JP7438376B2

JP7438376B2 - Ｓｎａｒｅ複合体の形成を阻害するペプチド、及びその用途

Info

Publication number: JP7438376B2
Application number: JP2022545368A
Authority: JP
Inventors: ジュノイ，; ドンギュイ，; デフンキム，
Original assignee: メディトックスインク．
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2024-02-26
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: EP4098656A1; KR20220012979A; KR102513577B1; CN115023433A; BR112022014944A2; EP4098656A4; WO2021153946A1; JP2023511693A; AU2021214474B2; CA3169953A1; KR20210097530A; AU2021214474A1

Description

本発明は、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害するペプチド、及びその用途に関する。

ＳＮＡＲＥ複合体は、ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びＶＡＭＰ２を含む複合体であり、神経伝達物質の排出に係わる。シナプスからの神経伝達物質の排出は、シナプス小胞のニューロン細胞膜（neuronal plasma membrane）との融合と係わり、共に挙動し、シナプス融合複合体を形成するさまざまなタンパク質を要求する。それらタンパク質は、ＳＮＡＲＥタンパク質と総称されるが、ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びシナプトブレビン（synaptobrevin）を含む。該シナプトブレビンは、ＶＡＭＰ２（vesicle-associated membrane protein ２）とも言う。ＶＡＭＰ２は、シナプス小胞膜に位置する一方、ＳＮＡＰ－２５及びシンタキシンは、細胞膜と結合されている。カルシウム排出は、複合体の形成を引き起こし、前記シナプス小胞が、前記細胞膜に近接するように引っ張って来て、前記細胞膜を融合させる。前記融合により、前記小胞内に含まれた神経伝達物質がシナプスに排出される。前記神経伝達物質は、アセチルコリンまたはノルエピネフリンなどが含まれうる。ＶＡＭＰ２由来のペプチドであり、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を効率的に阻害することができるペプチドが依然として要求されているが、そのようなＳＮＡＲＥタンパク質は、皮膚の保護機能のために、効率的に皮膚に作用することができないという短所がある。

なお、治療のための薬物やタンパク質を細胞内に移動させるのおいて、目的タンパク質を細胞内に運搬させることができる運搬体の役割を行うペプチドを利用し、細胞内への薬物伝達を試みている。しかしながら、全てのタンパク質が、タンパク質輸送ドメインと融合タンパク質をなし、細胞内に透過されるものではない。例えば、Ｔａｔ形質導入部位と結合させたタンパク質が細胞内に導入はされたが、活性を示さないという研究結果が論文に発表された事実がある（Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188 (2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10; 40 (14): 4349-4358及びDaniele Peroni et al., Neuroscience letters 421 (2007) 110-114）。すなわち、細胞導入が容易ではないタンパク質に、タンパク質輸送ドメインを融合させるとして、融合されたタンパク質が細胞内に導入された後、円滑な活性を示すと断定することはできない。

［発明が解決しようとする課題］
一態様は、ＶＡＭＰ２タンパク質、またはその断片に、細胞膜透過ペプチドが融合されているペプチドを提供する。
他の態様は、前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、及びそれを含むベクター及び宿主細胞を提供する。
他の態様は、前記ペプチドを含む皮膚美白組成物またはしわ改善用組成物、あるいはそのキットを提供する。
他の態様は、前記ペプチドを個体に投与し、個体の皮膚美白またはしわ改善のための方法を提供する。
他の態様は、前記ペプチドを利用し、皮膚美白組成物またはしわ改善用組成物を製造する方法を提供する。
他の態様は、皮膚美白剤またはしわ改善剤の製造にあたり、前記ペプチドの用途を提供する。
他の態様は、皮膚美白剤またはしわ改善剤として使用するための前記ペプチドを提供する。

［課題を解決するための手段］
一態様は、ＶＡＭＰ２タンパク質、またはその断片に、細胞膜透過ペプチドが融合されているペプチドを提供する。
該ＶＡＭＰ２タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列によってなるものでもある。前記断片は、ＶＡＭＰ２タンパク質のＮ末端断片でもある。前記断片は、配列番号７のアミノ酸配列（配列番号１３の３０番ないし４３番のアミノ酸配列）を含むものでもある。前記断片は、配列番号７のアミノ酸配列によって必須になるものでもある。前記断片は、配列番号７のアミノ酸配列によってなるものでもある。前記断片は、配列番号４のアミノ酸配列（配列番号１３の３０番ないし４６番のアミノ酸配列）を含むものでもある。前記断片は、配列番号４のアミノ酸配列によって必須になるものでもある。前記断片は、配列番号４のアミノ酸配列によってなるものでもある。前記アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸またはＬ－アミノ酸でもある。

用語「～を含む（comprising）」とは、「含む」または「特徴とする」と同一に使用され、組成物または方法において、言及されていないさらなる成分要素または方法段階などを排除するものではない。用語「～によってなる（consisting of）」とは、「～によって構成される」と同一に使用され、別途に記載されていないさらなる要素、段階または成分などを除くことを意味する。用語「必須になる（consisting essentially of）」または「必須に構成される」とは、組成物または方法の範囲において、記載された成分要素または段階と共に、その基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素または段階などを含むことを意味する。

前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸は、可逆的化学的変形を有するものでもある。前記変形は、グルタミン酸及びアスパラギン酸のカルボン酸基のエステル化を含むものでもある。前記変形により、アミノ酸の負電荷が除去され、疎水性が増大されうる。それによって変形されたペプチドは、安定性及び脂肪溶解性を含む生体利用率を上昇させることができ、血液・脳障壁及び上皮組織を介し、容易に通過させられる。また、前記変形は、アミノ酸のカルボン酸基のアミド化を含むものでもある。前記ペプチドのＮ末端アミノ酸は、アセチル化されたものでもある。前記ペプチドのＣ末端のアミノ酸は、アミド化されたものでもある。前記変形は、体内において、細胞内エステラーゼなどによっても加水分解される。

前記ペプチドは、ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びＶＡＭＰ２を含むＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害し、神経伝達物質の排出を抑制するものでもある。シナプスからの神経伝達物質の排出は、シナプス小胞のニューロン細胞膜（neuronal plasma membrane）との融合と係わって共に挙動し、シナプス融合複合体を形成するさまざまなタンパク質を要求する。それらタンパク質は、ＳＮＡＲＥタンパク質と総称されるが、ＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びシナプトブレビン（synaptobrevin）を含む。該シナプトブレビンは、ＶＡＭＰ２とも言う。該ＶＡＭＰ２は、シナプス小胞膜に位置する一方、ＳＮＡＰ－２５及びシンタキシンは、細胞膜と結合されている。カルシウム排出は、複合体の形成を引き起こし、前記シナプス小胞が前記細胞膜に近接するように引っぱって来て、前記細胞膜を融合させる。前記融合により、前記小胞中に含まれた神経伝達物質がシナプスに排出される。前記神経伝達物質は、アセチルコリンまたはノルエピネフリンなどが含まれうる。前記ペプチドは、ＶＡＭＰ２を模写し、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害し、神経伝達物質がシナプスに排出されることを抑制することができる。それにより、前記ペプチドは、前記神経伝達物質がシナプスに排出されることによって引き起こされるさまざまな症状を弱化または改善させることができる。前記ペプチドは、皮膚美白またはしわ改善を行うことができる。また、前記ペプチドは、ニューロン・エキソサイトーシス媒介された症状を改善または治療するのにも使用されることができる。前記症状は、筋緊張疾患（spastic ailments）でもある。前記筋緊張疾患は、筋肉緊張異常（dystonia）、斜視（strabismus）、チック（tics）、眼瞼攣縮（blepharospasm）または顔面側湾症（facial scoliosis）でもある。

前記ペプチドは、古典的固相化学的ペプチド合成法を介しても得られる。また、前記ペプチドは、組み換えＤＮＡ技術に基づく方法によっても得られる。例えば、前記方法は、前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを、適切なプラスミドまたはベクターに導入し、それを宿主細胞に導入し、得られた細胞を培養し、前記ペプチドが培養物内に形成されるようにし、選択的に、前記ペプチドを精製することを含むものでもある。

前記ペプチドは、細胞膜透過ペプチドと融合されているものでもある。前記細胞膜透過ペプチドは、融合された前記ペプチドが、細胞膜を通過することを増大させるものでもある。融合されたペプチドは、ＶＡＭＰ２タンパク質またはその断片のＮ末端に、細胞膜透過ペプチドのＣ末端が融合されているものでもある。前記細胞膜透過ペプチドは、ＴＤ１、ＩＭＴ－Ｐ８、Transkin、ＶＰ２－２、ＲＢＤ－１、ＳＮ２５－２、ＳＴＸ－１及びＴＤｂ－１によってなる群のうちから選択されたものでもある。前記ＩＭＴ－Ｐ８は、配列番号８のアミノ酸配列によって必須になるものでもある。前記ＩＭＴ－Ｐ８は、配列番号８のアミノ酸配列によってなるものでもある。
本明細書において、前記ペプチドは、ペプチドだけではなく、その塩を含むとも理解される。前記塩は、前記ペプチドの薬剤学的または化粧品学的に許容可能な塩でもある。

他の態様は、前述のペプチドを有効成分として含む皮膚美白組成物またはしわ改善用組成物を提供する。
前記組成物は、薬剤学的または化粧品学的に許容可能な担体をさらに含むものでもある。前記担体は、希釈剤または賦形剤でもある。前記担体は、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、香料などでもある。前記希釈剤は、水、バッファまたは塩水でもある。

また、前記組成物は、薬剤学的または化粧品学的に許容可能なアジュバントをさらに含むものでもある。
前記組成物は、化粧料、あるいは薬剤学的または食品的な組成物でもある。
前記組成物は、任意の剤形、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション及びスプレーのうちいずれか一つの剤形でもある。

前記剤形が、ペースト、クリーム及びゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク及び酸化亜鉛のうち１以上を含むものでもある。

前記剤形が、パウダー及びスプレーである場合、前記担体は、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート及びポリアミドパウダーのうち１以上でもある。特に、スプレーである場合、前記組成物は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン及びジメチルエーテルのような推進剤をさらに含むものでもある。

前記剤形が溶液及び乳濁液である場合、前記担体は、溶媒、溶解化剤及び乳濁化剤のうち１以上を含むものでもある。前記担体は、例えば、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルのうち１以上でもある。

前記剤形が懸濁液である場合、前記担体は、水、エタノール及びプロピレングリコールのような液状の希釈剤；エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤；微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラカントのうち１以上でもある。

前記ペプチドの含量は、皮膚美白またはしわ改善に有効な量でもある。前記含量は、例えば、前記組成物重量基準で、０．００１ないし９５％、０．００１ないし７０％、０．００１ないし５０％、または０．０１ないし５０％でもある。

他の態様は、前述のペプチドを含む皮膚美白またはしわ改善のために使用するためのキットを提供する。
前記キットは、担体及びアジュバントによってなる群のうちから選択された１以上をさらに含むものでもある。また、前記キットは、前記ペプチドを、皮膚美白またはしわ改善に使用する過程を記述したマニュアルをさらに含むものでもある。

他の態様は、皮膚美白またはしわ改善に有効な量の前述のペプチドを個体に投与する段階を含む、個体において、皮膚美白またはしわを改善するための方法を提供する。
前記ペプチドは、それ自体、または前述の組成物の形態でもある。
前記投与は、任意の経路によっても投与される。前記投与は、経口投与または非経口投与でもある。前記投与は、鼻腔、粘膜または皮膚に適用するものでもある。前記個体は、ヒト、またはヒトではない動物、例えば、哺乳動物でもある。前記方法は、化粧する方法でもある。

他の態様は、前述のペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを伝達するのに使用されるものであるならば、いずれも含まれるものでもある。前記ベクターは、核酸構造体、プラスミドまたはウイルス由来ベクターを含むものでもある。前記ベクターは、発現ベクター、例えば、哺乳動物で発現可能な発現ベクターでもある。

他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、バクテリアまたは動物細胞でもある。前記動物細胞は、ＣＨＯ（Chinese hamster ovary cell）のような公知の動物細胞でもある。

他の態様は、前述のペプチドを有効成分として含むＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びＶＡＭＰ２を含むＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害するのに使用するための組成物を提供する。前記組成物は、担体またはアジュバントをさらに含むものでもある。前記組成物は、化粧料、薬剤学的または食品的な組成物でもある。

前記組成物は、ニューロン・エキソサイトーシス媒介された症状を改善または治療するためのものでもある。前記症状は、筋緊張疾患でもある。前記筋緊張疾患は、筋肉緊張異常、斜視、チック、眼瞼攣縮または顔面側湾症でもある。
前記ペプチドの含量、及び担体またはアジュバントについては、前述の通りである。

他の態様は、前述のペプチドを含むＳＮＡＰ－２５、シンタキシン及びＶＡＭＰ２を含むＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害するのに使用するためのキットを提供する。前記キットは、担体及びアジュバントのうち１以上をさらに含むものでもある。

他の態様は、前述のペプチドを個体に投与する段階を含む、個体において、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害するための方法を提供する。
前記方法は、ニューロン・エキソサイトーシス媒介された症状を改善または治療するためのものでもある。前記症状は、筋緊張疾患でもある。前記筋緊張疾患は、筋緊張異常、斜視、チック、眼瞼攣縮または顔面側湾症でもある。
前記ペプチドは、ペプチド、またはそれを含む組成物の形態でもある。投与される前記ペプチドの量は、個体において、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害するのに有効な量でもある。

他の態様は、前記ペプチドを、希釈剤、賦形剤、担体及びアジュバントによってなる群のうちから選択された１以上と混合する段階を含む、皮膚美白組成物またはしわ改善用組成物を製造する方法を提供する。
他の態様は、皮膚美白剤またはしわ改善剤の製造にあたり、前記ペプチドの用途を提供する。
他の態様は、皮膚美白剤またはしわ改善剤として使用するための前記ペプチドを提供する。

［発明の効果］
一態様によるペプチドによれば、皮膚美白またはしわ改善にも使用される。
一態様による前記ペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、それを含むベクター、及び宿主細胞によれば、前記ペプチドを生産するのにも使用される。
一態様による前記ペプチドを含む組成物、あるいはそのキットによれば、皮膚美白またはしわ改善、またはニューロン・エキソサイトーシス媒介された症状を改善または治療するのにも使用される。
一態様による方法によれば、個体の皮膚美白またはしわ改善、またはニューロン・エキソサイトーシス媒介された症状の改善または治療を効率的に行うことができる。

７個融合ペプチドが、ＰＣ１２細胞において、ノルエピネフリン分泌に及ぼす影響を示した図である。融合ペプチドＣ２－Ｐ４とＰ４とが、ＰＣ１２細胞において、ノルエピネフリン分泌に及ぼす影響を示した図である。Ｃ２－Ｐ４の細胞毒性実験結果を示した図である。Ｃ２－Ｐ４が皮膚刺激に及ぼす影響を測定した結果を示した図である。Ｃ２－Ｐ４が、細胞内メラニンレベルに及ぼす影響を測定した結果を示した図である。Ｃ２－Ｐ４が、培地内メラニンレベルに及ぼす影響を測定した結果を示した図である。Ｃ２－Ｐ４及びα－ＭＳＨの存在下、ＭＩＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。

実施例及び比較例：神経伝達物質分泌阻害能を有する候補ペプチド及び比較用ペプチドの選定
ＳＮＡＲＥ複合体を構成するタンパク質であるＳＮＡＰ２５、シンタキシン１ａ及びＶＡＭＰ２から７個のペプチド断片を選定した。表１は、７個の候補ペプチド及び比較用ペプチドを示した表である。Ｐ１は、アジレリンのアミノ酸配列である。
表１に示されているように、Ｐ１ないしＰ７のペプチドは、いずれもヒトＳＮＡＰ２５、ヒトシンタキシン１ａ及びヒドＶＡＭＰ２のアミノ酸配列に由来する６個ないし１７個のアミノ酸によって構成されたペプチドである。表１において、カッコ内の数字は、各タンパク質のアミノ酸配列において、前記ペプチドの最初アミノ酸と最後アミノ酸との位置を示す。また、前述のＰ１ないしＰ７のペプチドのＮ末端に、細胞透過性ペプチドのＣ末端を連結した融合ペプチドを製造した。具体的には、前記細胞膜透過ペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列によってなるＩＭＴ－Ｐ８ペプチドを使用した。それら融合ペプチドを、Ｃ２－Ｐ１、Ｃ２－Ｐ２、Ｃ２－Ｐ３、Ｃ２－Ｐ４、Ｃ２－Ｐ５、Ｃ２－Ｐ６及びＣ２－Ｐ７と命名した。前述のＰ１ないしＰ７のペプチドは、（株）Lugen ＳＣＩ（韓国）に依頼して化学的に合成された。また、Ｃ２－Ｐ１、Ｃ２－Ｐ２、Ｃ２－Ｐ３、Ｃ２－Ｐ４、Ｃ２－Ｐ５、Ｃ２－Ｐ６及びＣ２－Ｐ７の融合ペプチドも、（株）Lugen ＳＣＩ（韓国）に依頼して化学的合成方法によって作製された（Ｃ２－Ｐ４：配列番号１４、Ｃ２－Ｐ７：配列番号１５）。

実験例１：神経伝達物質阻害能の測定
７個融合ペプチドが、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害し、神経伝達物質の分泌を阻害するか否かということを確認した。前記神経伝達物質は、ノルエピネフリンを選択した。

（１）７個融合ペプチドの、神経細胞におけるノルエピネフリン分泌に及ぼす影響
ＰＣ１２細胞（韓国細胞株銀行）を、マトリゲルでコーティングしたＴ－７５フラスコに、１０％ウマ血清と、抗生物質であるAntibiotic－Antimycotic（Gibco：ペニシリン１０，０００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、Fungizone(R)（アムホテリシンＢ）２５μｇ／ｍＬ）とを含むＲＰＭＩ１６４０培地において、３７℃で７２時間培養した。該ＰＣ１２細胞は、ラットの副腎髄質（adrenal medulla）に発生したクロム親和細胞腫（pheochromocytoma）に由来する細胞株である。該副腎髄質において、カテコールアミン分泌機能を行うクロム親和細胞（chromaffin cells）は、すでに分化されており、分裂しないので、クロム親和細胞を研究するために培養可能なＰＣ１２細胞が好まれて使用される。

培養が終わった、ＰＣ－１２細胞は、トリプシン・ＥＤＴＡでもって、細胞をフラスコで分離した後、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、細胞を集めた。集められた細胞は、１ｘ１０^５細胞／ウェルの濃度で、１０％ウマ血清と前記抗生物質とを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌに接種し、マトリゲルがコーティングされた４８ウェルプレートで、３７℃で２４時間培養した。その後、何も添加されていない前記ＲＰＭＩ１６４０培地に、各実験群ペプチド、すなわち、７個融合ペプチドを２０μＭの濃度で添加し、２時間培養した。各実験群は、Krebs緩衝液（１１８ｍＭＮａＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ_４、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、５ｍＭＫＣｌ、２４ｍＭＮＡＨＣＯ_２、２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１１ｍＭデキストロース、ｐＨ７．４）を利用し、２回洗浄し、高カリウムイオン含有Krebs緩衝液（５６ｍＭＮａＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ_４、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、６８ｍＭＫＣｌ、２４ｍＭＮａＨＣＯ_３、２ｍＭＫＨ２_ＰＯ_４、１１ｍＭデキストロース、ｐＨ７．４）において、３７℃で３０分間インキュベーションを行い、脱分極を誘導した。脱分極が誘導されたサンプルは、Norepinephrine ＥＬＩＳＡ Kit（Abnova Ｃａｔ＃ＫＡ１８９１）を使用し、ＥＬＩＳＡを遂行し、ノルエピネフリンの分泌量を測定した。具体的には、脱分極誘導された試料に対して洗浄を行えば、プレートのウェルには、培地が除去され、細胞だけが存在することになる。細胞に対して脱分極を行わせるために、カリウムイオンを含むKrebsバッファ溶液をプレートに入れ、人為的に神経伝達物質を出させ、細胞からKrebsバッファに放出された神経伝達物質を、ＥＬＩＳＡを介して測定した。

その結果を図１に示した。図１は、７個融合ペプチドが、ＰＣ１２細胞において、ノルエピネフリン分泌に及ぼす影響を示した図である。図１に示されているように、無処理群対比で、Ｃ２－Ｐ４ペプチド及びＣ２－Ｐ７ペプチドが処理されたとき、神経伝達物質の分泌率が、それぞれ３５％レベル及び５６％レベルに阻害されることを確認した。７個融合ペプチドのうちＣ２－Ｐ４ペプチドが神経伝達物質の分泌を最も多く阻害した。

（２）Ｃ２－Ｐ４とＰ４との細胞内神経伝達物質分泌阻害能の比較
ＰＣ１２細胞（韓国細胞株銀行）を、マトリゲルでコーティングしたＴ－７５フラスコに、１０％ウマ血清と、抗生物質であるAntibiotic－Antimycotic（Gibco、ペニシリン１０，０００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１０，０００μｇ／ｍＬ、Fungizone(R)（アムホテリシンＢ）２５μｇ／ｍＬ）とを含むＲＰＭＩ１６４０培地において、３７℃で７２時間培養した。該ＰＣ１２細胞は、ラットの副腎髄質に発生したクロム親和細胞腫に由来する細胞株である。該副腎髄質において、カテコールアミン分泌機能を行うクロム親和細胞は、すでに分化されており、分裂しないので、クロム親和細胞を研究するために、培養可能なＰＣ１２細胞が好まれて使用される。

培養が終わった、ＰＣ－１２細胞は、トリプシン・ＥＤＴＡでもって、細胞をフラスコで分離した後、１，５００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、細胞を集めた。集められた細胞は、１ｘ１０^５細胞／ウェルの濃度で、１０％ウマ血清と、前記抗生物質とを含むＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌに接種し、マトリゲルがコーティングされた４８ウェルプレートにおいて、３７℃で２４時間培養した。その後、何も添加されていない前記ＲＰＭＩ１６４０培地に、それぞれＰ４とＣ２－Ｐ４融合ペプチドとを２０μＭの濃度で添加して２時間培養した。各実験群は、Krebs緩衝液（１１８ｍＭＮａＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ_４、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、５ｍＭＫＣｌ、２４ｍＭＮＡＨＣＯ_２、２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１１ｍＭデキストロース、ｐＨ７．４）を利用し、２回洗浄し、高カリウムイオン含有Krebs緩衝液（５６ｍＭＮａＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ_４、２．５ｍＭＣａＣｌ_２、６８ｍＭＫＣｌ、２４ｍＭＮａＨＣＯ_３、２ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４、１１ｍＭデキストロース、ｐＨ７．４）において、３７℃で３０分間インキュベーションを行い、脱分極を誘導した。脱分極が誘導されたサンプルは、Norepinephrine ＥＬＩＳＡ Kit（Abnova Ｃａｔ＃ＫＡ１８９１）を使用し、ＥＬＩＳＡを遂行し、ノルエピネフリンの分泌量を測定した。具体的には、脱分極誘導された試料に対して洗浄を行えば、プレートのウェルには、培地が除去され、細胞だけが存在することになる。細胞に対して脱分極を行わせるために、カリウムイオンを含むKrebsバッファ溶液をプレートに入れ、人為的に神経伝達物質を出させ、細胞からKrebsバッファに放出された神経伝達物質を、ＥＬＩＳＡを介して測定した。

その結果を図２に示した。図２は、融合ペプチドＣ２－Ｐ４とＰ４とが、ＰＣ１２細胞において、ノルエピネフリン分泌に及ぼす影響を示した図である。図２に示されているように、無処理群対比で、Ｐ４とＣ２－Ｐ４との神経伝達物質分泌率は、それぞれ７５％レベル及び４１％レベルであった。すなわち、細胞膜透過ペプチドが融合されたＣ２－Ｐ４の神経伝達物質分泌率は、細胞膜透過ペプチドが融合されていないＰ４に比べ、３４％さらに低かった。

実験例２：選抜されたペプチドの毒性確認
（１）原料物質毒性実験：ＭＴＴ分析
韓国細胞株銀行から購入したＢ１６－Ｆ１０細胞を、９６ウェルプレートに、１ｘ１０_４細胞／ウェルの濃度で、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地１００μＬに接種し、４８時間培養した。Ｂ１６－Ｆ１０細胞は、マウスに由来する鼠黒色腫（melanoma）細胞株である。該細胞は、吸着性（adherent）であり、上皮性形態（epithelial morphology）を有する。その後、Ｃ２－Ｐ４ペプチドを、濃度別に、１２．５，２５，及び５０μＭでＤＭＥＭ培養液に希釈して入れ替え、４８時間培養した。プレートに対し、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、培養液を除去した。各ウェルは、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＥＭ培地に希釈して作った０．５ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液を添加した。細胞を、３７℃ ５％ＣＯ_２培養基で２時間培養した。プレートに対し、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った後、ＭＴＴ溶液を除去した。各ウェルを、ＰＢＳで２回洗浄し、ＤＭＳＯを１５０μｌ添加して生産されたポルマザンを溶かした。前記プレートを、Spectra ＭＡＸｉ３機器に入れ、各ウェル中の試料につき、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。

その結果を図３に示した。図３は、Ｃ２－Ｐ４の細胞毒性実験結果を示した図である。図３に示されているように、Ｃ２－Ｐ４は、ＭＴＴ分析法において、ランダム配列のペプチド（scrambled peptide）である陰性対照群に比較し、類似した細胞生存度を示しており、細胞毒性がなかった。

（２）皮膚刺激度試験
Tego Science（韓国）から購入した人工皮膚（Neoderm－ＥＤ）に、１ｘＰＢＳと５％ＳＤＳとを該人工皮膚にくまなく塗布し、それぞれ陰性対照群と陽性対照群とを作った。実験群は、１００μｇ／ｍｌＣ２－Ｐ４ペプチド２０μｌを満遍なく塗布した。１５分間室温で反応させた後、１２ウェル培養プレートのウェルに移し、３７℃ ５％ＣＯ_２培養基で１５分間培養した。反応が終わった人工皮膚は、ＰＢＳで２回洗浄し、新たな１２ウェル培養プレートのウェルに移し、４２時間培養した。培養が完了すれば、０．３ｍｇ／ｍｌＭＴＴ溶液２ｍｌを入れ、細胞を３時間培養した。前記プレートの各ウェル中の試料を、０．０４ＮＨＣｌ－イソプロパノールを添加して脱色させ、Spectra ＭＡＸｉ３に入れ、各ウェル中の試料につき、５８０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果を図４に示した。図４は、Ｃ２－Ｐ４が皮膚刺激に及ぼす影響を測定した結果を示した図である。図４に示されているように、Ｃ２－Ｐ４は、細胞生存率が約８５％であり、無刺激性であった。ここで、細胞生存率が、陰性対照群対比で、５０％以上であるならば、無刺激と判定した。

実験例３：選抜されたペプチドの美白効果の確認
（１）Ｃ２－Ｐ４処理後、細胞内部のメラニン量の測定
韓国細胞株銀行から購入したＢ１６－Ｆ１０細胞を、２４ウェルプレートに、１ｘ１０^４細胞／ウェルの濃度で、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地１ｍｌに接種し、３７℃ ５％ＣＯ_２培養基で４８時間培養し、細胞単層が形成されるようにした。その後、前記培地を、１０％ＦＢＳと、Ｃ２－Ｐ４ペプチド５μＭまたは１０μＭとが添加されたＤＭＥＭ（phenol-red free）培地で交換し、３７℃ ５％ＣＯ_２培養基で４８時間培養した。培養が完了した実験群は、ＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン・ＥＤＴＡでもって細胞を得た。各ウェル中の細胞単層は、１０％ＤＭＳＯが添加された１ＮＮａＯＨ溶液を入れ、９５℃で２０分間インキュベーションし、メラニン及び細胞を溶解させた後、Spectra ＭＡＸｉ３機器に入れ、各ウェル中の試料において、４９０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果を図５に示した。図５は、Ｃ２－Ｐ４が、細胞内メラニンレベルに及ぼす影響を測定した結果を示した図である。図５に示されているように、Ｃ２－Ｐ４は、５μＭ及び１０μＭの存在時、陰性対照群に比べ、１８０％及び２５０％を示し、細胞内メラニンレベルを顕著に上昇させた。

（２）Ｃ２－Ｐ４処理後培地でのメラニン量測定
また、（１）において、培養４８時間で細胞を除去した培養を、１０％ＤＭＳＯが添加された１ＮＮａＯＨ溶液を入れ、９５℃で２０分間メラニン及び細胞を溶解させた後、４９０ｎｍにおいて吸光度を測定した。
その結果を図６に示した。図６は、Ｃ２－Ｐ４が、培地内メラニンレベルに及ぼす影響を測定した結果を示した図である。図６に示されているように、Ｃ２－Ｐ４は、５μＭ及び１０μＭの存在時、陰性対照群に比べ、１０７％及び１０５％を示し、培地内メラニンレベルは、上昇していない。
図５及び図６によれば、Ｃ２－Ｐ４の存在下において、細胞内部のメラニンレベルは、上昇するが、培地内のメラニンレベルは、上昇していないので、Ｃ２－Ｐ４により、メラニンの細胞外部への分泌が抑制されるということを示す。

（３）Ｃ２－Ｐ４処理後、ＭＩＴＦ遺伝子活性の測定
韓国細胞株銀行から購入したＢ１６－Ｆ１０細胞を、６ウェルプレートに１ｘ１０_５細胞／ウェルの濃度で、１０％ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地３ｍｌに接種し、３７℃ ５％ＣＯ_２培養基で２４時間培養し、細胞単層が形成されるようにした。陰性対照群は、ＤＭＥＭ培地に替え、ペプチド処理実験群とα－ＭＳＨ実験群は、それぞれペプチド１０μＭとα－ＭＳＨ５０ｎＭとの含有ＤＭＥＭ培地に替え、４８時間培養した。各実験群は、ＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン・ＥＤＴＡを利用し、細胞を得て、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、細胞だけ得た。得られた細胞から、Trizolを利用し、ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を利用し、それぞれ１，０００ｎｇのｃＤＮＡを合成した。それぞれの合成されたｃＤＮＡの１００ｎｇを利用し、ＧＡＰＤＨとα－ＭＳＨとの発現様相をリアルタイム（real-time）ＰＣＲを利用して確認した。該リアルタイムＰＣＲに使用されたプライマーは、配列番号９及び１０、または配列番号１１及び１２のポリヌクレオチドセットを使用した。

その結果を図７及び表２に示した。図７は、Ｃ２－Ｐ４及びα－ＭＳＨの存在下におけるＭＩＴＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。

図７及び表２に示されているように、Ｂ１６－Ｆ１０細胞において、Ｃ２－Ｐ４ペプチドによるメラニン生成は、有意の変化がない一方、細胞によるメラニン分泌が、Ｃ２－Ｐ４ペプチドによって抑制されるということを確認した。ミクロフタルミア関連転写因子（ＭＩＴＦ：microphthalmia-associated transcription factor）は、ヒトにおいて、メラノサイトにおいて、正常メラニン合成に必須な多様な遺伝子の発現を調節すると知られている。図７及び表２に示されているように、Ｃ２－Ｐ４ペプチドは、メラニン形成に大きな影響を及ぼすＭＩＴＦ遺伝子の発現には、大きな影響がなかった。それは、前記Ｃ２－Ｐ４ペプチドは、メラニン生成増大ではなく、細胞外部への分泌抑制により、メラニンを細胞内部に蓄積させるということを示す。

Claims

ＶＡＭＰ２（ｖｅｓｉｃｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ２）タンパク質の断片に、細胞膜透過ペプチドが融合されている、ペプチドであって、
前記断片が、配列番号４又は７のアミノ酸配列からなり、前記細胞膜透過ペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列からなり、前記細胞膜透過ペプチドのＣ末端が、前記断片のＮ末端に融合されている、ペプチド。
前記ペプチドのＮ末端がアセチル化されている；
前記ペプチドのＣ末端がアミド化されている；又は、
前記ペプチドのＮ末端がアセチル化され、且つ、前記ペプチドのＣ末端がアミド化されている、
請求項１に記載のペプチド。
配列番号１４又は配列番号１５のアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載のペプチド。
請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドを有効成分として含む、皮膚美白組成物又はしわ改善用組成物。
希釈剤、賦形剤、担体及びアジュバントによってなる群のうちから選択された１以上をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
有効量の請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドを個体に投与することを含む、個体における皮膚美白又はしわ改善のための方法であって、前記方法が、化粧法であり、前記投与することが、皮膚美白又はしわ改善に有効な量の請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドを個体に塗布することである、方法。
請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドを、希釈剤、賦形剤、担体及びアジュバントによってなる群のうちから選択された１以上と混合する段階を含む、皮膚美白組成物又はしわ改善用組成物を製造する方法。
皮膚美白剤又はしわ改善剤の製造における、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
皮膚美白剤又はしわ改善剤として使用するための、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド。