JP7454201B1 - 糸状菌固体培養物の製造方法、及び糸状菌固体培養物 - Google Patents
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Abstract
【課題】固体培養を実施する前の基質に比して、二酸化硫黄濃度が低減されており、エルゴチオネインの含有量が向上した糸状菌固体培養物と、その製造方法を提供する。【解決手段】糸状菌を基質へ種付けし、通風して固体培養することにより、エルゴチオネインを乾燥重量１００ｇあたり２０ｍｇ以上含み、二酸化硫黄の含有量が３０ｐｐｍ以下の糸状菌固体培養物を製造する方法であり、前記基質はコーングルテンミールを含むものである、糸状菌固体培養物の製造方法、及び糸条菌固体培養物である。【選択図】図１
Description
本発明は、糸状菌固体物の製造方法と糸状菌固体培養物に関する。
トウモロコシからコーンスターチを工業的に製造する方法の一つにウェットミリング法がある。ウェットミリング法では、（１）トウモロコシの精選、（２）浸漬、（３）胚芽の分離、（４）磨砕及び繊維分離、（５）デンプンとグルテンの分離、という５つの基本的な工程により、トウモロコシをデンプン、油（胚芽）、繊維、タンパクの４つの成分に分離させる。これらの工程では、コーングルテンミール、コーンジャーム、コーングルテンフィード等の副産物を含むコーンウェットミリング由来物が生じる。そのうち（２）浸漬工程では、トウモロコシの粒を柔らかくし、各成分を分離しやすくするために、０．１～０．３％程度の亜硫酸水が用いられる。コーンスターチにおいては最終的に洗浄することで亜硫酸類を除去することが可能であるが、コーングルテンミール等のコーンウェットミリング由来物には比較的多量の亜硫酸類が残存してしまう。
亜硫酸類は酸化や変色の防止等を目的として食品に用いられることもあるが、日本では特別に定められたものを除き、食品中の二酸化硫黄の残存量として３０ｐｐｍ未満の使用に制限されている。二酸化硫黄の残存量を規定量以下に抑えることができれば、食用とすることも可能である。
このような問題に対して、例えば特許文献１にはコーングルテンミール粉末を１０５℃～１５０℃の温度で加熱することにより二酸化硫黄含量を３０ｐｐｍ未満に低減する方法が提案されている。
また、特許文献２には、コーングルテンミール等のトウモロコシタンパク製品を酸化剤（好ましくは過酸化水素）で処理することで、遊離亜硫酸塩濃度を１５０ｐｐｍ未満に減少させる方法が提案されている。
食品における機能性成分の一種としてエルゴチオネインが注目されている。エルゴチオネインは、強力な抗酸化作用を有する含硫アミノ酸であり、エラスターゼ阻害作用、チロシナーゼ阻害作用を有することで知られている。
特許文献３においては、主に大豆等を基質とした無通風の麹菌による固体培養において、エルゴチオネインが検出されたことが記載されている。
植物や動物は、エルゴチオネインを合成することはできない。上述のように、特許文献３においては、主に大豆等を基質とした無通風の麹菌による固体培養において、エルゴチオネインが検出されている。一方で、コーングルテンミールを基質とした、麹菌による固体培養において、エルゴチオネインが検出されたという報告は無い。
また、特許文献１のように加熱による二酸化硫黄の低減方法では、タンパク質が変性・変質するおそれや着色するおそれがあり、また、コーングルテンミール粉末中の水分量に応じて加熱の温度や時間等の加熱条件を調整しなければならないという問題がある。また、特許文献２のように酸化剤による遊離亜硫酸塩の低減方法では、酸化剤が残留するという問題がある。食品安全性の観点では、上述のとおり、二酸化硫黄濃度１５０ｐｐｍ未満よりも更に低減する必要がある。
本発明は、上記に鑑みて提案されたものであり、固体培養を実施する前の基質に比して、二酸化硫黄濃度が低減されており、エルゴチオネインの含有量が向上した糸状菌固体培養物と、その製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記目的について鋭意研究した結果、コーンウェットミリング由来物に糸状菌を接種し、通風して所定の時間にわたり固体培養することで、コーンウェットミリング由来物中の二酸化硫黄濃度が低減され、かつ、エルゴチオネイン濃度が高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
糸状菌を基質へ種付けし、通風して９６時間未満の培養時間で固体培養することにより、エルゴチオネインを乾燥重量１００ｇあたり２０ｍｇ以上含み、二酸化硫黄の含有量が３０ｐｐｍ以下の糸状菌固体培養物を製造する方法であり、前記基質はコーンウェットミリング由来物を含むものである、糸状菌固体培養物の製造方法により、上記の課題を解決する。
エルゴチオネインを乾燥重量１００ｇあたり２０ｍｇ以上含み、二酸化硫黄の含有量が３０ｐｐｍ以下である糸状菌固体培養物により、上記の課題を解決する。
前記糸状菌はカビ毒非生産菌であることが好ましい。
前記カビ毒非生産菌が、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・リューチューエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、及びモナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）からなる群から選択される一種以上の菌であることが好ましい。
糸状菌を基質に種付けして固体培養する際には、培養開始から菌体増殖期前と、菌体増殖期後とで、基質の品温が異なるように培養することが好ましい。また、培養開始から菌体増殖期前の基質の品温に比して、菌体増殖期後の品温が高くなるように培養することが好ましい。
本発明の方法によれば、二酸化硫黄濃度が低減され、かつ、高濃度エルゴチオネインを含むコーンウェットミリング由来物の糸状菌固体培養物を提供することができる。
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
≪糸状菌固体培養物の製造方法≫
本開示に係る糸状菌固体培養物の製造方法は、糸状菌を基質へ種付けし、通風して９６時間未満の培養時間で固体培養することにより、エルゴチオネインを乾燥重量１００ｇあたり２０ｍｇ以上含み、二酸化硫黄の含有量が３０ｐｐｍ以下の糸状菌固体培養物を製造する方法であり、前記基質はコーンウェットミリング由来物を含むものである。コーングルテンミール、コーンジャーム、コーングルテンフィード等を一種類以上含むものである。中でも、本発明の奏する効果が得られやすいという観点から、コーンウェットミリング由来物はコーングルテンミールであることが好ましい。コーングルテンミールとは、トウモロコシ粒からウェットミリング法によって分離される、タンパク質と澱粉とを主成分とする材料をいう。コーングルテンミールは、グルテンミールともいわれる。
本開示の糸状菌固体培養物の製造方法によれば、コーンウェットミリング由来物を含む基質に糸状菌を接種し通風して固体培養を行うことで、二酸化硫黄濃度が低減され、かつ、高濃度にエルゴチオネインを含有する糸状菌固体培養物を得ることができる。
基質はコーンウェットミリング由来物を含むものである。コーンウェットミリング由来物の剤型は、例えば、粉粒体状である。コーンウェットミリング由来物はタンパク質の割合が非常に多く、糖質が少ないことにより糸状菌の増殖効率が低い場合がある。糖質を補う目的で、コーンウェットミリング由来物にでんぷん質原料を添加して固体培養を行ってもよい。でんぷん質原料としては特に限定されず、例えば米糠、フスマ、米粉、小麦粉、又はこれらの混合物等が挙げられる。また、でんぷん質原料は、加熱して糊化したものであってもよい。でんぷん質原料の添加は、原料処理工程時に行ってもよく、糸状菌接種工程時に行ってもよく、固体培養工程時に行ってもよく、そのすべての工程で行ってもよい。
コーンウェットミリング由来物は、ヒスチジン、メチオニン、システインといった含硫アミノ酸の割合は高くはない。前記含硫アミノ酸は、エルゴチオネイン生合成経路に関係する。コーンウェットミリング由来物に含硫アミノ酸含有物を添加して固体培養を行ってもよい。含硫アミノ酸の供給源となる原料としては、特に限定されないが、例えば、魚粉、小麦、大豆等が挙げられる。含硫アミノ酸含有物の添加は、原料処理工程時に行ってもよく、糸状菌接種工程時に行ってもよく、固体培養工程時に行ってもよく、そのすべての工程で行ってもよい。
また、基質のｐＨを酸性（ｐＨ２～４）にすると、目的の糸状菌以外の雑菌が繁殖するのを抑制することができる。そのため、コーンウェットミリング由来物にｐＨ調整剤を添加して固体培養を行ってもよい。ｐＨの調整は、例えばｐＨ調整剤を添加するなどの方法により行うことができる。ｐＨ調整剤としては特に限定されず、例えばクエン酸、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸、コハク酸、酒石酸、乳酸等の酸性化合物が挙げられる。ｐＨ調整は、原料処理工程時に行ってもよく、糸状菌接種工程時に行ってもよく、固体培養工程時に行ってもよく、そのすべての工程で行ってもよい。
培養時における基質の品温は、特に限定されないが、基質の品温は培養開始から菌体増殖期前と、菌体増殖後とで異なる温度とすることが好ましい。菌体増殖期前における培養品温に比して、菌体増殖期後における培養品温が高くなるようにすることがより好ましい。なお、菌体増殖期とは、菌体数が指数関数的に増加して発熱が旺盛となる時間帯を示す。菌体増殖期においては、基質の品温と時間との関係をグラフにした際に、単位時間当たりの基質の品温の上昇量が急激に増大する。
基質の品温は、特に限定されないが、例えば、菌体増殖期前においては、２５℃以上、かつ３５℃未満にすることが好ましい。菌体増殖期後においては、３５℃以上、かつ４５℃以下にすることが好ましく、３５℃以上、かつ４０℃以下となるように調整することがより好ましい。
本糸状菌固体培養方法における培養時間は、基質の表面を糸状菌の菌糸が覆うまで培養するようにしてもよい。乾燥工程は、培養時間に含まないものとする。具体的な培養時間としては、９６時間未満である。培養時間は、８４時間以下とすることが好ましく、７２時間以下とすることがさらに好ましい。培養時間の下限値は、特に限定されないが、例えば、３０時間以上、４０時間以上、又は４５時間以上にすることができる。
本糸状菌固培養に用いる糸状菌は、摂取した動物に対して害が無く、基質を資化して増殖するものであれば特に限定されない。そのような糸状菌としては、例えば、アスペルギルス属、モナスカス属等が挙げられる。これらの内、食用として用いるという観点から、糸状菌はカビ毒非生産菌であることが好ましい。カビ毒非生産菌としては、例えば、カビ毒の生合成に関わる遺伝子の変異、欠損、又は転写抑制などの遺伝要因の蓄積によって、カビ毒の生産に関連する遺伝子が発現されず、カビ毒の生産能が喪失している菌を好適に使用することができる。具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・リューチューエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ａｗａｍｏｒｉ）、モナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）等が挙げられる。これらの糸状菌は、発酵食品の醸造用の種菌が市販されているし、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）で分譲を受けることもできる。上記の糸状菌は、遺伝子の改変を行っていない野生株でもよいし、例えば後述するエルゴチオネインの生産を増加させるように、遺伝子工学的な手法により遺伝子の改変を行ったものであってもよい。
カビ毒としては、例えば、アフラトキシン、オクラトキシン、ゼアラレノン、ステリグマトシスチン等が挙げられる。
糸状菌固体培養物は、糸状菌の生菌を含んでいるものであってもよく、糸状菌の死菌を含んでいるものであってもよく、それらの両方を含んでいるものであってもよい。
糸状菌については、公知の遺伝子工学的な手法を利用して、エルゴチオネインを野生株に比して高生産する変異株を使用してもよい。変異導入方法としては、例えば、セルフクローニング、紫外線(UV)やX線照射、アルキル化試薬による処理などが挙げられる。
培養前のコーンウェットミリング由来物は二酸化硫黄を含むものであってもよく、その二酸化硫黄濃度は１００ｐｐｍ以上であってもよく、２００ｐｐｍ以上であってもよく、５００ｐｐｍ以上であってもよい。培養前におけるコーンウェットミリング由来物の二酸化硫黄濃度の上限値は、８００ｐｐｍ以下であってもよく、１０００ｐｐｍ以下であってもよく、２０００ｐｐｍ以下であってもよい。このように二酸化硫黄を含有するコーンウェットミリング由来物であっても、コーンウェットミリング由来物を含有する基質に糸状菌を接種し、固体培養することで、糸状菌固体培養物における二酸化硫黄の濃度は３０ｐｐｍ以下に低減される。
基質は、糸状菌を種付けする前に、前処理を行ってもよい（前処理工程）。基質であるコーンウェットミリング由来物を前処理する方法は特に限定されず、公知の方法を使用することができる。例えば、コーンウェットミリング由来物に加水して撹拌した後、蒸煮処理を行い、基質に糸状菌を接種できる温度になるまで冷却する。
コーンウェットミリング由来物に糸状菌を接種する方法は特に限定されず、公知の方法を使用することができる（糸状菌接種工程）。例えば、上述した前処理工程後の基質に糸状菌の種菌（胞子）を散布して植菌する。また、接種する糸状菌は特に限定されないが、例えば上述の糸状菌を用いることができる。
基質を蒸煮する方法は特に限定されず、例えば、コーンウェットミリング由来物に対して好ましくは０．５～１．５倍量、より好ましくは０．７～１．３倍量の水を加えて撹拌した後に、蒸煮する方法が挙げられる。蒸煮温度は、特に限定されないが、好ましくは６０～１６０℃、より好ましくは９０～１３０℃の温度である。蒸煮時間も、特に限定されないが、好ましくは０．５～９０分間、より好ましくは２～６０分間である。
蒸煮した基質に糸状菌を接種する際の胞子数は、特に限定されないが、例えば、基質１g当たり１．０×１０３～１．０×１０９個とすることが好ましく、基質１ｇ当たり１．０×１０4～１．０×１０８個とすることがより好ましい。
固体培養工程において、糸状菌を接種したコーンウェットミリング由来物を固体培養する際には、必須ではないが、例えば、図１に示した装置を使用してもよい。当該装置は、基質５を堆積する培養床２を内部に有した培養室１と、培養床２の下から温湿度を調整した空気を送風することができる空調装置１０とを備える。培養室１は培養床２によって上室３と下室４に仕切られている。培養床２には複数の開孔が設けられており、空調装置１０から供給された空気は、下室４へと送り込まれ、開孔を通過して基質の間を通り抜け、上室３へと抜ける。上室３には、基質の品温を測定する品温センサー６が設けられており、下室４には、下室４に送り込まれた空気の湿度を測定する湿度センサー７が設けられている。
基質５に対して空気を供給するに際して、排気ダクト８を通じて一部又は全ての空気を外部に排出してもよいし、循環ダクト９を通じて一部又は全ての空気を循環させてもよい。
固体培養装置には、図１の装置のように、湿度調整のための二流体ノズル１１及び温度調整のための蒸気ノズル１２を設けてもよく、さらに、冷却部１３、又は加熱部１４などを設けてもよい。冷却部は、吸気した気体を冷却することができるものであればよく、例えば、内部に冷媒を通過させる熱交換器が挙げられる。加熱部は、吸気した気体を加熱することができるものであればよく、例えば、内部に加熱媒体を通過させる熱交換器又はヒーターなどが挙げられる。上記の熱交換器としては、例えば、フィンチューブ式熱交換器が挙げられる。冷媒としては、冷水などの液体、又は冷媒ガスなどの気体が挙げられる。加熱媒体としては、温水などの液体、熱風などの気体、又は蒸気などが挙げられる。
糸状菌により基質を固体培養する工程において糸状菌が増殖しエルゴチオネインを生産する過程で、基質の品温が培養経過に伴い変化する。そこで、所望の品温経過で培養が進むよう、基質に供給する空気の温度、湿度、及び風量のうち少なくとも一つを調整し、固体培養するのが好ましい。これにより、培養中の正確な温湿度の管理が可能となり、雑菌の増殖を抑えつつ糸状菌を効率的に増殖させることができる。また、基質の品温をコントロールすることにより、糸状菌固体培養物に含まれるエルゴチオネインの濃度を高めることができる。
上記基質の品温は、培養開始時から培養終了時までの間において１０～５５℃の範囲内であることが好ましく、１５～５０℃の範囲内であることがより好ましい。
上記基質に供給する風速は、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間において、線速度１ｃｍ／秒以上で基質を通過することが好ましい。線速度１～１７ｃｍ／秒で基質を通過することが好ましく、線速度３～１３ｃｍ／秒で基質を通過することがより好ましい。
上記基質に供給する空気の湿度は、相対湿度で５０～９９％であることが好ましく、７０～９９％であることがより好ましい。
糸状菌固体培養物の製造において、基質の含水率を調整することが好ましい。含水率を調整する方法としては、散水又は乾燥による方法が挙げられる。散水又は乾燥は、固体培養中に行ってもよいし、固体培養工程が終わった後に行ってもよい。固体培養工程中に散水することにより、糸状菌の生育に適した水分活性を維持し、糸状菌の増殖や酵素生産をより活発にすることができる。また、糸状菌固体培養物の保存性を高める観点から、固体培養工程後に乾燥して基質の含水率を調整することができる。糸状菌固体培養物や混合した他の材料の劣化を防ぎ、品質の安定化及び長期間の保存が可能となる。
≪糸状菌固体培養物≫
本実施形態に係る糸状菌固体培養物は、コーンウェットミリング由来物を含む基質を用いて、上述した糸状菌固体培養方法で製造される。
本実施形態に係る糸状菌固体培養物は、コーンウェットミリング由来物を含む基質を用いて、上述した糸状菌固体培養方法で製造される。
糸状菌固体培養物に含まれる二酸化硫黄の含有量は、例えば３０ｐｐｍ以下、好ましくは３０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ以下、更に好ましくは１０ｐｐｍ以下、更に好ましくは１０ｐｐｍ未満である。前記培養物に含まれる二酸化硫黄の含有量の下限値は、特に限定されないが、０ｐｐｍ以上である。このように、本実施形態に係る糸状菌固体培養物は、二酸化硫黄の含有量が低減されており、食品として用いることも可能である。
糸状菌固体培養物は、その培養物に含まれる乾燥重量１００ｇあたりのエルゴチオネインの含有量が、例えば２０ｍｇ以上、好ましくは２０～８０ｍｇ、より好ましくは２５～７０ｍｇ、更に好ましくは３０～７０ｍｇ、更に好ましくは３０～６０ｍｇである。このように、本実施形態に係る糸状菌固体培養物は、高濃度のエルゴチオネインを含有している。
また、基質のｐＨを酸性（ｐＨ２～４）にすると、目的の糸状菌以外の雑菌が繁殖するのを抑制することができる。したがって、コーングルテンミールを含む基質にｐＨ調整剤を添加して固体培養を行ってもよい。この場合、糸状菌固体培養物には、ｐＨ調整剤が含まれる。ｐＨ調整剤としては特に限定されず、例えばクエン酸、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸、コハク酸、酒石酸、又は乳酸等の酸性の化合物が挙げられる。
糸状菌固体培養物はそのまま使用することもできるが、他の材料と混合した組成物とすることもできる。糸状菌培養物を含む組成物に含まれる他の成分は特に限定されず、例えば一般的な食品や飼料などに通常用いられる他の原料や添加剤を適宜配合できる。なお、配合量は目的とする効果に応じて適宜調整できる。また、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、香料、各種エステル類、有機酸類、有機酸塩類、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、又は品質安定剤等の各種添加剤を含んでいてもよい。
糸状菌固体培養物又は上記組成物は、そのまま動物に与えることもできるし、他の食品や動物用飼料に含まれるものであってもよい。また、糸状菌固体培養物又は上記組成物は、他の食品や動物用飼料に混合するための食品添加剤や動物用飼料添加剤に含まれるものであってもよい。
糸状菌固体培養物を与えることができる対象は、特に限定されず、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、家禽等の家畜；エビ、カニ等の甲殻類；魚類（養殖魚を含む）；などが挙げられる。家禽には、例えば、鶏、鴨、アヒル、ガチョウ等が含まれる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
<実施例1>
含水率１０．４％のコーングルテンミール（基質）３ｋｇに対して、３.４Ｌの水を加えて撹拌した後、１００℃で３０分間蒸煮処理した。蒸煮後のコーングルテンミールを３５℃前後になるまで冷却した後、市販されているアスペルギルス・オリゼー（株式会社樋口松之助商店、Ｍ－０２無添加）を接種し、均一に種付けされるように混合した。なお、接種した胞子数は、コーングルテンミール１ｇ当たり約２×１０６個に相当する。種菌のアスペルギルス・オリゼーは、カビ毒非生産菌である。この種菌を接種した基質を、固体培養装置の培養床に盛り込み、堆積された基質の厚みが均一になるよう均してから培養を開始した。培養中は、温度及び湿度が管理された空気を培養床の下部から供給した。また、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間においては、堆積された基質へ線速度７～１３ｃｍ／秒程度通風することにより、基質の品温を厳密に制御した。基質の品温は、培養開始から培養２４時間までは３２℃、培養２６時間以降は３５℃となるよう、供給する空気の温度及び湿度を管理した。供給する空気の相対湿度は、９０～９９％の範囲となるよう管理した。培養中には、固体培養装置に備え付けられている撹拌機を用いて、適宜基質を撹拌し、培養状態が均一になるようにした。撹拌する際、適宜加水を行った。培養は４８時間行い、基質のコーングルテンミールの粒体表面を糸状菌の菌糸が十分に覆っていることを目視で確認した。更に、基質の含水率を調整する目的で、一晩送風乾燥を行い、糸状菌固体培養物を得た。
<実施例1>
含水率１０．４％のコーングルテンミール（基質）３ｋｇに対して、３.４Ｌの水を加えて撹拌した後、１００℃で３０分間蒸煮処理した。蒸煮後のコーングルテンミールを３５℃前後になるまで冷却した後、市販されているアスペルギルス・オリゼー（株式会社樋口松之助商店、Ｍ－０２無添加）を接種し、均一に種付けされるように混合した。なお、接種した胞子数は、コーングルテンミール１ｇ当たり約２×１０６個に相当する。種菌のアスペルギルス・オリゼーは、カビ毒非生産菌である。この種菌を接種した基質を、固体培養装置の培養床に盛り込み、堆積された基質の厚みが均一になるよう均してから培養を開始した。培養中は、温度及び湿度が管理された空気を培養床の下部から供給した。また、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間においては、堆積された基質へ線速度７～１３ｃｍ／秒程度通風することにより、基質の品温を厳密に制御した。基質の品温は、培養開始から培養２４時間までは３２℃、培養２６時間以降は３５℃となるよう、供給する空気の温度及び湿度を管理した。供給する空気の相対湿度は、９０～９９％の範囲となるよう管理した。培養中には、固体培養装置に備え付けられている撹拌機を用いて、適宜基質を撹拌し、培養状態が均一になるようにした。撹拌する際、適宜加水を行った。培養は４８時間行い、基質のコーングルテンミールの粒体表面を糸状菌の菌糸が十分に覆っていることを目視で確認した。更に、基質の含水率を調整する目的で、一晩送風乾燥を行い、糸状菌固体培養物を得た。
培養前のコーングルテンミール及び糸状菌固体培養物の二酸化硫黄の含有量は、以下のURLで公開されている「第２版 食品中の食品添加物分析法」別添３に定める二酸化硫黄の測定法のうち比色法（分析法Ｂ）により測定した。培養前のコーングルテンミールの二酸化硫黄の含有量は５１０ｐｐｍであり、糸状菌固体培養物の二酸化硫黄の含有量は１３ｐｐｍであった。
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/shokuhin/syokuten/bunseki/index.html
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/kenkou_iryou/shokuhin/syokuten/bunseki/index.html
エルゴチオネイン分析方法は、周知の方法を用いて行った。サンプル２ｇを秤量し、１００℃で１時間２回の水加熱還流で抽出後、遠心分離を行い上清を回収、２００ｍｌに定容した後に２０ｍｌに濃縮を行い、エタノール及び水の混液（７：３）で１０倍に希釈して、ＨＰＬＣ分析を行った。
<HPLC分析条件>
カラム：TSKgel Amide-80,内径4.6mm×250mm,粒径5μm
移動相：アセトニトリル及び10mmol/l酢酸アンモニウム溶液(8:2)
流量：１．０ｍｌ/ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
測定波長：２５８ｎｍ
<HPLC分析条件>
カラム：TSKgel Amide-80,内径4.6mm×250mm,粒径5μm
移動相：アセトニトリル及び10mmol/l酢酸アンモニウム溶液(8:2)
流量：１．０ｍｌ/ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
測定波長：２５８ｎｍ
培養前のコーングルテンミールではエルゴチオネインは検出されなかった(定量下限５ｍｇ以下／１００g)。糸状菌固体培養物のエルゴチオネインの含有量は乾燥重量１００ｇあたり４０．０ｍｇであった。
なお、乾燥重量１００ｇあたりのエルゴチオネイン濃度は、糸状菌固体培養物を含水率で除して算出した。具体的には、以下の式を用いた。Ｘは乾燥重量１００ｇあたりのエルゴチオネイン含有量であり、Ｙは水分を含む糸状菌固体培養物１００ｇあたりのエルゴチオネイン含有量であり、Ａは水分を含む糸状菌固体培養物の含水率(%)である。
Ｘ＝Ｙ÷(１００―Ａ)×１００
Ｘ＝Ｙ÷(１００―Ａ)×１００
培養中の線速度は、図１中のダクトに設置した面積式流量計を使用して流量を測り、培養床の断面積で除して算出した。なお、培養床の断面積とは、側壁１５と円柱状の培養床２の底面で規定される横断面の面積である。また、算出には下述の式を用いた。Ｘは線速度（ｃｍ/秒）であり、Ｙは面積式流量計で測定した値（ｍ３/分）であり、Ａは固体培養装置の培養床の断面積（ｍｍ２）である。
Ｘ＝（Ｙ×108÷60）÷Ａ
Ｘ＝（Ｙ×108÷60）÷Ａ
培養中の含水率は、サンプルを９０℃で１７時間保持して乾燥させ、その前後の差から水分量を算出して、水分量を乾燥前総重量で除することで算出した。具体的には、下述の式を用いた。
水分量＝乾燥前総重量―乾燥後総重量
含水率(%)＝水分量÷乾燥前総重量×100
水分量＝乾燥前総重量―乾燥後総重量
含水率(%)＝水分量÷乾燥前総重量×100
<実施例２>
含水率１０．４％のコーングルテンミール（基質）３ｋｇに対して、３.４Ｌの水を加えて撹拌した後、１００℃で３０分間蒸煮処理した。蒸煮後のコーングルテンミールを３５℃前後になるまで冷却した後、市販されているアスペルギルス・オリゼー（株式会社樋口松之助商店、Ｍ－０２無添加）を接種し、均一に種付けされるように混合した。なお、接種した胞子数は、コーングルテンミール１ｇ当たり約２×１０６個に相当する。種菌のアスペルギルス・オリゼーは、カビ毒非生産菌である。この種菌を接種した基質を、固体培養装置の培養床に盛り込み、堆積された基質の厚みが均一になるよう均してから培養を開始した。培養中は、温度及び湿度が管理された空気を培養床の下部から供給した。また、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間においては、堆積された基質へ線速度５～１１ｃｍ／秒程度通風することにより、基質の品温を厳密に制御した。基質の品温は、培養開始から培養２４時間までは３２℃、培養２６時間以降は３８℃となるよう、供給する空気の温度及び湿度を管理した。供給する空気の相対湿度は、９０～９９％の範囲となるよう管理した。培養中には、固体培養装置に備え付けられている撹拌機を用いて、適宜基質を撹拌し、培養状態が均一になるようにした。撹拌する際、適宜加水を行った。培養は７２時間行い、基質のコーングルテンミールの粒体表面を糸状菌の菌糸が十分に覆っていることを目視で確認した。更に、基質の含水率を調整する目的で、一晩送風乾燥を行い、糸状菌固体培養物を得た。
含水率１０．４％のコーングルテンミール（基質）３ｋｇに対して、３.４Ｌの水を加えて撹拌した後、１００℃で３０分間蒸煮処理した。蒸煮後のコーングルテンミールを３５℃前後になるまで冷却した後、市販されているアスペルギルス・オリゼー（株式会社樋口松之助商店、Ｍ－０２無添加）を接種し、均一に種付けされるように混合した。なお、接種した胞子数は、コーングルテンミール１ｇ当たり約２×１０６個に相当する。種菌のアスペルギルス・オリゼーは、カビ毒非生産菌である。この種菌を接種した基質を、固体培養装置の培養床に盛り込み、堆積された基質の厚みが均一になるよう均してから培養を開始した。培養中は、温度及び湿度が管理された空気を培養床の下部から供給した。また、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間においては、堆積された基質へ線速度５～１１ｃｍ／秒程度通風することにより、基質の品温を厳密に制御した。基質の品温は、培養開始から培養２４時間までは３２℃、培養２６時間以降は３８℃となるよう、供給する空気の温度及び湿度を管理した。供給する空気の相対湿度は、９０～９９％の範囲となるよう管理した。培養中には、固体培養装置に備え付けられている撹拌機を用いて、適宜基質を撹拌し、培養状態が均一になるようにした。撹拌する際、適宜加水を行った。培養は７２時間行い、基質のコーングルテンミールの粒体表面を糸状菌の菌糸が十分に覆っていることを目視で確認した。更に、基質の含水率を調整する目的で、一晩送風乾燥を行い、糸状菌固体培養物を得た。
培養前のコーングルテンミールの二酸化硫黄の含有量は５１０ｐｐｍであり、糸状菌固体培養物の二酸化硫黄の含有量は１０ｐｐｍであった。
培養前のコーングルテンミールではエルゴチオネインは検出されず(定量下限５ｍｇ以下／１００ｇ)。培養開始から４５時間経過後では乾燥重量１００ｇあたり２２．２ｍｇであり、糸状菌固体培養物（培養時間７２時間）では乾燥重量１００ｇあたり４７．４ｍｇであった。培養時間４５時間後と培養時間７２時間後のエルゴチオネイン濃度を比較すると約２倍となっていたことから、培養時間を長くすることが重要である。なお、二酸化硫黄の含有量、エルゴチオネインの含有量、培養中の線速度、培養物の含水率及び乾燥重量は、上述した測定方法及び計算式を用いた。
<実施例３>
含水率８．３％のコーングルテンミール（基質）３．７ｋｇに対して、４.３Ｌの水を加えて撹拌した後、１００℃で３０分間蒸煮処理した。蒸煮後のコーングルテンミールを３５℃前後になるまで冷却した後、市販されているアスペルギルス・オリゼー（株式会社樋口松之助商店、Ｍ－０２無添加）を接種し、均一に種付けされるように混合した。なお、接種した胞子数は、コーングルテンミール１ｇ当たり約２×１０６個に相当する。種菌のアスペルギルス・オリゼーは、カビ毒非生産菌である。この種菌を接種した基質を、固体培養装置の培養床に盛り込み、堆積された基質の厚みが均一になるよう均してから培養を開始した。培養中は、温度及び湿度が管理された空気を培養床の下部から供給した。また、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間においては、堆積された基質へ線速度７～１３ｃｍ／秒程度通風することにより、基質の品温を厳密に制御した。基質の品温は、培養開始から培養２４時間までは３０℃、培養２６時間以降は２５℃となるよう、供給する空気の温度及び湿度を管理した。供給する空気の相対湿度は、９０～９９％の範囲となるよう管理した。培養中には、固体培養装置に備え付けられている撹拌機を用いて、適宜基質を撹拌し、培養状態が均一になるようにした。撹拌する際、適宜加水を行った。培養は４５時間行い、基質のコーングルテンミールの粒体表面を糸状菌の菌糸が十分に覆っていることを目視で確認した。更に、基質の含水率を調整する目的で、一晩送風乾燥を行い、糸状菌固体培養物を得た。
含水率８．３％のコーングルテンミール（基質）３．７ｋｇに対して、４.３Ｌの水を加えて撹拌した後、１００℃で３０分間蒸煮処理した。蒸煮後のコーングルテンミールを３５℃前後になるまで冷却した後、市販されているアスペルギルス・オリゼー（株式会社樋口松之助商店、Ｍ－０２無添加）を接種し、均一に種付けされるように混合した。なお、接種した胞子数は、コーングルテンミール１ｇ当たり約２×１０６個に相当する。種菌のアスペルギルス・オリゼーは、カビ毒非生産菌である。この種菌を接種した基質を、固体培養装置の培養床に盛り込み、堆積された基質の厚みが均一になるよう均してから培養を開始した。培養中は、温度及び湿度が管理された空気を培養床の下部から供給した。また、菌の発熱量が大きい培養開始から１２～２４時間においては、堆積された基質へ線速度７～１３ｃｍ／秒程度通風することにより、基質の品温を厳密に制御した。基質の品温は、培養開始から培養２４時間までは３０℃、培養２６時間以降は２５℃となるよう、供給する空気の温度及び湿度を管理した。供給する空気の相対湿度は、９０～９９％の範囲となるよう管理した。培養中には、固体培養装置に備え付けられている撹拌機を用いて、適宜基質を撹拌し、培養状態が均一になるようにした。撹拌する際、適宜加水を行った。培養は４５時間行い、基質のコーングルテンミールの粒体表面を糸状菌の菌糸が十分に覆っていることを目視で確認した。更に、基質の含水率を調整する目的で、一晩送風乾燥を行い、糸状菌固体培養物を得た。
培養前のコーングルテンミールの二酸化硫黄の含有量は１３０ｐｐｍであり、糸状菌固体培養物の二酸化硫黄の含有量は２４ｐｐｍであった。
培養前のコーングルテンミールではエルゴチオネインは検出されず(定量下限５mg以下／１００g)、糸状菌固体培養物のエルゴチオネインの含有量は乾燥重量１００ｇあたり２１．４ｍｇであった。実施例１ではエルゴチオネインの含有量は乾燥重量１００ｇあたり４０．０ｍｇであったことから、一定時間の経過後に品温を上昇させる事で、エルゴチオネイン濃度が上昇することが分かった。なお、二酸化硫黄の含有量、エルゴチオネインの含有量、培養中の線速度、培養物の含水率及び乾燥重量は、上述した測定方法及び計算式を用いた。
Claims (6)
- 糸状菌を基質へ種付けし、
通風して９６時間未満の培養時間で固体培養することにより、
エルゴチオネインを乾燥重量１００ｇあたり２０ｍｇ以上含み、
二酸化硫黄の含有量が３０ｐｐｍ以下の糸状菌固体培養物を製造する方法であり、
前記基質はコーングルテンミールである、
糸状菌固体培養物の製造方法。 - 前記糸状菌がカビ毒非生産菌である、請求項１に記載の糸状菌固体培養物の製造方法。
- 前記カビ毒非生産菌が、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・リューチューエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、及びモナスカス・ピローサス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）からなる群から選択される一種以上の菌である、請求項2に記載の糸状菌固体培養物の製造方法。
- 糸状菌を基質に種付けして固体培養する際には、菌体増殖期前と、菌体増殖期後とで、基質の品温が異なるように培養する請求項１に記載の糸状菌固体培養物の製造方法。
- 菌体増殖期前の基質の品温に比して、菌体増殖期後の品温が高くなるように培養する請求項４に記載の糸状菌固体培養物の製造方法。
- 基質を糸状菌で固体培養したものであり、
エルゴチオネインを乾燥重量１００ｇあたり２０ｍｇ以上含み、
二酸化硫黄の含有量が３０ｐｐｍ以下であり、
前記基質はコーングルテンミールである、
糸状菌固体培養物。
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