＣＫ２では１５μΜのＡＴＰ）で反応が実施された、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）についてのＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対するＩＣ_５０を示している。

上記の結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＲＯＣＫ１よりもＲＯＣＫ２について８６倍高い選択性を有することを示している。異なるＡＴＰ濃度を使用するとＲＯＣＫ選択性が変動するのは、１０μΜのＡＴＰではＲＯＣＫ１はそのＫｍ未満であり従ってＶ_ｍａｘに達するのにより長くかかることになり、酵素活性と競合して阻害するのにより少ないＢＡ‐１０４９しか必要としない、という事実によるのかもしれない。よって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、ＡＴＰ濃度が健康な組織と比較して減少している虚血組織又は病変組織において、ＲＯＣＫ２について高い効力を有している。

［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の治療的使用］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、中枢神経系において高度に発現されるＲＯＣＫのアイソフォームであるＲＯＣＫ２について選択性を有する。ＲＯＣＫ２は、様々な神経系疾患のニューロンにおいて、一部には該疾患の炎症性構成要素、並びにＲＯＣＫの活性化体として働くことが知られている腫瘍壊死因子及びＬＰＡのような分子の侵入を原因として、超活性化される。そのような疾患には、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ハンチントン病、及び脊髄筋萎縮症（ＳＭＡ）が挙げられる。神経外傷におけるミエリン由来の増殖阻害タンパク質の放出はＲＯＣＫ２の超活性化を引き起こすので、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、脊髄損傷、外傷性脳損傷、視神経損傷及び末梢神経損傷を治療するのに有用である。

虚血は脳内皮細胞におけるＲＯＣＫの超活性化を引き起こすので、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、脳卒中、くも膜下出血後の血管攣縮、脳海綿状血管腫、遺伝性出血性末梢血管拡張症、脳動脈血管奇形、及びベーチェット病を治療するのに有用である。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、自閉症、並びに樹状突起棘に異常を有する、脆弱Ｘ、レット症候群及びその他の障害のような疾患を、治療するのに有用である。これは、ＲＯＣＫが細胞骨格の、及び樹状突起棘形成の、重要な調節因子であるからであり、また異常な樹状突起棘をもたらすＲＯＣＫの過剰活性化が、様々な形態の自閉症において報告されているからである。

加えて、ＲＯＣＫ２は大型の結腸（large colon）の上皮細胞で発現されるＲＯＣＫの主要形態であるので、ＢＡ‐１０４９は、病変した上皮細胞においてＲＯＣＫ２が超活性化される疾患を治療するのに有用である。内皮細胞と同様に、ＲＯＣＫ２は上皮細胞の間の細胞‐細胞間ジャンクションを調節する。したがって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、クローン病及び炎症性腸疾患を治療するのに有用である。

ＲＯＣＫは放射線照射に際して上皮細胞で活性化されるので、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、化学療法で使用される電離放射線、又は環境災害に起因する放射線の悪影響から細胞を保護するのに有用である。これは、放射線症候群の胃腸への影響について有用である。

様々な上皮細胞において、ＲＯＣＫはさらにコラーゲンの発現の調節においても役割を果たす。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、例えば腎臓及び肝臓における、様々な繊維性疾患、並びに特に肺の線維症を治療するのに有効であるが、これはＲＯＣＫ２が肺において高度に発現されるからである。

活性代謝物１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はＲＯＣＫ２に対する効能を示し、よって上述のようなＢＡ‐１０４９（Ｒ）に関するのと同じ役割の多くにおいて有用性を有する。アルデヒドオキシダーゼは、生体異物、特にＢＡ‐１０４９（Ｒ）のようなＮ‐複素環である生体異物の代謝におけるその重要性で良く知られた酵素であり、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が経口投与された時の１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の生成におそらくは関与する酵素である。そのため、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、急性期の患者が意識レベルの変化又は低下を示し、よって薬剤の経口投与は困難又は不可能である場合に、静注経路で優先的に使用される。状況によっては、遺伝学又は病理学のいずれかが化合物の選択の指標となるかもしれない。ヒトのアルデヒドオキシダーゼ遺伝子にはこの酵素の活性低減をもたらす可能性のある自然発生の多型が存在するので（ハートマン（Hartmann）ら、ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metab. Disposition）、２０１２年、第４０巻、第５号、ｐ．８５６－８６４）、この集団は上述のような疾患、障害又は損傷について１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の投与から恩恵を受ける。加えて、社会歴において慢性的なアルコールの使用又は乱用が確認されると、上記に挙げられたもののような疾患、障害又は損傷の治療への使用に１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を選ぶことが支持されるが、これはアルコール乱用歴が肝臓の肝細胞におけるアルデヒドオキシダーゼ活性の著しい低下を引き起こす可能性があるからである（ハッスラー（Hutzler）ら、ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metab. Disposition）、２０１４年、第４２巻、第６号、ｐ．１０９０－１０９７）。従って、急性脊髄損傷及び外傷性脳損傷の治療については、酩酊が一般市民においてよく見られる神経外傷との共存疾患であるので、ヒドロキシ代謝物は有用である。

［治療用医薬製剤］
本開示による治療方法に有用な医薬製剤は、治療上有効な量の、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び／又はその活性代謝物であって例えば１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、並びに、それらのアジピン酸塩及び／又はそれらの重水素化形態、のうち少なくともいずれかを含む。ＣＣＭ、動脈瘤、及び上記に挙げられた障害の治療に使用される他の医薬製剤は、治療上有効な量の、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）以外のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む。

本明細書中で使用されるような「治療上有効な量」とは、ＣＣＭ、脳動脈瘤、脳卒中、くも膜下出血後の血管攣縮、又は脊髄損傷のような神経学的外傷を治療するための治療効果及び予防的治療効果のうち少なくともいずれかを提供する量を指す。別のＲｈｏ阻害剤化合物がＢＡ‐１０４９（Ｒ）医薬製剤の一部である場合、又は該化合物が別個の医薬製剤に含めて投与されることになっている場合、治療上有効な量はそれぞれ異なっていてもよく、また製剤中にこれらの薬剤のうち１以上を添加することにより、阻害されるキナーゼの比率を変更することが可能である。

そのような製剤は、既知の技法、例えばレミングトン（Remington）、「ザ・サイエンス・アンド・プラクティス・オブ・ファーマシー（The Science And Practice of Pharmacy）」、第９版、１９９５年に記載されたものに従って薬学的に許容可能な担体を用いて調製される。用語「薬学的に許容可能な担体」とは、本明細書中では、医学的に、本発明の化合物と一緒に許容可能に患者に投与可能であり、かつ該化合物の薬理活性に望ましからぬ影響を及ぼさない、任意の物質を指すものとして理解されるべきであり、よって「薬学的に許容可能な担体」は、例えば、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、張性改変剤、緩衝剤及び任意の他の生理学的に許容可能なビヒクルを含んでなるか又はそれらで構成されている群から選択された、薬学的に許容可能な構成物であってよい。この医薬製剤は、追加のＲｈｏ阻害剤をさらに含有してもよい。

医薬製剤は、注射用、経口用、吸入用、経皮用、膜透過用などのために調製可能である。
経口投与に適した製剤は、個別の単位又は剤形、例えばカプセル剤、カシェ剤、ロゼンジ剤、錠剤、舌下錠、ピル、散剤、果粒剤、チューインガム、懸濁液、溶液、などで提示されうる。剤形はそれぞれ所定量のＲｈｏキナーゼ阻害剤化合物を含有する。溶液の形態の場合、薬学的に許容可能な担体は水性液、例えば薬学的に許容可能なｐＨ緩衝剤で緩衝化されたものであってもよいし、又はＤＭＳＯのような非水性液中に含められても、水中油型若しくは油中水型の乳剤として調製されてもよい。

注射用剤形は、薬学的に許容可能な方式で、例えば不活性ガス雰囲気下でバイアル中に密閉された水性溶液の１２０℃で約１５分～２０分間の蒸気滅菌により、又は０．２μΜ若しくはそれより小さな孔径のフィルタを通す溶液の濾過滅菌と、任意選択で後続する凍結乾燥ステップとにより、又は放射線源からの放射による本発明の化合物を含有する組成物の放射線照射により、滅菌可能である。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はその活性ヒドロキシル代謝物の治療上有効な投与量は、患者によって様々であってよく、かつ患者の年齢、患者の遺伝的特徴、及び診断された患者の状態のような要素、並びに患者への剤形の送達経路に応じたものであってよい。治療上有効な用量、及び剤形の投与の頻度は、当業者に既知の日常的な薬理学的手順に従って決定可能である。例えば、投薬量及び投与の頻度は、様々であってよいし、時間及びその神経学的外傷の重症度の関数として変化してもよい。約０．１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又はこれらの重水素化物若しくはアジピン酸塩の投薬が適切となりうる。

投与は、溶液としての、又は例えば小胞からなど注射された製薬剤形からの持続放出に適している懸濁液としての、脳脊髄液中への注射によるものであってよい。あるいは、定位固定式注射により病変部位へ投与がなされてもよい。

ここで本開示を例証する具体的実施例を参照する。実施例は典型的な実施形態を例証するために提供されており、かつそれにより本開示内容の範囲への限定は意図されていないことを理解されたい。

実施例
実施例１
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の合成］
以下のスキームは、ＢＡ‐１０４９のＲ鏡像異性体（ＮＴ‐００００７７）５０ｍｇ～１００ｍｇの合成について述べており、かつ該分子の絶対構造（（Ｒ）又は（Ｓ））の同定を可能にするキラル合成方法を含んでいる。

１‐ベンジルオキシカルボニル‐４‐ホルミルピペリジン（１）（２．０ｇ、８．１ｍＭ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中の溶液に、（Ｓ）‐２‐メチルプロパン‐２‐スルフィンアミド（１．０ｇ、８．５ｍＭ）を加え、続いてＴｉ（ＯｉＰｒ）_４（４．４５ｍＬ、１６．２ｍＭ）を添加した。得られた溶液を、室温（ＲＴ）で１８時間撹拌し、次いで飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。該混合物をｃｅｌｉｔｅパッドを通して濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄した。層を分離し、有機相を塩水で洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮すると粗製残留物が得られ、該残留物をヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配（７０／３０～３０／６０）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィー（イスコ（Isco） ４０ｇ）により精製して、所望のイミン２が得られた（２．２ｇ、７８％）。

イミン２（２．２ｇ、６．３ｍＭ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）中の－７８℃の溶液に、ＭｅＭｇＢｒ（３．１ｍＬ、Ｅｔ_２Ｏ中に３．０Ｍ、９．３ｍＭ）を添加した。この反応物を－７８℃に１時間維持し、次いでＲＴまで徐々に一晩かけて温めた。該反応物を飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈し、層を分離した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、塩水で洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮した。粗製残留物を、ヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配（７０／３０～１０／９０）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィー（イスコ ８０ｇ）により精製して、所望の材料３（１．６７ｇ、７３％）を得た。

スルフィンアミド３（１．６７ｇ、４．５６ｍＭ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の溶液に、ＨＣｌ（２５ｍｌ、ジオキサン中に４Ｍ、６．２５ｍＭ）を添加した。この反応物を、分析的逆相ＨＰＬＣにより出発物質の消失をモニタリングしながらＲＴでエイジングさせた。出発物質が消費された時、反応物を減圧下で濃縮した。粗製残留物をＥｔＯＡｃで希釈し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、塩水で洗浄し、脱水（ＭｇＳＯ_４）して濃縮した。粗製残留物４を、そのまま次のステップで使用した（１．１６ｇ、９７％）。

アミン４（１．１６ｇ、４．４ｍＭ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．７７ｍｌ、４．４ｍＭ）を、続いてＢｏｃ_２Ｏ（３．２ｇ、１４．６ｍＭ）を添加した。結果として生じる溶液をＲＴで一晩撹拌した。次いで該反応物を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。層を分離し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、塩水で洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮すると粗製誘導体が得られ、該誘導体をヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配（９０／１０～５０／５０）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィー（イスコ ８０ｇ）により精製して、所望の材料５を得た（１．５５ｇ、９７％）。

Ｃｂｚ誘導体５（１．５５ｇ、４．３ｍＭ）のＭｅＯＨ（５０ｍＬ）中の溶液に、パラジウム炭素１０％（１５５ｍｇ）を添加した。結果として生じる懸濁液を水素で２度パージし、反応物を１気圧の水素下でＲＴにて一晩撹拌した。反応物を窒素でパージし、次いでＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、ｃｅｌｉｔｅで濾過し、濃縮して粗製誘導体６が得られ、該誘導体をそのまま次のステップに使用した（０．９８ｇ、定量（quant.））。

５‐イソキノリンスルホン酸（５ｇ、２４ｍＭ）が入ったフラスコに、ＳＯＣｌ_２（２２ｍｌ、３００ｍＭ）を、続いて触媒量のＤＭＦ（０．２５ｍｌ）を添加した。その結果生じる混合物を、還流しながら４時間撹拌した。次いでこれを冷却し、減圧下で濃縮した。残留物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２を用いたトリチュレーションによって精製し、所望の塩化スルフォニル８を白色固形物として得た（４．２ｇ、６６％）。

アミン６（１．０ｇ、４．４ｍＭ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）中の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２．３ｍｌ、１３．１ｍＭ）を、続いて塩化スルフォニル８（１．７３ｇ、６．６ｍＭ）を添加した。その結果生じた溶液をＲＴで一晩撹拌した。該反応物を次に水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。層を分離し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、塩水で洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮すると粗製誘導体が得られ、該誘導体をヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配（７０／３０～１００％）を用いて溶出するカラムクロマトグラフィー（イスコ ８０ｇ）により精製して、所望の材料７を得た。キラルＨＰＬＣに注入された分析用試料は９５％の鏡像異性体過剰率（「ｅｅ」）を示した。ＣＨ_２Ｃｌ_２／Ｅｔ_２Ｏ／ヘキサンからの再結晶により、所望の材料７を白色固形物及びｅｅ＞９９％として得た。（７５０ｍｇ、４１％）。

Ｂｏｃ誘導体７（０．７５ｇ、１．８ｍＭ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）中の溶液に、ＨＣｌ（ジオキサン中に４Ｍ、５ｍｌ、２０ｍＭ）を添加した。該反応物をＲＴで一晩撹拌した。次いで該反応物を減圧下で濃縮した。粗製残留物を最小限のＭｅＯＨで希釈し、Ｅｔ_２Ｏが入ったフラスコに徐々に添加した。この不均質混合物を５分間撹拌し、次いで濾別してＢＡ‐１０４９（Ｒ）を白色固形物として得た（６５０ｍｇ、９３％）。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＨ_３ＯＨ‐ｄ_４、４００ＭＨｚ）：δ９．９７（１Ｈ、ｓ）、９．１８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ）、８．７６－８．８１（３Ｈ、ｍ）、８．１８（１Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、３．９８－４．０１（２Ｈ、ｂｒ ｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ）、３．１５（１Ｈ、ｐ、Ｊ＝６．６Ｈｚ）、２．６２（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝１２Ｈｚ）、１．７９－１．８４（２Ｈ、ｍ）、１．５７－１．６１（１Ｈ、ｍ）、１．４０（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２、４．１Ｈｚ）、１．２４（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）。

実施例２
［１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の合成］
次のスキームは、実施例１で上記に示された同じＢｏｃ誘導体化合物７で開始する１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の合成について述べる。この合成では、絶対立体化学が既知であるように、すでに光学活性的に選択された化合物が生産される。

Ｂｏｃ誘導体７（上記）（１．２ｇ）が入ったフラスコに、窒素でパージされた雰囲気中で７２ｍＬのＤＣＭを添加した。この溶液を撹拌して０～５℃に冷却した。該溶液に、小分けにしたメタクロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ；合計０．９ｇ）を添加し、該反応物を一晩（ＯＮ）撹拌して同時にＲＴまで暖めた。３０ｍＬの１０％Ｎａ_２ＳＯ_３水溶液を添加して３０分間撹拌した。生成物をカラムクロマトグラフィー（イスコ ８０ｇ；フィッシャーサイエンティフィック（Fisher Scientific ）；米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）によって精製し、所望の材料：Ｎ‐オキシド化合物７を得た（９９．２％）。

窒素でパージしたフラスコに０．９ｇの化合物７Ｎ‐オキシドを入れ、９ｍＬのＤＣＭを撹拌しながら添加した。この溶液に、０．２ｇの相間移動触媒テトラブチルアンモニウム硫酸水素塩（ＴＢＡＢ）及び酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）水溶液（４．５ｍＬ）を撹拌しながら添加した。さらに１０分間の撹拌の後、塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ）を該混合物に撹拌しながら徐々に添加した。層を分離し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液、塩水で洗浄し、脱水し（ＭｇＳＯ_４）、濃縮して粗製誘導体を得た。該材料をカラムクロマトグラフィーによって精製した（９８．９％）（イスコ ８０ｇ；フィッシャーサイエンティフィック）。

実施例３
［ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対するＢＡ‐１０４９鏡像異性体の特異性の測定］
Ａ． 手順方法
化合物ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及びその他のさらなるＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＢＡ‐１０４１、ＢＡ‐１０４２、ＢＡ‐１０４３、ＢＡ‐１０５０、ＢＡ‐１０５０Ａ及びＢＡ‐１０５０Ｂを、確立されたプロトコール（米国特許第７，５７２，９１３号明細書）に従って合成した。化合物１０５０Ａ及びＢはカラムクロマトグラフィーによって精製された鏡像異性体であるが正確な配向を同定しなかったので、これらをＡ及びＢと名付けている。各化合物の保存溶液を１００％ＤＭＳＯ中に１００ｍＭとして調製し、気密容器中にて－２０℃で保管した。１０ｍＭの作業用アリコートを、保存溶液を１００％ＤＭＳＯ中で１：１０に希釈することにより調製した。Ｋ_Ｄの測定用には、１０ｍＭの５０μＬアリコートを試験する各化合物について調製した。ＩＣ_５０の測定用には、化合物を１０ｍＭで２０μＬ又は１００μＬのアリコートとして調製した。

ＢＡ‐１０４９及びＢＡ‐１０５０は各々が１つの不斉中心を有するラセミ混合物として存在する。ＢＡ‐１０４９及びＢＡ‐１０５０はそのそれぞれの鏡像異性体に、ＢＡ‐１０４９については（Ｓ）及び（Ｒ）に分割され；ＢＡ‐１０５０鏡像異性体はその絶対立体化学が決定されなかったのでＡ及びＢと呼ばれる。１０ｍＭの保存溶液をＤＭＳＯ中で調製してから該保存溶液を－２０℃で保管した。

ＢＡ‐１０４９についてのＩＣ_５０測定を、後述のような直接的フィルタ結合放射測定キナーゼアッセイを使用して実施した。１例においては、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２のＩＣ_５０測定を１０μΜのＡＴＰ濃度を使用して行った。別の例では、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２のＩＣ_５０測定を、ＡＴＰ濃度１０μΜ、又はＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２についてそれぞれ７０μΜ及び１５μΜのＫｍ ＡＴＰの、いずれかのＡＴＰ濃度を使用して行った。ＡＴＰ濃度の変動については、ＡＴＰ濃度が低く選択性に影響を与える可能性のある虚血組織及び病変組織における潜在的な選択性をより十分に理解するために試験した。

１． 平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）の測定
試験すべき化合物及び対照品のＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対するＫ_Ｄ値を、ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）プロファイリングサービス（米国カリフォルニア州フリーモントのディスカバーエックス・コーポレイション（DiscoverX Corp））を利用して測定した。ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）は、化合物が固定化された活性部位指向性リガンドと競合する能力を定量的に計測する競合結合アッセイに基づいている。該アッセイは、ＤＮＡタグが付されたキナーゼ、固定化されたリガンド、及び試験化合物を組み合わせることにより実施される。試験化合物が固定化されたリガンドと競合する能力は、ＤＮＡタグの定量ＰＣＲによって計測される。

化合物は、３倍系列希釈を用いて１１ポイントの曲線を使用して試験した。試験した最も高い濃度は３０μΜであった。試験化合物を１００％ＤＭＳＯ中で１００×最終試験濃度に調製し、アッセイでは１×に希釈して最終ＤＭＳＯ濃度は１％となった。

ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを、ビオチン化された低分子リガンドを用いてＲＴで３０分間処理し、キナーゼアッセイ用の親和性樹脂を生成した。リガンドが結合したビーズを過剰量のビオチンでブロッキングし、ブロッキングバッファー（ＳｅａＢｌｏｃｋ（商標）（ピアス（Pierce））、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄して、未結合のリガンドを除去し、かつ非特異的な結合を低減した。結合反応は、キナーゼ、リガンドが結合した親和性ビーズ、及び試験化合物を、１×結合バッファー（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ ＤＴＴ）の中で組み合わせることにより組み立てた。反応はすべて、ポリスチレン製９６ウェルプレートにおいて０．１３５ｍＬの最終体積で実施した。このアッセイプレートをＲＴで振盪しながら１時間間インキュベートした。親和性ビーズを洗浄用バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。その後ビーズを、溶離バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μΜのビオチン化されていない親和性リガンド）の中に再懸濁し、ＲＴで振盪しながら３０分間インキュベートした。溶離液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲによって計測した。

曲線はレーベンバーグ・マーカート（Levenberg-Marquardt）アルゴリズムを用いた非線形最小二乗フィッティングを使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）６．０７でフィッティングした。結合定数（Ｋ_Ｄ値）は、ヒル勾配を１に設定したヒルの式すなわち、
応答＝バックグラウンド＋｛シグナル－バックグラウンド｝／｛１＋（Ｋ_Ｄ ^ヒル勾配／用量^ヒル勾配）｝
を使用して標準的な用量‐応答曲線を用いて計算した。

２． 半数阻害定数（ＩＣ_５０）の測定
被験物質及び対照品のＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２に対するＩＣ_５０値は、Ｋｉｎａｓｅ ＨｏｔＳｐｏｔ（商標）プロファイリングサービス（米国ペンシルベニア州モールヴァンのリアクション・バイオロジー・コーポレイション（Reaction Biology Corp.））、及びＩＣ_５０Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（商標）（米国ミズーリ州セントチャールズのユーロフィンズ・ファーマ・ディスカバリー・サービス（Eurofins Pharma Discovery Services））を利用して測定した。いずれのサービスも、プロトコールにわずかな変更を伴う直接的フィルタ結合放射測定キナーゼアッセイを使用する。

化合物を、３倍系列希釈を用いた１１ポイントの曲線を使用して試験した。試験した最高濃度はいずれのサービスについても１００μΜであった。試験化合物は１００％ＤＭＳＯ中で５０×最終試験濃度に調製し、アッセイでは１×に希釈して最終ＤＭＳＯ濃度は２％となった。

一方のアッセイについては、基質のＥＡＫＥＫＲＱＥＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＧＧＳＱＫ（配列番号１）（３０μΜ）を、反応バッファー（表４）及びＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２のいずれかのキナーゼドメイン（表４に示されたとおり）と混合した。次に、化合物（ＤＭＳＯ溶液）を該混合物中に音響混合技術（Ｅｃｈｏ（登録商標）５５０、ナノリットル範囲）（米国マサチューセッツ州ウォルサムのセレクトサイエンス（SelectScience））を介して送達し、ＲＴで２０分間インキュベートした。放射標識されたγ‐^３３Ρ‐ＡＴＰ（１０μΜ）を添加して該反応物をＲＴで２時間インキュベートした。反応物を次いでＰ８１イオン交換紙にスポットし、続いてシンチレーション計数を行った。

他方のアッセイについては、ＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２を反応バッファー、基質、１０ｍＭのＭｇアセタート及びγ‐^３３Ρ‐ＡＴＰ（１０μΜ又はＫｍ濃度）と共にインキュベートし（表４を参照）、ＲＴで４０分間インキュベートした。反応を３％リン酸の添加によって停止し、１０μＬの反応物をＰ３０ ｆｉｌｔｅｒｍａｔ（商標）にスポットし、７５ｍＭリン酸中で３回、メタノール中で１回洗浄した後にシンチレーション計数を行った。

カウント毎分（ｃｐｍ）を以下のようにして活性（％）に変換した：
活性（％）＝｛（Ａ－Ｂ）／Ｃ｝＊１００
Ａ＝被験物質のｃｐｍ
Ｂ＝ブランク（キナーゼドメインを用いない反応）のｃｐｍ
Ｃ＝対照（キナーゼドメインのみを用いた反応）の平均ｃｐｍ
曲線を、４パラメータロジスティック非線形回帰を使用してＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０７でフィッティングした。

ＩＣ_５０値は、可変勾配を備えた用量‐応答曲線から以下のようにして計算した。

生データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２０１３に取り込んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌからのデータを、用量‐応答曲線を導いてＫ_Ｄ値及びＩＣ_５０値を計算するためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０７に転送した。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ２０１３を使用して計算した。データを平均値±ＳＥＭとして示した。

Ｂ． 結果
１． Ｋ_Ｄの測定
測定は２連で実施し、結果は平均測定値として表５に示されている。

平衡解離定数（Ｋ_Ｄ値）を、異なるラセミ体ロットのＢＡ‐１０４９（ロット１及び２）並びに鏡像異性体Ｒ及びＳについて実施した。この分析には、ＢＡ‐１０４９とのその構造類似性及びＲＯＣＫ２を選択的に阻害するその能力に基づいて選択された、６つの他のＲｈｏキナーゼ阻害剤も含めた。これらの化合物には、ＢＡ‐１０４１、ＢＡ‐１０４２、ＢＡ‐１０４３、ＢＡ‐１０５０並びにその鏡像異性体Ａ及びＢが含まれた。

表５に示されるように、ＢＡ‐１０４９及びその鏡像異性体は他のＲｈｏキナーゼ阻害剤と比較してＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方に対して最も強い結合を示し（ｎＭ範囲）、データからＢＡ‐１０４９が依然として最も強いＲｈｏキナーゼＩＩ選択的阻害剤であることが確認された。ＲＯＣＫ２とのＫ_Ｄ値は、既知のＲＯＣＫ１／２キナーゼ阻害剤であるファスジル及びＲＯＣＫ２選択的阻害剤ＳＬｘ‐２１１９（ＫＤ０２５）の値に類似していた。新たに合成されたＢＡ‐１０４９及びその鏡像異性体のロット（ロット２）については反復測定を実施し、最初の測定の結果を確認した。これらの化合物についてのＫ_Ｄ値は、２回の２連測定値（すなわち４つの測定値）の平均を表わす。

２． ＩＣ_５０の測定
ＢＡ‐１０４９を使用して、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方に対するＩＣ_５０値を、１０μΜのＡＴＰ濃度を用いて測定した。ほとんどのキナーゼ阻害剤はＡＴＰの結合と競合するが、生理的なレベルはｍＭ範囲であるにもかかわらず１０μΜがスクリーニングに使用されることが多い。直接的フィルタ結合放射測定キナーゼアッセイの２つの異なる変法を、上述のようにして使用した。結果を表６に示す。

これらの結果は、ＢＡ‐１０４９及びその鏡像異性体がＲＯＣＫ２を選択的に阻害することを示している。１例においてはＲＯＣＫ２の選択性に２～３倍の差があった一方、別の例では、データからＲＯＣＫ２選択性におよそ１２～１３倍の差が示された。ＢＡ‐１０４９ＢはＲＯＣＫ２に対して最も低いＩＣ_５０値（０．２４μΜ）を有し、かつ最も高いＲＯＣＫ２選択性を示した。ＲＯＣＫ２選択性における差は、それぞれのアッセイで使用された個々のキナーゼドメインの調製における違いに起因する可能性が最も高い。キナーゼドメインの純度は、化合物が結合かつ従って阻害する能力に著しい影響を及ぼす可能性がある。加えて、これらの化合物はキナーゼドメイン上に残存する精製用の小さな６×Ｈｉｓタグを備えており、一方でリアクション・バイオロジーはキナーゼドメインに融合させた２６ｋＤａのＧＳＴタンパク質を使用している。

ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）についてのＩＣ_５０値をＫｍのＡＴＰ濃度でＲＯＣＫ１（７０μΜ）及びＲＯＣＫ２（１５μΜ）の両方について測定したが、ＡＴＰ濃度がＲＯＣＫ１のＫｍより低くなるとどうなるかを理解するための人為的アッセイである。この場合、反応の最大速度はより遅くなり、かつＢＡ‐１０４９（Ｒ）はＲＯＣＫ２に対して活性を有し続けることになる。結果を表７に示す。

データは、ＲＯＣＫ１と比較してＲＯＣＫ２に対して５０～６０倍高い選択性を示している。
実施例４
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の用量及び投与経路の決定］
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のネズミ科動物腔内モノフィラメントモデルを、本研究においてマウスに使用する。ＭＣＡＯは、外頚動脈内への外科用フィラメントの挿入、及び該フィラメントを先端がＭＣＡの起点を閉塞するまで内頚動脈内へと通すことを伴い、その結果としてＭＣＡ領域における血流の停止とその後の脳梗塞とをもたらす。この技法は一時的な閉塞をモデル化するために本明細書中で使用される。フィラメントが１ｈ後に除去されると、再潅流が達成される（一過性ＭＣＡＯ）。本研究は、一過性ＭＣＡＯで誘発されたマウスの脳卒中の後のＲｈｏキナーゼ２（ＲＯＣＫ２）の活性化を低減する、最も効果的な用量及び投与経路を決定する。薬力学的応答も本研究において測定する。このモデルは、十分に特徴解析されたＲＯＣＫ２活性のバイオマーカーであるリン酸化アデュシン（ｐ‐アデュシン）、リン酸化ミオシン軽鎖２（ｐＭＬＣ２）、リン酸化コフィリン（ホスホコフィリン）、リン酸化ＬＩＭＫ１／２、及び自己リン酸化ＲＯＣＫ２の使用を通じて、内皮細胞におけるＢＡ‐１０４９（ラセミ混合物）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）の効能を迅速に検出する。効果的な経路及び用量の選択に続いて、バイオマーカー発現の持続期間に基づいてＢＡ‐１０４９（ラセミ混合物）の効果の持続期間を評価するために、経時変化を実施する。

Ａ． 動物試験
２８匹の９週齢のＣ５７ＢＬ／６（チャールス・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories））を本研究に使用した。手術については、マウスを赤外線加熱パッド上に背臥位で配置した。頚部腹側を覆う毛皮を剃り、皮膚を７０％エタノール及びポビドンヨードで消毒した。解剖用実体顕微鏡下で、１ｃｍの正中切開を頚部に施し、開創器を使用して左総頚動脈（ＣＣＡ）、外頚動脈（ＥＣＡ）及び内頚動脈（ＩＣＡ）を露出させた。動脈を注意深く解剖し、周囲の神経及び筋膜から動脈を解放した。ＥＣＡをさらに末梢側で解剖し、２本の８‐０号絹製縫合糸をＥＣＡの基部（stump ）の周りに縛り付け、血管クランプを、ＥＣＡ及びＩＣＡへのＣＣＡ分岐部に適用した。ヴァナス式スプリング剪刀を用いてＥＣＡ基部の終端を小さく切開した。鈍端の５‐０号モノフィラメント縫合糸（ドッコル（Doccol））を切開部に挿入し、ＭＣＡの起点を閉塞するためにＣＣＡの分岐部を９～１０ｍｍ越える距離だけＥＣＡの内腔からＩＣＡの中へと前進させた。該マウスモデルについては、ＣＣＡ分岐部の吻側９ｍｍ～１１ｍｍの距離に挿入する。６０分後、モノフィラメントを除去した。切開部を４．０号のｐｒｏｌｅｎｅ（登録商標）縫合糸で縫合した。１ｍＬの生理食塩水を皮下注射し、かつ疼痛を弱めるために０．１ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを８時間～１２時間ごとに最大４８時間皮下注射した。マウスを、体温調節が再開されるまで加熱パッド上で回復させる。

被験Ｒｈｏキナーゼ阻害剤化合物投薬用溶液は、ＢＡ‐１０４９粉末（ラセミ混合物）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）を無菌のＰＢＳ中に溶解することにより、Ｂ群、Ｃ群、及びＤ群についてそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、及び５０ｍｇ／ｍＬの濃度を達成するように調製した。試験化合物投薬用溶液のｐＨは７に調整した。調製後、投薬用溶液を使用時まで４℃に保ち、保持しておく投薬用溶液は４℃で保管する。

試験化合物投薬用溶液は、ファスジル（カルビオケム（Calbiochem））粉末を無菌のＰＢＳ中に溶解することにより、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、及び５０ｍｇ／ｍＬの濃度を達成するように調製した。試験化合物投薬用溶液のｐＨは７に調整した。調製後、投薬用溶液を使用時まで４℃に保つ。保持しておく投薬用溶液は４℃で保管した。

本研究は、以下表８～表１１のように３部で構成された：

第１部については、被験物質（ＢＡ‐１０４９ラセミ混合物、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ファスジル）及び（生理食塩水）を、２５Ｇ ５／８注射針が取り付けられた無菌の１ｍＬシリンジを使用してＭＣＡＯ手術の３０分後にＩ．Ｐ．単回投与として全てのマウスに体積約０．２ｍＬ（体積は個々の体重に基づいて調整した）として指定の用量で投与した。

第２ａ／２ｂ部については、被験物質及びビヒクル物質を、ＭＣＡＯ手術の３０分後に経口強制投与（ＰＯ）（＜１０ｍｇ／ｋｇ）する（２ａ）か、又は２５Ｇ ５／８注射針が取り付けられた無菌の１ｍＬシリンジを使用してＭＣＡＯ手術の３０分後に右側腹部に皮下（ＳＣ）注射すること（２ｂ）のいずれかにより、全てのマウスに体積約０．２ｍＬ（体積は個々の体重に基づいて調整する）として指定の用量で投与した。

ＭＣＡＯ手術後２４時間において、マウスを安楽死させて脳をウエスタンブロット解析又は免疫組織化学法によるバイオマーカー分析のために採取する。ウエスタンブロット解析については、イソフルランを使用してマウスを麻酔して斬首した。左右の中大脳動脈は、運動皮質及び感覚皮質の領域のそれぞれの脳葉の外側面に供給を行う。小脳の吻側の脳（嗅球を除く）を、閉塞と同側（左半球）及び反対側（右半球）で採取した。同側及び反対側の半球は２本の別個のチューブに採取する。凍結した脳組織を、以下に文書化された実験プロトコールに従ってさらに処理して組織溶解産物とした。

免疫組織化学法については、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、パラホルムアルデヒド（４％ＰＦＡ）を使用して心臓内から潅流し、脳及び重量を記録した。固定した動物からの脳検体をＯＣＴ中で凍結させ、クリオスタットを使用して薄片化した。

Ｂ． 組織溶解産物の調製及び定量化
２０μＬのプロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ、米国ペンシルベニア州ピッツバーグのフィッシャーサイエンティフィック）及び１０μＬの脱リン酸化酵素阻害剤（フィッシャーサイエンティフィック）を、１ｍＬのＲＴＰＡバッファー（米国テキサス州ダラスのサンタクルズ・バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology））に添加した。０．５ｍＬの溶解バッファーを各組織試料に添加し、該組織を、各試料について個々に清浄なＢｉｏＭａｓｈｅｒ ＩＩ（登録商標）チューブ／乳棒（米国ニュージャージー州ヴァインランドのキンブル・チェイス・ライフサイエンス（Kimble Chase Life Science ））を使用してすりつぶした。該混合物を、組織の溶解を助けるためにボルテックス混合し、４℃で１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離処理した。各チューブの上清を採取した。各試料のタンパク質濃度を、ＤＣ（商標）プロテインアッセイキットを使用して製造業者の説明書に従って測定した。

Ｃ． ウエスタンイムノブロッティング
タンパク質溶解産物を、表１２の以下の実験プロトコールに従ってウエスタンブロット解析により分析した。

各脳の左半球及び右半球をホモジナイズしてウエスタンブロッティング用に調製し、ホスホコフィリンのシグナルを、内部標準のサイクロフィリンと比較したデンシトメトリーにより定量的に計測した。

図９は、上記及び表３において概説された研究の第１部の結果を示す。ＢＡ‐１０４９（１０ｍｇ／ｋｇ）を、ファスジル（１０ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照と比較した。注射はＭＣＡＯ後の回復３０分以内にＩＰで行った。組織はＭＣＡＯの２４時間後に採取した。脳の左半球対右半球におけるホスホコフィリンシグナルの比率を、ウエスタンブロッティングを使用して調べた。これらの実験では、左側（ＭＣＡＯ）と右側（無傷）との間のホスホコフィリン発現の比率の低下は、ＲＯＣＫ活性化の低下を、かつしたがって施された処置によるＲＯＣＫ阻害の増大を実証している。図８は、ホスホコフィリンの発現が脳の卒中側において大きく上昇し、ＲＯＣＫ２活性化の有効なバイオマーカーとして働くことを示している。

図９に示されるように、ホスホコフィリン発現の比率は、ビヒクルのみの対照と比較してラセミ体ＢＡ‐１０４９により強く低減され、また程度は比較的低いがファスジルにより低減された。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を用いて該実験を繰り返すと、ＭＣＡＯ後のホスホコフィリン低減に対する効果は増大される。これらの実験は、１０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）が、ファスジルと比較して、ＭＣＡＯによるＲＯＣＫ２活性化の低減に効果的であることを示している。よって、これらの結果は、両者を１０ｍｇ／ｋｇで比較した場合にＢＡ‐１０４９（Ｒ）がファスジルよりも強力にホスホコフィリンを低減することを示している。

Ｄ． 免疫組織化学法
ＯＣＴ中に包埋された凍結組織切片を免疫組織化学法により分析した。脳切片の左側はＭＣＡＯによる虚血組織を含有する一方、右半球は虚血のない対照としての役割を果たす。脳切片を、表１３に挙げた抗体を用いて処理した。これらの抗体を用いた染色は、虚血領域及びＲＯＣＫ２活性化の両方についてのバイオマーカーを提供する。

図１０Ａ～図１０Ｄは、島皮質の微小血管におけるホスホＭＬＣ２（Ｓｅｒ１９）の染色を示す。血管は、脳の左（ＭＣＡＯ）側の島皮質で強く染色されている（図１０Ａ）一方、対照（非ＭＣＡＯ）側の微小血管の染色はみられない（図１０Ｂ）。ホスホＭＬＣ２はＲＯＣＫ２活性化の下流のマーカーである。腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射された１０ｍｇ／ｋｇのファスジル（図１０Ｃ）は染色量を低減する一方、Ｉ．Ｐ．注射された１０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（図１０Ｄ）は、微小血管の染色の低減においてファスジルよりさらに有効である。図１０Ｅ及び図１０Ｆは、ＭＣＡＯ及びビヒクル（図１０Ｅ）又はＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図１０Ｆ）を用いたＩ．Ｐ．注射の後の、左脳線条体におけるＩｂａ‐１免疫反応性を示す。Ｉｂａ‐１免疫反応性は、脳内のミクログリアのマーカーである。Ｉｂａ‐１染色の強度は、脳内の虚血性障害に応答して、活性化されたミクログリアにおいて増大する。これらの結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が虚血に対するミクログリアの反応を低減することを実証している。

実施例５
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の有効用量］
ＲＯＣＫの活性化を解消するための有効用量を決定するために、実施例４で上述されたようなＭＣＡＯモデルを使用した。これらの実験では、マウスにＭＣＡＯの血管閉塞及び０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３，ｍｇ／ｋｇ若しくは１０ｍｇ／ｋｇの用量又は対照としての生理食塩水（ビヒクル）の腹腔内注射を施し、ＲＯＣＫ活性化を左脳対右脳におけるホスホコフィリン発現によって評価する。このモデルでは、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の単回施用の後、最小有効用量は図１１に見られるように１ｍｇ／ｋｇであった。最小有効レベルは、毎日の反復投薬では１ｍｇ／ｋｇ未満である。

別個の実験セットでは、副作用を評価するために毎日の反復投薬実験を実施した。正常なマウスに、１ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）を１日１回、腹腔内注射で２週間にわたり投与した。実験の期間中、動物を何らかの臨床徴候の出現について毎日モニタリングした。血液学、血液化学、及び組織病理学については実験終了時に追跡調査した。

２週間にわたる毎日の反復投薬では、１ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでのＢＡ‐１０４９（Ｒ）の毎日の投薬に関係する異常な所見は認められなかった。したがって、図１１に示されるＢＡ‐１０４９（Ｒ）の治療用量は、２週間反復投薬実験から測定された１０ｍｇ／ｋｇの無影響レベル用量未満である。

実施例６
［薬力学的応答］
薬力学的応答を測定するために、マウスをＭＣＡＯに供し、次いで左脳の右脳に対するホスホコフィリンレベルの比率を実施例４において上述されるようにして測定した。マウスは、再潅流及び１０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）の投与の４時間後又は２４時間後に検査した。

図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、いずれの時点においても効能が示され、少なくとも２４時間間にわたるＢＡ‐１０４９（Ｒ）の効能が実証された。さらなる実験では、ＭＣＡＯの２４時間、７２時間、又は１６８時間前にマウスにＢＡ‐１０４９（Ｒ）を与えた。図１２Ｃに示された結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）への３日前の曝露がＭＣＡＯ後のＲＯＣＫの超活性化を防止することを実証している。

実施例７
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）によって解消された内皮の透過性］
本研究は、脳卒中のマウスＭＣＡＯモデルにおいて生じる内皮細胞透過性をＢＡ‐１０４９（Ｒ）が解消する能力を実証する。

マウスに、実施例４に記載されるようにしてＭＣＡＯ病変を施した。再潅流の２時間後、マウスに、ＰＢＳ中に１．２％のエバンスブルー染料溶液をＩ．Ｐ．注射したが、該染料は血清アルブミンに強固に結合する。ＭＣＡＯの２時間後、エバンスブルーを注射し、再潅流から４時間でマウスを安楽殺し、潅流し、斬首し、かつその脳を実施例４に記載されるようにして解剖した。

ホモジネートを実施例４のようにして調製し、次いで５０％トリクロロ酢酸中で沈殿生成させて、タンパク質を沈殿させエバンスブルー染料をアルブミンから放出させた。タンパク質を（１０，０００×ｇで）遠沈させた後、上清を９６ウェルディッシュに入れ、５９５ｎｍでの吸光度及び蛍光（５３５Ｅｘ／６４２Ｅｍ）をＶｉｃｔｏｒ２（商標）ワラック（Wallac）プレートリーダ（米国コネチカット州ブランフォードのパーキン・エルマー（Perkin-Elmer））を使用して読みとる。標準曲線との比較から、試料中のエバンスブルー染料濃度の測定、及びしたがってアルブミン透過性の計測、が可能となる。

図１３Ａは、ビヒクル又はＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理された動物の脳の顕微鏡写真を示す。左（Ｌ）側は脳の虚血側であり、右（Ｒ）の皮質と比較される。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はビヒクル対照と比較して、蛍光シグナルを低減している。図１３Ｂはその結果のグラフ表示を示し、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）処理がビヒクル対照の左脳と比較してエバンスブルーのシグナルを低減することが可能であることを示している。これらの結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が内皮細胞の透過性を低減することが可能であることを実証している。

実施例８
［Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＢＡ‐１０４９（Ｒ）投与の経路（非ＧＬＰ）］
オスのＣ５７ＢＬ／６マウスへの単回の静脈内（ＩＶ）（５ｍｇ／ｋｇ）、腹腔内（ＩＰ）（１０ｍｇ／ｋｇ）、又は経口（ＰＯ）（３０ｍｇ／ｋｇ）での投与後の試験化合物及び被験物質の血漿中濃度及び薬物動態を測定するために、次の試験を表１４に述べた条件に従って実施［した／する］。

８～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（米国マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールス・リバー・ラボラトリーズ）を本研究に使用した。被験薬は以下の表１５に示されている。

被験薬を一旦以下のようにして用意する：各々のＩ．Ｖ．投薬用シリンジについて、装薬時及び非装薬時に少なくとも小数点以下４桁まで重量計測する。動物に投与される実際の用量（５ｍｇ／ｋｇ）は、装薬時及び非装薬時の投薬用シリンジの重量の差である。各々のＩＰ投薬用シリンジについて、装薬時及び非装薬時に少なくとも小数点以下４桁まで重量計測する。動物に投与される実際の用量（１０ｍｇ／ｋｇ）は、装薬時及び非装薬時の投薬用シリンジの重量の差である。３０ｍｇ／ｋｇのＰＯ投与は、プラスチックシリンジに取り付けられた、ボールチップ付ステンレス胃管栄養針を使用して実施する。

Ａ． 薬物動態学
１． 血液試料採取
Ｉ．Ｖ．投薬に続いて、最終血液試料（それぞれ約１ｍｌ～２ｍｌ）を投薬後次の各時点すなわち：０．０８３時間、０．５時間、２時間、６時間、１２時間、及び２４時間において４匹の動物から収集する。Ｉ．Ｐ．又はＰＯでの投薬に続いて、最終血液試料（それぞれ約１ｍｌ～２ｍｌ）を、投与経路ごとに投薬後次の各時点すなわち：０．２５時間、１時間、４時間、８時間、１２時間、及び２４時間において４匹の動物から収集する。各動物をＣＯ_２吸入によって麻酔し、最終血液試料を心臓穿刺によって収集して、抗凝血薬としてヘパリンナトリウムが入っている予めラベルしたチューブの中に移す。心臓穿刺血液収集の後、動物をＣＯ_２チャンバに戻してＣＯ_２窒息により安楽死させる。収集した血液試料を、抗凝血薬を混合するために静かに数回転倒混和する。

Ｂ． 血漿の採取
血液試料を約３０００×ｇ ｒｐｍにて約４℃で１０分間遠心分離処理する［得られた血漿を溶血反応について観察する］。全ての得られた血漿試料を、さらなる処理までおよそ－８０℃で凍結保管する。

Ｃ． 脳の採取
Ｉ．Ｖ．投薬に続いて、全脳を、投与後次の各時点すなわち：０．０８３時間、０．５時間、２時間、６時間、１２時間、及び２４時間において４匹の動物から心臓穿刺後に収集する。Ｉ．Ｐ．及びＰＯでの投薬に続いて、全脳を、投与経路ごとに投与後次の各時点すなわち：０．２５時間、１時間、４時間、８時間、１２時間、及び２４時間において４匹の動物から心臓穿刺後に収集する。全脳を１×ＰＢＳ中ですすぎ、組織重量を記録し、かつ液体窒素を使用して予めラベルしたチューブ内でスナップ凍結させる。加えて、５匹の無処置マウスからの全脳を２４時間で採取し、１×ＰＢＳ中ですすぎ、組織重量を記録し、かつ液体窒素を使用して予めラベルしたチューブ内でスナップ凍結させる。

Ｄ． バイオアナリシスによる分析
試料を、アジレント（Agilent ）１２００ ＨＰＬＣ及びＣＴＣ製のＰＡＬ冷却機能付きオートサンプラに接続されたアジレント６４１０質量分析計（これらは全てＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェア（アジレント）によって制御される）を使用して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析する。アセトニトリル‐水の勾配システム（下記に示す）を使用するＸ‐Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ（Waters）、１３０Ａ、３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）での分離後、ＭＲＭモードでのＥＳＩによるイオン化を使用してピークを質量分析法（ＭＳ）により分析した。

較正用試料については、終濃度の２５倍の被験物質の作業用希釈液を調製し、系列希釈する（３倍）。これらの試料を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのブランクの血漿中で２５倍に希釈し、分析用内部標準（プロプラノロール）を含有する３倍体積のアセトニトリルと混合して、４℃で１０分間氷上でインキュベートしてから遠心分離処理する。このタンパク質を含まない上清を、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ分析（液体クロマトグラフィータンデム質量分析）に使用する。図１４に示した結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が３つの投与経路によって脳に浸透することが可能であることを示している。

実施例９
［ＮＧ１０８細胞からの神経突起の成長に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）の効果］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）について、ＮＧ‐１０８細胞を用いた細胞培養アッセイを使用して神経突起の成長に対するその効果を比較した。最初に、ＮＧ‐１０８細胞とともに使用するための有効用量を決定し、次にＢＡ‐１０４９（Ｒ）をＲＯＣＫ２特異的阻害剤ＳＬｘ‐２１１９と比較した。

ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）を、ＮＧ‐１０８細胞からの神経突起の成長に対するその効果について比較した。図１５Ｄに示されるように、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、ＤＭＳＯ対照（図１５Ａ）、ラセミ体ＢＡ‐１０４９（図１５Ｂ）、又はＢＡ‐１０４９（Ｓ）（図１５Ｃ）と比較して、神経突起の成長を刺激するのに最も強力な化合物であった。よって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は（Ｓ）化合物を上回り、最も強健な神経突起の成長をもたらす。

図１６Ａ～図１６Ｃに示されるように、５μΜのＳＬｘ‐２１１９はＮＧ‐１０８細胞に対して有毒であることが示され、細胞は空胞の形成を示して死に始めた（図１６Ａ）。対照的に、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は５μΜ（図１６Ｂ）及び５０μΜ（図１６Ｃ）で神経突起の成長を促進し；ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は試験した最も高い濃度においてＮＧ‐１０８細胞に対し有毒ではなかった（図１６Ｃ）。

実施例１０
［ＲＯＣＫ２の発現に対するＰＴＥＮサイレンシングの効果］
神経細胞を、酵素的かつ機械的破壊方法を使用してラット胎児の発生中の大脳皮質から単離し、次いで組織培養ディッシュ中のラミニン及びポリ‐Ｄ‐リジンを含む特殊な増殖基質上にプレーティングした。これらの細胞混合物を、ディッシュ中の神経細胞の生存を増強するように設計された、特殊な選択された培地添加物を含有する低血清の条件下の特殊な培地（Ｂ２７添加剤を含むＮｅｕｒｏＢａｓａｌ（登録商標）培地、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific））において成長させた。神経細胞培養物を、１日（Ｄ１）又は７日（Ｄ７）のいずれかにわたってディッシュで成長させた後、該培養物を、１μΜの濃度の、ＰＴＥＮ配列を標的とするｓｄＲＮＡ分子（ｓｄＲＮＡ＝自己送達ＲＮＡｉ）又は無関係の「無標的の」対照ＲＮＡ配列に曝露した。該神経培養物をその後、これらのｓｄＲＮＡ分子の存在下でさらに３日間インキュベートした。タンパク質を、ＮＰ‐４０及びデオキシコール酸界面活性剤を含有するトリス緩衝液ベースの溶液中で、トリチュレーション及びボルテックス混合とその後の非可溶性材料を除去するための遠心分離処理により、培養物から抽出した。該抽出物のタンパク質濃度を改変ブラッドフォードアッセイによって測定し、同等量のタンパク質含有抽出物を、表示のｓｄＲＮＡを用いた処理の後にＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ２、又はＧＡＰＤＨタンパク質の量に特有の変化があったかどうかを判断するために、ウエスタンブロット法により分析した。

図１７に示す結果は、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ２、及びＧＡＰＤＨタンパク質のレベルを分析したウエスタンブロッティング実験に由来する。ｓｄＲＮＡを用いる処置の前に７日間成長させた神経細胞培養物（Ｄ７）の場合には、ＰＴＥＮ特異的なｓｄＲＮＡを使用してＰＴＥＮ ｍＲＮＡを低減の標的とすることにより、予想通り、これらの細胞におけるＰＴＥＮタンパク質レベルの低減がもたらされる。ＰＴＥＮタンパク質レベルの低減はさらに、ＲＯＣＫ２キナーゼのタンパク質レベルの大幅な低減をもたらす。これらのデータは、ＰＴＥＮタンパク質の減少をもたらす介入処置が、最終的にはＲＯＣＫ２タンパク質の減少をも同様にもたらす可能性があることを示している。ＰＴＥＮの発現を低減することにより細胞の総ＲＯＣＫ２活性を低減する能力は、神経再生におけるＰＴＥＮ活性の低減の関与に関して現在知られていることの構成要素でもあるかもしれない。これは、ＰＴＥＮ機能が阻害されるときに見られる効果の一部が結局はＲＯＣＫ２発現の減少によるのかもしれないことを示している。よって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を使用して選択的にＲＯＣＫ２を阻害し、かつ再生効果を生じる能力はさらに、ＰＴＥＮに干渉する結果として再生が生じるときに関係する経路の一部でもある可能性がある。

ＲＯＣＫ２の発現はＰＴＥＮのノックダウンにより減少し、予想外にもＲＯＣＫ２がＰＴＥＮの下流の有望な標的であることを示している。よって、ＲＯＣＫ２を不活性化するＢＡ‐１０４９は、ＣＮＳにおける軸索の再生を誘発するための、ＰＴＥＮよりも優れた標的である。

マウス１２匹の群における脊髄の皮質脊髄路（中枢神経系）、動物１２匹の群における視神経への、及びマウス１２匹のさらなる群における末梢神経系の坐骨神経への、双方の外科的損傷を使用して、５μＬの１μΜ ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は対照の生理食塩水（マウス６匹の群）を、実験的損傷の時点で損傷部位への直接注射により手術中に適用し、動物を損傷後２～４週間回復させる。安楽殺の時点で、相対的な再生の度合いにおける変化を、組織学的技法を使用して計測する。安楽殺の１日前に、標識したコレラ毒素のような蛍光トレーサ分子を、脊髄内に突出する軸索を染色するために運動野皮質の中に、網膜神経節細胞の軸索再生を計測するために眼内に注射し、又は坐骨神経の場合には、神経根の領域における脊髄の近位への標識デキストランアミンの注射により、順行性標識法による末梢の神経軸索の特徴解析が可能となる。動物の安楽殺及び固定剤を用いた灌流に続き、翌日に切片を調製する。切片をスライドガラス上に収集し、次いで蛍光マーカーを顕微鏡によって視覚化し、標識された再生中の軸索が成長している距離を、指定の切片について撮影した一連の写真において計測する。標識された軸索の長さを、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理された動物と生理食塩水の注射でのみ処理された動物との間で比較する。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理された動物は、処理を受けていない動物と比較して中枢神経系（例えば皮質脊髄路及び視神経）における再生を示し、対照と比較して、末梢神経中のより多くの軸索が再生し、かつその標的に到達する。

実施例１１
［内皮細胞に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）の効果］
ＲＯＣＫの超活性化及び内皮の障壁機能に対するＢＡ‐１０４９Ｂ（Ｒ）の効果を測定するために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用する。ＲＯＣＫの超活性化は、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ経路の強力な活性化因子であるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich））の投与によって誘発する。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の効能を、ＲＯＣＫ活性のバイオマーカーであるアクチンストレスファイバーの形成、及び内皮の障壁完全性のバイオマーカーである焦点接着斑複合体タンパク質ビンキュリンの分布を調査することにより測定する。

Ａ． 細胞培養及びＬＰＡ刺激
初代ＨＵＶＥＣ細胞（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー（Thermo Fisher ））を、内皮増殖培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ２００基礎培地ＣａｔにＧｉｂｃｏ（登録商標）の大血管内皮サプリメント（Large Vessel Endothelial Supplement）を補足）において培養する。継代第１～４代のＨＵＶＥＣを全ての実験に使用する。ＨＵＶＥＣを、７０μｇ／ｍｌのラットコラーゲンＩ（米国ニューヨーク州コーニングのコーニング（Corning））でコーティングしたポリ‐Ｄ‐リジン処理済みカバーガラス（米国ニューヨーク州コーニングのコーニング）の上で培養し、コンフルエントな細胞単層が確立されるまで４日間培養する。ＬＰＡ刺激の前に、５０μΜのＢＡ１０４９（Ｒ）、５０μΜのファスジル、又はビヒクル（ＤＭＳＯ）をそれぞれ含有する、０．１％ヒト血清アルブミンを補足したＭｅｄｉｕｍ２００を使用して細胞を１時間血清飢餓状態とする。次いでＨＵＶＥＣを２０μΜのＬＰＡで１０分間刺激し、続いて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／スクロース溶液を使用して固定する。

Ｂ． 免疫細胞化学法及びマイクロコピー（Microcopy）
ＰＦＡ固定の後、カバーガラス上の細胞をＴＢＳ‐Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）‐Ｘ１００（０．１％）を用いて透過化し、１％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、マウスのビンキュリン一次抗体（表１６）とともにインキュベートする。ビンキュリンの免疫標識を、抗マウス蛍光二次抗体（表１６）を使用して視覚化する。アクチン細胞骨格を、Ｆ‐アクチンフィラメントに特異的に結合する化合物である蛍光性のファロイジン（表１６）で染色することにより視覚化する。落射蛍光顕微鏡法を用いて免疫蛍光及びファロイジン蛍光それぞれの画像を獲得する。

図１８に示される結果は、ＬＰＡ刺激が刺激前の細胞（図１８Ａ）と比較してＨＵＶＥＣにおいて顕著なアクチンストレスファイバー形成を誘発する（図１８Ｂ）ということを実証している。

図１９に示されるように、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図１９Ａ及び図１９Ｃ）又はファスジル（図１９Ｂ及び図１９Ｄ）のいずれかを用いた処理は、ストレスファイバーのそのような形成を防止する。加えて、アクチンストレスファイバーの低減は、ファスジルで処理された細胞（図１９Ｂ）と比較して、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理されたＨＵＶＥＣ（図１９Ａ）において、より顕著である。さらに、ビンキュリン免疫蛍光法は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図１９Ｃ）がファスジル（図１９Ｄ）と比較してＬＰＡ刺激時のＨＵＶＥＣ単層の完全性の保存において優れていることを明らかにしている。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）で処理された細胞が、コンフルエントな細胞単層に特徴的なビンキュリン免疫蛍光法の薄い周辺バンドを示す（図１９Ｃ）一方、ファスジルで処理された細胞は、細胞密集度の低下に関連したビンキュリン陽性の焦点接着斑複合体のアップレギュレーションを示している（図１９Ｄ）。

実施例１２
［培養肝細胞において生成されるＢＡ‐１０４９（Ｒ）代謝物］
様々な哺乳類生物種におけるＢＡ‐１０４９（Ｒ）の代謝を調査するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏのシステムを使用した。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を、様々な生物種における代謝を調査するためにラット、ヒト、マウス、カニクイザル、及びイヌの肝細胞の培養物に添加した。

ＢＡ‐１０４９の保存溶液を最初に、アセトニトリル中で所望の終濃度の１００×濃度に希釈した。被験物質を二連のラット肝細胞において３７℃でインキュベートした。該反応物には、１ｍｌのＫＨＢバッファー（ｐＨ７．４）あたり１０６個の成育可能な肝細胞が含まれた。指定の時点（０分、１５分、３０分、６０分、１２０分）において、個々の実験反応物及び対照反応物からアリコートを取り出し、等量の氷冷メタノールと混合した。停止させた反応物を－２０℃で少なくとも１０分インキュベートした。試料を遠心分離処理して沈殿したタンパク質を除去し、上清をＬＣ‐ＭＳ／ＭＳによって分析した。

図２０の結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の半減期が様々な生物種において異なること、及びイヌの肝細胞はこの化合物を代謝しないように見えることを示している。表１７はさらに、ラット及びサルが、その代謝の速度がほとんど同じようであることからヒトでの研究のための準備において薬物代謝をモデル化するのに適した生物種であることを示している。

並行して、被験薬が存在しないブランクの肝細胞を１２０分間インキュベートした。このブランクの肝細胞のインキュベーションは、肝細胞自体に由来するピークの存在を示すために対照として使用した。陰性対照は、肝細胞を被験物質の非存在下でインキュベートし、その後クエンチしたアッセイに被験物質を添加することにより用意した（Ｔ＝０分）。この陰性対照は、被験物質中の何らかの不純物の存在を示すために含めた。

ポジティブ及びネガティブ両方のイオン化モードにおけるフルスキャンのマススペクトル（１００ｍｇ‐８００ｍ／ｚ）を、代謝物の存在を捜すために勾配全体にわたり実行した。ブランクの肝細胞及び陰性対照（Ｔ＝０分）からのスキャンを、インキュベートした試料（Ｔ＝１２０分）と比較した。ピークが二連の試験試料の両方においていずれかの陰性対照試料より少なくとも５倍高いレベルで存在する場合に、該ピークを潜在的な代謝物と判断した。観察されたピークのプロダクトイオンスキャンを実施して、これらの観察されたピークが確かに親関連であるかどうかを確認した。

表１７は、様々な生物種におけるＢＡ‐１０４９（Ｒ）の半減期を示す。図２０及び表１７の結果は、複数の生物種由来の培養肝細胞に添加されたＢＡ‐１０４９（Ｒ）がヒト、ラット、マウス、及びサルの肝細胞では１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）へと容易に代謝される一方で、ラット肝細胞はさらにＮ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）も生成するということを示している。Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の構造は図２１Ｃに表わされて示されている。イヌの肝細胞はＢＡ‐１０４９（Ｒ）の検出可能な代謝作用を示さず、該細胞がヒトで試験する前の該薬物の研究用には不十分な生物種選択肢の可能性があることを示している。

実施例１３
［マウス及びラットの脳及び血管組織におけるＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の浸透］
次の実験は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその代謝物である１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の、静脈内（ＩＶ）投与を介したラット及びマウスの脳内への浸透を実証する。

マウスの脳を、ＩＶでのＢＡ‐１０４９（Ｒ）投与後の特定の時点で解剖し、ホモジナイズした脳組織中のＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の濃度を、ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ分析を使用して測定する。ラットでは、脳及び血管を、ＩＶでのＢＡ‐１０４９（Ｒ）投与後の特定の時点で解剖する。

実験結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が脳組織に浸透して疾患、障害、又は損傷を治療又は処置するということを実証する。
Ａ． 動物及び投薬
成体オスのＣ５７ＢＬ／６マウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）を本研究に使用する。マウスに、静脈内（ＩＶ）投与又は経口強制投与による経口（ＰＯ）投与のいずれかによって投薬を行う。ＩＶで投薬するマウスには、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調合された単回の５ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）用量を投薬する。さらなるマウスのコホートには、ＰＢＳ中で調合された単回の３０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）の経口用量を投薬する。

マウスを、投与した化合物の副作用の臨床徴候について投与後にモニタリングする。
成体オスのスプレーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）を本研究に使用する。ラットに、尾静脈注射による単回の静脈内（ＩＶ）への２．５ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）用量を投薬する。いずれの用量もリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で調合する。

ラットを、投与した化合物の副作用の臨床徴候について投与後にモニタリングする。
Ｂ． 試料の収集及び分析
ＩＶ投薬の後、脳を各時点すなわち、投薬後０．０８３時間、０．５時間、２時間、６時間、１２時間、及び２４時間において４匹のマウスから収集する。各マウスはＣＯ_２により安楽死させる。全脳を摘出し、計量し、ＰＢＳですすぎ、チューブに入れ、液体窒素中でスナップ凍結させる。

ＩＶ投薬の後、脳を各時点すなわち：投薬後０．２５時間、０．５時間、及び１時間において３匹のラットから収集する。脳試料を計量し、チューブに入れ、ドライアイス上で凍結させる。脳を分析まで－８０℃で保管する。

下大静脈の一部分を解剖し、計量し、ドライアイス上のチューブに入れる。この血管組織を分析まで－８０℃で保管する。
マウスの脳試料を、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその代謝物１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の血漿中濃度の測定のために分析する。脳組織を１ｍＬ／ｇのＰＢＳでホモジナイズした。脳ホモジネートを、目詰まりを防ぐために無菌的に切断した１０００μＬピペットチップを使用して、２００μＬのホモジネートをチューブの中でピペッティングすることにより、沈殿生成させる。試料をさらに、沈澱生成の助けとなるように１００μＬのＰＢＳで希釈する。９００μＬの冷メタノールを各試料に加え、試料を５秒～１０秒間ボルテックス混合する。試料を４℃に３０分～４０分間置き、次いで１０，０００ＲＰＭにて４℃で１５分間、遠心分離処理する。上清を収集し、分析されるまで－８０℃で保管する。

これらの試料を、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の検出のためにＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィータンデム型質量分析）システムに注入する。

ラットの脳試料を、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその代謝物１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の血漿中濃度の測定のために分析する。脳組織を１ｍＬ／ｇのＰＢＳ中でホモジナイズする。脳ホモジネートを、目詰まりを防ぐために無菌的に切断した１０００μＬピペットチップを使用して、２００μＬのホモジネートをチューブの中にピペッティングすることにより、沈殿生成させる。試料をさらに、沈澱生成の助けとなるように１００μＬのＰＢＳで希釈する。９００μＬの冷メタノールを各試料に加え、試料を５～１０秒間ボルテックス混合する。試料を４℃に３０分～４０分間置き、次いで１０，０００ＲＰＭにて４℃で１５分間、遠心分離処理する。上清を収集し、分析されるまで－８０℃で保管した。

下大静脈を、２ｍＬ／ｇのＰＢＳを加えることによりホモジナイズし、ｂｉｏｍａｃｈｅｒ（登録商標）撹拌棒（キンブル（Kimble））を用いてすり潰した。３ｍＬ／ｍＬの冷メタノールを加えることにより沈澱生成を実施した。試料を５秒～１０秒間ボルテックス混合した。試料を４℃に６０分間置き、次いで１０，０００ＲＰＭにて４℃で１５分間、遠心分離処理した。上清を収集し、分析されるまで－８０℃で保管した。

これらの試料を、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の検出のためにＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィータンデム型質量分析）システムに注入した。

各試料中のＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の濃度を、脳組織１グラムあたりの各化合物の量を計算するために希釈及び組織重量について調整した。これらの値を報告し、平均し、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び代謝物の出現及び消失の時間的経過を測定するために時間に対してプロットした。

Ｃ． 結果
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその主要な活性代謝物１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、ＩＶ投与後のラット及びマウスの脳において検出可能であった（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。マウスでは、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は投与後少なくとも２４時間において検出可能であり続けたが、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は１２時間までに検出不能となった。ラットの脳では、マウスと同様に、投与後３０分で１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）よりもＢＡ‐１０４９（Ｒ）が多かった。ＩＶ投与後３０分のラットの血管組織には大量の両化合物が存在しており、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）よりも１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が多かった。

これらの結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその代謝物１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＩＶ投与後の血液、脳及び血管組織の中に存在しかつ検出可能であることを実証している。重量比では、下大静脈のような血管組織は脳組織よりさらに多くの両化合物を含有している。加えて、静脈内投与は、薬理学的に活性な化合物を、疾患、障害、又は損傷を治療又は処置するために脳及び血管組織中に提供する。

実施例１４
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）代謝物の活性］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の代謝物である１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＮ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＲＯＣＫ２についての阻害活性を示すかどうかを測定するために、各化合物について親化合物ＢＡ‐１０４９（Ｒ）と比較して阻害曲線を測定する。

各化合物をＤＭＳＯ中で１００ｍＭに溶解した。この化合物‐ＤＭＳＯ溶液をｄＨ_２Ｏ中で５００μΜに希釈する。他のアッセイ試薬中で５Ｘに希釈した後に片対数の範囲の化合物が存在するように、１００μΜから１ｎＭまで、系列希釈を調製した。

１０μＬの各濃度の各化合物を、ＲＯＣＫ２基質ＭＹＰＴ１（サーモフィッシャー）で予めコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）プレート（サーモフィッシャー）の個々のウェルに二連として添加した。ｄＨ_２Ｏを陰性対照として添加する。

マルチチャンネルピペットを使用して、反応を開始するための下記の各溶液すなわち：１０μＬの２０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、２５ｍＭ β‐グリセロリン酸、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、及び１ｍＭ ＤＴＴ、１０μＬの５０μΜ ＡＴＰ、１０μＬの７５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、並びに１０μＬの１ｍＵ／μＬ ＲＯＣＫ２溶液、の添加により１ウェル当たり４０μＬの最終体積とした。該溶液を撹拌により混合し、振盪機にて３０℃で１０分間インキュベートした。

該反応は、プレートを空にして２００μＬの洗浄バッファー（トリス緩衝生理食塩水及び０．０５％のＴｗｅｅｎ‐２０）を用いて各３分で３回洗浄することにより停止させた。

抗リン酸化ＭＹＰＴ１（Ｔｈｒ６９６）抗体（米国マサチューセッツ州ビレリカのイーエムディー（EMD ）、カタログ番号ＣＳ２０５３０９）の０．５μｇ／ｍＬの溶液１００μＬを各ウェルに添加した。プレートをＲＴにて振盪機で１時間インキュベートし、次いで２００μＬの洗浄バッファーを用いて３分間で３回洗浄した。

１００μＬのヤギ抗ウサギＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（米国マサチューセッツ州ビレリカのイーエムディー、カタログ番号９０２７６、１：２０００希釈）を各ウェルに添加した。プレートをＲＴにて振盪機で１時間インキュベートし、次いで２００μＬの洗浄バッファーを用いて３分間で３回洗浄した。該プレートを、トリス緩衝生理食塩水を用いて各３分でさらに２回洗浄した。

１００μＬのＴＭＢ／Ｅ溶液を、マルチチャンネルピペットで各ウェルに添加した。十分に発色し次第、反応を１００μＬの停止液を使用して停止させ、ワラックのＶｉｃｔｏｒ２プレートリーダを使用して４５０ｎｍで吸光度を読み取った。

吸光度の値はＲＯＣＫ２活性に比例するので、４５０ｎｍの吸光度を代謝物及び親化合物の終濃度に対してプロットすると、阻害曲線が得られる。相対的な阻害プロファイルを、これらの曲線の４ＰＬ分析により測定した。算出されたＩＣ_５０における変動は、実験変数における変動により、アッセイ最適化前はよくあることである。

図２３の結果は、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＢＡ‐１０４９（Ｒ）親化合物よりもＲＯＣＫ２活性の阻害剤として１／２ ｌｏｇ倍強力であることを示している。Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は阻害活性を示していない。

実施例１５
［Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋ活性化後のヒト臍静脈内皮細胞に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）、及びこれらの代謝物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）の代謝物の活性を、培養ヒト血管内皮細胞を使用して調査した。

１． 細胞培養
初代ＨＵＶＥＣ（米国バージニア州マナッサスのＡＴＣＣ）を、コラーゲン‐１（５０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた７５ｃｍ^２組織培養フラスコにおいて、大血管内皮増殖サプリメントを補足したＭｅｄｉｕｍ‐２００（いずれも米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）を使用して増殖させた。８０％コンフルエントに達した後、０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）を使用して細胞を取り出し、下記に述べるような組織培養基質上にプレーティングした。

２． 投薬及び分析のタイミング
５種の個別の用量（１μΜ、１０μΜ、２５μΜ、５０μΜ、及び１００μΜ）のＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）を、ＬＰＡ処理されたＨＵＶＥＣにおいて正常なＲｈｏ／ＲＯＣＫ活性を回復させる能力について評価した。細胞株を各用量に１時間曝露し、次いで下記に述べるように２０μΜのＬＰＡを用いて５分間又は１時間刺激する。全ての実験を三連で実行し、細胞株及び処理のいずれについても知らされていない２名の独立な判定者により分析を行った。

ａ． ＲＯＣＫ２下流の標的であるミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２）及びコフィリンのリン酸化
細胞を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングを使用する二リン酸化ＭＬＣ２（トレオニン１８／セリン１９リン酸化部位）及びコフィリン（セリン９リン酸化部位）の生化学分析に供した。細胞を、７０μｇ／ｍｌのラットコラーゲン‐１（米国ニューヨーク州コーニングのコーニング）でコーティングされた２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、コンフルエントになるまで３７℃／５％ＣＯ_２で２日～３日間増殖させた。細胞を、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、米国ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ）を補足したＭｅｄｉｕｍ２００（サーモフィッシャー）で希釈された５種の個別の用量（１μΜ、１０μΜ、２５μΜ、５０μΜ、及び１００μΜ）のＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）で、１時間前処理した。次に培地を、０．１％ＨＳＡ（シグマ・アルドリッチ）及び２０μΜのＬＰＡ（サンタクルーズ・バイオテク（Santa Cruz Biotech）；米国カリフォルニア州サンタクルーズ）を補足したＭｅｄｉｕｍ２００に交換し、５分間インキュベートした。ＬＰＡ刺激の後、ＨＡＬＴ（商標）完全プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）を補足したＲＩＰＡバッファーを用いる溶解によって細胞からタンパク質を抽出し、レムリ（Laemmli）サンプルバッファー（米国カリフォルニア州ヘラクレスのバイオラッド（BioRad））／β‐メルカプトエタノールを使用して還元及び変性させて、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供した。

変性した試料を、還元性の１０％のビス‐トリス‐ゲルポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）；米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）の中で電気泳動し、０．２５μｍ ＰＶＤＦメンブレン（米国マサチューセッツ州ビレリカのイーエムディー・ミリポア（EMD Millipore ））に転写した。メンブレンを、抗ｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９（１：５００；米国マサチューセッツ州ダンヴァーズのセル・シグナリング（Cell Signaling））又は抗ｐコフィリンＳ９（１：５００、米国マサチューセッツ州ダンヴァーズのセル・シグナリング）、及び抗グリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ装荷量対照（ＧＡＰＤＨ、１：１００００；アブカム（Abcam ））を使用して探査する。タンパク質レベルを、化学ルミネセンス基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）を使用して検出し、ＦｌｕｏｒｏＣｈｅｍ（商標）ＳＰイメージングシステムを使用して画像を取り込んだ。

ｂ． 内皮単層の完全性
ＨＵＶＥＣ単層の完全性を調べるために、フィブロネクチン、コラーゲン‐１及びゼラチンでコーティングしたＰＤＬコートカバーガラス（コーニング）に細胞をプレーティングした。５０，０００個の細胞を２４ウェルプレートに置かれた各カバーガラス上に播種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で３日間増殖させた。様々な細胞試料を、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ（Sigma ））を補足したＭｅｄｉｕｍ２００（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）で希釈された５種の異なる用量（１μΜ、１０μΜ、２５μΜ、５０μΜ、及び１００μΜ）のＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はＢＡ‐１０７６（Ｓ）で、１時間前処理した。培地を、０．１％ＨＳＡ及び２０μΜのＬＰＡ（サンタクルーズ）を補足したＭｅｄｉｕｍ２００に交換し、６０分間インキュベートした。

ＬＰＡ刺激の後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、アクチン‐ファロイジン（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャー）及びＶ‐カドヘリン（米国マサチューセッツ州ダンヴァーズのセル・シグナリング）について染色し、顕微鏡用スライド上に載せた。カバーガラスを蛍光顕微鏡法によって画像化し、単層中の細胞の無い穴をＩｍａｇｅＪ（フリーウェア；https://imagej.nih.gov/ij/）を使用して計測する。

３． 結果
ＬＰＡで処理されたＨＵＶＥＣでは、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はＭＬＣ２の二リン酸化を低減する一方、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はそのような効果を示さなかった（図２４）。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）よりもｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９の低減においてより高い効力を示す（図２４）。１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、１０μΜ以上の濃度でＭＬＣ２の二リン酸化を完全に排除して、全ての試験化合物の中で最も高い効力を示している（図２４）。ＲＯＣＫの活性化を刺激するためにＬＰＡで処理されたＨＵＶＥＣは、ストレスファイバーの増加及び細胞‐細胞間ジャンクションにおける変化を示し、これは対照（図２５Ａ）と比較して、単層中に細胞の無い穴を生じる（図２５Ｄ）。ＬＰＡと、１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図２５Ｂ）又は１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）（図２５Ｃ）で処理された細胞は、正常な単層の外観を備えた対照培養物に類似している。細胞をＬＰＡに加えて１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）（図２５Ｅ）又は１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）（図２５Ｆ）で処理する場合、いずれの濃度もＬＰＡの作用を解消しない。よって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）への曝露後のＲｈｏ／ＲＯＣＫの活性化を防止してヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における単層の完全性を回復させるが、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及びＮ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はいずれも、そうではない。

実施例１６
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９、及びＢＡ‐１０７６ Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋ活性化（Ｓ）の、Ｒｈｏ／Ｒｏｃｋ活性化後の脳微小血管内皮細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）、及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）の代謝物の活性について、初代ヒト脳微小血管内皮細胞を使用して調査する。

１． 細胞培養
初代ｈＢＭＶＥＣ（米国ミネソタ州イーダイナのニューロミクス（Neuromics））を、コラーゲン‐１（７０μｇ／ｍＬ、コーニング）でコーティングされた７５ｃｍ^２組織培養フラスコで、ＥＮＤＯ増殖培地（ＥＮＤＯ基本培地＋ＥＮＤＯ増殖サプリメント、いずれも米国ミネソタ州イーダイナのニューロミクス）を使用して増殖させる。９０％コンフルエントに達した後、０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡを使用して細胞を取り出し、下記に述べるような組織培養基質上にプレーティングする。

２． 投薬及び分析のタイミング
５種の個別の用量のＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）を、ＬＰＡ処理されたｈＢＭＶＥＣにおいて正常なＲｈｏ／ＲＯＣＫ活性を回復させる能力について評価する。細胞を各用量に１時間曝露し、次いで下記に述べるように２０μΜのＬＰＡを用いて５分間又は１時間刺激する。全ての実験を三連で実行し、細胞株及び処理のいずれについても知らされていない２名の独立な判定者により分析を行う。

ａ． ＲＯＣＫ２下流の標的であるミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２）及びコフィリンのリン酸化
細胞を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングを使用する二リン酸化ＭＬＣ２（トレオニン１８／セリン１９リン酸化部位）及びリン酸化コフィリン（セリン９リン酸化部位）の生化学分析に供する。細胞を、７０μｇ／ｍｌのラットコラーゲン‐１（コーニング）でコーティングされた２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、ＥＮＤＯ増殖培地（ニューロミクス）においてコンフルエントになるまで３７℃／５％ＣＯ_２で３日間増殖させる。細胞を、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ・アルドリッチ）を補足したＥＮＤＯ基本培地（ニューロミクス）で希釈された５種の個別の用量（１μΜ、１０μΜ、２５μΜ、５０μΜ、及び１００μΜ）のＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）で、１時間前処理する。培地を、１％ＨＳＡ、２０μΜのＬＰＡ（サンタクルーズ・バイオテク；米国カリフォルニア州サンタクルーズ）及び適正量の試験されている化合物を補足したＥＮＤＯ基本培地に交換する。５分後、培地を吸引除去し、細胞を１×ＰＢＳで短時間洗浄する。完全プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（ＨＡＬＴ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を補足したＲＩＰＡバッファーを用いる溶解によって細胞からタンパク質を抽出し、レムリサンプルバッファー（バイオラッド；米国カリフォルニア州ヘラクレス、β‐メルカプトエタノールを使用して還元及び変性させて、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥに供する。

変性した試料を、還元性の１０％ビス‐トリス‐ＰＡゲル（Ｎｏｖｅｘ；サーモフィッシャー）において電気泳動し、０．２５μｍのＰＶＤＦメンブレン（イーエムディー・ミリポア）に転写する。メンブレンを、抗ｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９（１：５００；セル・シグナリング）又は抗ｐコフィリン（１：５００、セル・シグナリング Ｓ９）、及び抗グリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ装荷量対照（ＧＡＰＤＨ、１：１００００；米国マサチューセッツ州ケンブリッジのアブカム）を使用して探査する。タンパク質レベルを、化学ルミネセンス基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ、サーモフィッシャー）を使用して検出し、ＦｌｕｏｒｏＣｈｅｍ ＳＰイメージングシステムを使用して画像を取り込む。

ｂ． 内皮単層の完全性
ｈＢＭＶＥＣ単層の完全性を調べるために、フィブロネクチン、コラーゲン‐１及びゼラチンでコーティングされたＰＤＬコートカバーガラス（コーニング）に細胞をプレーティングする。５０，０００個の細胞を、２４ウェルプレートに置かれた各カバーガラス上に播種する。細胞を、３７℃／５％ＣＯ_２でＥＮＤＯ増殖培地（ニューロミクス）にて３日間増殖させる。様々な細胞試料を、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ・アルドリッチ）を補足したＥＮＤＯ基本培地（ニューロミクス）で希釈された５種の異なる用量のＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はＢＡ‐１０７６（Ｓ）で、１時間前処理する。培地を、１％ＨＳＡ、２０μΜのＬＰＡ（サンタクルーズ・バイオテク；米国カリフォルニア州サンタクルーズ）及び適正量の試験されている化合物を補足したＥＮＤＯ基本培地に交換する。６０分後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、アクチン‐ファロイジン（サーモフィッシャー）及びＶ‐カドヘリン（セル・シグナリング）について染色し、次いで顕微鏡用スライド上に載せた。カバーガラスを蛍光顕微鏡法によって画像化し、単層中の細胞の無い穴をＩｍａｇｅＪを使用して計測する。

３． 結果
ＬＰＡで処理されたｈＢＭＶＥＣでは、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はＭＬＣ２の二リン酸化を低減する一方、Ｎ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はそのような効果を示さない。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）よりもｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９の低減においてより高い効力を示す。１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、１０μΜ以上の濃度でＭＬＣ２の二リン酸化を完全に排除して、全ての試験化合物の中で最も高い効力を示す。ＲＯＣＫの活性化を刺激するためにＬＰＡで処理されたｈＢＭＶＥＣは、対照と比較して、ストレスファイバーの増加及び細胞‐細胞間ジャンクションにおける変化を示し、単層中に細胞の無い穴を生じる。ＬＰＡと、１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）とで処理された細胞は、正常な単層の外観を備えた対照培養物に類似している。細胞を、ＬＰＡに加えて１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）又は１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）で処理する場合、いずれの濃度もＬＰＡの作用を解消しない。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は内皮細胞におけるＲＯＣＫ活性化のＬＰＡ刺激によって誘発された細胞の変化を解消することができるが、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）にはできない。
よって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）への曝露後のＲｈｏ／ＲＯＣＫの活性化を防止してヒト脳微小血管内皮細胞（ｈＢＭＶＥＣ）におけるタイトジャンクションの維持を保護するが、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）又はＮ‐オキシド‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はそうではない。

実施例１７
［ヒト内皮細胞におけるＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の効能及び効力］
１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を、初代ヒト内皮細胞におけるその効能を測定するために試験した。培養されたヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のＥＣ_５０についても、両化合物の効力を比較し、かつｉｎ ｖｉｖｏでの必要曝露量に関する情報を提供するために調査した。

１． 細胞培養
初代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；ＡＴＣＣ）を、プラスチックの組織培養フラスコで、大血管内皮増殖サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を補足したＭｅｄｉｕｍ‐２００を使用して増殖させた。８０％コンフルエントに達した後、０．２５％トリプシン‐ＥＤＴＡを使用して細胞を取り出し、下記に述べるような２４ウェル組織培養プレート（ファルコン）にプレーティングした。

２． 投薬及び分析のタイミング
８種の異なる用量のＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）（０ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μΜ、１０μΜ、５０μΜ、１００μΜ、及び１ｍＭ）を、細胞内ＲＯＣＫ活性に対するそれらの効果について評価した。細胞を各用量に１時間曝露した。全ての実験を三連で実行し、化合物及び化合物濃度について知らされていない２名の独立な判定者により分析を行った。

ａ． ＲＯＣＫ２下流の標的であるミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２）のリン酸化
細胞を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングを使用する二リン酸化ＭＬＣ２（トレオニン１８／セリン１９のリン酸化部位）の生化学的タンパク質分析に供した。細胞を、７０μｇ／ｍｌのラットコラーゲン‐１（コーニング）でコーティングされた２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、コンフルエントになるまで３７℃／５％ＣＯ_２で２～３日間増殖させた。細胞を、様々な用量のＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）で１時間前処理した。薬物は、０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ・アルドリッチ）を補足したＭｅｄｉｕｍ２００（サーモフィッシャーサイエンティフィック）中で希釈した。１時間後、細胞を、完全プロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（ＨＡＬＴ、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を補足したＲＩＰＡバッファー（ボストン・バイオプロダクツ（Boston Bioproducts）；米国マサチューセッツ州アシュランド）で溶解し、還元し、レムリサンプルバッファー（バイオラッド）／β‐メルカプトエタノールで変性させた。変性試料を、還元性の１０％ビス‐トリス‐ＰＡゲル（Ｎｏｖｅｘ）で電気泳動し、次いで０．２５μｍのＰＶＤＦメンブレン（イーエムディー・ミリポア）に転写した。メンブレンを、非特異的な抗体結合部位をブロックするために４％ウシ血清アルブミン溶液とともにインキュベートし、次いでｐｐＭＬＣ２ Ｔ１８／Ｓ１９（１：５００、セル・シグナリング）及びグリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ装荷量対照（ＧＡＰＤＨ、１：１０，０００；アブカム）について免疫標識した。タンパク質レベルを、化学ルミネセンス基質（Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ、サーモフィッシャー）を使用して検出し、かつＦｌｕｏｒｏＣｈｅｍ ＳＰイメージングシステムで取り込んだ。ｐｐＭＬＣ２及びＧＡＰＤＨの化学ルミネセンスをデンシトメトリー分析によって計測した。ｐｐＭＬＣ２のシグナルをＧＡＰＤＨのシグナルに対して標準化し、未処理対照（０μΜ）の百分率としてプロットした。ＥＣ_５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して用量‐応答分析により測定した。

３． 結果
図２６に示されるように、用量‐応答分析は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の両方がＭＬＣ２の二リン酸化を用量依存的に低減したことを示している（図２Ａ）。いずれの薬物も、試験した最も高い用量（＝１ｍＭ）でＢＡ‐１０４９（Ｒ）について８９％及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）について９４％の、ｐｐＭＬＣ２レベルの最大限の低減を伴う同様の効能を示した。しかしながら、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）について３８３０ｎＭのＥＣ_５０値と比較して１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）については４４９．１ｎＭのＥＣ_５０値によって示される、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）よりも１ｌｏｇ分高い効力を示した（図２６Ｂ）。

これらの結果は、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が細胞透過性でありかつ生物活性を有すること、並びに１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、その親のＢＡ‐１０４９（Ｒ）と比べてＨＵＶＥＣにおけるＲＯＣＫの阻害において同様の効能を有するがより高い効力を有すること、を示唆している。

実施例１８
［マウスの収縮期血圧値に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）の影響］
次の実験は、マウスの収縮期血圧の低下に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）の影響の差について実証する。Ｒｈｏキナーゼは血管緊張の調節において重要な役割を果たすが、血圧はそれ以上に末梢血管に依存しており、末梢血管ではＲＯＣＫ１の発現がＲＯＣＫ２よりも高い。マウスを、その飲料水を介して送達される漸増用量のＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はＢＡ‐１０４９（Ｓ）のいずれかに曝露させ、該マウスの血圧をモニタリングする。ＢＡ‐１０４９（Ｓ）のＲＯＣＫ２に対する選択性の低さにより、ＲＯＣＫ２に対してより高い選択性を示すＢＡ‐１０４９（Ｒ）よりも著しく低い用量での、収縮期血圧の低下が引き起こされる。

マウスの３つの被験コホートを、通常の食事及び飲料水へのアクセスを無制限として飼育する。最初の５日間、マウスを接触に慣れさせるために毎日ハンドリングし、また該マウスの血圧を、多動物テールカフ式プレチスモグラフィー装置（エムアールビーピー・テールカフ血圧システム（MRBP Tail Cuff Blood Pressure System）；アイアイティーシー・ライフ・サイエンス（IITC Life Science）；米国カリフォルニア州ウッドランドヒルズ）を使用して計測する。各マウスの収縮期血圧を、２日目及び５日目の５分の期間で複数回記録する。これらの値はベースラインとしての役割を果たす。

５日目に、１コホートのマウスを体重１ｋｇあたり０．５ｍｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）を含有する飲料水に切り替える。第２のコホートには、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇのＢＡ‐１０４９（Ｓ）を含有する水を与える。第３のコホートには、通常の混じり物のない飲料水を与える。８日目に、全てのマウスについて血圧を計測する。

８日目の血圧計測の後、２つの被験コホートの薬物投与量を体重１ｋｇあたり１ｍｇに増大し、該コホートをその新しい用量で３日間継続する。１１日目に、血圧をテールカフ式プレチスモグラフィーにより全てのマウスについて５分の記録期間の間、再び記録する。

血圧の記録に続き、１１日目に、試験群の飲料水中の薬物投与量を体重１ｋｇあたり３ｍｇまで増大し、該コホートをその新しい用量で３日間継続する。１４日目に、血圧をテールカフ式プレチスモグラフィーにより全てのマウスについて５分の記録期間の間、記録する。

ＢＡ‐１０４９（Ｓ）の試験用量のうち１以上は、所与の治療コホート内の平均収縮期血圧を低下させる。ＢＡ‐１０４９（Ｓ）の用量を高めると、収縮期血圧のより大きな低下が示される。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、ＲＯＣＫ２に対するその選択性がより高いので、平均収縮期血圧に対する影響をほとんど又は全く示さない。

実施例１９
［ＣＣＭタンパク質が枯渇した血管内皮細胞に対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果］
次の実験は、ＣＣＭタンパク質が枯渇した血管内皮細胞において重要な野生型（ＷＴ）の特徴を回復させる能力がＢＡ‐１０４９（Ｒ）にはあり、ＢＡ‐１０４９（Ｓ）にはないことを実証する。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏの実験は、Ｃｃｍ１、Ｃｃｍ２、又はＣｃｍ３突然変異を有する患者のＣＣＭ病変生検に由来する内皮細胞株において、及びヒト微小血管内皮細胞株（ＨＭＶＥＣ）において実施する。

１． 細胞株の準備
ＨＭＶＥＣ細胞を、Ｃｃｍ１、Ｃｃｍ２又はＣｃｍ３に特異的な小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（米国コロラド州ラファイエットのダーマコン（Dharmacon））を用いたトランスフェクションによってＣＣＭタンパク質の各々について枯渇させ；野生型細胞株は、未処理のＨＭＶＥＣ細胞で構成される。患者の生検細胞株（野生型、Ｃｃｍ１突然変異；Ｃｃｍ２突然変異；Ｃｃｍ３突然変異）は、特定のＣｃｍ突然変異を有する患者の生検中に得られた内皮細胞から生成し；野生型細胞株は、Ｃｃｍ突然変異を持たない対象者の生検試料に由来する。

２． 投薬及び分析のタイミング
５種の個別の用量（１μΜ、１０μΜ、２５μΜ、５０μΜ、１００μΜ）のＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）を、各ＣＣＭ ＨＭＶＥＣ細胞株及び各Ｃｃｍ突然変異体生検細胞株において野生型表現型を回復させる能力について評価する。細胞株を、次の各用量：（１）培地中の１日用量を反復；（２）毎日３０分の曝露及び洗い流し；並びに（３）最初の２４時間のみの処置、に曝露させる。

後述のエンドポイントは、各用量が各時点で各細胞株において野生型の内皮の表現型を回復させる能力を評価するために使用する。各エンドポイントは、最初の処置後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、及び１６８時間で評価を行う。全ての実験を三連で実行し、細胞株及び処理のいずれについても知らされていない２名の独立な判定者により分析を行う。

ａ． 内皮細胞の血管形成
細胞をコラーゲン・マトリックス中に懸濁させて、該細胞が血管様チューブを形成する能力を分析できるようにする。マトリックスは以下のように作製する、すなわち：コラーゲンを、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック）及びＮａＯＨの混合物が入った０℃のチューブに添加する。細胞を添加して最終コラーゲン濃度３．７５ｍｇ／ｍＬとし、この細胞‐コラーゲン混合物を４．５ｍｍのマイクロウェル中に播種する。コラーゲンをゲル化させ、ＣＯ_２インキュベータ中３７℃で平衡化する。無血清培地（低血清ＩＩサプリメント（米国ニューヨーク州レークプラシッドのアップステート・バイオテクノロジー（Upstate Biotechnology ））、ｂＦＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（４０ｎｇ／ｍＬ）、ホルボールエステル（５０ｎｇ／ｍＬ）、及びアスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ）を含有しているＭｅｄｉｕｍ１９９）の中で３時間のインキュベーションの後、培養物を３％グルタルアルデヒドを用いて３０分間固定する。

固定後０時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１６時間、２０時間、及び２４時間において、培養物の画像を収集するために蛍光タイムラプス顕微鏡法を実行する。経時的な空胞及び内腔のエリアを、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）イメージングソフトウェア（米国カリフォルニア州サニーヴェールのモレキュラー・デバイシズ・コーポレイション（Molecular Devices Corp. ））を使用してトレース及び定量化し（ｎ＝時点ごとに５つの独立した視野）、また２４時間での１視野当たりの内腔の数を計数する（ｎ＝５つの独立した視野）。

ｂ． 内皮細胞の遊走
走触性の遊走について以下のように検査する：２０，０００個の細胞を、内皮増殖培地‐２（米国メリーランド州ウォーカーズヴィルのロンザ（Lonza ））に含めてボイデンチャンバ（米国メリーランド州ゲーサーズバーグのニューロ・プローブ（Neuro Probe ））の上部ウェルに播種し、下面にヒトフィブロネクチン（１μｇ／ｍＬ）（米国マサチューセッツ州ウォードヒルのバイオメディカル・テクノロジーズ（Biomedical Technologies ））がコーティングされたポリカーボネートメンブレン（８μΜ細孔）（シグマ・アルドリッチ）の中へと３時間遊走させる。

遊走していない細胞を除去した後、メンブレンを固定及び染色し（Ｈｅｍａ３（登録商標））キット、米国マサチューセッツ州ウォルサムのフィッシャーサイエンティフィック）、スライドガラス上に載せる。高倍率の顕微鏡視野あたりの遊走した細胞の数を定量化する（ｎ＝条件ごとに１０視野）。

ｃ． 内皮細胞の透過性
ホースラディッシュペルオキシダーゼに対する内皮細胞の透過性を、以下のようにしてトランスウェルアッセイを使用して計測する：Ｔｒａｎｓ‐ｗｅｌｌ（登録商標）インサート（４８ウェル、３μΜ細孔）（米国ニューヨーク州コーニングのコーニング・インコーポレイテッド（Corning Inc.））をヒトフィブロネクチンでコーティングし、１ウェルあたり３０，０００個の細胞を播種する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（２５μｇ／ｍＬ）をインサートの上部に添加し、６時間透過させる。６時間後、各ウェルの底部からの溶液を０．１ｍＬのグアイアコール及び０．２ｍＬの過酸化水素とともに混合し、Ａ４９０ｎｍで吸光度を計測する（ｎ＝各６ウェル）。

ｄ． 内皮内部のＲｈｏキナーゼ活性
内皮内部のＲＯＣＫ活性を、リン酸化ミオシン軽鎖２（ホスホＭＬＣ２）のレベルを以下のようにして計測することにより評価する：サブコンフルエント状態の細胞を収集し、ＲＩＰＡ溶解バッファー（米国テキサス州ダラスのサンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド（Santa Cruz Biotechnology, Inc.））の中で溶解させる。細胞溶解物を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（７％ゲル）及び二リン酸化ミオシン軽鎖２に特異的な抗体（セル・シグナリング・テクノロジー（Cell Signaling Technology）；米国マサチューセッツ州ダンヴァーズ）（３６７４）を使用するウエスタンブロットにより分析する。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート型の二次抗体を、発色及び画像化を可能にするために使用し；リン酸化ミオシン軽鎖２の相対レベルを、ＩｍａｇｅＪにおいて、ＩｍａｇｅＪユーザ・マニュアルのゲル分析に関する説明書（http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#gels）に従い、バンド強度のデンシトメトリーによる定量化によって定量する。

ｅ． 内皮内部のＲＯＣＫ１とＲＯＣＫ２の比率
内皮細胞内のＲＯＣＫ１とＲＯＣＫ２の比率を以下のように評価する：サブコンフルエント状態の細胞を収集し、ＲＩＰＡ溶解バッファー（サンタクルーズ・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド）の中で溶解させる。細胞溶解物を、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（７％ゲル）並びに抗ＲＯＣＫ１及び抗ＲＯＣＫ２抗体（６１１１３６及び６１０６２３）（ビーディー・バイオサイエンシズ（BD Biosciences）、米国カリフォルニア州サンホセ））を使用するウエスタンブロットによって分析する。ＨＲＰコンジュゲート型の二次抗体を、発色及び画像化を可能にするために使用し；ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の相対レベルを、ＩｍａｇｅＪにおいて、ＩｍａｇｅＪユーザ・マニュアルのゲル分析に関する説明書（http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#gels）に従い、バンド強度のデンシトメトリーによる定量化によって定量する。

Ｂ． 結果
試験したＢＡ‐１０４９用量のうち１以上が、試験した投薬レジメンに従って投与された時に内皮細胞の血管形成、遊走、透過性、Ｒｈｏキナーゼ活性、及びＲＯＣＫ１：ＲＯＣＫ２比率をＷＴレベルまで回復させ；試験したＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１０４９（Ｓ）用量のうちいずれも、試験した投薬レジメンに従って投与された時に内皮細胞の血管形成、遊走、透過性、Ｒｈｏキナーゼ活性、及びＲＯＣＫ１：ＲＯＣＫ２比率をＷＴレベルには回復させない。

実施例２０
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はＢＡ‐１０４９（Ｓ）を用いた処理の後の内皮の透過性］
標識されたアルブミンの経血管輸送を、内皮の透過性を研究するために使用する。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０４９（Ｓ）を、血管外漏出の網膜モデルにおける血液網膜関門の修復に対するその効果について比較する。網膜における血管外漏出を、蛍光トレーサであるアルブミン‐ＦＩＴＣの静脈内注射の後に検出する。このトレーサは血液脳関門又は血液網膜関門を通常は横断できないが、検出可能な内皮細胞透過性が存在する場合には網膜内へと漏れることになる。該トレーサの血管外漏出は、網膜血管構造の視覚化を可能にする網膜全載標本において検出可能である。

成体ラットの血液網膜関門を破壊するために、４μＬ、１０μｇの細胞透過性Ｃ３トランスフェラーゼ（米国コロラド州デンバーのサイトスケルトン・インコーポレイテッド（Cytoskeleton, Inc.））を、８匹のスプレーグ・ドーリーラットの左右の眼内に、ラットをイソフルランで麻酔した後に注射する。硝子体内注射は、１０μｌハミルトンシリンジを使用して後眼房内に行う。２４時間後、１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）を４匹のラットの左眼に注射し、１μΜのＢＡ‐１０４９（Ｓ）を残りの４匹のラットの左眼に注射する。右眼は、高濃度の細胞透過性Ｃ３トランスフェラーゼによって誘発された血管外漏出を検出するための未処理の対照としての役割を果たす。２４時間後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、米国ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチ）にタグ付けされたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、３００μｇ／ｍｌ）を次いで動脈内注射し（体重１００ｇあたり０．２ｍｌ）、１０分間循環させ、次に網膜全載標本の調製のために眼球を摘出する。眼球を、全載標本の調製に先立ち、ラベル付きチューブの中の４％パラホルムアルデヒドで１時間固定する。

網膜全載標本は、強膜の周囲で切断し、かつ水晶体を静かに除去することにより調製する。この眼球をワックスプレート上にピンで留め、単一の鮮やかな切り口を備えた杯状眼球構造（eye cup）中の４つの四分円部位へと割断する。この組織片を、網膜ではなく強膜にピンを刺して固定し、次いで該組織片を折り返して網膜を露出させる。４つ全てを折り返したとき、網膜を視神経から解放するために視神経を中心窩において切る。網膜をスライドに移すために小さな絵筆を使用しながら、これを神経節細胞層を上にして置き、濾紙に添着し、そして後固定する（眼球は神経節層を内側にして自然にカールする）。神経節細胞層を上に維持する（網膜は神経節細胞層を内側にして自然にカールし、濾紙がこれを平らに固定する）。該試料を、網膜を平らにするためにリン酸緩衝液中４％のパラホルムアルデヒドにおいて後固定し、ＰＢＳで一晩すすぐ。網膜を、筆を使用して濾紙から少しずつ剥がす。過剰な硝子体液を紙芯で吸い取る。スライドにカバーグラスをかけ、ＦＬＴＣ標識された血管を、落射蛍光顕微鏡法によって検出する。

結果から、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＢＡ‐１０４９（Ｓ）よりも効果的に内皮の透過性及びＦＩＴＣ‐ＢＳＡの血管外漏出を解消することが可能であることが示される。
タイトジャンクションタンパク質であるオクルディンに対するＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びＢＡ‐１０７６（Ｓ）の効果についても４匹のラットで調査する。オクルディンは、細胞透過性Ｃ３トランスフェラーゼの注射後最初の２４時間で網膜内皮細胞においてダウンレギュレートされる。４匹のラットでは、細胞透過性Ｃ３トランスフェラーゼを上記のようにして注射し、２４時間後にＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はＢＡ‐１０７６（Ｓ）を上述のようにして注射する。３日後、網膜を摘出してオクルディン発現の定量のためのウエスタンブロッティング用に処理する。

タイトジャンクションの緩みは血液網膜関門の崩壊をもたらし、結果として血管外漏出を生じる。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の適用はオクルディンの発現を回復させる。
実施例２１
［ＢＡ‐１０４９Ｒ及び代謝物の選択的重水素化］
重水素は、電子を１つだけ含有しているが１個の陽子及び１個の中性子を含有する原子核を備えている、水素の安定同位体である。従って、重水素は２．０の原子質量（ＡＭＵ）を有する一方、原子核が１個の陽子しか含有していない水素は１．０ＡＭＵである。炭素‐重水素結合における重水素の存在は、炭素‐水素結合とは全く異なり、結合を開裂するためにより大きなエネルギーを必要とし、かつ化合物の薬物動態学的プロファイルに影響を及ぼして、重水素化された化合物をより長く存続させる。化合物の選択的な重水素化は、ひとたび投与されたときの生物体における該化合物の代謝又は半減期を変化させる可能性があるが、該化合物を、生物学的挙動の変化が重水素化されていない化合物と比較して重水素化によってもたらされているということを確かめるために試験する。

化合物を、多くは現在市販されている特殊重水素化前駆的化学物質を使用して、又はＤ_２Ｏ存在下でのフローケミストリーのような方法を用いて、重水素化することが可能である（エトヴェス（Oetvoes）ら、モレキュラー・ダイバーシティ（Molec. Diversity）、２０１１年、第１５巻、第３号、６０５－１１）。

次の実験は、経口及び静脈内投与の後のラット血漿における、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）並びにそれらの重水素化相当物の出現及び消失の時間的経過を実証する。

１． 動物及び投薬
頚静脈に二重にカニューレが挿入された成体オスのスプレーグ・ドーリーラット（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）を、本研究に使用する。ラットには静脈内（ＩＶ）投与又は経口（ＰＯ）投与のいずれかによって投薬する。ＩＶで投薬されるラットには、１ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１ｍｇ／ｋｇの重水素化ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の１：１混合物の単回投与量を、外科的に埋め込んだ頚静脈カニューレを介して行う一方、ＰＯで投薬されるラットには、正常化合物及び重水素化化合物の１：１混合物の１０ｍｇ／ｋｇの単回投与量を、経口強制投与によって与える。いずれの用量もリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で調合する。水素の代わりに重水素が存在することにより、１つの交換部位につき１ＡＭＵだけ各イオンの質量が増大する。したがって、例えば４つの部位で水素を重水素に交換した場合、結果として生じる重水素化イオンは４ＡＭＵだけ大きい全質量を有することになる。

ラットを、投与された化合物の副作用の臨床徴候について、投与後にモニタリングした。
ＩＶ又はＰＯ投薬の後、血液試料を、０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、及び２４時間で採取する。各時点において、０．３ｍＬの血液を頚静脈カニューレから採取し、抗凝血薬としてＥＤＴＡ二カリウムが入っているチューブに入れる。各血液試料の採取後すぐに、０．３ｍＬの無菌の注射用０．９％塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を、採取した血液量を補充するためにカニューレを通して投与する。血液試料は、遠心分離処理するまでは氷上に置く。試料を遠心分離処理し、血漿を新しいチューブにピペットで移してドライアイス上に置いてから、詳しい分析に先立ち保管のために－８０℃に移動させる。

２． 試料の分析
血漿試料を、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、並びに各々の重水素化相当物の、血漿中濃度の測定のために分析する。２５μＬの各血漿試料並びに標準品及び精度管理（ＱＣ）試料を、アセトニトリル／メタノール（５０／５０ ｖ／ｖ）中に１０ｎｇ／ｍＬのプロプラノロールを含有する２００μＬの内部標準溶液と混合する。試料をボルテックス混合して４℃で遠心分離処理する。結果として生じる上清のうち１００μＬを３００μＬの水／ギ酸（１００／０．１ ｖ／ｖ）と混合し、アリコートを取り出す。

これらの試料を、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）並びにこれらの重水素化体の検出のためにＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ（液体クロマトグラフィータンデム型質量分析）システムに注入する。

３． データ分析
分析物の血漿中濃度を同定し、平均し、時間に対してプロットして、様々な薬物動態学的な値、例えば出現及び消失の時間的経過（Ｔ１／２）、血漿中最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）並びに最大血漿中濃度に達する時間（Ｔ_ｍａｘ）、並びに化合物への全体的な全身曝露の指標としての濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を測定する。

４． 結果
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びこれらの重水素化相当物は、図２２に表わされた方法を用いて見られるように、ＩＶ投与後又はＰＯ投与後のいずれにおいても血漿中に全て検出可能である。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又はその重水素化形態のＩＶ投薬による投与の後、各々の形態が血漿から消失する時間の速さは、重水素化がＢＡ‐１０４９（Ｒ）の代謝又は循環系からの除去をどのように変化させるかを示す。経口経路による投与は、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及びその重水素化形態の生成は検出可能であること、並びに重水素化形態は血液循環からの消失速度が異なるようであることを示している。

これらの結果は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の化学構造中の様々な位置における水素の重水素による置換は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のいずれの重水素化形態が投薬後に血漿から消失する速度も、変化させることを実証している。この結果は、特定の重水素化形態はより有利な薬物動態プロファイルを有し、したがって疾患、障害、又は損傷を治療又は管理するためのより長期にわたる効果を有することを示している。

実施例２２
［１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）代謝物が神経突起の成長を引き起こす能力］
１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）代謝物が特定の状況において活性を有するかどうかを測定するために、神経突起成長アッセイを使用する。実施例９に記載された方法に従い、様々な化合物が神経突起の成長を促進する能力を比較するためのＢＡ‐１０４９（Ｓ）、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の１‐ヒドロキシ代謝物は、他の試験化合物のどれよりも低い濃度で神経突起の成長を刺激する。
実施例２３
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のキナーゼ阻害スクリーニング検査］
次の実験は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）をキノムスクリーニングによってどのように評価したかを実証する。ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）スクリーニングプラットフォーム（米国カリフォルニア州フリーモントのディスカバーエックス・コーポレイション）は、試験化合物と、４５０種を超えるヒトキナーゼ及び疾患関連の突然変異バリアントとの間の相互作用を定量的に計測するために、新規な活性部位特異的競合結合アッセイを使用する。これらのアッセイはＡＴＰを必要とせず、その結果として、ＡＴＰ濃度に左右される可能性のあるＩＣ_５０値とは対照的に、真の熱力学的な相互作用親和性を報告する。キナーゼ活性部位に結合し、かつ固定化リガンドへのキナーゼ結合を直接的（立体的）に又は間接的（アロステリック的）に防止する化合物は、固体支持体上に捕捉されるキナーゼの量を低減することになる。反対に、キナーゼに結合しない被験分子は、固体支持体上に捕捉されるキナーゼの量に対して影響を及ぼさない。スクリーニングの「ヒット」は、関連するＤＮＡ標識を検出する定量的で正確かつ超高感度のｑＰＣＲ法を使用して、被験試料中と対照試料中とを対比して捕捉されるキナーゼの量を計測することにより同定される。

キナーゼタグ付きのＴ７ファージ株を、２４ウェルブロックにおいて並行して、ＢＬ２１株に由来する大腸菌宿主において増殖させた。大腸菌を対数増殖期まで増殖させ、凍結ストックのＴ７ファージに感染させ（感染多重度＝０．４）、溶菌するまで振盪しながら３２℃でインキュベートした（９０～１５０分）。溶解物を遠心分離処理し（６，０００×ｇ）、細胞残屑を除去するために濾過した（０．２μｍ）。残りのキナーゼはＨＥＫ‐２９３細胞で生産し、続いてｑＰＣＲ検出用にＤＮＡでタグ付けした（ウエイン（Wein）ら、ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat. Comm.）、２０１６年、第７巻）。ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを、ビオチン化された小分子リガンドを用いてＲＴで３０分間処理し、キナーゼアッセイ用の親和性樹脂を生成した（ペゴラロ（Pegoraro）ら、ネイチャー・コミュニケーションズ、２０１７年、第８巻）。このリガンド付きビーズを過剰量のビオチンでブロッキングし、そして未結合のリガンドを除去するため及び非特異的なファージ結合を低減するために、ブロッキングバッファー（ＳｅａＢｌｏｃｋ（商標）、（ピアース・バイオケミカル（Pierce Biochemical）；米国イリノイ州ロックフォード）、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＤＴＴ）で洗浄した。結合反応は、キナーゼ、リガンド付き親和性ビーズ、及び試験化合物を１×結合バッファー（２０％ＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、６ｍＭ ＤＴＴ）中で組み合わせることにより組み立てた。試験化合物は、１００％ＤＭＳＯ中で４０×ストックとして調製し、アッセイ中で直接希釈した。反応は全て、ポリプロピレンの３８４ウェルプレート中で０．０２ｍｌの最終体積で実施した。アッセイプレートを１時間振盪しながらＲＴでインキュベートし、親和性ビーズを洗浄バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。次いでビーズを溶離バッファー（１×ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５μΜの非ビオチン化親和性リガンド）の中に再懸濁し、３０分間振盪しながらＲＴでインキュベートした。溶離液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲによって計測した。

表１７は、４６８種のキナーゼに対して、及び心臓毒性に関与するキナーゼについてスクリーニングした１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９及びＢＡ‐１０４９の研究結果を示す。

この値は、陰性対照の結合に対する百分率を表す（すなわち、１００％は化合物による結合の妨害がないことに相当し；有意な結合が存在するのは陰性対照の３０％以下の場合である）。いずれの化合物も、化合物のうちいずれかに対する生物学的に関連性のある親和性を伴った相互作用はしなかった。しかしながら、これらのアッセイ条件では、化合物はＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２の両方に結合する。

実施例２４
［ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のアジピン酸塩の性質］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、遊離塩基の形態である時は適切な条件下で陽イオンとして存在し、かつ許容可能な陰イオンとともに塩を形成する、イオン性化合物である。次の塩のスクリーニングは、優れた結晶性及び許容可能な物理化学的性質を達成するように該分子と対合する適切なカウンターイオンを同定するために実施した。安定な結晶格子を備えた結晶の形成は、生産の際の原薬の結晶から不純物を保護し、かつさらにその安定性を高める助けとなることができる。

実験方法
遊離塩基としておよそ１００ｍｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）を、２ｍＬのイソプロピルアルコール、続いて０．５ｍＬのジクロロメタン中に溶解し、該溶液をＢＡ‐１０４９（Ｒ）が完全に溶解されるまで撹拌した。１モル当量又は０．５モル当量のいずれかの薬学的に許容可能なカウンターイオンを該溶液に添加し、塩形成のプロセスを開始するために６８℃で２時間～６時間撹拌した。許容可能なカウンターイオンには、塩酸、トシル酸、アジピン酸、メシル酸、Ｄ‐酒石酸、Ｌ‐酒石酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、コハク酸、リン酸及びその他が挙げられる。溶液を連続して撹拌しながらＲＴに冷却し、塩を濾過によって回収し、続いて、粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）、吸湿性による吸水量、融点及び他の物理化学的パラメータによる結晶性及び物性の詳しい分析のために脱水した。

結果
試験したカウンターイオンのうちかなりの割合がＢＡ‐１０４９（Ｒ）とともに安定結晶を生成し、かつ様々な手段を使用してさらに評価された。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）の多数の様々な塩形態は、動的走査熱量測定によって決定されるように遊離塩基と比較して融解温度プロファイルの大幅な上昇を示し、かつ熱重量分析（ＴＧＡ）及び動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）によって評価された。

ＸＲＰＤにて良好な結晶性を備えた固体を形成した塩の多くが融解温度の上昇を示した一方、ＤＶＳにおけるそのそれぞれの挙動は様々であった。加湿及び除湿の反復サイクルは特に、アジピン酸塩を、少量の水蒸気を吸収することが可能であると明らかにした。図２７に示されるように、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のアジピン酸塩形態は乾燥に際して水を排出することが可能であり、かつ結晶格子の挙動の変化を示すことなくそうしており、また水和とその後の脱水の複数のサイクルにわたってそうすることが可能であった（図２７）。アジピン酸塩が結晶性固体としては低含水率を保持する一方で水に容易に溶解する能力（ＲＴで＞２００ｍｇ／ｍＬ）と相まって、これらの性質からアジピン酸塩が治療的適応のための有用な塩であることが明らかになった。

実施例２５
［オフターゲットの安全性の精査］
小分子キナーゼ阻害剤は特定のキナーゼ又はキナーゼ群を標的とする。しかしながら、全てのキナーゼ阻害剤は他のキナーゼに対する意図せぬオフターゲット効果を示し、かつさらには非キナーゼの標的にも影響を与える場合がある。非キナーゼの標的に対するオフターゲット活性の一例は、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）及びセロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）をも不活性化する化合物ＡＲ‐１３３２４である（表１９）（スターディヴァント（Sturdivant）ら、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Bio-organic Med. Chem. Lett.）、２０１６年、第３６巻、ｐ．２４７５）。オフターゲット効果に関する困難の一部は、多くのキナーゼ阻害剤がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の結合を直接又は間接に妨害するように合成されることから生じる。キナーゼ阻害剤と他の標的との間のオフターゲット相互作用についてのスクリーニングは、キナーゼ阻害剤が適切な薬剤特性を有するかどうかを明らかにすることができる。

次の実験は、組織培養細胞株の選択された細胞表面標的の、又は精製された酵素からの、特異的活性を計測するアッセイを使用する、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のいずれかの潜在的なオフターゲット相互作用を同定する。ＳＡＦＥＴＹｓｃａｎ（商標）（ディスカバーエックス）を、薬剤開発に重要な良く知られた膜タンパク質、例えば選択された電位型イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体、神経伝達物質輸送体及びさらには選択された精製細胞酵素群、を含むパネルに対する任意の化合物の迅速な試験のために使用する。

ムスカリン性アセチルコリン受容体又はドーパミンＤ１受容体のような個々の膜貫通型受容体タンパク質を発現するように操作された細胞株を、その標準的な増殖培地における培養でコンフルエントに達するまで増殖させた。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を１０μΜの濃度で適用し、該培養物を、標的のイオンチャネル又は膜輸送体の活性化又は阻害を評価するために蛍光リポーターを使用してその特定のイオンチャネルの活性が計測されるまで、様々な時間にわたってインキュベートした。実験はさらに、標的の膜タンパク質の既知のアゴニスト及びアンタゴニストなど、比較のための対照も含む。

精製された酵素を使用するアッセイについては、酵素アッセイを、標準的な反応バッファー及び活性に必要な指示薬、例えば補因子、バッファー及び合成基質などで組み立てる。次いで活性アッセイを、１０μΜのＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうちいずれかの存在下又は非存在下で実施し、酵素活性に対するそれらの存在の影響を計測する。陽性対照として、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）を使用する結合アッセイをパネルに含めた。パネル中の他の標的には、Ｇタンパク質共役受容体、核内ホルモン受容体、細胞内の非キナーゼ酵素、イオンチャネル、及び神経伝達物質輸送体を含めた。具体的な標的は、それらが以前に細胞又は動物全体での研究において問題含みのオフターゲット効果の起源であることとの関連性が知られていることから選んだ。

結果
表１９に示されるように、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のいずれも、表に挙げた２つの非ＲＯＣＫ標的に対して有意な影響を示さなかった。加えて、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は、５‐ＨＴ２ｂ受容体との拮抗的相互作用の可能性について除けばＳＡＦＥＴＹｓｃａｎ（商標）全体の標的のうちいずれに対しても活性を示さなかった。

ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のいずれについても顕著なヒットが存在しないことから、これらの化合物の特異性、及び疾患、障害又は損傷を治療するための該化合物の開発の可能性について、明白な証拠が提供された。

実施例２６ ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は脊髄損傷後の機能的回復を改善する
［脊髄損傷に対するＢＡ‐１０４９（Ａ）の効果］
次の実験は、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）が脊髄損傷（ＳＣＩ）後のマウスにおける機能的回復を改善する能力を実証する。

１． 動物及び外科手術
成体メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールス・リバー・ラボラトリーズ）を本研究に使用した。マウスに以下の方法で背側の片側過切断（overhemisection）を施した。麻酔の導入を、１００％Ｏ_２中５％イソフルランによって行った。残りの手術のために１００％Ｏ_２中１～２％イソフルランの下でマウスの麻酔を維持した。マウスには鎮痛用にＢｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ ＳＲ（商標）を与えた。マウスの背部を剃毛して７０％エタノール及びポビドン溶液を交互に用いて滅菌した。切開を下部胸椎の上方で実施した。椎弓切除を脊椎レベルＴ９～Ｔ１０において実施した。背側の脊髄に０．５ｍｍの深さかつ横方向に横断して切り込みを入れ、背側の片側過切断を遂行した。

筋肉及び皮膚を縫合し、体液補給を支援するためにマウスに０．９％塩化ナトリウム溶液を与えた。マウスの回復期の間、該マウスに水ゲル、柔らかくしたフード、マウス通常食及び水を供給した。マウスが自分で排出する能力を取り戻すまで、マウスの膀胱について１日２回絞り出しを行った。さらにマウスを毎日体重測定し、かつ臨床徴候について毎日モニタリングした。

２． 投薬
ＳＣＩマウスを、３群すなわち：手術後２日目で開始して２週間継続するＢＡ‐１０４９（Ｒ）治療群、手術後に１４日目で開始して２週間継続するＢＡ‐１０４９（Ｒ）治療群、及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）を投与しない対照群、のうちの１つに無作為に割り当てた。

治療群のマウスには、適切な治療期間中毎日、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に含めたＢＡ‐１０４９（Ｒ）を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ＩＰ）投与した。
３． 行動試験
損傷後２８日目に、３群全てのマウスを、２つの行動試験における成績について、各マウスの治療の枠組みが何であるかを知らされていない実験者によって類別した。第１はオープンフィールドでの自発運動の試験であり、第２は、マウスが鉛筆のような細い円錐形の物体の近くにその後肢で安全にぶら下げられる、後肢握り行動試験である。損傷を受けていないマウスは自分の後肢を差し伸べて物体を握ることになり；損傷を受けたマウスは、その反応が損傷を受けていないマウスの反応にどれだけ類似しているかについて類別される。

「知らされていない」実験者の行動に関する記録を別の科学者により統合し、マウスを各試験における成績に従ってランク付けする。ランク付けの後、マウスがどの治療群であるかを「暴露」した。

４． 結果
損傷後最初の２週間にわたり毎日１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰのＢＡ‐１０４９（Ｒ）で治療したマウスは、いずれの行動試験においても損傷を受けていないマウスの成績に近い成績を実証した（図２８）。この回復には、後脚での体重支持及びオープンフィールドでの自発運動の際の尾の挙上、並びに握り行動試験の際の後部脚を用いた正常な握り行動が含まれた。ＢＡ‐１０４９（Ｒ）治療を受けていないマウスでは、オープンフィールドでの自発運動の際の後部後肢の引きずり、及び握り行動試験の際の握り行動を伴わない後足の外旋が実証された。損傷後１４日目に１０ｍｇ／ｋｇのＢＡ‐１０４９（Ｒ）の腹腔内投与が開始されて１４日継続された損傷マウスは、他の群と比較して中間的な回復すなわち；オープンフィールドでの散発的な体重支持及び握り行動試験の際の緩徐又は微弱な握り行動、を示した。

図２８に示したこれらの結果は、毎日のＢＡ‐１０４９（Ｒ）がＳＣＩ後の大幅な自発運動及び後肢運動制御の回復を引き起こすことを実証している。それらはさらに、脊髄損傷後の治療のための時間帯が存在するかもしれないこと、具体的には、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を用いる治療は、回復初期に投与された場合、より遅い時点から開始するのに対してより効果的であること、を示唆している。

等価物
当業者であれば、本明細書中に具体的に記載された具体的な実施形態の数多くの等価物を認識するであろうし、又は該等価物を日常的な実験作業のみを用いて確認可能であろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるように意図されている。
［付記１］
構造：

を有している、ＢＡ‐１０４９のＲ鏡像異性体のヒドロキシ代謝物（１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ））。
［付記２］
アジピン酸塩である、付記１に記載のヒドロキシ代謝物。
［付記３］
重水素化されている、付記１に記載のヒドロキシ代謝物。
［付記４］
付記１に記載のヒドロキシ代謝物を含んでなる医薬製剤。
［付記５］
ヒドロキシ代謝物は重水素化されている、付記４に記載の医薬製剤。
［付記６］
ヒドロキシ代謝物はアジピン酸塩である、付記４に記載の医薬製剤。
［付記７］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）をさらに含んでなる、付記５に記載の医薬製剤。
［付記８］
ヒドロキシ代謝物及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方は重水素化されている、付記７に記載の医薬製剤。
［付記９］
ヒドロキシ代謝物及びＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方はアジピン酸塩である、付記７に記載の医薬製剤。
［付記１０］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含んでなる、付記４に記載の医薬製剤。
［付記１１］
ＣＣＭに罹患している患者のＣＣＭを治療する方法であって、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
［付記１２］
１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）は重水素化されている、付記１１に記載の方法。
［付記１３］
１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）はアジピン酸塩である、付記１１に記載の方法。
［付記１４］
治療用製剤は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含む、付記１１に記載の方法。
［付記１５］
１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない治療上有効な量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を患者に投与するステップをさらに含む、付記１１に記載の方法。
［付記１６］
脳卒中に罹患している患者の脳卒中を治療する方法であって、ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又はこれらの混合物を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
［付記１７］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方は重水素化されている、付記１６に記載の方法。
［付記１８］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方はアジピン酸塩である、付記１６に記載の方法。
［付記１９］
治療用製剤はＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含む、付記１６に記載の方法。
［付記２０］
ＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない治療上の量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を患者に投与するステップをさらに含む、付記１６に記載の方法。
［付記２１］
脳動脈瘤卒中に罹患している患者の脳動脈瘤卒中を治療する方法であって、化合物ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又はこれらの混合物を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
［付記２２］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方は重水素化されている、付記２４に記載の方法。
［付記２３］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方はアジピン酸塩である、付記２４に記載の方法。
［付記２４］
治療用製剤はＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含む、付記２４に記載の方法。
［付記２５］
ＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない治療上有効な量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を患者に投与するステップをさらに含む、付記２４に記載の方法。
［付記２６］
脊髄損傷卒中に罹患している患者の脊髄損傷卒中を治療する方法であって、化合物ＢＡ‐１０４９（Ｒ）若しくは１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又はこれらの混合物を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
［付記２７］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方は重水素化されている、付記２６に記載の方法。
［付記２８］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方はアジピン酸塩である、付記２６に記載の方法。
［付記２９］
治療用製剤はＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含む、付記２６に記載の方法。
［付記３０］
ＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない治療上有効な量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を患者に投与するステップをさらに含む、付記２６に記載の方法。
［付記３１］
脊髄損傷に罹患している患者の脊髄損傷を治療する方法であって、化合物ＢＡ‐１０４９（Ｒ）若しくは１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又はこれらの混合物を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
［付記３２］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方は、重水素化されているかアジピン酸塩であるかのうち少なくともいずれか一方である、付記３１に記載の方法。
［付記３３］
治療用製剤は、ＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含む、付記３１に記載の方法。
［付記３４］
ＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない治療上の量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を患者に投与するステップをさらに含む、付記３１に記載の方法。
［付記３５］
くも膜下出血後の血管攣縮に罹患している患者のくも膜下出血後の血管攣縮を治療する方法であって、化合物ＢＡ‐１０４９（Ｒ）若しくは１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）、又はこれらの混合物を含んでなる治療上有効な量の医薬製剤を患者に投与することを含む方法。
［付記３６］
ＢＡ‐１０４９（Ｒ）及び１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）のうち少なくともいずれか一方は、重水素化されているかアジピン酸塩であるかのうち少なくともいずれか一方である、付記３５に記載の方法。
［付記３７］
治療用製剤はＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではないｒｈｏキナーゼ阻害剤をさらに含む、付記３５に記載の方法。
［付記３８］
ＢＡ１０４９‐（Ｒ）又は１‐ヒドロキシ‐ＢＡ‐１０４９（Ｒ）ではない治療上の量のｒｈｏキナーゼ阻害剤を含んでなる第２の医薬製剤を患者に投与するステップをさらに含む、付記３５に記載の方法。

Claims (6)

1. 以下の構造：
   
   の化合物又はそれの薬学的に許容可能な塩を含んでなる医薬製剤であって、前記薬学的に許容可能な塩がアジピン酸塩である、医薬製剤。
2. 脳海綿状血管腫の治療に用いられる請求項１に記載の医薬製剤。
3. 脳卒中又はくも膜下出血後の血管攣縮の治療に用いられる請求項１に記載の医薬製剤。
4. 脳動脈瘤の治療に用いられる請求項１に記載の医薬製剤。
5. 脊髄損傷又は外傷性脳損傷の治療に用いられる請求項１に記載の医薬製剤。
6. 前記化合物は重水素化されている請求項１に記載の医薬製剤。