JP7450585B2 - ＣＤ６６ｃに特異的に結合する抗体およびその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、抗－ＣＤ６６ｃ抗体およびその癌治療用途に関するものであって、具体的にＣＤ６６ｃを特異的に認識する抗体を用いてＴ－細胞活性化、または体液性免疫反応を誘導することができ、ＣＤ６６ｃを認識して結合する抗体、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞および前記抗体または抗原結合断片のＣＤ６６ｃ関連疾病、例えば固形癌の軽減、予防、治療または診断用途に関するものである。
ＣＤ６６ｃはＣＥＡＣＡＭ６（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ６）またはＮＣＡ（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｎｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ）－９０とも知られており、肺癌、すい臓癌、乳癌、直腸癌、肝癌などの患者で血液内のＣＤ６６ｃの量が高く示されると知られている。前記ＣＤ６６ｃは細胞接着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）に関連した重要な蛋白質であって、好中性白血球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ）の場合、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）によって活性化された内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）との接着に関与すると知られている。
また正常細胞の場合、細胞接着が行われない場合に細胞自滅が行われ、このような作用をアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）という。しかし、腫瘍細胞の場合、このようなアノイキスに対して抵抗力を有しており、これによって癌発生と癌転移が促進される。前記ＣＤ６６ｃはアノイキスを抑制するという報告があり、ＣＤ６６ｃの発現を調節することによって癌細胞の悪性表現型（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）が変わるという報告もある。
またＣＤ６６ｃ遺伝子を低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いてサイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）させて蛋白質の発現を抑制した場合、アノイキスが増加してｉｎ ｖｉｖｏ上で癌転移が抑制されるという実験結果も報告されている。結局、ＣＤ６６ｃの機能を抑制することが癌転移を抑制するのに重要な作用を果たすことができる。
本発明の一例は、ＣＤ６６ｃに結合する抗体およびその抗原結合断片に関するものである。
本発明の一例は、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞に関するものである。
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含むＣＤ６６ｃ関連疾患の探知または診断方法、または診断キットに関するものである。
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含むＣＤ６６ｃ関連疾患の予防、治療、または軽減用組成物または用途に関するものである。
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含む組成物をＣＤ６６ｃ関連疾患を有する対象に投与する段階を含む、ＣＤ６６ｃ関連疾患の予防、治療、または軽減方法に関するものである。
本発明の一例は、前記抗体、核酸分子、ベクター、および／または宿主細胞を含む癌および癌転移関連疾患の予防または治療用組成物、または方法に関するものである。
本発明は、ＣＤ６６ｃを認識して結合する抗体、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞および前記抗体またはその抗原結合断片のＣＤ６６ｃ陽性の固形癌の軽減、予防、治療または診断用途に関するものである。
ＣＤ６６ｃ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６６ｃ）はＣＥＡＣＡＭ ６（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ６）またはＮＣＡ（ｎｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｎｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ）－９０とも知られている蛋白質であって、細胞接着（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）に関連した重要な蛋白質と知られており、これに限定されないが、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎｏ．ＡＡＨ０５００８）で表示できる。
一例は、ＣＤ６６ｃを特異的に認知する抗ＣＤ６６ｃ抗体を提供する。本発明による抗－ＣＤ６６ｃ抗体は、体液性および細胞－媒介免疫反応を誘導する。本発明による抗ＣＤ６６ｃ抗体は、ＣＤ６６ｃ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ６６ｃ）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）を特異的に認識して、ＣＤ６６ｃ抗原を効果的に検出することができる。
本明細書で“抗体”とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、その種類は特に制限されない。前記抗体は、非自然的に生成されたもの、例えば、組換えまたは合成的に生成されたものであり得る。前記抗体は、動物抗体（例えば、マウス抗体など）、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得る。前記抗体は、単クローン抗体または多クローン抗体であり得る。
また本明細書で抗体は、特別な言及がない限り、抗原結合能を保有した抗体の抗原結合断片も含むと理解できる。本明細書で“相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、ＣＤＲ）”とは、抗体の可変部位のうちの抗原との結合特異性を付与する部位を意味する。前述の抗体の抗原結合断片は、前記相補性決定領域を一つ以上含む抗体断片であり得る。
本発明の一例は、ＣＤ６６ｃを特異的に認識またはＣＤ６６ｃに特異的に結合する抗ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明による抗－ＣＤ６６ｃはＣＤ６６ｃを特異的に認識および／または結合し、抗体はマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体を含む。本発明でキメラ抗体は、可変領域配列が一つの種に由来し、不変領域配列が他の種に由来した抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、不変領域配列がヒト抗体に由来した抗体を意味する。本発明でヒト化抗体とはヒトで免疫性が少ないながら非ヒト抗体の活性を保有する抗体を意味する。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を維持させ、抗体の残り部分をヒト対応部（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）で置換することによって製造できる。例えば、下記文献が参照される：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、４４：６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、２８：４８９－４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．、３１（３）：１６９－２１７（１９９４）。
本発明で抗体切片は抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでＣＤ６６ｃエピトープを選択的に認識することができるものであればこれに制限がないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲからなる群より選択されたものであり得る。特に、前記ｓｃＦｖは前記重鎖可変部位（ＶＨ）および軽鎖可変部位（ＶＬ）をリンカーポリペプチドで連結して単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）に作った抗体切片である。
本発明によるマウス抗体またはキメラ抗体の一例は、配列番号１～３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列および配列番号４～６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合断片であり得る。前記マウス抗体またはキメラ抗体の一例によるＣＤＲ配列と可変領域配列を下記表１に整理する。
具体的に、本発明の抗体の一例は、ＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列として配列番号１（ＣＤＲ１）、配列番号２（ＣＤＲ２）および配列番号３（ＣＤＲ３）および／またはＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列である配列番号４（ＣＤＲ１）、配列番号５（ＣＤＲ２）および配列番号６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。
前記マウス抗体またはキメラ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含むものであってもよい。
本発明によるマウス抗体またはキメラ抗体を有効成分として含む癌および癌転移から選択された疾病の予防または治療用薬学組成物、キットまたは治療方法に関するものである。本発明によるマウス抗体またはキメラ抗体、例えば寄託番号ＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００２３０のハイブリドーマから生産された抗－ＣＤ６６ｃ抗体のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、およびＣＤＲ－Ｌ３を含む抗－ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片を含む癌および癌転移から選択された疾病の予防または治療用薬学組成物に関するものである。前記ハイブリドーマ細胞は韓国細胞株銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、ＫＣＬＲＦ）に‘８Ｆ５’として２０１０年２月２２日付で寄託番号ＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００２３０で寄託されたものであり、ＫＲ１０－１２１４１７７登録公報に詳しく記載されている。
前記癌はＣＤ６６ｃ陽性の固形癌であってもよく、例えば、ＣＤ６６ｃ陽性の肺癌、大腸癌、胃癌、肝癌、乳癌、または前立腺癌であってもよく、好ましくは大腸癌、胃癌または肝癌であってもよい。前記癌および癌転移の予防、抑制、または治療用途は例えば、固形癌または固形癌細胞の大きさを減少させるか腫瘍退化を誘導または促進することができる。
本発明は前記マウス抗体またはキメラ抗体を用いて抗－ＣＤ６６ｃ抗体８Ｆ５のアミノ酸配列とヒト抗体配列をフレームワーク配列に基づいて製造する。ヒト化組換え抗体候補の中から発現程度と凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）有無、細胞結合程度を基準にして、ヒト化候補抗体の中から発現が正常に行われ、蛋白質自体の不安定性によって形成される凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が少なく、またターゲット抗原陽性の細胞に結合する能力がキメラ抗体と類似したヒト化抗体候補を選別する。具体的に細胞結合様相はキメラ抗体と類似した水準であって抗体陽性率（％ ｇａｔｅｄ）と蛍光平均値（ｍｅａｎ）をかけ、これをキメラ抗体と相対比較して±２０％範囲内に含まれる候補抗体を選別する（実施例２）。したがって、本発明で選定された抗体群は通常ヒト化抗体生成時、ヒト化抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）にマウス抗体ＣＤＲ部位配列を挿入した時に元の蛋白質構造の変更で抗体結合力が急激に低下するという結果を考慮した時、非常に優れたヒト化抗体を選別したと言える。
好ましくは、キメラ抗体と比較して細胞結合力を基準にして高い結合力を示す５種類のヒト化組換え抗体を選択し、これらをＥＬＩＳＡ方法でＣＤ６６ｃ抗原および類似ＣＤ６６抗原に対する結合力分析を実施する。
また、本願発明によるヒト化抗体はキメラ抗体に比べて優れた安定性を示し、例えばＡＮＳ反応性変異％が２００％未満で安定した抗体であり、２００％未満は変化が非常に微小であると見なされ、それ以上は有意義な蛋白質構造変更が行われＡＮＳ反応性が観察されたと解釈できる。したがって、本発明によるヒト化抗体はキメラ抗体と比較して類似した抗原結合力および細胞結合力を有し、抗体蛋白質自体の物理的安定性が増加し、このような事実は治療用抗体のドラッガビリティ（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）の面で非常に優れた特定と言える。
ＡＮＳ試薬に対する抗体の蛍光値変異率は、低温条件（例、４℃）で測定した蛍光値と、高温条件（例、６２℃）で測定した蛍光値の差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、低温条件で測定した蛍光値で割った値を意味する。
［数式］
蛍光値変異率＝（高温条件で測定した蛍光値－低温条件で測定した蛍光値）／（低温条件で測定した蛍光値）
蛍光値変異率＝（高温条件で測定した蛍光値－低温条件で測定した蛍光値）／（低温条件で測定した蛍光値）
具体的な抗体蛍光値変異率を得る方法として、冷蔵条件（４℃）および６２℃温度でそれぞれ４時間放置した後にＡＮＳ試薬反応性を蛍光リーダーで分析して蛍光値で表示し、前記数式を用いて蛍光値変異率を測定することができる。
本発明によるヒト化抗体の一例は配列番号９～１３のアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖可変領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含むことができ、追加的にマウス抗体またはキメラ抗体の一例は配列番号１～３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列および配列番号４～６のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲを決定するアミノ酸配列からなる群より選択された１種以上のアミノ酸配列を含む抗体であり得る。
具体的に、ヒト化抗体の一例は、配列番号１または９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲ１を決定するアミノ酸配列、配列番号２または１０のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲ２を決定するアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ領域のＣＤＲ３を決定するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域であり得る。
また、ヒト化抗体の一例は、配列番号４、１１または１２のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲ１を決定するアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲ２を決定するアミノ酸配列、配列番号６または配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＬ領域のＣＤＲ３を決定するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域であり得る。
ヒト化抗体の一例は配列番号７および配列番号１４～１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からなる群より選択された重鎖可変領域と、配列番号８および配列番号１９～２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域からなる群より選択された軽鎖可変領域を含むことができ、但し、配列番号７および配列番号８を含む抗体は除外される。
前記ヒト化抗体の一例によるＣＤＲ配列と可変領域配列を下記表１に整理する。
本発明によるヒト化抗体の一例のフレームワーク配列を下記表３および４に示し、前記抗体は重鎖可変領域のフレームワーク１～４、および軽鎖可変領域のフレームワーク１～４からなる群より選択された１種以上のフレームワークを含む抗体であり得る。
具体的に、重鎖可変領域でフレームワーク１のアミノ酸配列は配列番号２３～２７を含むことができ、フレームワーク２のアミノ酸配列は配列番号３２～３７を含むことができ、フレームワーク３のアミノ酸配列は配列番号４３～４７を含むことができ、およびフレームワーク４のアミノ酸配列は配列番号５３～５７を含むことができる。
軽鎖可変領域でフレームワーク１のアミノ酸配列は配列番号２９～３１を含むことができ、フレームワーク２のアミノ酸配列は配列番号３９～４１を含むことができ、フレームワーク３のアミノ酸配列は配列番号４９～５１を含むことができ、およびフレームワーク４のアミノ酸配列は配列番号５９～６１を含むことができる。前記ヒト化抗体の一例によるフレームワーク配列を下記表に示す。
前記ヒト化抗体は、配列番号１４～１８のアミノ酸配列からなる群より選択されるＶＨ領域および配列番号１９～２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含むものであり得る。具体的に、前記ヒト化抗体の例は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ６）、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ１１）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１９のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ５＋ＶＨ７）、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ６）、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ１０）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む（Ｖｋ７＋ＶＨ７）、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ５）、および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ７）であり得る。前記抗体の具体的な組み合わせおよびアミノ酸配列は下記表６に示す。前記抗体の好ましい一例は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ６）、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２１のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ８＋ＶＨ１１）、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１９のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ５＋ＶＨ７）、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ６）、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号２０のアミノ酸配列からなる群より選択されたＶＬ領域を含む抗体（Ｖｋ７＋ＶＨ１０）であり得る。
前記ヒト化抗体はマウス抗体やキメラ抗体とは異なり、人体投与時、免疫原性の原因を大幅に減らす差別性以外にも安定性の面でキメラ８Ｆ５抗体より１０倍以上の高い安定性を示した。具体的には、高い温度、例えば温度６２℃でＡＮＳ結合による蛍光値変異率が２００％未満で、安定性が高い。
具体的な苛酷条件で抗体物性の変異によってキメラ８Ｆ５抗体は１，４０６％のＡＮＳ反応性変化を示した反面、ヒト化抗体は１１４％、１３３％程度の相対的に微小な変化を示し、非常に蛋白質の面で安定化されたことが分かる。
前記キメラ８Ｆ５およびヒト化抗体はＴ細胞の活性化を増加させ、これはＴ細胞活性因子による活性化増大および互いに異なるヒトの同種樹状細胞とＴ細胞混合によるＴ細胞活性条件でも活性増大を示す場合が挙げられる。このようなＴ細胞活性化誘導は、癌細胞との共同培養時に癌細胞の死滅を誘導し、多様な癌細胞との共同培養条件でＴ細胞活性化誘導する場合が挙げられる。
本発明による抗体またはその断片は、腫瘍退縮（ｔｕｍｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）活性および腫瘍細胞株に対して直接的な抑制効果を有する。本明細書で腫瘍の退縮は腫瘍大きさの減少および／または腫瘍細胞の成長阻害、中断または減少などを誘導または促進することを含む。腫瘍の大きさ減少は例えば、本発明の抗体またはその断片を含む組成物を処理する前を１００％を基準にして、前記抗体またはその断片を含む組成物を投与した場合に得られた腫瘍の大きさが９７％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下の大きさを有する場合などが挙げられる。
本発明による抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）と補体系依存（ＣＤＣ、ｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する。
用語、“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）”は免疫グロブリン重鎖および軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖はそれぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）。前記ＣＤＲは抗体が抗原またはエピトープに結合することにおいて主要な接触残基を提供することができる。一方、本明細書において、用語、“特異的に結合”または“特異的に認識”は当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。
用語、“抗原結合断片”は免疫グロブリン全体構造に対するその断片であって、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよいが、これに限定されない。
ＣＤ６６Ｃ抗体または抗体切片は、多様な標識基（ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、毒性物質または抗腫瘍剤と結合することができる。当該技術分野において周知の方法によって本発明の抗体は前記標識基、毒素、または抗腫瘍剤と結合できることは当業者に明らかである。このような結合は、抗体または抗原の発現後、付着部位に化学的に行うことも可能であり、或いはＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原内に結合産物を操作して入れてもよい。次いで、本明細書において以下に記載する適切な宿主系においてＤＮＡを発現させ、そして発現させた蛋白質を回収して、必要によって再生させる。結合は当該技術水準において知られたリンカーを通じて達成してもよい。特にこの技術と共に酸性条件或いは還元条件下でまたは特定プロテアーゼに対する露出時に毒素または抗腫瘍剤を放出する、多様なリンカーを用いることができる。特定様態においては標識基、毒素、または抗腫瘍剤を多様な長さのスペーサーアームによって結合させて潜在的な立体障害を減少させることが好ましい場合もある。
前記標識基としては、放射線同位元素、ハプテン、蛍光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）および染色物質からなる群より選択された物質で標識でき、具体的に、フラグ（ＦＬＡＧ）、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｄトマト（ｄＴｏｍａｔｏ）、チェリー（ｃｈｅｒｒｙ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＮＰ、ＡＭＣＡ、ビオチン、ジゴキシゲニン、タムラ（Ｔａｍｒａ）、テキサスレッド、ローダミン、アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒｓ）、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣより選択される。或いは標識基は例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、または１３１Ｉなどの放射性同位体であってもよい。適切な標識基の新たな例は、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、西洋ワサビガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または第２のレポーターによって認識される、予め決定されたポリペプチドエピトープである。
前記毒性物質としては、細胞または生物に対して毒性を有する任意の化合物に関する。したがって、毒素は例えば、放射線同位元素、小分子、ペプチド、または蛋白質であってもよい。抗体或いは抗体切片は、毒性物質と結合されて融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）を形成することができる。毒素蛋白質としてはリシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ジフテリア毒素、または緑膿菌毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）であってもよく、放射線同位元素としては１３１Ｉ、１８８Ｒｈと９０Ｙがあるが、これに限定されるのではない。
前記“抗腫瘍剤”との用語は、本発明によれば、組織の異常増殖を停止させるかまたは遅延させるか、いずれか一つが可能な薬剤を特定する。したがって、抗腫瘍剤は特に癌を治療する時に有用である。抗腫瘍剤は、血管新生阻害剤、ＤＮＡ挿入剤或いはＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ－ＲＮＡ転写制御因子、酵素阻害剤、遺伝子制御因子、微小管阻害剤、またはその他の抗腫瘍剤であり得る。
本発明は、本発明による抗体をコードする核酸分子に関する。本発明の抗体をコードする、本発明の核酸分子は例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成によって産生されるＤＮＡ或いはＲＮＡ、或いはこれらの核酸分子のいずれか一つを単独でまたは組み合わせて含んだ組換え技術によって産生されるキメラ核酸分子であってもよい。核酸分子はまた、遺伝子全体或いはその相当部分、またはその断片および誘導体に対応するゲノムＤＮＡであってもよい。抗体のアミノ酸配列中の一つのアミノ酸が置換されているこれら配列をコードする核酸を含むのに必要な単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または付加をヌクレオチド配列が含有してもよい。本発明の特に好ましい実施形態においては、核酸分子はｃＤＮＡ分子である。
本発明の一実施形態はまた、核酸分子が発現可能な形態で含まれたベクターにも関する。本発明のベクターは例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは複製可能であってもよく、或いは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般に補完宿主／細胞（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｈｏｓｔ／ｃｅｌｌｓ）で発生する。
前記に引用する核酸分子を他のポリヌクレオチドという翻訳融合が発生するように、ベクター内に挿入することができる。一般にベクターは１以上の複製起点（ｏｒｉ）およびクローニングまたは発現に関する遺伝系（ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、宿主の選択のための１以上のマーカ、例えば抗生物質耐性および１以上の発現カセットを含むことができる。適切な複製起点（ｏｒｉ）には例えばＣｏｌ Ｅ１、ＳＶ４０ウイルスおよびＭ１３の複製起点が含まれる。
本明細書において前述の核酸分子は、宿主への直接導入、或いはリポソーム、ファージベクターまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）を通じた導入のために設計されてもよい。また、バキュロウイルスシステム、またはワクシニアウイルス或いはセムリキ森林熱ウイルスに基づいたシステムを本発明の核酸分子のための真核生物発現システムとして用いることができる。
本発明の他の実施形態は、本発明のベクターを含む非ヒト宿主に関する。前記宿主は原核細胞または真核細胞であってもよい。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは宿主細胞のゲノム内に結合されていてもよく、或いは染色体外に維持されていてもよく、いずれであってもよい。
本発明はまた、本発明の抗体を生産するのに用いられ得る、本発明の１以上の核酸分子を含む遺伝子移植非ヒト動物にも関する。ヤギ、牛、馬、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターまたはその他の哺乳動物の組織、または牛乳、血液或いは小便などの体液において抗体を生産して、これらから回収することも可能である。
また、本発明は、ＣＤ６６Ｃを選択的に認知する物質を生産する方法と、抗体を生産する生産株を提供する。ＣＤ６６Ｃの抗原決定部位に対する抗体または抗体切片は、ＣＤ６６Ｃ蛋白質、ＣＤ６６Ｃの抗原決定部位、ＣＤ６６Ｃの抗原決定部位を含むＣＤ６６Ｃ蛋白質一部、またはＣＤ６６Ｃの抗原決定部位を発現する細胞を抗原として用いて通常の方法で製造可能である。一例として、ＣＤ６６Ｃ抗体製造方法は、（ａ）ＣＤ６６Ｃ蛋白質、ＣＤ６６Ｃの抗原決定部位、ＣＤ６６Ｃの抗原決定部位を含むＣＤ６６Ｃ蛋白質一部、またはＣＤ６６Ｃの抗原決定部位を発現する細胞を動物に注入して免疫化させる段階、（ｂ）ＣＤ６６Ｃに特異的な抗体を生産する脾臓細胞を収得する段階および（ｃ）前記脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ＣＤ６６Ｃに対する抗体を生産するハイブリドーマ細胞を選別する段階を含むＣＤ６６Ｃ抗体を生産する生産株製造方法を通じて実施可能である。前記生産株は生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養するか、生体内に注入して抗体を分離することができる。一例として、マウスの腹腔内に挿入して腹水から分離、精製する。単クローン抗体の分離および精製は培養上澄み液または腹水をイオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２など）、抗免疫グロブリンカラムまたはプロテインＡカラムなどのアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施することができる。
本発明による抗体が結合する抗原決定部位は、固形癌特異的な発現を示す。したがって、抗－ＣＤ６６Ｃ抗体は腫瘍細胞の検出に有用に使用できるだけでなく、毒性物質を含ませて腫瘍細胞のみ特異的に細胞殺傷（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）させることができる。
他の例は、本発明による抗体のＣＤ６６ｃを含む固形癌の検出のためのマーカとしての用途を提供する。抗原決定部位と相互作用する物質を含む固形癌の癌幹細胞検出用組成物を提供する。前記相互作用する物質は、ＣＤ６６Ｃに位置する抗原決定部位と相互作用可能な全ての物質、例えば、化学物質（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ）、抗体、抗体の抗原結合断片、アプタマーなどからなる群より選択された１種以上であり得る。
他の実施形態において、本発明は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主を含む診断組成物に関する。本明細書において用いられる組成物とは、本発明の少なくとも一つの抗体、核酸分子、ベクターおよび／または宿主を含む組成物を定義するものである。
本発明の診断組成物は、多様な細胞、組織または他の適切な試料における、ＣＤ６６Ｃの好ましくない発現または過剰発現の検出として、試料を本発明の抗体と接触させることおよび試料においてＣＤ６６Ｃの存在を検出することを含む検出に有用である。したがって、本発明の診断組成物を以下で定義する発病または疾患状態を評価するために用いてもよい。特に、ＣＤ６６Ｃを発現する、癌細胞などの悪性細胞を本発明の抗体、抗体断片または誘導体でターゲッティングしてもよい。本発明の抗体が結合した細胞は、したがって補体系などの免疫系機能によって、または細胞媒介性細胞毒性によって攻撃され、したがってＣＤ６６Ｃの好ましくない発現または過剰発現を示す細胞の数が減少するか、またはこのような細胞が根絶される。
本発明の一様態においては、本発明の抗体、抗体断片または誘導体を標識基に結合させる。このような抗体は、診断アプリケーションに特に適合する。
本発明の診断組成物は単独活性薬剤として投与することができ、または他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。
腫瘍細胞検査方法は、（ａ）ＣＤ６６Ｃ抗体を腫瘍細胞を含む試料に反応させ、（ｂ）前記抗体に対して陽性反応を示す試料を腫瘍と判断することである。前記試料はリンパ液、骨髄、血液または血球であってもよいが、これに限定されるのではない。前記腫瘍細胞は、好ましくは乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、または肝癌細胞であり得る。
前記ＣＤ６６Ｃ抗体を用いて腫瘍細胞を検査する場合、前記ＣＤ６６Ｃ抗体は、抗原－抗体反応性を確認できる物質で標識されたものであり得る。使用可能な前記物質としては放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）、またはその他の染色物質などがある。
また、本発明のＣＤ６６Ｃ抗体は、固形癌を診断するための診断キットとして提供されてもよい。前記診断キットはＣＤ６６Ｃ抗体以外に、抗原－抗体反応検出手段を含むことができる。前記検出手段は、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）および発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）からなる群より選択された方法を実施するための通常の物質であってもよい。即ち、標識手段としては、酵素の場合、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）があり、蛍光物質としてはＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｔｈｉｏｃａｒｂａｍｙｌ ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）が、発光物質としてはルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、イソルミノールおよびルシゲニン（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）が、放射線同位元素としては１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１３１Ｉがあるが、これに限定されるのではない。前記標識手段による標識の有無は、酵素の基質や、蛍光、発光または放射線を測定するための道具を用いて確認可能である。一例として、ＣＤ６６Ｃ抗体はＥＬＩＳＡキットまたはストリップキットに製造できる。
一実施形態で、本発明は、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主に関するものである。本発明の一実施形態によれば、本発明の抗体、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主は、癌または癌転移、例えば固形癌を治療または阻害することに用いるためのものである。本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の宿主の有効量を投与の必要がある対象に投与することによって癌または癌転移、例えば固形癌を治療または阻害するための方法である。
本発明による“固形癌”との用語は、嚢胞または液体領域を通常は含まない組織の異常な塊りを定義するものである。固形癌は陽性（癌でない）または悪性（しばしば当該技術分野において癌と称される）を全て含む。本発明による抗体を適用可能な固形癌の例は、肉腫、神経膠腫、癌腫、中皮腫、リンパ腫、腎臓腫瘍、肺腫瘍、乳房腫瘍、子宮頚部腫瘍、卵巣腫瘍、結腸直腸腫瘍、肝臓腫瘍、前立腺腫瘍、膵臓腫瘍および頭頚部腫瘍から選択され、好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、または肝癌である。前記乳癌は好ましくは、三重陰性乳癌（Ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ（ＴＮＢＣ））も含み、前記三重陰性乳癌はＨＥＲ２、エストロゲン受容体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＥＲ）、およびプロゲステロン受容体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＰＲ）を含む三つの乳癌診断マーカによっても全て陰性と検出される乳癌であって、検出が非常に難しいという問題点がある。
前記固形癌の治療効果は、癌細胞（特に、癌幹細胞）またはこれを含む癌組織の成長抑制（量的減少）、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）効果だけでなく、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸湿（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制してこれによる癌の悪化を抑制する効果を含む。
本発明による抗体はＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１の結合環を抑制する抑制剤と併用処理して効果を極大化するために、実施例７のように癌細胞と免疫細胞の共同培養時にＴ細胞活性化を誘導してサイトカインを分泌させ、癌細胞および免疫細胞表面のＰＤ－Ｌ１蛋白質水準を増加させた。これは、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１結合抑制剤と本発明の抗体との併用処理時により高い抗癌効果を得ることを期待することができる。免疫チェックポイント抑制剤としてＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対する抗体治療剤が承認されて臨床に適用されている。前記組成物はＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１結合抑制剤を追加的に含んでもよい。
本明細書で、“対象”または“患者”は、固形癌の軽減、予防および／または治療を必要とする患者を意味するものであって、全ての哺乳類、例えば人間、猿などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類であってもよく、固形癌を患っているか固形癌の症状を持っているか、固形癌発病の危険がある患者であってもよい。
本発明による抗体或いは抗体切片の投与は、許容された全ての薬物投与方法によって施行できる。具体的に例えば、ＣＤ６６Ｃ抗体を有効成分として含む治療剤を腫瘍細胞を有する対象、即ち、人間または動物に経口または非経口、好ましくは非経口で投与するのである。前記治療剤は薬理学的に許容可能な賦形剤を含んでもよく、その投与量は患者の状態によって適切に調節することが好ましいが、一例として、１日３ｍｇ～６，０００ｍｇであってもよい。治療剤の剤形は、液剤、散剤、乳剤、懸濁剤または注射剤であってもよいが、これに限定されるのではない。
本発明は、ＣＤ６６ｃ抗原決定部位に対する抗体、抗体切片（Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂおよびＦｖなど）、およびリガンドからなる群より選択された抗体を用いて急性白血病、母細胞危機が発生した慢性白血病およびリンパ芽球性リンパ腫を治療する方法を提供する。
抗体或いは抗体切片は、好ましくは単クローンまたは多クローン抗体からなる群より選択され、好ましくはヒトと動物に由来したものである。前記ＣＤ６６Ｃ抗体または抗体切片は、前記で言及した毒素物質がさらに含まれたものであってもよい。毒素物質は、抗体に融合、接合、結合、またはリンクされてもよく、これは公知の技術で実施可能である。
本発明の医薬組成物は、単独活性薬剤として投与してもよく、またはその他の薬剤と組み合わせて、好ましくは当該技術分野において問題の疾患の治療に適したのが知られているものと組み合わせて投与してもよい。また、本発明の抗体を投与する方法は、他の抗ガン治療、例えば化学的療法、放射線療法、細胞治療剤と並行して行うことができる。前記化学的療法または細胞治療剤に使用される多様な固形癌治療抗ガン剤は知られた抗ガン剤を使用することができる。
他の例は、ＣＤ６６Ｃ、具体的にＣＤ６６Ｃの非触媒的領域に位置する原決定部位に候補化合物を接触させる段階、および前記抗原決定部位に結合する候補化合物を選択して固形癌治療剤候補物質に決定する段階を含む、固形癌の治療剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。他の例で、前記のようにスクリーニングされた固形癌治療剤を有効成分として含む固形癌の治療用薬学組成物を提供する。
前記候補化合物は、人工的に合成されるか天然の各種化合物、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド構造体または蛋白質構造体（例えば、抗体、抗体の抗原結合断片、ぺプチボディ、ナノボディ、など）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンス－ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ）、アプタマー、天然物抽出物などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
前記候補化合物と抗原決定部位の結合は候補化合物と抗原決定部位の複合体形成を確認することによって行うことができ、これは当業界に公知された多様な方法を通じて行うことができる。例えば、通常の酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出を通じて測定でき、具体的に、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などからなる群より選択された方法によって測定できるが、これに制限されるわけではない。
本発明はＣＤ６６ｃを認識して結合する抗体、前記抗体または抗原結合断片をコーディングする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞および前記抗体またはその抗原結合断片のＣＤ６６ｃ関連疾病、例えば固形癌の軽減、予防、治療または診断用途に関するものである。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのではない。
＜実施例１＞抗－ＣＤ６６ｃキメラ抗体の製造
１．１．抗－ＣＤ６６ｃ抗体遺伝子配列クローニング
８Ｆ５抗体遺伝子はＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。８Ｆ５ハイブリドーマから分離したＲＮＡからＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔを用いてＰＣＲを行い、これをｐＧｅｍ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シークエンシングを通じてＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通じてマウス抗体遺伝子を確認した。分析された８Ｆ５抗体重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
１．１．抗－ＣＤ６６ｃ抗体遺伝子配列クローニング
８Ｆ５抗体遺伝子はＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：６９８３１）を用いてクローニングした。８Ｆ５ハイブリドーマから分離したＲＮＡからＭｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔを用いてＰＣＲを行い、これをｐＧｅｍ－Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ａ３６００）に挿入した後、シークエンシングを通じてＤＮＡ塩基配列を確認し、ＩＭＧＴ ｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）を通じてマウス抗体遺伝子を確認した。分析された８Ｆ５抗体重鎖および軽鎖可変領域配列は以下の通りである。
１－２．キメラ抗体製造
前記製作された抗－ＣＤ６６ｃマウス抗体８Ｆ５のアミノ酸配列に基づいて、抗－ＣＤ６６ｃキメラ抗体を製作した。
前記製作された抗－ＣＤ６６ｃマウス抗体８Ｆ５のアミノ酸配列に基づいて、抗－ＣＤ６６ｃキメラ抗体を製作した。
１－２－１．プラスミド製作
抗－ＣＤ６６ｃキメラ抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ製作した。軽鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用し、重鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用した。
抗－ＣＤ６６ｃキメラ抗体の発現のために、重鎖発現用プラスミドと軽鎖発現用プラスミドをそれぞれ製作した。軽鎖発現用プラスミドはｐＯｐｔｉＶＥＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用し、重鎖発現用プラスミドはｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ベクターを使用した。
追加的なアミノ酸の挿入なく抗体それぞれの可変領域コーディングｃＤＮＡと不変領域コーディングｃＤＮＡを連続的なアミノ酸配列として発現されるようにするために、前記クローニングした可変領域のコーディング塩基配列と知られたヒト（ｈｕｍａｎ）ＩｇＧ１不変領域（重鎖）およびカッパ（ｋａｐｐａ）不変領域（軽鎖）コーディング塩基配列を連結した遺伝子切片それぞれを合成（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）した。このように合成した重鎖および軽鎖発現遺伝子は制限酵素Ｘｈｏ ＩとＳａｌ Ｉに切断した後、軽鎖遺伝子切片はｐＯｐｔｉＶｅｃベクターに、重鎖遺伝子切片はｐｃＤＮＡ３．３ベクターにそれぞれライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）して完全な抗体発現用プラスミドを製作した（ｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドおよびｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミド）。
１－２－２．形質転換
前記製作されたｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミドをＣＨＯ細胞由来のＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ形質転換過程を行った。
前記製作されたｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミドをＣＨＯ細胞由来のＤＧ４４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ形質転換過程を行った。
先ず、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）３日前に浮遊状態のＤＧ４４細胞を５％ＦＢＳが含まれているＭＥＭａ培地に適応させることにより付着状態細胞に変換させて形質転換効率を高めることができるように適応させた。形質転換はＶｉａＦｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．＃：Ｅ４９８１）を使用して６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で行った。形質転換１日前に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で継代培養して付着状態で適応されたＤＧ４４細胞を準備し、形質転換に使用されたＤＮＡの量はｐｃＤＮＡ３．３－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ重鎖発現プラスミドとｐＯｐｔｉＶＥＣ－ａｎｔｉ－ＣＤ６６ｃ軽鎖発現プラスミドそれぞれ２ｕｇ、１．５ｕｇずつ１．５：１比率の組み合わせで使用した。形質転換は４８時間行った。形質転換された細胞群を分析するために、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いた。図１のようにキメラ抗体の発現はＡ５４９非小細胞肺癌細胞株で確認した。図１は、マウス８Ｆ５抗体から抗体遺伝子をクローニングしてキメラ組換え抗体ｆｒで発現させて、ＣＤ６６ｃ抗原陽性のＡ５４９細胞表面に結合するのを示す結果である。
＜実施例２＞ヒト化抗－ＣＤ６６ｃ単クローン抗体の製作
２．１ Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎによる組換え抗体配列選定 マウスＣＤ６６ｃ抗体、８Ｆ５（重鎖アミノ酸配列：７ 重鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２；軽鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；軽鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）の重鎖、軽鎖それぞれのＣＤＲ部位配列（ＣＤＲＨ１：ＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＭＮ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＣＤＲＨ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＬＩＮＰＦＨＧＧＴＶＳＮＱＲＦＫＶ）；ＣＤＲＨ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＶＲＧＤＰＶＲＨＹＹＡＬＡＹ）；ＣＤＲＬ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＧＡＳＥＮＶＹＧＴＬ）；ＣＤＲＬ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＧＡＴＮＬＡＤ）；ＣＤＲＬ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＶＡＴＹＹＣＱＮＶＬＳＡＰＹＴ）をできるだけ類似するように維持して抗原結合力が同等であるか優れていれば、ヒト抗体遺伝子をコーディングしている生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の配列を基盤にしてフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）に対する部位配列を組換えたヒト化抗体配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法で選別した。マウスＣＤ６６ｃ抗体８Ｆ５の重鎖、軽鎖それぞれ配列と最も類似性が高くてヒト化組換え抗体配列の主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として使用したヒト抗体生殖細胞系列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子は下記表５の通りである。前記マウスＣＤ６６ｃ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列と核酸配列、そして重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を下記表６に示す。
２．１ Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎによる組換え抗体配列選定 マウスＣＤ６６ｃ抗体、８Ｆ５（重鎖アミノ酸配列：７ 重鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２；軽鎖アミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８；軽鎖コーディングＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）の重鎖、軽鎖それぞれのＣＤＲ部位配列（ＣＤＲＨ１：ＡＳＧＹＳＦＴＤＹＴＭＮ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＣＤＲＨ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＬＩＮＰＦＨＧＧＴＶＳＮＱＲＦＫＶ）；ＣＤＲＨ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（ＶＲＧＤＰＶＲＨＹＹＡＬＡＹ）；ＣＤＲＬ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ＧＡＳＥＮＶＹＧＴＬ）；ＣＤＲＬ２：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（ＧＡＴＮＬＡＤ）；ＣＤＲＬ３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（ＶＡＴＹＹＣＱＮＶＬＳＡＰＹＴ）をできるだけ類似するように維持して抗原結合力が同等であるか優れていれば、ヒト抗体遺伝子をコーディングしている生殖細胞系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の配列を基盤にしてフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）に対する部位配列を組換えたヒト化抗体配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法で選別した。マウスＣＤ６６ｃ抗体８Ｆ５の重鎖、軽鎖それぞれ配列と最も類似性が高くてヒト化組換え抗体配列の主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として使用したヒト抗体生殖細胞系列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子は下記表５の通りである。前記マウスＣＤ６６ｃ抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列と核酸配列、そして重鎖可変領域と軽鎖可変領域のＣＤＲ配列を下記表６に示す。
上記ヒト抗体生殖細胞系列（Ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子配列を用いて選定したヒト化８Ｆ５抗体配列として、重鎖可変領域１２種、軽鎖可変領域８種を選別し、該当配列は下記表３の通りであり、前記選別されたヒト化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ配列およびフレームワーク配列を下記表６～表８に示し、キメラ抗体とヒト化抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表１に示した。マウス抗体とヒト化抗体は重鎖ＣＤＲ３と軽鎖ＣＤＲ２の配列が同一であるのが好ましい。下記表６で太字および下線で表示した部分はＣＤＲ抗体配列である。表７で太字および下線で表示した部分は変更されたアミノ酸を示す。
２．２ ヒト化組換え抗体の発現および分析
選別された抗体配列はそれぞれヒトＩｇＧ１重鎖不変領域とカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖不変領域と連結してヒトＩｇＧ１形態に２９３細胞で発現させた。トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、７日後に培養液はＫａｎＣａｐ Ａ ｒｅｓｉｎ（Ｋａｎｅｃａ社）を用いてヒト化組換え抗体を精製した。
選別された抗体配列はそれぞれヒトＩｇＧ１重鎖不変領域とカッパ（ｋａｐｐａ）軽鎖不変領域と連結してヒトＩｇＧ１形態に２９３細胞で発現させた。トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後、７日後に培養液はＫａｎＣａｐ Ａ ｒｅｓｉｎ（Ｋａｎｅｃａ社）を用いてヒト化組換え抗体を精製した。
精製した抗体はＯＤ２８０ｎｍ測定で定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。また、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００ ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｅｐａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でＨＰＬＣを行って２８０ｎｍと２２０ｎｍで分析することによって、抗体の純度および凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の有無を分析した（図２ａ～図２ｃ）。
２．３ ヒト化組換え抗体の細胞結合および抗原結合分析
２－３－１ 細胞結合分析
発現させた９６種のヒト化組換え抗体をそれぞれ同量（１ｕｇ）をＣＤ６６ｃ陽性細胞であるＡ５４９非小細胞肺癌細胞株が入っている試験管に入れて４℃で３０分間反応させた後にＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（ダイノナ株式会社（ＤｉＮｏｎａ Ｉｎｃ）、Ｋｏｒｅａ）を入れて４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、フローサイトメーター（Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ、Ｓ１０００ＥＸｉ）で分析してその結果を下記に記載した。
２－３－１ 細胞結合分析
発現させた９６種のヒト化組換え抗体をそれぞれ同量（１ｕｇ）をＣＤ６６ｃ陽性細胞であるＡ５４９非小細胞肺癌細胞株が入っている試験管に入れて４℃で３０分間反応させた後にＰＢＳで水洗し、ＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（ダイノナ株式会社（ＤｉＮｏｎａ Ｉｎｃ）、Ｋｏｒｅａ）を入れて４℃で１５分間培養した。再びＰＢＳで水洗した後、フローサイトメーター（Ｓｔｒａｔｅｄｉｇｍ、Ｓ１０００ＥＸｉ）で分析してその結果を下記に記載した。
９６種のヒト化組換え抗体候補の中から発現程度と凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）の有無、細胞結合程度を基準にして８種を一次に選定した（表９および表１０、図３ａ～図３ｅ）。下記表９および表１０は１次選定された抗ＣＤ６６ｃヒト化抗体およびキメラ８Ｆ５の分析結果であって、表１０はフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の分析結果を示す。
前記選定された８種の抗体は発現程度と凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）有無、細胞結合程度を表９に示し、具体的に１次選定された８種抗体に対する発現程度と分子量を整理したものである。また、表１０のフローサイトメトリー結果を見れば、８種のヒト化組換え抗体がキメラ抗体に比べて±２０％の細胞結合力を示してキメラ抗体と非常に類似した細胞結合力を示すのを確認した。これによって９６種のヒト化候補抗体の中から発現が正常に行われ、蛋白質自体の不安定性によって形成される凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が少なく、またターゲット抗原陽性の細胞に結合する能力がキメラ抗体と類似したヒト化抗体８種を１次選別した。
特に細胞株結合力は数値上では差があるように見えるが、図３のように実際の細胞結合様相はキメラ抗体と類似した水準であって抗体陽性率（％ｇａｔｅｄ）と蛍光平均値（ｍｅａｎ）をかけてこれをキメラ抗体と相対比較して±２０％範囲内に含まれる８種を選別したのであって、通常ヒト化抗体生成時、ヒト化抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）にマウス抗体ＣＤＲ部位配列を挿入した時に元の蛋白質構造の変更で抗体結合力が急激に低下するという結果を考慮したとき、非常に優れたヒト化抗体を選別したと言える。
２－３－２ 抗原結合分析
前記のように選定した８種ヒト化組換え抗体の中から、キメラ抗体に比べて細胞結合力を基準にして高い結合力を示す５種類のヒト化組換え抗体を選択し、これらをＥＬＩＳＡ方法でＣＤ６６ｃ抗原および類似ＣＤ６６抗原に対する結合力分析を実施した。
前記のように選定した８種ヒト化組換え抗体の中から、キメラ抗体に比べて細胞結合力を基準にして高い結合力を示す５種類のヒト化組換え抗体を選択し、これらをＥＬＩＳＡ方法でＣＤ６６ｃ抗原および類似ＣＤ６６抗原に対する結合力分析を実施した。
抗原ＣＤ６６ｃ（ＣＥＡＣＡＭ６；ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）とＣＥＡＣＡＭ１抗原（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を９６ウェルプレートにウェル当り１００ｎｇずつコーティングした後、ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。一次抗体量は１０ｕｇ／ｍｌから３倍ずつ希釈して３７℃温度で１時間結合させ、二次抗体としてｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｉｇ－ＨＲＰ接合体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を１：１００００で希釈して３７℃温度で３０分間結合させた。各段階の間は３回ずつ水洗過程を経てＴＭＢ反応した。１Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液でＴＭＢ溶液と同量（１００ｕｌ）処理して反応中止した後、４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。
前記実験結果として９６種のヒト化組換え抗体の中から選定された５種のヒト化組換え抗体に対するＣＤ６６ｃ抗原に対する結合力を図４ａ、表１２および図４ｂ、表１３に示し、図４ａと表１２はＣＥＣＡＣＡＭ６（ＣＤ６６ｃ）抗原に対する結果であり、図４ｂと表１３はＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）抗原に対する結果である。
図４ａ、表１２および図４ｂ、表１３の抗原に対する結合力結果から、ＣＥＡＣＡＭ６に対しては全ての抗体がキメラ抗体と類似した結合様相を示し、ＣＥＡＣＡＭ１に対しては弱い結合と結合しないグループとに両分された。
２．４ ヒト化組換え抗体の安定性分析
前記抗原および細胞結合様相を通じて選定した、前記実施例３．３の５種のヒト化組換え抗体を高い温度条件に放置して抗体の安定性の有無を分析する実験を行った。
前記抗原および細胞結合様相を通じて選定した、前記実施例３．３の５種のヒト化組換え抗体を高い温度条件に放置して抗体の安定性の有無を分析する実験を行った。
安定性測定は８－アニリノ－１－ナフタレンスルホン酸（８－ａｎｉｌｉｎｏ－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（以下、ＡＮＳ；Ｓｉｇｍａ社）を用いた結合実験を通じて確認した。ＡＮＳは、蛋白質変性時に露出される疎水性部位に結合する時とそうでない時との蛍光波長が異なるためこのような波長変化を測定することによって蛋白質の変性有無を確認することができる化合物である。
ヒト化組換え抗体をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を用いて０．２ｍｇ／ｍｌ濃度に全て合わせた後、苛酷条件として５０℃温度で４時間放置した。０．２ｍｇ／ｍｌのＡＮＳ溶液を、測定するための抗体希釈液５００ｕｌ当り２０ｕｌを入れて混合した後、５分後に蛍光リーダーで３６０ｎｍ励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）、４６０ｎｍ放出（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）条件で分析した。追加的に７０℃温度で３０分間さらに放置した条件でもＡＮＳ試薬反応を測定した。
前記表１１に示した５種のヒト化組換え抗体に対する苛酷温度条件での抗体安定性を確認した結果を図５ａおよび図５ｂに示した。即ち、苛酷条件として５０℃温度で４時間抗体を放置した後にＡＮＳ試薬反応性を蛍光で測定し、追加的に７０℃温度で３０分間さらに放置した条件でもＡＮＳ試薬反応を測定した結果を示す。図５ａの実験結果に示したように、５０℃温度で４時間放置条件では５種の抗体大部分がＡＮＳ反応が微小であったが、７０℃温度で追加３０分放置条件では大部分抗体の蛍光値が大きく増加した。その中ではｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０５８組換え抗体が最も低い蛍光値増加傾向を示して、５種類の組換えヒト化抗体の中で最も温度変化に対して安定した結果を示した。
また、ＡＮＳ試薬反応性変化率を測定するために、冷蔵条件（４±２℃）および６２℃温度でそれぞれ４時間放置した後にＡＮＳ試薬反応性を前記と同様な方法で蛍光リーダーで分析した。また、ＡＮＳ試薬に対する抗体の蛍光値変異率は、低温条件（例、４℃）で測定した蛍光値と、高温条件（例、６２℃）で測定した蛍光値との差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を、低温条件で測定した蛍光値で割った値を意味する。
［数式］
蛍光値変異率＝（高温条件で測定した蛍光値－低温条件で測定した蛍光値）／（低温条件で測定した蛍光値）
蛍光値変異率＝（高温条件で測定した蛍光値－低温条件で測定した蛍光値）／（低温条件で測定した蛍光値）
図５ｂのように苛酷条件の温度（５０℃）から温度をさらに上げた６２℃温度で４時間放置後、ＡＮＳ試薬反応性を確認した。５種が組換えヒト化抗体とキメラ抗体の両方とも冷蔵条件ではＡＮＳ反応値が微小であったが、温度を上昇することによってＡＮＳ蛍光値が増加した。しかし、キメラ８Ｆ５は６２℃温度条件保管実験によってＡＮＳ試薬反応性が１，４０６％まで増加し、同時に沈殿物が発生して不安定な結果を示した。しかし、ヒト化抗体５種はキメラ抗体よりＡＮＳ試薬反応性変化が顕著に低く測定され、沈殿物が発生しなかった。特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ ３０１９ヒト化抗体とＰｒｏｔｅｉｎ ＩＤ ３０５８ヒト化抗体はそれぞれ１１４％、１３３％にＡＮＳ反応性の変化が測定されて最も安定した抗体と評価された。ＡＮＳ試薬反応性が大きくなるという意味は蛋白質構造上内側に配置されていた疎水性アミノ酸の露出が増加するという意味であり、これは蛋白質構造の変性とこれによる蛋白質凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、即ち、沈殿物生成の原因になる。本発明によるヒト化抗体はＡＮＳ反応性変異％が２００％未満で安定した抗体であり、２００％未満は変化が非常に微小であると見なされ、それ以上は有意義な蛋白質構造変更が行われＡＮＳ反応性が観察されたと解釈できる。したがって、本発明によるヒト化抗体はキメラ抗体に比べて類似した抗原結合力および細胞結合力を有し、抗体蛋白質自体の物理的安定性が増加し、このような事実は治療用抗体のドラッガビリティ（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）の面で非常に優れた特徴と言える。
２．５ ヒト化組換え抗体のＣＨＯ細胞発現および分析
前記実施例２．３で選定された５種のヒト化組換え抗体を実際大部分の治療用抗体を発現させるために使用するＣＨＯ細胞に発現させて分析した。選定された５種のヒト化組換え抗体を構成するための軽鎖および重鎖可変領域ＤＮＡ配列をコドン最適化過程を経た後、合成してヒトＩｇＧ１不変領域遺伝子とｏｖｅｒｌａｙ ＰＣＲ方法で連結してＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ遺伝子切片でｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にクローニングした。前記表１１は、ＣＨＯ細胞発現のために選別されたヒト化抗体の軽鎖および重鎖組み合わせを示す。
前記実施例２．３で選定された５種のヒト化組換え抗体を実際大部分の治療用抗体を発現させるために使用するＣＨＯ細胞に発現させて分析した。選定された５種のヒト化組換え抗体を構成するための軽鎖および重鎖可変領域ＤＮＡ配列をコドン最適化過程を経た後、合成してヒトＩｇＧ１不変領域遺伝子とｏｖｅｒｌａｙ ＰＣＲ方法で連結してＸｈｏＩとＥｃｏＲＩ遺伝子切片でｐｃＤＮＡ３．４ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にクローニングした。前記表１１は、ＣＨＯ細胞発現のために選別されたヒト化抗体の軽鎖および重鎖組み合わせを示す。
可変－不変領域遺伝子ＰＣＲのために使用したＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒ配列は下記表１４の通りである。
５種のヒト化組換え抗体はＥｘｐｉＣＨＯ（ｔｒａｄｅｍａｒｋ） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社；Ｃａｔ．Ｎｏ：Ａ２９１３３）を用いて一過性トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、発現させた抗体は図６ａ～図６ｃのようにＣＤ６６ｃ陽性細胞であるＡ５４９非小細胞肺癌細胞株に結合させてフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。５種類ヒト化組換え抗体は全てキメラ抗体と類似した結合力を示した。前記測定したフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）蛍光値をＣＨＯ培養液の抗体発現量で割って、相対的な抗体発現量に対する細胞表面結合力（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）を表示したものを図式化すれば図６ｄの通りであった。したがって、ヒト化組換え抗体はＣＨＯ細胞でも適切に発現されるのを確認した。抗体の細胞表面結合力を求め、これを１００％にして相対的な変化を示したものが図６ｄである。
＜実施例３＞キメラ８Ｆ５抗体によるＴ細胞活性および癌細胞死滅
３．１．ＣＤ８＋Ｔ細胞と癌細胞ＬＳ１７４Ｔの共同培養に続くＴ細胞活性サイトカイン分析および癌細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）分析
ＣＤ８＋Ｔ細胞はヒト血液細胞からＭａｇｎｉＳｏｒｔ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｔｒａｄｅｍａｒｋ）Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．＃：８８０４－６８１２－７４）を用いて分離した。６ウェルプレートの各ウェルにＣＤ８＋Ｔ細胞は１×１０６個の細胞を、大腸癌癌細胞であるＬＳ１７４Ｔは２×１０５個の細胞を同時に入れて、ウェル当り２ｍｌの量（ｖｏｌｕｍｅ）になるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地にして培養した。この時、キメラ８Ｆ５抗体は２０ｕｇ／ｍｌになるように処理した。培養後、３日と５日目に培養液を各１００ｕｌずつ取って培養液のＩＦＮγとパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）分泌量をＨｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ）キットを用いて測定した。培養７日目に大腸癌細胞ＬＳ１７４Ｔを分離して７－ＡＡＤで染色後、フローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。図７ａは大腸癌細胞株であるＬＳ１７４Ｔ細胞とヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を共同培養した条件でキメラ８Ｆ５抗体を処理した時、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されてＩＦＮγとパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）を分泌させる結果であり、図７ｂは図７ａと同一の条件で大腸癌細胞ＬＳ１７４Ｔがキメラ８Ｆ５抗体処理時、細胞死滅が増加するのを示す結果である。
３．１．ＣＤ８＋Ｔ細胞と癌細胞ＬＳ１７４Ｔの共同培養に続くＴ細胞活性サイトカイン分析および癌細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）分析
ＣＤ８＋Ｔ細胞はヒト血液細胞からＭａｇｎｉＳｏｒｔ（ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｔｒａｄｅｍａｒｋ）Ｈｕｍａｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．＃：８８０４－６８１２－７４）を用いて分離した。６ウェルプレートの各ウェルにＣＤ８＋Ｔ細胞は１×１０６個の細胞を、大腸癌癌細胞であるＬＳ１７４Ｔは２×１０５個の細胞を同時に入れて、ウェル当り２ｍｌの量（ｖｏｌｕｍｅ）になるように１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地にして培養した。この時、キメラ８Ｆ５抗体は２０ｕｇ／ｍｌになるように処理した。培養後、３日と５日目に培養液を各１００ｕｌずつ取って培養液のＩＦＮγとパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）分泌量をＨｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｅａｄ Ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃：ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ）キットを用いて測定した。培養７日目に大腸癌細胞ＬＳ１７４Ｔを分離して７－ＡＡＤで染色後、フローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で細胞の生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。図７ａは大腸癌細胞株であるＬＳ１７４Ｔ細胞とヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を共同培養した条件でキメラ８Ｆ５抗体を処理した時、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されてＩＦＮγとパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）を分泌させる結果であり、図７ｂは図７ａと同一の条件で大腸癌細胞ＬＳ１７４Ｔがキメラ８Ｆ５抗体処理時、細胞死滅が増加するのを示す結果である。
図７ａのグラフに示したように、大腸癌細胞ＬＳ１７４Ｔ細胞とヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を共同培養した条件でキメラ８Ｆ５抗体を処理した時、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化されＩＦＮγとパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）の分泌が増加し、ＬＳ１７４Ｔ細胞は細胞死滅が増加した。
３．２．ＣＤ８＋Ｔ細胞と多様な癌細胞の共同培養に続くＴ細胞活性分析
実施例３．１のようにＣＤ８＋Ｔ細胞を分離して、多様な癌細胞と共同培養条件でキメラ８Ｆ５抗体によるＴ細胞活性をＥＬＩＳＯＴ方法で確認した。Ｈｕｍａｎ ＩＦＮｇａｍｍａ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ．＃：８８－７３８６－２１）キットを用いてＩＦＮγを分析した。各ウェル当り１００ｕｌの体積（ｖｏｌｕｍｅ）でＣＤ８＋Ｔ細胞は２．５×１０４、癌細胞は５×１０３細胞を共に入れて３日間培養後、キットで提示する方法でＩＦＮγ分泌する細胞ｓｐｏｔｓを検出した。
実施例３．１のようにＣＤ８＋Ｔ細胞を分離して、多様な癌細胞と共同培養条件でキメラ８Ｆ５抗体によるＴ細胞活性をＥＬＩＳＯＴ方法で確認した。Ｈｕｍａｎ ＩＦＮｇａｍｍａ ＥＬＩＳＰＯＴ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃａｔ．＃：８８－７３８６－２１）キットを用いてＩＦＮγを分析した。各ウェル当り１００ｕｌの体積（ｖｏｌｕｍｅ）でＣＤ８＋Ｔ細胞は２．５×１０４、癌細胞は５×１０３細胞を共に入れて３日間培養後、キットで提示する方法でＩＦＮγ分泌する細胞ｓｐｏｔｓを検出した。
図８はＣＤ８＋Ｔ細胞と多様な癌細胞との共同培養条件でキメラ８Ｆ５抗体を処理する場合のみに選択的にＩＦＮγ分泌が増加するのを示す結果であって、胃癌細胞であるＮＣＩ－Ｎ８７細胞、ＳＮＵ－７１９細胞と肝癌細胞であるＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞に対する結果である。
図８に示したように、ＣＤ８＋Ｔ細胞と多様な癌細胞との共同培養条件でキメラ８Ｆ５抗体を処理する場合のみに選択的にＩＦＮγ分泌が増加するのを示した。
＜実施例４＞ＣＤ６６ｃ抗原によるＴ細胞活性抑制
癌細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の共同培養時、８Ｆ５抗体によるＴ細胞活性が実際８Ｆ５抗体の抗原であるＣＤ６６ｃ抗原によるものか確認するために、ヒトＰＢＭＣを分離してＯＫＴ３抗体によるＴ細胞活性がＣＤ６６ｃ抗原によって抑制できるか確認した。
癌細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の共同培養時、８Ｆ５抗体によるＴ細胞活性が実際８Ｆ５抗体の抗原であるＣＤ６６ｃ抗原によるものか確認するために、ヒトＰＢＭＣを分離してＯＫＴ３抗体によるＴ細胞活性がＣＤ６６ｃ抗原によって抑制できるか確認した。
具体的に、Ｔ細胞の細胞内ＩＦＮγ（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を染色してフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で確認する方法と、ＥＬＩＳＰＯＴでＩＦＮγを分析する二つの方法で確認した。抗体処理はＯＫＴ３である場合は１ｕｇ／ｍｌとし、ＣＤ６６ｃ抗原は１０ｕｇ／ｍｌで処理した。Ｔ細胞内ＩＦＮγを染色するためにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０００Ｘ）（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：００－４５０６－５１）を１Ｘになるように希釈して染色する３時間前に事前処理し、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩＦＮｇａｍｍａ ＰＥ（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－７３１９－４１）とＦＩＴＣ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ－α／β（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃａｔ．＃：３４７７７３）で染色してフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）ｍで分析した。
図９ａ～図９ｃはＣＤ６６ｃ抗原がＴ細胞活性を抑制することができるのを示す結果であって、図９ａはＴ細胞活性に対する因子としてＩＦＮγの細胞質内量をフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で測定した結果であり、図９ｂと図９ｃはＥＬＩＳＰＯＴでＩＦＮγの分泌を測定した結果である。図９ｂと図９ｃの場合、互いに異なる供給源のＣＤ６６ｃ抗原を使用した場合にも同様にＴ細胞活性を抑制するのを同一に示す結果である。
図９ａのように、ＣＤ６６ｃ抗原を同時処理する場合、ＩＦＮγ陽性Ｔ細胞が１５．５５％から８．８７％に減少することによって、ＣＤ６６抗原によってＴ細胞の活性が抑制される結果を示した。
実施例３．２のようにＥＬＩＳＰＯＴ方法でヒトＰＢＭＣのＩＦＮγ生成増加または抑制を追加的に確認し、ＣＤ６６ｃ抗原はダイノナ内部的に製作および生産した抗原と外部で購入した抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ．＃：１０８２３－Ｈ０８Ｈ－５０）を１０ｕｇ／ｍｌを投与した。この実験でもまたＣＤ６６ｃ抗原を処理した二つの場合ともＩＦＮγ陽性ｓｐｏｔ数を顕著に落とす結果を示した（図９ｂ、９ｃ）。
＜実施例５＞キメラ８Ｆ５抗体によるＴ細胞の活性化誘導
５．１．Ｔ細胞活性化の増加
ＯＫＴ３抗体によるＴ細胞の活性化をキメラ８Ｆ５抗体がどんな影響を与えるか確認するために、０．３ｍｇ／ｍｌ濃度でＯＫＴ３抗体を付着させた３５－ｍｍｄｉｓｈ条件でヒトＰＢＭＣを２×１０６細胞を入れて３日間培養した。この時、キメラ８Ｆ５抗体は２０ｕｇ／ｍｌになるように処理し、３日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞をＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ６９ ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－０６９９－４１）、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－１０７９－４１）、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２５ ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１７－０２５９－４１）で染色した。Ａｎｔｉ－ＣＤ４－ＡＰＣおよびＡｎｔｉ－ＣＤ８－ＦＩＴＣはダイノナで製造した試薬で染色して各ＣＤ４およびＣＤ８グループをフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）上でゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）して分析した。図１０ａおよび図１０ｂは付着されたＯＫＴ３抗体によるＴ細胞活性化条件でキメラ８Ｆ５抗体が活性化を増加させてＣＤ６９、ＣＤ１０７、ＣＤ２５などの様々な活性化細胞表面マーカ蛋白質を増加させるのを示す結果である。
５．１．Ｔ細胞活性化の増加
ＯＫＴ３抗体によるＴ細胞の活性化をキメラ８Ｆ５抗体がどんな影響を与えるか確認するために、０．３ｍｇ／ｍｌ濃度でＯＫＴ３抗体を付着させた３５－ｍｍｄｉｓｈ条件でヒトＰＢＭＣを２×１０６細胞を入れて３日間培養した。この時、キメラ８Ｆ５抗体は２０ｕｇ／ｍｌになるように処理し、３日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞をＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ６９ ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－０６９９－４１）、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－１０７９－４１）、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２５ ＡＰＣ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１７－０２５９－４１）で染色した。Ａｎｔｉ－ＣＤ４－ＡＰＣおよびＡｎｔｉ－ＣＤ８－ＦＩＴＣはダイノナで製造した試薬で染色して各ＣＤ４およびＣＤ８グループをフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）上でゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）して分析した。図１０ａおよび図１０ｂは付着されたＯＫＴ３抗体によるＴ細胞活性化条件でキメラ８Ｆ５抗体が活性化を増加させてＣＤ６９、ＣＤ１０７、ＣＤ２５などの様々な活性化細胞表面マーカ蛋白質を増加させるのを示す結果である。
図１０ａの結果に示したように、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞で全てキメラ８Ｆ５抗体投与時、活性化標識マーカであるＣＤ６９陽性比率が増加し、図１０ｂの結果のようにＣＤ８陽性細胞ではまた他の活性化マーカであるＣＤ１０７とＣＤ２５陽性比率が増加した。このようなＴ細胞活性化条件でキメラ８Ｆ５抗体がＴ細胞活性化を増加させた結果は、実施例３で記述している結果がＴ細胞自体の活性化増加による結果として反映されたことを意味し、また実施例４で記述したように、ＣＤ６６ｃ抗原のＴ細胞活性抑制現象を抗ＣＤ６６ｃ抗体として戻すことができ、これによりＴ細胞活性を維持または強化して癌細胞死滅を招くことができるのを示す。
５．２．ＭＬＲでのＴ細胞活性化増加
キメラ８Ｆ５抗体処理によるＴ細胞活性化を追加的に確認するためにＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）実験を行った。まず、ヒトＰＢＭＣを分離して培養皿に付着された細胞のみＩＬ－４（５×１０３ｕｎｉｔ／ｍｌ、ＪＷＣｒｅａｇｅｎｅ）とＧＭ－ＣＳＦ（５×１０３ｕｎｉｔ／ｍｌ、ＪＷＣｒｅａｇｅｎｅ）を３日間隔で二回処理して樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）に分化させた。その後、他のヒトのＰＢＭＣと共にＰＢＭＣ：ＤＣ比率が５：１になるように混合して５日間培養した。ＰＢＭＣ細胞数は、１２ウェルプレートの場合、ウェル当り１．４×１０６細胞を使用した。５日後、細胞は分離してＣＤ４－ＦＩＴＣ／ＣＤ１０７－ＰＥ／ＣＤ２５－ＡＰＣまたはＣＤ８－ＦＩＴＣ／ＣＤ１０７－ＰＥ／ＣＤ２５－ＡＰＣで染色してフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）分析を行った。図１１ａおよび図１１ｂは互いに異なるヒトの樹状細胞とＰＢＭＣを混合するＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）条件でキメラ８Ｆ５抗体がＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞を活性化させるのを示す結果である。
キメラ８Ｆ５抗体処理によるＴ細胞活性化を追加的に確認するためにＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）実験を行った。まず、ヒトＰＢＭＣを分離して培養皿に付着された細胞のみＩＬ－４（５×１０３ｕｎｉｔ／ｍｌ、ＪＷＣｒｅａｇｅｎｅ）とＧＭ－ＣＳＦ（５×１０３ｕｎｉｔ／ｍｌ、ＪＷＣｒｅａｇｅｎｅ）を３日間隔で二回処理して樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）に分化させた。その後、他のヒトのＰＢＭＣと共にＰＢＭＣ：ＤＣ比率が５：１になるように混合して５日間培養した。ＰＢＭＣ細胞数は、１２ウェルプレートの場合、ウェル当り１．４×１０６細胞を使用した。５日後、細胞は分離してＣＤ４－ＦＩＴＣ／ＣＤ１０７－ＰＥ／ＣＤ２５－ＡＰＣまたはＣＤ８－ＦＩＴＣ／ＣＤ１０７－ＰＥ／ＣＤ２５－ＡＰＣで染色してフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）分析を行った。図１１ａおよび図１１ｂは互いに異なるヒトの樹状細胞とＰＢＭＣを混合するＭＬＲ（Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）条件でキメラ８Ｆ５抗体がＣＤ４、ＣＤ８陽性細胞を活性化させるのを示す結果である。
図１１ａおよび図１１ｂのようにＭＬＲ条件でもキメラ８Ｆ５抗体投与によって、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞でＣＤ２５またはＣＤ１０７の陽性比率が顕著に増加した。
結果的に、これはＯＫＴ３によるＴ細胞活性化および同種免疫細胞によるＴ細胞活性化条件の両方でキメラ８Ｆ５抗体がＴ細胞活性化自体を増加させることができるという結果を示し、これによりＴ細胞が癌細胞を死滅させるようにキメラ８Ｆ５抗体が作用するという点が追加的に分かる。
＜実施例６＞キメラ８Ｆ５抗体による胃癌患者ＰＢＭＣ活性化
胃癌患者とＰＢＭＣ共同培養時キメラ８Ｆ５抗体によるＰＢＭＣ活性化を評価しようとした。実験室で培養している癌細胞でない実際胃癌患者の腹水から癌細胞を分離して、キメラ８Ｆ５抗体投与時免疫細胞活性化されるかどうかを確認した。胃癌患者の腹水サンプルはソウル峨山病院で獲得し、腹水サンプルからＣＤ６６ｃ陽性が確認されたサンプルの胃癌細胞と同一患者の血液からＰＢＭＣを分離して実施例３．２のようにＥＬＩＳＰＯＴ試験を行った。
胃癌患者とＰＢＭＣ共同培養時キメラ８Ｆ５抗体によるＰＢＭＣ活性化を評価しようとした。実験室で培養している癌細胞でない実際胃癌患者の腹水から癌細胞を分離して、キメラ８Ｆ５抗体投与時免疫細胞活性化されるかどうかを確認した。胃癌患者の腹水サンプルはソウル峨山病院で獲得し、腹水サンプルからＣＤ６６ｃ陽性が確認されたサンプルの胃癌細胞と同一患者の血液からＰＢＭＣを分離して実施例３．２のようにＥＬＩＳＰＯＴ試験を行った。
図１２ａは実際胃癌患者の腹水から胃癌細胞を分離してヒトＰＢＭＣと共同培養時キメラ８Ｆ５抗体を処理すればＩＦＮγ分泌が増加するのをＥＬＩＳＰＯＴで測定した結果である。図１２ｂと図１２ｃはＣＤ６６ｃ抗原陽性の胃癌患者３人に対する追加的なＥＬＩＳＰＯＴ実験を行って類似した結果を示すのを示している。
キメラ８Ｆ５抗体を投与した場合、陽性対照群で処理したＴ細胞活性化誘導抗体であるＯＫＴ抗体を投与した水準と同様にＩＦＮγ陽性ｓｐｏｔが増加した（図１２ａ）。これは、キメラ８Ｆ５抗体の処理が自己免疫細胞の活性化を誘導したのを示す結果である。
互いに異なる胃癌患者の腹水からＣＤ６６ｃ陽性の胃癌細胞を追加的に分離して、正常人の血液から分離したＰＢＭＣと混合して同一な条件で実施例３．２のようにＥＬＩＳＰＯＴ試験を行った。図１２ｂの結果のように、程度の差はあるが、キメラ８Ｆ５抗体処理時、ＩＦＮγ陽性が増加した。
＜実施例７＞キメラ８Ｆ５抗体によってＰＤ－Ｌ１発現量増加
癌細胞とＰＢＭＣ共同培養時キメラ８Ｆ５抗体によってＰＤ－Ｌ１発現量増加を評価しようとした。癌細胞ＬＳ－１７４－Ｔ（大腸癌細胞株）、ＮＣＩ－Ｎ８７（胃癌細胞株）Ａ５４９（非小細胞肺癌細胞株）とＰＢＭＣ共同培養時、キメラ８Ｆ５抗体による免疫チェックポイント関連蛋白質の変化を確認するためにＰＤ－Ｌ１の細胞表面変化を観察した。６ウェルプレート上で各ウェル当り癌細胞：ＰＢＭＣ＝１：３の比率で（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ：１．５×１０６ｃｅｌｌｓ）混合して２４時間培養し、この時、抗体は２０ｕｇ／ｍｌで処理した。癌細胞およびＰＢＭＣ細胞表面のＰＤ－Ｌ１はＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１）ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－５９８３－４１）で染色し、癌細胞とＰＢＭＣを区分するためにＣＤ４５－ＦＩＴＣ（ダイノナ）を同時染色した。
癌細胞とＰＢＭＣ共同培養時キメラ８Ｆ５抗体によってＰＤ－Ｌ１発現量増加を評価しようとした。癌細胞ＬＳ－１７４－Ｔ（大腸癌細胞株）、ＮＣＩ－Ｎ８７（胃癌細胞株）Ａ５４９（非小細胞肺癌細胞株）とＰＢＭＣ共同培養時、キメラ８Ｆ５抗体による免疫チェックポイント関連蛋白質の変化を確認するためにＰＤ－Ｌ１の細胞表面変化を観察した。６ウェルプレート上で各ウェル当り癌細胞：ＰＢＭＣ＝１：３の比率で（０．５×１０６ｃｅｌｌｓ：１．５×１０６ｃｅｌｌｓ）混合して２４時間培養し、この時、抗体は２０ｕｇ／ｍｌで処理した。癌細胞およびＰＢＭＣ細胞表面のＰＤ－Ｌ１はＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１）ＰＥ（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．＃：１２－５９８３－４１）で染色し、癌細胞とＰＢＭＣを区分するためにＣＤ４５－ＦＩＴＣ（ダイノナ）を同時染色した。
図１３ａおよびヒトＰＢＭＣとＡ５４９非小細胞肺癌細胞と共同培養してキメラ８Ｆ５抗体を処理すれば、ＰＢＭＣとＡ５４９癌細胞それぞれの表面でＰＤ－Ｌ１抗原の発現が増加するのを示す結果であり、図１３ｂはＡ５４９、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＬＳ－１７４－Ｔ細胞株のＰＤ－Ｌ１抗原発現増加を表で示した結果である。
図１３ａおよび図１３ｂのように、キメラ８Ｆ５抗体投与によって癌細胞およびＰＢＭＣの両方ともでＰＤ－Ｌ１細胞表面水準が増加したことが分かる。これはキメラ８Ｆ５抗体によって免疫細胞が活性化されたのを間接的に証明することであり、今後、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する抑制剤との併用治療が可能であるのを示す。
＜実施例８＞ヒト化８Ｆ５抗体によるＰＢＭＣ活性化
癌細胞とＰＢＭＣ共同培養時ヒト化８Ｆ５抗体によるＰＢＭＣ活性化を評価しようとした。即ち、表１１のように選定されたヒト化８Ｆ５抗体の中から５種類を選定して、実施例３．２のようにＥＬＩＳＰＯＴ試験を行った。同時培養した癌細胞はＡ５４９非小細胞癌細胞株（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞株）を使用し、投与した抗体の濃度は２０ｕｇ／ｍｌである。３日後、ＩＦＮγ陽性ｓｐｏｔを確認した時、図１４のように試験した５種類全てのヒト化８Ｆ５抗体がキメラ８Ｆ５抗体と同様な水準でＩＦＮγ陽性ｓｐｏｔを増加させたことが分かり、一部はキメラ８Ｆ５抗体よりさらに多くの程度の増加傾向を示した。したがって、機能的にヒト化８Ｆ５抗体はキメラ８Ｆ５抗体と非常に類似しているのを確認することができた。
癌細胞とＰＢＭＣ共同培養時ヒト化８Ｆ５抗体によるＰＢＭＣ活性化を評価しようとした。即ち、表１１のように選定されたヒト化８Ｆ５抗体の中から５種類を選定して、実施例３．２のようにＥＬＩＳＰＯＴ試験を行った。同時培養した癌細胞はＡ５４９非小細胞癌細胞株（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞株）を使用し、投与した抗体の濃度は２０ｕｇ／ｍｌである。３日後、ＩＦＮγ陽性ｓｐｏｔを確認した時、図１４のように試験した５種類全てのヒト化８Ｆ５抗体がキメラ８Ｆ５抗体と同様な水準でＩＦＮγ陽性ｓｐｏｔを増加させたことが分かり、一部はキメラ８Ｆ５抗体よりさらに多くの程度の増加傾向を示した。したがって、機能的にヒト化８Ｆ５抗体はキメラ８Ｆ５抗体と非常に類似しているのを確認することができた。
図１４ａおよび図１４ｂはヒト化組換え抗体もキメラ８Ｆ５抗体と類似したパターンでＡ５４９癌細胞とヒトＰＢＭＣ共同培養時、ＩＦＮγ分泌を増加させることによって、類似した程度の抗体機能があるのを示す結果である。
＜実施例９＞ヒト化８Ｆ５抗体による癌細胞の死滅化
９－１：癌細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞の共同培養
癌細胞とＣＤ３陽性Ｔ細胞との共同培養時ヒト化８Ｆ５抗体による癌細胞の死滅化を評価しようとした。大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞とヒトのＣＤ３陽性Ｔ細胞を共同培養する条件で抗体処理時、活性化されたＴ細胞によって癌細胞が死滅するかをｉｎ ｖｉｔｒｏ上で確認した。
９－１：癌細胞とＣＤ３＋Ｔ細胞の共同培養
癌細胞とＣＤ３陽性Ｔ細胞との共同培養時ヒト化８Ｆ５抗体による癌細胞の死滅化を評価しようとした。大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞とヒトのＣＤ３陽性Ｔ細胞を共同培養する条件で抗体処理時、活性化されたＴ細胞によって癌細胞が死滅するかをｉｎ ｖｉｔｒｏ上で確認した。
具体的に、９６ウェルプレート条件で癌細胞：Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）を１×１０４ｃｅｌｌｓ：１×１０５ｃｅｌｌｓの比率でウェル当り１００ｕｌの体積で共同培養し、１０ｕｇ／ｍｌの各抗体を処理して３日後に癌細胞死滅化程度をＥｚ－Ｃｙｔｏｘ（デイルバイオテック、ＥＺ－１０００）ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定した。抗体はヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９（表１１、Ｅ３）、ＰＤ－１（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ同一配列抗体）、ＰＤ－Ｌ１（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ同一配列抗体）、ＣＥＡＣＡＭ６（Ｂａｙｅｒ社の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体と同一配列抗体）をそれぞれ処理して測定した。図１５ａは前記死滅化実験の結果であり、本発明によるヒト化８Ｆ５抗体が最も高い癌細胞死滅効果を示した。
９－２：癌細胞とＰＢＭＣの共同培養
癌細胞とＰＢＭＣ共同培養時ヒト化８Ｆ５（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９）抗体による癌細胞の死滅化を評価しようとした。
癌細胞とＰＢＭＣ共同培養時ヒト化８Ｆ５（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９）抗体による癌細胞の死滅化を評価しようとした。
具体的に、前記実施例９－１と実質的に同一の方法で評価を行い、但し、大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞とヒトのＣＤ３陽性Ｔ細胞を共同培養する条件の代わりに、Ａ５４９（ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ細胞株）細胞株と互いに異なる二人のＰＢＭＣ（Ｄｏｎｏｒ１、Ｄｏｎｏｒ２）を使用して前記のような条件の実験を行った。図１５ｂの実験結果で示したように、ヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９；Ｅ３、ｌｇＧ１）を処理したウェルの癌細胞が二種類のＰＢＭＣ条件で全て最も高い癌細胞死滅効果を示した（図１５ｂ）。
＜実施例１０＞マウス動物モデルを用いた抗癌効能評価
１０－１：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルを用いたキメラ８Ｆ５抗体の抗癌効能評価 キメラ８Ｆ５抗体のＩｎ ｖｉｖｏ免疫抗癌効果を確認するために、免疫欠乏マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いた。従来の先行特許（大韓民国：１０－１２１４１７７；米国：８４０４８１２）ではＮｕｄｅマウスを用いて抗癌効果を示したが、Ｎｕｄｅマウスを用いた動物実験セットは抗癌効果を示す免疫細胞がヒト由来でないマウス免疫細胞を効能細胞として用いたものであって、実際ヒトで候補抗体が治療的効能を示すことができるのを立証するのに限界がある。したがって、実質的なヒト免疫細胞による動物実験内癌細胞死滅に対する抗体の抗癌効果を評価するために、マウスＴ細胞をはじめとする免疫細胞が欠乏されているＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを動物実験に使用した。
１０－１：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルを用いたキメラ８Ｆ５抗体の抗癌効能評価 キメラ８Ｆ５抗体のＩｎ ｖｉｖｏ免疫抗癌効果を確認するために、免疫欠乏マウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いた。従来の先行特許（大韓民国：１０－１２１４１７７；米国：８４０４８１２）ではＮｕｄｅマウスを用いて抗癌効果を示したが、Ｎｕｄｅマウスを用いた動物実験セットは抗癌効果を示す免疫細胞がヒト由来でないマウス免疫細胞を効能細胞として用いたものであって、実際ヒトで候補抗体が治療的効能を示すことができるのを立証するのに限界がある。したがって、実質的なヒト免疫細胞による動物実験内癌細胞死滅に対する抗体の抗癌効果を評価するために、マウスＴ細胞をはじめとする免疫細胞が欠乏されているＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを動物実験に使用した。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス免疫細胞によるＡｓｉａｌｏ ＧＭ１抗体をマウスに癌細胞およびヒトＰＢＭＣ投与１日前に投与してマウス内に残留するマウスナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を除去し、その翌日に癌細胞とＰＢＭＣをマウスに注射した。大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞はマウス当り５×１０６細胞数を皮下（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）に注入し、ＰＢＭＣは１×１０７細胞数を腹腔（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）に注入した。細胞注入後、４日後に１０ｍｇ／ｋｇの容量で抗体を静脈注射し、その後皮下注入癌細胞の癌腫瘍塊（ｔｕｍｏｒ ｍａｓｓ）の大きさを観察および測定した。
図１６ａは大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞を、図１６ｂは非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞を用いたＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス移植モデルとキメラ８Ｆ５抗体を使用した。
図１６ａはキメラ８Ｆ５抗体を用いたヒトＰＢＭＣを注入したヒト化条件のマウス動物モデルを用いたＩｎ Ｖｉｖｏ抗癌効能を示す結果である。互いに異なるヒトのＰＢＭＣを投与した時、全て同じ傾向でキメラ８Ｆ５抗体投与群が最も高い抗癌効果（Ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ；ＴＧＩ）を示し、第１の実験セットの場合４０％の抗癌効果を、第２の実験セットの場合４６％の抗癌効果を示した。図１６ａは大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞を、図１６ｂは非小細胞肺癌細胞であるＡ５４９細胞を用いた移植モデルを使用した。両方の場合ともキメラ８Ｆ５抗体投与群が最も高い抗癌効果を示した。ＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ抗体配列同一抗体）投与群は抗癌効果が無いか非常に微小であったが、これは癌細胞表面のＰＤ－Ｌ１抗原発現水準が非常に弱くて反応しなかったと判断される。
結果的に、ヒト免疫細胞とキメラ８Ｆ５抗体によって生体内抗癌効果を示すことができるのを大腸癌および肺癌動物モデルで確認した。
１０－２：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスＬＳ－１７４－Ｔモデルを用いたヒト化８Ｆ５抗体の抗癌効能評価
実施例１０－１と実質的に同一の方法で動物モデルを用いた抗癌効能を評価したが、但し、大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞を用いたＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス移植モデルとヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９、表１１）を使用し、実験結果を図１６ｃに示した。
実施例１０－１と実質的に同一の方法で動物モデルを用いた抗癌効能を評価したが、但し、大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞を用いたＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス移植モデルとヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９、表１１）を使用し、実験結果を図１６ｃに示した。
同一ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞株移植モデルでヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９）を投与した実験セットでも同じ類型の抗癌効果を確認した（図１６ｃ）。
１０－３：ＮＳＧマウスＬＳ－１７４－Ｔモデルを用いたヒト化８Ｆ５抗体の抗癌効能評価
実施例１０－１と１０－２で使用したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスより免疫欠乏程度がさらに深刻なＮＳＧマウスを用いた動物実験を行った。ＮＳＧマウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでＩＬ２レセプターガンマ（ＩＬ２Ｒγ）遺伝子に突然変異を誘導してＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに残留するＮＫ細胞の活性を完全に除去したマウスであって、これは微量残留するマウス免疫細胞による影響を完全に除去してひたすら一由来免疫細胞による影響を評価するためである。
実施例１０－１と１０－２で使用したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスより免疫欠乏程度がさらに深刻なＮＳＧマウスを用いた動物実験を行った。ＮＳＧマウスはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスでＩＬ２レセプターガンマ（ＩＬ２Ｒγ）遺伝子に突然変異を誘導してＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに残留するＮＫ細胞の活性を完全に除去したマウスであって、これは微量残留するマウス免疫細胞による影響を完全に除去してひたすら一由来免疫細胞による影響を評価するためである。
大腸癌細胞であるＬＳ－１７４－Ｔ細胞を用いたＮＳＧマウス移植モデルとヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９、表１１）、Ｂａｙｅｒ社のＣＥＡＣＡＭ６抗体、Ｍｅｒｃｋ社のＣＥＡＣＡＭ１抗体を使用し、実験結果を図１６ｄおよび１６ｅに示した。図１６ｄと図１６ｇはＮＳＧ免疫欠乏マウスで互いに異なるヒトＰＢＭＣを効能細胞にしてヒト化８Ｆ５抗体のＩｎ Ｖｉｖｏ抗癌効能を示す結果である。
ＮＳＧマウスＬＳ－１７４－Ｔモデルで投与した抗体は、ヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９）、Ｂａｙｅｒ社のＣＥＡＣＡＭ６抗体、Ｍｅｒｃｋ社のＣＥＡＣＡＭ１抗体であって、これらに対する抗癌効果を互いに比較した。ヒト化８Ｆ５と類似したターゲットに対する他の抗体を比較した時、ヒト化８Ｆ５抗体が最も優れた抗癌効果を示した。
図１６ｄは互いに異なる５人のヒトＰＢＭＣを効能細胞として使用した実験に対する平均値を示す実験結果であって、ヒト化８Ｆ５抗体（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９）投与群が比較群に比べて最も高い腫瘍成長抑制効果を示した。図１６ｅ～図１６ｇは実験に互いに異なるヒト（３人）ＰＢＭＣ注入による各抗体の抗癌効果を一人のＰＢＭＣ別にグラフ化したものであって、ヒト化８Ｆ５抗体投与群（ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：３０１９；Ｐ＋Ｅ３）が最も高い抗癌効果を示すのを三人の互いに異なるＰＢＭＣ投与群で確認し、残り２人の実験セットでも類似した結果を確認した。
Claims (9)
- （ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗－ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗原結合断片は、前記抗－ＣＤ６６ｃ抗体のｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１に記載の抗－ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項１に記載の抗－ＣＤ６６ｃ抗体またはその抗原結合断片を含む、癌および癌転移から選択された疾病の予防または治療のための薬学組成物。
- 前記癌は、ＣＤ６６ｃ陽性の固形癌である、請求項３に記載の薬学組成物。
- 前記固形癌は、ＣＤ６６ｃ陽性の肺癌、大腸癌、胃癌、肝癌、乳癌、または前立腺癌である、請求項４に記載の薬学組成物。
- ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１結合抑制剤をさらに含む、請求項３に記載の薬学組成物。
- 請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
- 請求項７に記載の核酸を含む、組換えベクター。
- 請求項８に記載の組換えベクターを含む、組換え細胞。
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