JP7437456B2 - 分析物の検出および分析のためのナノポアタンパク質コンジュゲート - Google Patents
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Description
[001]この出願は、名称が「分析物の検出および分析のためのナノポアタンパク質コン
ジュゲート」である、2018年2月15日に出願された米国仮特許出願第62/630,993号の優先権の恩恵を主張する。上記で特定された優先権出願の全開示は、全体として参照により本明細書に完全に組み入れられている。
[002]本出願は、ASCII形式で電子的に提出されており、かつ全体として参照によ
り本明細書に組み入れられている配列表を含有する。2019年1月16日に作成された前記ASCIIコピーは、08485_001WO1_SL.txtという名前で、サイズが29,354バイトである。
ムに関し、より具体的には、流体溶液において分析物を同定するための、およびその溶液中の分析物の濃度を決定するためのナノポアタンパク質コンジュゲートの使用に関する。
、多数の生物学的過程および機能に関与している。したがって、そのような成分のレベルにおけるいかなる異常も疾患をもたらし、または疾患過程を加速し得る。このため、患者診断および処置に用いられる生物活性成分を迅速に検出し、かつ同定するための信頼のおける方法を開発するのに、多くの努力が払われてきた。例えば、血液または尿試料においてタンパク質または小分子を検出することは、患者の代謝状態を評価するために用いることができる。同様に、血液または尿試料における抗原の検出は、患者が曝露されている病原体を同定し、それにしたがって、適切な処置を促進するために用いることができる。そして、胎児性無細胞DNAの同定における最近の進歩に伴って、母親の血液試料からある特定の遺伝性障害を出生前に診断する能力が、無細胞DNAの検出を通して、今や可能である。溶液中の分析物の濃度を決定できることは、さらに有益である。例えば、血液または尿成分の濃度を決定することは、その成分を参照値と比較し、それにしたがって、患者の健康状態のさらなる評価を促進することを可能にし得る。
であり、かつ幾分、時間がかかり得る。例えば、多くの診断試験は、完了するのに数日かかり得、かつかなりの検査室資源を必要とし得る。そして、場合によっては、心筋梗塞に関連したマーカーの分析においてなどの診断の遅れは、患者治療にマイナスの影響を及ぼし得る。さらに、生物活性成分を同定することを目的とした多くの診断試験の複雑さは、誤差に加担し、それにしたがって、精度を低下させる。そして、多くの検出および同定方法は、一度に1個または数個の生物活性成分を分析できるだけである(しかも、濃度を決定することができない)。
で、迅速に検出および同定することができるさらなる方法、組成物、およびシステムである。同時に複数の生物活性成分をアッセイすることができ、それにしたがって、費用を低減する、方法、組成物、およびシステムもまた必要とされている。さらに、流体溶液中の生物活性成分の濃度を決定するための方法、組成物、およびシステムが必要とされている。
ナノポアタンパク質コンジュゲートが提供される。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲートは、配列番号4または配列番号7として示される配列と少なくとも60%、65%、70%、80%、90%、もしくは95%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
検出複合体が提供される。例えば、分析物検出複合体は、イソペプチド結合を介してなど、ナノポアタンパク質コンジュゲートと連結している分析物リガンドを含む。
アアセンブリが提供される。例えば、ナノポアアセンブリは、分析物検出複合体を含む七量体ナノポアアセンブリであり得る。ある特定の例的態様において、コンジュゲートのナノポア単量体は、アルファ-ヘモリシン単量体であり、七量体のその他の6個の単量体のそれぞれは、アルファ-ヘモリシン単量体である。
ステムが提供される。システムはまた、溶液において分析物を検出するために用いることができる。システムは、例えば、チップの膜内に配置されているナノポアアセンブリを有するチップを含む。ナノポアアセンブリは、例えば、捕獲タグおよび分析物リガンドを有する少なくとも1個のナノポアタンパク質単量体を含む。システムはさらに、膜に隣接して、またはその近くに位置づけられた検知電極を含む。検知電極は、例えば、ナノポアアセンブリからのシグナルを検出するように構成される。システムはさらに、ナノポアアセンブリに関連した第1の遷移および第2の遷移を同定するように、検知電極と共に構成されるコンピュータープロセッサーを含む。第1の遷移は、例えば、分析物の分析物リガンドとの結合に対応する。第2の遷移は、例えば、分析物の分析物リガンドからの解離に対応する。
[0022]本明細書に開示されているように、標的分析物の検出のための方法、組成物、およびシステムが提供される。流体溶液中の1つまたは複数の標的分析物の濃度を決定するための方法、組成物、およびシステムもまた提供される。組成物は、ナノポアタンパク質単量体が捕獲タグと連結しているナノポアタンパク質コンジュゲートを含む。ナノポアタンパク質コンジュゲートへ繋がれるのは、特定の分析物へ方向づけられ得る分析物リガンドである。本明細書に記載されているように、ナノポアコンジュゲートを含むナノポアアセンブリに渡って電圧が加えられた場合、ナノポアは捕獲タグを所定の捕獲速度で捕獲する。しかしながら、分析物リガンドに対する分析物の存在下では、捕獲タグの捕獲速度は変化し、それにしたがって、ナノポアアセンブリによる分析物の検出を可能にする。さらに、ある特定の例においては、分析物と分析物リガンドの間の結合に関連した捕獲速度に基づいて、分析物の濃度を決定することができる。
グは、電圧の存在下で、七量体ナノポアアセンブリと相互作用するように構成される。ある特定の例において、捕獲タグは、アルファ-ヘモリシン単量体の合成中、アルファ-ヘモリシンとリンカー配列を介して融合され、それにより、ナノポアタンパク質コンジュゲートを形成する。例えば、捕獲タグは、ナノポアが捕獲および放出することができる任意の分子であり、それによって、検出可能な捕獲速度を生じる。
[0028]本発明をここで、以下の定義および例を用いて、参照としてのみ、詳細に記載する。本明細書において他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科
学的用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似したまたは等価の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載される。この発明は、記載された特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されないことは理解されるべきであり、これらは様々であり得るためである。
;バルプロ酸;キニジン;黄体形成ホルモン(leutinizing hormone)(LH);卵胞刺
激ホルモン(FSH);エストラジオール、プロゲステロン;IgE抗体;ビタミン;β(B)2ミクログロブリン;糖化ヘモグロビン(Gly.Hb);コルチゾール;ジギト
キシン;N-アセチルプロカインアミド(NAPA);プロカインアミド;風疹IgGおよび風疹IgMなどの風疹に対する抗体;トキソプラズマ症IgG(Toxo-IgG)およびトキソプラズマ症IgM(Toxo-IgM)などのトキソプラズマ症に対する抗
体;テストステロン;サリシレート;アセトアミノフェン;B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg);抗B型肝炎コア抗原IgGおよびIgMなどのB型肝炎コア抗原に対する抗体(抗HBC);ヒト免疫不全ウイルス1型および2型(HTLV);B型肝炎e抗原(HBeAg);B型肝炎e抗原に対する抗体(抗Hbe);甲状腺刺激ホルモン(TSH);チロキシン(T4);総トリヨードサイロニン(Total T3);遊離トリヨードサイロニン(Free T3);癌胎児抗原(CEA);およびアルファ胎児タンパク質(AF);ならびに乱用薬物および規制物質、例として、非限定的に、アンフェタミン;メタンフェタミン;アモバルビタール、セコバルビタール(seobarbital)、ペントバルビタール、フェノバルビタール、およびバルビタールなどのバルビツレート(barbituates);リブリウムおよびバリウムなどのベンゾジアゼピン;ハシッシュおよびマリファナなどのカンナビノイド;コカイン;フェンタニル(fetanyl);LSD;メタカロン(methapualone);ヘロイン、モルヒネ、コデイン(codine)、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルホン、およびアヘンなどのオピエート;フェンサイクリジン;ならびにプロポキシフェン(propoxyhene)を挙げることができる。分析物という用語はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、高分子、およびそれらの組合せを含む。
ンパク質B、コレステロール、CK、CK-MB、CK-MB(mass)、CK-MB(mass) STAT、CRP hs、シスタチンC、D-Dimer、心臓ジギトキシン、ジゴキシン、GDF-154、HDLコレステロール直接法、ホモシステイン、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、LDLコレステロール直接法、リポタンパク質(a)、ミオグロビン、ミオグロビンSTAT、NT-proBNP、NT-proBNP STAT、トロポニンI、トロポニンI STAT、トロポニンT hs、トロポニンT hs STAT、凝固AT III、D-Dimer、乱用薬物検査アンフェタミン(エクスタシー)、ベンゾジアゼピン、ベンゾジアゼピン(血清)、カンナビノイド、コカイン、エタノール、メサドン、メサドン代謝産物(EDDP)、メタカロン、オピエート、オキシコドン、3、フェンサイクリジン、プロポキシフェン、アミラーゼ、ACTH、抗Tg、抗TPO、抗TSH-R、カルシトニン、コルチゾール、C-ペプチド、FT3、FT4、hGH、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、IGF-14、インスリン、リパーゼ、PTH STAT、T3、T4、サイログロブリン(Thyreoglobulin)(TG II)、サイログロブリン(Thyreoglobulin)確認、TSH、T-摂取率、受精能抗ミュラー管ホルモン、DHEA-S、エストラジオール、FSH、hCG、hCG plus beta、LH、プロゲステロン、プロラクチン、SHBG、テストステロン、肝臓学AFP、アルカリホスファターゼ(IFCC)、アルカリホスファターゼ(最適化)、3、Pyp有りでのALT/GPT、PypなしでのALT/GPT、アンモニア、抗HCV、Pyp有りでのAST/GOT、PypなしでのAST/GOT、直接ビリルビン、総ビリルビン、アセチルコリンエステラーゼ、3、ブチリルコリンエステラーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、HBeAg、HBsAg、乳酸デヒドロゲナーゼ、感染性疾患 抗HAV、抗HAV IgM、抗HBc、抗HBc IgM、抗HBe、HBeAg、抗HBsAg、HBsAg、HBsAg確認、HBsAg定量、抗HCV、Chagas 4、CMV IgG、CMV IgG結合力、CMV IgM、HIV combi PT、HIV-Ag、HIV-Ag確認、HSV-1 IgG、HSV-2 IgG、HTLV-I/II、風疹IgG、風疹IgM、梅毒、Toxo IgG、Toxo IgG結合力、Toxo IgM、TPLA(梅毒)、抗CCP、ASLO、C3c、C4、セルロプラスミン、CRP(ラテックス)、ハプトグロビン、IgA、IgE、IgG、IgM、免疫グロブリンA CSF、免疫グロブリンM CSF、インターロイキン6、カッパ軽鎖、遊離カッパ軽鎖6,2,3、ラムダ軽鎖、遊離ラムダ軽鎖6,2,3、プレアルブミン、プロカルシトニン、リウマトイド因子、α1-酸性糖タンパク質、α1-アンチトリプシン、重炭酸塩(CO2)、カルシウム、クロリド、フルクトサミン、グルコース、HbA1c(溶血血液)、HbA1c(全血)、インスリン、ラクテート、LDLコレステロール直接法、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、総タンパク質、トリグリセリド、トリグリセリド グリセロール消去法、総ビタミンD、酸性ホスファターゼ、AFP、CA 125、CA 15-3、CA 19-9、CA 72-4、カルシトニン、Cyfra 21-1、hCG plus beta、HE4、遊離カッパ軽鎖6,2,3、遊離ラムダ軽鎖6,2,3、NSE、proGRP、遊離PSA、総PSA、SCC、S-100、サイログロブリン(Thyreoglobulin)(TG II)、サイログロブリン(Thyreoglobulin)確認、β2-ミクログロブリン、アルブミン(BCG)、アルブミン(BCP)、アルブミン 免疫性、クレアチニン(酵素法)、クレアチニン(Jaffe)、シスタチンC、カリウム、PTH、PTH(1-84)、総タンパク質、総タンパク質、尿/CSF、尿素/BUN、尿酸、α1-ミクログロブリン、β2-ミクログロブリン、アセトアミノフェン(パラセタモール)、アミカシン、カルバマゼピン、サイクロスポリン、ジギトキシン、ジゴキシン、エベロリムス、ゲンタマイシン、リドカイン、リチウム、ISEミコフェノール酸、NAPA、フェノバルビタール、フェニトイン、プリミドン、プロカインアミド、キニジン、サリシレート、シロリムス、タクロリムス、テオフィリン、トブラマイシン、バルプロ酸、バンコマイシン、抗ミュラー管ホルモン、AFP、β-Crosslaps、DHEA-S、エストラジオール、FSH、遊離βhCG、hCG、hCG plus beta、hCG STAT、HE4、LH、N-MIDオステオカルシン、PAPP-A、PlGF、sFIt-1、P1NP、プロゲステロン、プロラクチン、SHBG、テストステロン、CMV IgG、CMV IgG結合力、CMV IgM、風疹IgG、風疹IgM、Toxo IgG、Toxo IgG結合力、および/またはToxo IgMが挙げられる。
oined)」、「連結する(link)」、「連結された(linked)」、または「繋がれた」は、タンパク質をDNA分子と、またはタンパク質をタンパク質と接続することなど、2つ以上の実体を機能的に接続するための、当技術分野において公知の任意の方法を指す。例えば組換え型融合タンパク質において、介在配列またはドメイン有りまたはなしで、1つのタンパク質が別のタンパク質と共有結合を介して連結され得る。共有結合の例は、例えば、SpyCatcher/SpyTag相互作用、システイン-マレイミドコンジュゲーション、またはアジド-アルキンクリックケミストリー、加えて、当技術分野において公知の他の手段を通して、形成され得る。さらに、1個のDNA分子は、別のDNAと、相補DNA配列のハイブリダイゼーションを介して連結され得る。
nkタンパク質配列および他の公共データベースにおけるアミノ酸配列に対して検索するためには、BLASTXプログラムが好ましい。BLASTNとBLASTXのどちらも、11.0のオープンギャップペナルティおよび1.0の伸長ギャップペナルティのデフォルトパラメータを用いて実行され、BLOSUM-62マトリックスを利用する(例えば、Altschul,S.F.ら、Nucleic Acids Res. 25:3389~3402、1997参照)。
態の進行についてモニターすることを必要とし得る。患者はまた、効力についてモニターする必要がある処置治療に関与し得る。哺乳類は、例えば、ヒト、チンパンジー、家畜および農業用動物、加えて、動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む、哺乳類として分類される任意の動物を指す。
[0067]例的実施形態をここで、一部、添付の図を参照して、詳細に記載する。図が参照される場合、同様の数字は、図を通して同様(ただし、必ずしも同一とは限らない)の要素を示す。
[0068]ナノポアタンパク質コンジュゲートを含む組成物が本明細書に提供される。図1に示されているように、コンジュゲート1は、ある特定の例的実施形態により、捕獲タグ5と連結されているナノポア単量体2を含み得る。ナノポアタンパク質コンジュゲート1はまた、分析物リガンド付着部位4を含み得る。したがって、その結果として生じたナノポアタンパク質コンジュゲート1は、ナノポア単量体ドメイン、分析物リガンド付着ドメイン、および捕獲タグドメインを含み得る。そのようなナノポアタンパク質コンジュゲート1は、例えば、本明細書に記載されているような分析物と、本明細書に記載されているように、相互作用し、かつその検出を促進することができる分析物検出複合体を形成するために用いることができる。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート1はまた、ナノポアタンパク質コンジュゲート1の様々な成分を連結する1つまたは複数のリンカードメイン3を含み得る。
そのような実施形態において、その結果として生じたナノポアタンパク質コンジュゲート1は、アルファ-ヘモリシンドメイン(すなわち、そのコンジュゲートのアルファ-ヘモリシン単量体部分)、分析物リガンド付着部位4、および捕獲タグ5を含む(図1)。ある特定の例的実施形態において、そのようなナノポアタンパク質コンジュゲートはまた、ナノポアタンパク質コンジュゲート1の様々なドメインを連結する1つまたは複数のリンカー領域3を含み得る。
えば、そのバレルは、グラム陰性細菌において、栄養分、イオン、およびタンパク質の受動的だが、選択的な取り込みおよび分泌を可能にする。そのようなポリンは、一般的に、周辺質側に短いターン、および細胞外側に長いループを有する。しかし、たいていのポリンとは違って、OmpGは単量体として機能すると理解されている。
アミノ酸配列に対応し得る。
[0087]図2は、ある特定の例的実施形態による分析物検出複合体9を示すイラストである。図2を参照して、ナノポアタンパク質コンジュゲート1は、分析物リガンド8と連結されて、分析物検出複合体9を形成することができる。例えば、分析物リガンド8は、ナノポアタンパク質コンジュゲート1と、ナノポアタンパク質コンジュゲート1の分析物リガンド付着部位4、例えば、付着メンバー6を介して、連結され得る。ある特定の例的実施形態において、リンカーメンバー7は、分析物リガンド8をナノポアタンパク質コンジュゲート1の分析物付着部位4へ間接的に付着させるために用いることができる。
ば、リボヌクレアーゼ、S-ペプチド、およびリボヌクレアーゼS-タンパク質)、糖とボロン酸、および結合アッセイにおいて会合を可能にする親和性を有する類似した分子が挙げられる。
[0095]図3を参照して、ある特定の例的実施形態による、分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブリ10が提供される。ナノポアアセンブリ10は、典型的には、脂質膜11などの基質に埋め込まれた多量体タンパク質構造である。ナノポアアセンブリ10のタンパク質サブユニットの少なくとも1つが、本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート1を含む。本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート1を含むことにより、分析物リガンド8がナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着することができる。さらに、ナノポアタンパク質コンジュゲート1の使用と共に、ナノポアアセンブリ10のナノポアタンパク質サブユニットの少なくとも1つは、捕獲タグ5およびナノポア単量体2を含み、ナノポア単量体2は、他のナノポアサブユニットと相互作用して多量体ナノポアを形成する単量体サブユニットの部分である。例えば、捕獲タグ5は、ポアと相互作用するように利用可能であり、そのポアとの相互作用が、本明細書に記載されているような分析物の存在下で改変され得る。
ンパク質コンジュゲート1の分析物リガンド付着部位4は、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート1(および、したがって、単一の捕獲タグ5)を含むアルファ-ヘモリシン七量体について選択するために用いることができる。例えば、ナノポアタンパク質コンジュゲート1をアルファ-ヘモリシンタンパク質単量体と混合することが、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のナノポアタンパク質コンジュゲートを有する七量体を生じる。しかし、各七量体と会合した異なる数(0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個)のSpyTag配列のために、七量体は異なる電荷を有する。したがって、ある特定の例的実施形態において、七量体は、陽イオン交換クロマトグラフィでの溶出によるなど、当技術分野において公知の方法によって分離することができる。その後、溶出した画分は、どの画分が単一のSpyTagを有するアセンブリを含むかを決定するために調べることができる。PCT/EP2017/057433参照。
体あたり単一のポリメラーゼ/SpyCatcher融合タンパク質のみを結合する能力がある)かを決定するのに様々な方法が適し得るが、ある特定の例的実施形態において、異なる七量体画分は、SDS-PAGEによるなどの分子量に基づいて分離することがで
きる。その後、各画分と会合したSpyTagの存在を確認するために試薬が用いられ得る。例えば、参照により本明細書に明確に組み入れられている、PCT/EP2017/057433に記載されているように、SDS-PAGEによる分離前に、SpyCat
cher-GFP(緑色蛍光タンパク質)が画分に加えられ得る。
り少ないSpyTag)を有する七量体は、より多い数のナノポアタンパク質コンジュゲート(および、したがって、より多いSpyTag)を有する七量体より小さいため、単一のSpyTag、および、したがって、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート1を有する画分は、そのバンドに対応するSDS-PAGEゲルにおいて、最も遠いバンド泳動およびGFP蛍光の存在によって証明されるように、同定することができる。例えば、7個のアルファ-ヘモリシン単量体を含有する(しかし、ナノポアタンパク質コンジュゲートを含まない)画分は、最も遠くに泳動するが、その七量体に結合したSpyTagの非存在のためにSpyCatcher-GFPと混合した場合に蛍光を発しないと予想される。しかし、単一のSpyTagを含有する画分は、(他の蛍光バンドと比較して)その次に最も遠く泳動し、かつ蛍光を発し、それにより、単一のナノポアタンパク質コンジュゲート1(および、したがって、単一の捕獲タグ5)を含有する画分の同定を容易にする。PCT/EP2017/057433参照。追加の捕獲タグ5を有するナノポアセンブリが望まれ得る例的実施形態において、そのような泳動シフト分析が同様に、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個のナノポアタンパク質コンジュゲート1(および、したがって、0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の捕獲タグ5)を有するアルファ-ヘモリシンナノポア画分を同定するために用いることができる。
[00103]分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブリ10を調製するために(図3)
、分析物リガンド8をナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させる。ある特定の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート1が膜へ組み入れられる前に、分析物リガンド8を、ナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させることができる。他の例的実施形態において、ナノポアタンパク質コンジュゲート1が膜へ組み入れられた後に、分析物リガンド8をナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させることができる。例えば、ナノポアアセンブリ10が、OmpG単量体などの他の単量体とオリゴマー形成しないポリン単量体を含む場合、ナノポアタンパク質コンジュゲート1が脂質膜へ組み入れられる前に、またはナノポアタンパク質コンジュゲート1がその膜へ組み入れられた後に、分析物リガンド8を、OmpGナノポアタンパク質単量体2を含むナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させることができる。
である場合、ナノポアタンパク質コンジュゲート1が多量体ナノポアアセンブリ10へ組み入れられる前または後に、分析物リガンド8を、アルファ-ヘモリシンナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させることができる。例えば、アルファ-ヘモリシン七量体ナノポアは、アルファ-ヘモリシンナノポアタンパク質単量体2を有する単一のナノポアタンパク質コンジュゲート1を含むように、本明細書に記載されているようにアセンブルされ得る。その後、アルファ-ヘモリシン七量体ナノポアのアセンブリの後、そのナノポアアセンブリ10がアセンブルされた後、分析物リガンド8を、ナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させ、それにより、ナノポアの一部としての分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブリ10を形成することができる。他の例的実施形態において、アルファ-ヘモリシン七量体ナノポアアセンブリの形成前に、分析物リガンド8を、ナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させることができる。その後、アルファ-ヘモリシン分析物検出複合体9を、本明細書に記載されているような他のナノポアタンパク質単量体と混合して、アルファ-ヘモリシンナノポアアセンブリ10を形成することができる。
タンパク質コンジュゲート1(および、したがって、ナノポアアセンブリ10)に付着させることができる。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド8をナノポアタンパク質コンジュゲート1に付着させることは、一般的に、ナノポアタンパク質コンジュゲート1の分析物リガンド付着部位4としてリンカー配列またはリンカー分子を含むことを含む。その後、分析物リガンド8が、分析物リガンド付着部位4のリンカー配列への付着メンバー6の付着を介して、分析物リガンド付着部位4に付着することができる。例えば、付着メンバー6は、ナノポアタンパク質コンジュゲート1の分析物リガンド付着部位4に分析物リガンド8を連結するように、分析物リガンド付着部位4と結合し、または相互作用する配列または他の分子であり得る。
ジュゲート1に、任意の適切な化学作用(例えば、共有結合および/またはリンカー)を用いて、付着させることができる。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド8を、ナノポアタンパク質コンジュゲート1に、分子ステープルを用いて付着させる。ある
特定の例的実施形態において、分子ステープルは、3つのアミノ酸配列(リンカーA、B、およびCと表示される)を含む。リンカーAは、ナノポアタンパク質コンジュゲート1から、例えば、分析物リガンド付着部位4から伸び得る。リンカーBは、分析物リガンド8から、例えば、分析物リガンド8と会合した付着メンバー6から伸び得る。そして、リンカーCは、リンカーAとリンカーBを(例えば、リンカーAとリンカーBの両方に巻き付くことにより)結合し、それにしたがって、分析物リガンド8をナノポアタンパク質コンジュゲート1に連結することができる。リンカーCはまた、リンカーAまたはリンカーBの一部であるように構築することができ、したがって、リンカー分子の数が減らされる。
ペプチド結合を形成するSpyTag/SpyCatcher系が、ナノポアタンパク質コンジュゲート1を分析物リガンド8に連結するために用いることができる。例えば、Liら、J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309~17参照。例えば、分析物リガンド付着部位4としてSpyTagドメインを有するナノポアタンパク質コンジュゲート1が発現し得る。さらに、ナノポアタンパク質コンジュゲート1に連結されるべき分析物リガンド8は、付着メンバー6としてSpyCatcherドメインを含み得る。SpyTag/ナノポアタンパク質コンジュゲート1をSpyCatcher/分析物リガンド8と混合することにより、SpyTagおよびSpyCatcherタンパク質は相互作用して、共有結合性イソペプチド結合を介して分析物リガンド8に連結されているナノポアタンパク質コンジュゲート1を形成し、それにより、本明細書に記載されているような分析物検出複合体9を形成する。例えば、Liら、J Mol
Biol. 2014 Jan 23;426(2):309~17参照。
[00108]本明細書に記載されているような分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブ
リ10を用い、かつそれに頼ることにより、ある特定の例的実施形態において、流体溶液などの試料において分析物を検出するためのシステムおよび方法が提供される。分析物を検出するために、ある特定の例的実施形態において、分析物検出複合体10を含むナノポアアセンブリ10は、膜内に埋め込まれ、検知電極が、その膜に隣接して、またはその近くに位置づけられる。例えば、本明細書に記載されたナノポアアセンブリ10は、集積回路などの検知回路の検知電極に隣接して配置された膜内に形成されるか、またはそれ以外の方法で埋め込まれ得る。集積回路は、特定用途向け集積回路(ASIC)であり得る。ある特定の例的実施形態において、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体(CMOS)である。検知回路は、ナノポアを含むチップもしくは他のデバイスに、またはオフチップ構成としてなどチップもしくはデバイスから離れて、置くことができる。半導体は、任意の半導体であり得、それには、非限定的に、IV族(例えば、シリコン)およびIII-V族半導体(例えば、ガリウムヒ素)が挙げられる。本明細書に記載された組成物および方法にしたがって用いることができる装置およびデバイス設定について、例えば、WO2013/123450(その全内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている)を参照されたい。
プ)は、単一分子の電子的問い合わせ分析について用いることができる。ポアに基づいたセンサーは、検知電極に隣接してまたはその近くに配置される膜内に形成される本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリ10を含み得る。センサーは、例えば、対電極を含み得る。膜は、トランス側(すなわち、検知電極に対面する側)およびシス側(すなわち、対電極に対面する側)を含む。したがって、膜内に配置されるナノポアアセンブリもまた、トランス側(すなわち、検知電極に対面する側)およびシス側(すなわち、対電極に対面する側)を含み得る。分析物検出複合体9の分析物リガンド8は、例えば、膜
のシス側に位置する。
物は、捕獲タグ5のナノポアアセンブリ10による捕獲速度の測定および分析に依存する。捕獲事象は、全体として本明細書に組み入れられている、「Period-to-Period Analysis of AC Signals from Nanopore Sequencing」という名称である、WO/2017/220732に記載されているように、期間対期間(またはp2p)の差分法を用いて同定することができる。簡単に延べれば、捕獲事象は、ACサイクルの明期部分または暗期部分のいずれかのADCシグナルが、閾値p2p差分値より上である場合に検出される。時間の任意の所定のスライドウィンドウにおける捕獲事象の数が、捕獲速度を示す。捕獲タグが正味負電荷を有する場合、捕獲は、ACサイクルの明期部分にあり、一方、正味正電荷を有する捕獲タグは、ACサイクルの暗期部分で捕獲されると予想される。WO/2017/220732参照。
た分析物検出複合体9が膜内に配置された時点で(図3参照)、捕獲タグ5の第1の捕獲速度が検知電極によって決定され得る。第1の捕獲速度は、例えば、結合される分析物リガンド8単独の存在下での(すなわち、分析物リガンドと結合されることになっている分析物の存在なしでの)捕獲タグ5の捕獲速度に対応する。すなわち、本明細書で用いられる場合、第1の捕獲速度は、分析物リガンド8が結合親和性を有する任意の分析物を分析物リガンドが結合する前の、ナノポアアセンブリ10による捕獲タグ5の捕獲速度に対応する。したがって、第1の捕獲速度は、ナノポアアセンブリを含むチップが、分析物を含む試料と接触する前に決定され得る。他の例的実施形態において、第1の捕獲速度は、分析物が分析物検出複合体の分析物リガンド8から解離しているポアの状態を表す。いずれにしろ、第1の捕獲速度は、分析物リガンドが非結合状態である(すなわち、リガンドが結合していない)、分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブリ10を示し得る。
ノポアタンパク質コンジュゲート1、および、したがって、ナノポアアセンブリと結合しているという指標を提供するために、ベースライン捕獲速度から区別することができる。例えば、分析物リガンド8が、ナノポアの形成後、ナノポアタンパク質コンジュゲート1と連結される例的実施形態において、ナノポアの捕獲速度は、分析物リガンド8がナノポアタンパク質コンジュゲート1に連結される前に決定され得る。すなわち、ナノポアの捕獲速度は、分析物リガンド8の非存在下で決定され得る。その後、分析物リガンド8が、ナノポアタンパク質コンジュゲート1に連結されて、分析物検出複合体9を形成することができ、第1の捕獲速度がそのナノポアから決定され得る。
ようなナノポアタンパク質コンジュゲート1への分析物リガンド8の付着に関して、分析物リガンド8と捕獲タグ5との近接が、捕獲タグ5のナノポアとの相互作用を変化させると考えられる。例えば、分析物リガンド8が、捕獲タグ5のナノポアとの会合を立体的に邪魔し得る。したがって、ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド8の存在が、捕獲タグ5のナノポアアセンブリ10による捕獲速度を減少させ得る。ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド8の存在が、捕獲タグ5のナノポアアセンブリによる捕獲速度を増加させ得る。いずれにしろ、そのような捕獲速度の増加または減少が、例えば、第1の捕獲速度(すなわち、分析物リガンド8がナノポアタンパク質コンジュゲート1と結合している)をベースライン捕獲速度(分析物リガンドはナノポアタンパク質コンジュゲート1と結合していない)と比較することにより、決定することができる。例えば、ベースライン捕獲速度と第1の捕獲速度の間でのそのような捕獲速度の変化は、ある特定の例的実施形態において、分析物リガンド8が、ナノポアタンパク質コンジュゲート1と成功裏に結合しているという指標を提供し得る。
ド8が結合している)とベースライン捕獲速度(分析物リガンド8が付着しているが、分析物は結合していない)の差は、捕獲タグ5への干渉のレベルに基づいて非常に変動しやすいと考えられる。ある特定の例的実施形態において、第1の捕獲速度は、ベースライン捕獲速度より約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、200%大きいか、またはそれより大きくてもよい。ある特定の例的実施形態において、第1の捕獲速度は、ベースライン捕獲速度と比較して、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、もしくは200%減少しているか、またはそれより多く減少していてもよい。
検出複合体9を含有するチップを、標的分析物について試験される試料溶液などの流体溶液と接触させ得る。標的分析物の存在について流体溶液を試験するために、流体溶液を、ナノポアアセンブリ10を含むチップに渡って流し、それにより、ナノポアアセンブリ10を流体溶液と接触させることができる。例えば、ナノポアアセンブリ10は、本明細書に記載されているような少なくとも1つの分析物検出複合体9を含むように配置され、分析物検出複合体9の分析物リガンド8が標的分析物に対する結合親和性を有する。流体を、ナノポアに渡って流した場合、(存在する場合)標的分析物は、分析物リガンド8と相互作用することができ、それにより、分析物リガンド8を結合することができる。逆に、標的分析物が流体溶液に存在しない場合には、そのような分析物リガンド8との結合は起こり得ない。試験され得る流体溶液は、例えば、標的分析物を含む(または含む可能性がある)、本明細書に記載されているような任意の生物学的流体、流体試料、または他の試料を含み、またはそれからなり得る。
ンブリ10による第2の捕獲速度が決定され得る。その後、第2の捕獲速度は、分析物検出複合体9の分析物リガンド8が標的分析物と結合したかどうかという指標を提供し得る。したがって、第2の捕獲速度は、標的分析物が、試験された流体溶液に存在するかどうかという指標を提供し得る。例えば、標的分析物が分析物リガンド8と結合している場合、第2の捕獲速度は、第1の捕獲速度とは異なり得る。ある特定の例的実施形態において、分析物が分析物リガンド8と結合している場合、第2の捕獲速度は、第1の捕獲速度に対して増加し得る。他の例的実施形態において、標的分析物が分析物リガンド8と結合している場合、第2の捕獲速度は、第1の捕獲速度に対して減少し得る。いずれにしろ、第1の捕獲速度と比較した場合の、異なる第2の捕獲速度は、標的分析物がナノポアアセンブリ10の分析物リガンド8と結合している(および、したがって、標的分析物が流体溶液に存在する)という指標を提供し得る。
ド8との結合に関して、標的分析物/分析物リガンドの結合ペアと捕獲タグ5との近接が、捕獲タグ5のナノポアとの相互作用を変化させると考えられる。例えば、標的分析物/分析物リガンドの結合ペアは、捕獲タグ5のナノポアとの会合を立体的に邪魔し、それにより、(第1の捕獲速度に対して)減少した第2の捕獲速度を生じ得る。あるいは、やはり再び、いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ある特定の例的実施形態において、(結合ペアを形成し得る)標的分析物と分析物リガンド8の結合は、(結合した分析物がない)分析物リガンド8単独によって課せられる立体障害を低下させ、それにより、(第1の捕獲速度に対して)増加した第2の捕獲速度を生じ得る。したがって、第1の捕獲速度から第2の捕獲速度への捕獲速度の変化は、流体溶液において分析物を検出するために用いることができる。
し、かつ結合している)と第1の捕獲速度(分析物リガンド8が付着しているが、分析物は結合していない)の間の差は、捕獲タグ5への干渉のレベルに基づいて非常に変動しやすいと考えられる。ある特定の例的実施形態において、第2の捕獲速度は、第1の捕獲速度より約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、もしくは200%より大きいか、またはそれより大きくてもよい。ある特定の例的実施形態において、第2の捕獲速度は、第1の捕獲速度と比較して、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、105%、110%、115%、120%、125%、130%、135%、140%、145%、150%、155%、160%、165%、170%、175%、180%、185%、190%、195%、もしくは200%減少しているか、またはそれより多く減少していてもよい。
た分析物の特定の同一性が、分析物リガンド8の同一性に基づいて決定することができる。例えば、分析物リガンド8が、特定のペプチドへ方向づけられたナノボディであり、かつ第2の捕獲速度が、そのペプチドが、試験された試料に存在するという指標を提供したならば、試料に存在するペプチドの同一性が決定され得る。換言すれば、分析物を検出するために本明細書に記載されているように用いられる任意の公知の分析物リガンド8が、分析物の同一性を決定するために用いることができる。
、システム、および組成物は、様々な実践的適用に用いることができる。例えば、本明細書に記載された方法、システム、および組成物は、未知の分析物についての試料のスクリーニングを促進するために用いることができる。そのような例的実施形態において、分析物検出複合体9は、分析物リガンド8として公知の細胞受容体の結合ドメインを含むように構成することができる。ナノポアアセンブリ10を含むチップに適用される流体溶液は、例えば、その受容体の潜在的アゴニストまたはアンタゴニストなどの分析物を含有する画分の1つまたは複数を有する、複数の画分のうちの1つであり得る。本明細書に記載されているような各画分を試験することにより、分析物リガンド8(すなわち、受容体ドメイン)に対する分析物を含む画分が決定され得る。
びシステムは、単一のチップ上で、単一の流体試料における複数の異なる分析物の存在についてスクリーニングするために用いることができる。当業者が認識しているように、現在のチップテクノロジーは、単一チップ上の何十万個(またはそれより多く)ものナノポアの沈着を可能にする。したがって、本明細書に記載された方法および組成物を用いるこ
とにより、それぞれが分析物検出複合体を含む複数の異なるナノポアアセンブリ10は、複数の異なる分析物について流体試料を試験するために同じチップ上で用いることができる。例えば、ナノポアアセンブリ10の個々のセットが、各セットが異なる分析物を検出するように配置されて、本明細書に記載されているようにアセンブルされ得る。
、分析物Aに対する分析物リガンド8を含み得、一方、ナノポアアセンブリ10の別のセットは、分析物Bに対する分析物リガンド8を含み得る。分析物C、D、E、Fなどに対して方向づけられたものなど、複数の他のナノポアアセンブリ10が、同様に、同じチップ上に配置され得、その結果、チップは、複数の異なる分析物を検出することができる。ある特定の例的実施形態において、ベースライン捕獲速度は、各ナノポアアセンブリについて決定され得、ベースライン捕獲速度は、分析物リガンド8が本明細書に記載されているようなナノポアタンパク質コンジュゲート1と連結されているという指標を提供するために、本明細書に記載されているように第1の捕獲速度と比較することができる。
ようなチップ(および、したがって、複数の異なるナノポアアセンブリ)と接触させることができる。その後、ナノポアアセンブリ10のそれぞれについて、第2の捕獲速度が、本明細書に記載されているように、決定され、第1の捕獲速度と比較され、それにしたがって、ナノポアアセンブリ10の各異なるセットについての異なる分析物リガンドの検出を可能にすることができる。その後、各ポアについて、第2の捕獲速度は、それに対して、そのポアの分析物リガンド8が方向づけられている標的分析物が試料に存在するかどうかという指標を提供することができる。したがって、複数のポアは、複数の異なる分析物を検出するために用いることができる。
術を用いることができ、かつ利用可能である。例えば、ナノポアアセンブリの異なる群に異なる捕獲タグ5を用いることができ、その結果、異なるベースライン捕獲速度が、異なるナノポアアセンブリ10を同定するために用いることができる。例えば、公知のベースライン捕獲速度を有する捕獲タグ5は、分析物Aに方向づけられたナノポアアセンブリ10の1つのセットに関して用いることができ、一方、異なるベースライン捕獲速度を有する異なる捕獲タグ5が、分析物Bに方向づけられたナノポアアセンブリ10のセットと共に用いることができる。その後、その2つの異なるナノポア集団は、異なるベースライン捕獲速度によって区別することができる。
るポアなどの異なるポアタイプを用いることができ、当技術分野において公知の技術に基づいて容易に区別することができる。そのような構成に関して、例えば、より大きい開口を有するナノポアは、より小さい開口を有するポアより大きい電流シグナルを与え、それにしたがって、同じチップ上でのポアの区別を可能にすることができる。その後、異なるポアは、それらが検出するように構成されている分析物と相互に関連付けられ、それにしたがって、同じチップ上で異なる分析物の同定を可能にすることができる。区別の他の方法には、捕獲タグの遮断レベル、本明細書に記載されているような分析物の非存在下での捕獲タグ捕獲の速度、およびナノポアの電流-電圧プロファイルが挙げられる。
トランス側に位置し、それにより、異なるポアのセットを同じチップ上で区別することができるという追加の方法を提供することができる。そのような例において、第2の捕獲タグが、ナノポアのトランス側に付着して、ACサイクルの暗期中に遮断を生じ得る。これらの暗期側捕獲もまた、捕獲の速度および捕獲タグのレベルによりお互いから区別され得
る。WO/2017/220732参照。
1の捕獲速度、および第2の捕獲速度と関連しているナノポアアセンブリの様々な状態を示すイラストである。図4Aに示されているように、ナノポアアセンブリは、捕獲タグ(すなわち、図示されているようなペプチドタグ5)と共に、(図1に示されているような)ナノポアタンパク質コンジュゲート1を含む。点線は、ペプチドタグとナノポアのポアとの相互作用を図示し、その相互作用は、結果として、検出可能なベースライン捕獲速度を生じる。示されているように、分析物リガンド(例えば、ナノボディ)は、ナノポアアセンブリにまだ連結されていない(図4A)。図4Bに示されているように、ナノポアアセンブリは、(図1に記載されているような)ナノポアタンパク質コンジュゲート1を、付着したナノボディ8と共に含む。したがって、ナノポアアセンブリは、本明細書に記載されているような分析物検出複合体を含む。捕獲タグ(すなわち、ペプチドタグ5)もまた示され、点線が捕獲タグのナノポアとの相互作用を示し、その相互作用の結果として、検出可能な第1の捕獲速度を生じる(図4B)。図4Cに示されているように、分析物(例えば、抗原)が、分析物検出複合体の分析物リガンド(例えば、ナノボディ8)とここで、結合しており、その結果として、捕獲タグの検出可能な第2の捕獲速度(図示されているように、ペプチドタグの捕獲)を生じる。
[00128]分析物を検出および同定することに加えて、本明細書に記載された方法、シス
テム、および組成物は、流体溶液中の分析物の濃度を決定するために用いることができる。例えば、第1の捕獲速度および第2の捕獲速度は、それぞれ、非結合状態から分析物が結合した状態へ遷移する所定のナノポアに対応するため、第1の捕獲速度から第2の捕獲速度へ、そして、第1の捕獲速度へ戻る、捕獲速度の変化は、分析物リガンドと分析物の間での会合/解離速度を決定するために用いることができる。その後、分析物リガンドと分析物の間の公知の結合特性に加えて、会合/解離速度が、試料中の分析物についての濃度情報を決定するために、公知の速度論的方法と共に用いることができる。
在を検出するための方法を実施することができ、分析物/リガンドのペアの間での会合/解離速度が、第1および第2の捕獲速度遷移から決定される。例えば、本明細書に記載されているような分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブリ10は、チップの膜内に配置される。その後、1つまたは複数の検知電極が、分析物検出複合体9を含むナノポアアセンブリ10の近くに置かれる。その後、第1の捕獲速度が、本明細書に記載されているようなナノポアアセンブリ10について決定され、その第1の捕獲速度が、結合した分析物の非存在下で分析物リガンド8がナノポアアセンブリ10のナノポアタンパク質コンジュゲート1と結合しているポア状態に対応する。
リ10)を、分析物リガンドを含む試料などの流体試料と接触させ、捕獲速度を連続的にモニターすることができる。ナノポアアセンブリ10を分析物と接触させることは、分析物の分析物リガンド8との結合を可能にし、したがって、本明細書に記載されているような第1の捕獲速度から第2の捕獲速度への遷移の同定を可能にする。例えば、第2の捕獲速度は、分析物がここで、本明細書に記載されているような分析物リガンドと結合しているポア状態に対応する。
的測定により、第2の遷移、すなわち、第2の捕獲速度が遷移して、第1の捕獲速度(またはおよそそれくらい)へ戻る時点の同定が可能になる。すなわち、捕獲速度の連続的測
定を用いて、第1の捕獲速度(またはおよそそれくらい)への復帰を同定することができ、第1の捕獲速度への復帰は、分析物と分析物リガンド8が結合しなくなったポア状態に対応する。換言すれば、第2の捕獲速度から第1の捕獲速度(またはおよそそれくらい)へ戻る第2の遷移は、分析物-リガンド結合ペアの解離に対応する。
態で費やされる時間は、第1の遷移と第2の遷移の間の時間間隔を測定することにより決定することができる。同様に、ある特定の例的実施形態において、分析物-リガンドのペアが非結合状態で費やす時間は、分析物の存在下で第1の捕獲速度から第2の捕獲速度へ戻る遷移の長さを測定することにより決定することができる。その後、結合反応についての分析物と分析物リガンド8の間の会合/解離速度は、同定された捕獲速度遷移から、特に、ナノポアが結合状態にある時間の長さ対非結合状態である時間の長さから、決定することができる。例えば、会合速度(Ka)を決定するために、所定の結合反応についての個々の捕獲間の時間が記録されて、その結合反応を表現する方程式に適合され得る。方程式は、例えば、分析物と分析物リガンド8の間の結合機構(例えば、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-DNA相互作用、DNA-DNA相互作用、アプタマー-DNA相互作用、タンパク質-化学物質など)に依存して、単一指数方程式または別の型の方程式であり得る。結合反応についての解離速度(Kd)を決定するために、結合ドウェル時間および各結合事象の持続時間が収集され、記録され、解離反応を表現する方程式に適合される。これは、結合反応に関連した解離機構に依存して、単一指数方程式または別の型の方程式であり得る。
らば、KaおよびKdは、公知の速度論的方法および原理に沿って、分析物の濃度を逆算するために用いることができる。例えば、チップのナノポア濃度、抗原-リガンド(すなわち、分析物-ポア)濃度、およびKa/Kdがわかっている場合、分析物の濃度は、以下の速度論的方程式から容易に決定することができる:
ポアアセンブリは、(分析物検出と濃度決定の両方についての)本明細書に記載された方法およびシステムと適合し得る他の構成をもつことができる。例えば、ある特定の例的実施形態において、本明細書に記載された捕獲タグは、分析物リガンドと直接的または間接的に付着することができる。そのような実施形態において、ナノポアアセンブリは、コンジュゲートタンパク質が、ナノポアタンパク質単量体および分析物リガンド付着部位を含むナノポアタンパク質コンジュゲートを含むように構成することができる。その後、捕獲タグを含む分析物リガンドを、分析物リガンド付着部位と付着させ、それにより、捕獲タグが、ナノポアタンパク質コンジュゲートよりむしろ、分析物リガンドと直接的または間
接的に付着している分析物検出複合体を形成することができる。ある特定の例的実施形態において、捕獲タグを有する分析物リガンドを、ナノポアが脂質膜内に形成された後、コンジュゲートタンパク質の分析物リガンド付着部位と付着させることができる。他の例的実施形態において、捕獲タグを有する分析物リガンドを、その複合体が脂質膜へ組み入れられる前に、コンジュゲートタンパク質の付着部位と連結させることができる。
ナノポアタンパク質コンジュゲートを、分析物リガンドを含む少なくとも1個の他のナノポア単量体と組み合わせることができる。例えば、アルファ-ヘモリシンナノポアは、その1つの成分が捕獲タグを含むナノポアコンジュゲートであり、その他の6個のアルファ-ヘモリシン単量体のうちの1個が分析物リガンドを含むように形成することができる。したがって、アルファ-ヘモリシンナノポアアセンブリは、単一の捕獲タグおよび単一の分析物リガンドを有する1:6七量体である。他の例的実施形態において、分析物リガンドを、七量体のアルファ-ヘモリシン単量体のうちの1個、2個、3個、4個、5個、または6個と付着させることができ、その残りのアルファ-ヘモリシン単量体が捕獲タグを含む。他の例的実施形態において、捕獲タグを、複数のアルファ-ヘモリシン単量体上に置くことができ、七量体の単量体の他の1個または複数が分析物リガンドを含む。そのようなナノポアは、例えば、本明細書に記載されているように、移動シフト分析を用いて、同定することができる。
れている本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。添付の図は、本発明の明細および記載の不可欠な部分として考慮されるよう意図される。引用された全ての参考文献は、本明細書に記載されている全てのために、参照により本明細書に具体的に組み入れられている。以下の実施例は、例証するために提供されるが、特許請求されている発明を限定するためではない。
ル濃度);μM(マイクロモル濃度);N(正常);mol(モル);mmol(ミリモル);μmol(マイクロモル);nmol(ナノモル);g(グラム);mg(ミリグラム);kg(キログラム);μg(マイクログラム);L(リットル);ml(ミリリットル);μl(マイクロリットル);cm(センチメートル);mm(ミリメートル);μm(マイクロメートル);nm(ナノメートル);℃(摂氏度);h(時間);min(分);sec(秒);msec(ミリ秒)。
タンパク質発現および回収
[00138]この実施例は、細菌宿主細胞、例えば、大腸菌(E.coli)からのタンパ
ク質の発現および回収を例証する。より具体的には、この実施例は、α-HLナノポアタンパク質コンジュゲート(α-HLサブユニット/SpyTag/捕獲タグ配列、配列番号4)、α-HLサブユニットバリアント(配列番号5)、SpyCatcher配列を有するGFP分析物リガンド(配列番号9)、およびGFP分析物(配列番号10)の発現および回収を記述する。
[00139]α-HLサブユニット/SpyTag/捕獲タグタンパク質(配列番号4)を
、ナノポアタンパク質コンジュゲートとして調製し、そのコンジュゲートの捕獲タグドメインが配列番号8として示される配列に対応し、そのコンジュゲートのα-HL単量体が配列番号16に対応する。α-HLサブユニット/SpyTag/捕獲タグタンパク質(
配列番号4)を調製するために、α-HLサブユニット/SpyTag/捕獲タグタンパク質配列(配列番号4)をコードする遺伝子を、商業的DNA合成により合成し、標準DNA制限酵素消化およびライゲーションを用いてpET26bベクターへ挿入した。プラスミドDNAを、標準熱ショックプロトコールを用いてBL21(DE3)大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したLB寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したLB培地の5ml培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導MagicMedia(Invitrogen)において増殖し、25℃で16~24時間、増殖させておいた。2,200xgで15分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで-80℃で凍結させた。
レットを解凍し、1グラムの細胞ペレットあたり5mLの溶解バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、300mM NaCl、100mM KPO4、10mM イミダゾール)中に可溶化し、EDTAを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびDNase1(Sigma-Aldrich商標)を追加した。細胞を、90%最大パワーに設定されたチップソニケーター(Fisher Scientific商標)を用い、1秒間のオン、4秒間のオフで2分間、パルスして、溶解した。細胞片を、20,000xgで45分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、2カラム体積の溶解バッファー、2カラム体積の洗浄バッファー(50mM
Tris-HCl、pH 8.0、500mM NaCl、10mM イミダゾール)、10カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、1M NaCl、10mM イミダゾール)、2カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、150mM イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。
[00141]α-HLサブユニットバリアント(配列番号5)は、(実施例2に記載されて
いるような)1:6α-HL七量体を形成するための6個の成分として用いられる。簡単に述べれば、α-HLサブユニットバリアント(配列番号5)を調製するために、配列番号5に表記されたα-HLバリアントタンパク質サブユニットをコードする遺伝子を、商業的DNA合成により合成し、標準DNA制限酵素消化およびライゲーションを用いてpET26bベクターへ挿入した。プラスミドDNAを、標準熱ショックプロトコールを用いてBL21(DE3)大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したLB寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したLB培地の5ml培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導MagicMedia(Invitrogen)において増殖し、25℃で16~24時間、増殖させておいた。2,200xgで15分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで-80℃で凍結させた。
細胞ペレットあたり5mLの溶解バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、300mM NaCl、100mM KPO4、10mM イミダゾール)中に可溶化し、EDTAを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびDNase1(Sigma-Aldrich商標)を追加した。細胞を、90%最大パワーに設定されたチップソニケーター(Fisher Scientific商標)を用い、1秒間のオン、4秒間のオフで2分間、パルスして、溶解した。細胞片を、20,000xgで45分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、2カラム体積の溶解バッファー、2カラム体積の洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、500mM NaCl、10mM イミダゾール)、10カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、1M NaCl、10mM イミダゾール)、2カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、150mM イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。
[00143]GFP分析物リガンドは、分析物検出複合体の分析物リガンドが抗GFPであ
る、分析物検出複合体を形成するために用いられる。GFP分析物リガンドを調製するために、GFP分析物リガンド/SpyCatcher融合タンパク質(配列番号9)をコードする遺伝子を、商業的DNA合成により合成し、標準DNA制限酵素消化およびライゲーションを用いてpET26bベクターへ挿入した。プラスミドDNAを、標準熱ショックプロトコールを用いてBL21(DE3)大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したLB寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したLB培地の5ml培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導MagicMedia(Invitrogen)において増殖し、25℃で16~24時間、増殖させておいた。2,200xgで15分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで-80℃で凍結させた。
現後、ペレットを解凍し、1グラムの細胞ペレットあたり5mLの溶解バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、300mM NaCl、100mM KPO4、10mM イミダゾール)中に可溶化し、EDTAを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびDNase1(Sigma-Aldrich商標)を追加した。細胞を、90%最大パワーに設定されたチップソニケーター(Fisher Scientific商標)を用い、1秒間のオン、4秒間のオフで2分間、パルスして、溶解した。細胞片を、20,000xgで45分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、2カラム体積の溶解バッファー、2カラム体積の洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、500mM NaCl、10mM イミダゾール)、10カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、1M NaCl、10mM イミダゾール)、2カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、150mM イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。
[00145]GFP分析物(配列番号10)は、分析物検出複合体を含むα-HLナノポア
の活性を実証するために分析物検出複合体と共に用いられる(実施例3参照)。GFP分析物(配列番号10)を調製するために、配列番号10に表記されたGFP分析物をコードする遺伝子を、商業的DNA合成により合成し、標準DNA制限酵素消化およびライゲーションを用いてpET26bベクターへ挿入した。プラスミドDNAを、標準熱ショックプロトコールを用いてBL21(DE3)大腸菌コンピテント細胞へ形質転換し、カナマイシンを追加したLB寒天プレート上で増殖した。細菌コロニーを選択し、シーケンシングして、遺伝子の完全性を検証した。グリセロールストックから細菌培養を開始し、適切な抗生物質を追加したLB培地の5ml培養物において一晩、増殖した。その後、これらの培養物を、抗生物質を追加した自己誘導MagicMedia(Invitrogen)において増殖し、25℃で16~24時間、増殖させておいた。2,200xgで15分間の遠心分離を用いて細胞ペレットを採取し、さらなる使用まで-80℃で凍結させた。
ペレットあたり5mLの溶解バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、300mM NaCl、100mM KPO4、10mM イミダゾール)中に可溶化し、EDTAを含まないプロテアーゼインヒビター錠剤およびDNase1(Sigma-Aldrich商標)を追加した。細胞を、90%最大パワーに設定されたチップソニケーター(Fisher Scientific商標)を用い、1秒間のオン、4秒間のオフで2分間、パルスして、溶解した。細胞片を、20,000xgで45分間の遠心分離を用いて除去した。上清を、コバルトアフィニティカラムへ適用し、2カラム体積の溶解バッファー、2カラム体積の洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、500mM NaCl、10mM イミダゾール)、10カラム体積の高塩濃度洗浄バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、1M NaCl、10mM イミダゾール)、2カラム体積の洗浄バッファーで洗浄し、150mM イミダゾールを追加した洗浄バッファーを用いて溶出した。タンパク質を分注し、使用直前まで-80℃で保存した。
分析物検出複合体を含むナノポアのアセンブリ
[00147]この実施例は、6個のα-HLバリアント単量体サブユニット(配列番号5)
ならびに捕獲タグ配列およびSpyTag配列を含む1個のα-HLサブユニット(配列番号4)を有する七量体ナノポアのアセンブリであって、GFP分析物リガンド(配列番号9)が単一のα-HLサブユニット(配列番号4)とSpyTag-SpyCatcher結合を介して付着して、分析物検出複合体を形成する、七量体ナノポアのアセンブリを記載する。SpyTag-SpyCatcher結合は、例えば、Liら、J Mol
Biol. 2014 Jan 23;426(2):309~17に記載されている。
[00148]1個のα-HL/SpyTag(配列番号4)および6個のα-HLバリアン
トタンパク質(配列番号5)を含むα-HL七量体ナノポアアセンブリ(すなわち、1:6七量体比)は、一般的に、PCT/EP2017/057433に記載されているように調製することができる。簡単に述べれば、およそ20mgの総タンパク質を用いて、望ましいα-HLバリアントタンパク質(配列番号5)溶液に対してα-HL/SpyTag(配列番号4)を1:9比で一緒に混合して、七量体の混合物を形成した。そのような混合物は、様々な比(すなわち、0:7、1:6、2:5、3:4など)のα-HL/SpyTag(配列番号4)とα-HLバリアントタンパク質(配列番号5)を含む様々な画分を生じ、α-HL/SpyTag(配列番号4)成分は、七量体の0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の単量体サブユニットとして存在することが予想される。
is、200mM NaCl、pH 8かまたは150mM KCl、30mM HEPES、pH 7.5のいずれかに50mg/mlの最終濃度へと可溶化し、α-HL単量体の混合物を5mg/mlの最終濃度へと加えた。α-HL単量体の混合物を37℃で少なくとも60分間、インキュベートした。その後、n-オクチル-β-D-グルコピラノシド(βOG)を、5%(重量/体積)の最終濃度へと加えて、生じた脂質-タンパク質混合物を可溶化した。その試料を透明なタンパク質凝集物および使い残しの脂質複合体へと遠心分離し、上清をさらなる精製のために収集した。
各画分について、2つの試料をSDS-PAGE用に調製した。第1の試料は、15uL
のα-HL溶出液のみを含み、第2の試料を、3ugのGFP-SpyCatcher(
配列番号10)と組み合わせた。その後、試料を、室温で1~16時間、インキュベートした(および遮光した)。インキュベーション後、5uLの4×Laemmli SDS-PAGEバッファー(Bio-Rad商標)を各試料に加えた。その後、試料およびPrecisionPlus(商標)Stain-Freeタンパク質ラダーを4~20%
Mini-PROTEAN Stain-Free protein precast
gel(Bio-Rad)上へ負荷した。そのゲルを200mVで30分間、流した。その後、ゲルをStain-Freeフィルターを用いて画像化した。
)へのGFP-SpyCatcher(配列番号10)の付着は、SDS-PAGE中の
分子量バンドシフトによって観察することができ、したがって、1:6七量体画分の同定を容易にする。すなわち、単一のSpyTagを含有する七量体は、単一のGFP-SpyCatcher(配列番号10)分子を結合し、それにしたがって、単一のGFP-SpyCatcher(配列番号10)分子の分子量を加えた七量体ポアの分子量に対応するシフトを生じると予想され、一方、2個以上のSpyTagを有する七量体は、それに応じて、より大きい分子量シフトを生じるはずである。それゆえに、上記の七量体α-HL精製中に陽イオン交換カラムから溶出されたピークは、α-HLバリアントに対するα-HL/SpyTagの比について分析することができる。加えて、GFP-SpyCatcher(配列番号10)付着の存在は、SDS-PAGEゲルを画像化した場合にG
FP蛍光フィルターを用いて観察することができる。PCT/EP2017/057433参照。
(配列番号10)の単一の付加、および、したがって、1成分のナノポアタンパク質コンジュゲート(配列番号4)対6個のα-HLバリアント(配列番号5)に対応する画分を、分子量標準タンパク質ラダーを用いて決定した。Bio-Radの染色なし画像化システムを用いて、分子量シフトを決定した。GFP蛍光の存在を、青色フィルターを用いて決定した。蛍光の存在を用いて、SpyTagタンパク質の存在を確認した。PCT/EP2017/057433参照。その後、1:6比、すなわち、1個のα-HL/SpyTag(配列番号4)対6個のα-HLバリアント(配列番号5)に対応する溶出画分をさらなる実験に用いた。
[00153]その後、上記からの1:6七量体画分を用いて、GFP分析物リガンド(配列
番号9)(すなわち、SpyCatcher配列を含む抗GFPナノボディ)を、1:6七量体の1個のα-HL/SpyTag/捕獲タグ(配列番号4)成分に、SpyTag/SpyCatcherシステムを用いて付着させ(Liら、J Mol Biol. 2014 Jan 23;426(2):309~17参照)、それにより、ナノポアアセンブリ内に分析物検出複合体を形成した。簡単に述べれば、粘着性GFP分析物リガンド(配列番号9)を1:6七量体の1個のα-HL/SpyTag/捕獲タグ(配列番号4)成分に付着させるために、粘着性GFP分析物リガンド(配列番号9)を1:6七量体複合体(上記参照)と4℃で一晩、混合した。その混合物をサイズ排除クロマトグラフィカラムに適用することにより、付着していないGFP分析物リガンド(配列番号9)をその複合体から分離した。その複合体を含有する生じた画分を分注し、使用前に-80℃で保存した。その後、α-HL/SpyTag/捕獲タグ(配列番号4)に付着したGFP分析物リガンド(配列番号9)が、ナノポアアセンブリの分析物検出複合体を形成している、GFP分析物リガンドを含む七量体を次の実験に用いた。
捕獲速度決定および分析
[00154]この実施例は、付着した分析物リガンドを含まない、分析物リガンドが付着し
ている(すなわち、上記の実施例2に記載されたナノポア)、およびGFP分析物(配列番号10)の存在下での、ナノポアアセンブリについての捕獲速度決定および分析を示す。
tems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer」である、米国特許出願公開第2017/0322195号に記載されているように、分析物リガンドが付着していない、1:6アルファ-ヘモリシン七量体を調製し、チップ上に配置した。
すなわち、GFP分析物リガンドがポアと結合していない、GFP分析物リガンドがポアと結合している、およびGFP分析物の存在下)での捕獲タグの捕獲速度を評価した。簡単に述べれば、捕獲速度分析方法は、WO/2017/220732に詳細に記載されている、期間対期間の差による方法に基づいている。捕獲速度は、まず、ポアによる全てのタグ捕獲事象を検出することにより測定することができる。捕獲事象は、1つの期間によって右にシフトしたシグナルを最初のシグナルから引き算することにより、シグナルにおいて検出される。シグナル差は、ADCノイズ閾値より下の差の値をゼロに設定することによりさらに処理される。捕獲事象のそれぞれのタイムスタンプが記録される。
ある。例えば、図5A~5Cにおける各点は、事象の測定されたタイムスタンプに対する捕獲事象数を表す。捕獲速度は、全事象のプロットの傾きの逆数である。より具体的には、図5Aは、GFP分析物リガンドの非存在下(すなわち、リガンドが結合していない)、単一の全体的な傾きを有するタグ捕獲についてのベースライン捕獲速度を示す。図5Bに示されるデータについて、GFP分析物リガンドが、上記の実施例2に記載されているように、ナノポアに付着しており、第1の捕獲速度が決定された。図5Bに示されているように、第1の捕獲速度は、GFP分析物リガンドがナノポアに付着した場合、ベースライン捕獲速度(図5A)と比較して低下した。
GFP分析物リガンドの結合に対応する第2の捕獲速度が、図5Cに示されているように、決定された。簡単に述べれば、27μLのGFP分析物(配列番号10)をチップに加え、それにしたがって、GFP分析物(配列番号10)とナノポアのGFP分析物リガンドとの間の結合を促進した。図5Cに示されているように、第2の捕獲速度は、第1の捕獲速度より低い。さらに、GFP分析物リガンドがGFP分析物に付着してから(約300秒時点)、その後、解離するまで(800秒時点の前)の遷移を観察することができる(図5C)。第1の捕獲速度とは異なる第2の捕獲速度の同定(図5C)に基づいて、チップ上のGFP分析物(配列番号10)の存在を確認することができる。
下線=可動性リンカー;イタリック体=Hisタグ;GSGG(配列番号14)=第2のリンカー;太字/下線=SpyTag;太字のみ=ペプチドに基づいたナノタグ
AHIVMVDAYKPTKK
GGSSGGSSGG
EKEKEKGS
GSGG
GSGSGS
EPPP
Claims (20)
- ナノポアタンパク質単量体および捕獲タグを含むナノポアタンパク質コンジュゲート、ならびに前記ナノポアタンパク質コンジュゲートと連結している分析物リガンドを含む、分析物検出複合体であって、
捕獲タグが、配列番号8(捕獲タグ配列)として示される配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり、
ナノポアタンパク質コンジュゲートのナノポアタンパク質単量体が、配列番号16(α-HL)または配列番号6(OMPG)として示される配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ナノポアタンパク質単量体と捕獲タグとの間に位置する分析物リガンド付着部位を介して、前記ナノポアタンパク質単量体および前記捕獲タグが連結しており、
前記分析物リガンド付着部位を介して、分析物リガンドがナノポアタンパク質コンジュゲートに結合している、
前記分析物検出複合体。 - 捕獲タグが、配列番号8(捕獲タグ配列)として示される配列と少なくとも95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の分析物検出複合体。
- ナノポアタンパク質コンジュゲートのナノポアタンパク質単量体が、配列番号16(α-HL)または配列番号6(OMPG)として示される配列と少なくとも95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の分析物検出複合体。
- ナノポアタンパク質コンジュゲートのナノポアタンパク質単量体が、アルファ-ヘモリシン単量体を含み、捕獲タグが、配列番号8(捕獲タグ配列)として示される配列と少なくとも95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の分析物検出複合体。
- ナノポアタンパク質コンジュゲートが、配列番号4または配列番号7として示される配列と少なくとも95%、98%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の分析物検出複合体。
- 分析物リガンド付着部位が、配列番号11として示される配列と少なくとも90%、95%、またはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の分析物検出複合体。
- 分析物リガンドがナノボディである、請求項1~6のいずれか1項に記載の分析物検出複合体。
- 分析物リガンドがナノポアタンパク質コンジュゲートとイソペプチド結合を介して連結している、請求項1~7のいずれか1項に記載の分析物検出複合体。
- イソペプチド結合がSpyTag/SpyCatcher結合である、請求項8に記載の分析物検出複合体。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の少なくとも1つの分析物検出複合体を含むナノポアアセンブリ。
- ナノポアアセンブリが七量体ナノポアアセンブリであり、前記七量体ナノポアアセンブリの各単量体がアルファ-ヘモリシン単量体を含む、請求項10に記載のナノポアアセンブリ。
- 流体溶液において分析物を検出するための方法であって、
請求項10または11に記載のナノポアアセンブリを含むチップを供給するステップであって、前記ナノポアアセンブリが膜内に配置されている、前記ステップ;
検知電極を前記膜に隣接してまたはその近くに位置づけるステップ;
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリの捕獲タグの第1の捕獲速度を決定するステップ;
ナノポアアセンブリを分析物と接触させるステップであって、前記分析物が、分析物検出複合体の分析物リガンドに対する結合親和性を含む、前記ステップ;ならびに
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリと会合した捕獲タグの第2の捕獲速度を決定するステップであって、前記第2の捕獲速度が、前記分析物が分析物検出複合体の分析物リガンドと結合しており、それにより、流体溶液中に存在するという指標を提供する、前記ステップ;
を含む、前記方法。 - 第2の捕獲速度が第1の捕獲速度より高いかまたは低い、請求項12に記載の方法。
- 分析物リガンドの同一性に基づいて、および分析物が分析物リガンドと結合しているという指標に基づいて、分析物を同定するステップをさらに含む、請求項12または13に記載の方法。
- 流体溶液中の分析物の濃度を決定するための方法であって、
請求項10または11に記載のナノポアアセンブリを含むチップを供給するステップであって、前記ナノポアアセンブリが膜内に配置されている、前記ステップ;
検知電極を前記膜に隣接してまたはその近くに位置づけるステップ;
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、ナノポアアセンブリの捕獲タグの第1の捕獲速度を決定するステップ、ここで、第1の捕獲速度は、結合される分析物リガンドの存在下で、かつ分析物リガンドと結合される分析物の非存在下で決定される;
ナノポアアセンブリを分析物と接触させるステップであって、前記分析物が、分析物検出複合体の分析物リガンドに対する結合親和性を含む、前記ステップ;
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、分析物検出複合体の捕獲タグの第1の捕獲速度から第2の捕獲速度への第1の遷移を同定するステップ、ここで、第2の捕獲速度は、結合された分析物リガンドの存在下で、かつ結合した分析物の存在下で決定される;
コンピュータープロセッサーおよび検知電極を活用して、第2の捕獲速度からおよそ第1の捕獲速度への第2の遷移を同定するステップ;ならびに
第1の遷移および第2の遷移の同定に少なくとも部分的に基づいて、流体溶液中の分析物の濃度を決定するステップ;
を含む、前記方法。 - 第2の捕獲速度が第1の捕獲速度より高いかまたは低い、請求項15に記載の方法。
- 流体溶液中の分析物の濃度を決定することが、第1の遷移と第2の遷移との間の時間間隔を測定するステップをさらに含む、請求項15または16に記載の方法。
- 流体溶液中の分析物の濃度を決定することが、分析物と、ナノポアアセンブリの分析物検出複合体の分析物リガンドとの間の会合速度を決定するステップをさらに含む、請求項15~17のいずれか一項に記載の方法。
- 流体溶液中の分析物の濃度を決定するためのシステムであって、
請求項10または11に記載のナノポアアセンブリを含むチップであって、前記ナノポアアセンブリが前記チップの膜内に配置されており、前記ナノポアアセンブリの少なくとも1個のナノポアタンパク質単量体が捕獲タグおよび分析物リガンドを含む、前記チップ;
前記膜に隣接してまたはその近くに位置づけられた検知電極であって、ナノポアアセンブリからのシグナルを検出するように構成されている、検知電極;および
コンピュータープロセッサーであって、前記コンピュータープロセッサーおよび検知電極が、ナノポアアセンブリに関連した第1の遷移および第2の遷移を同定するように構成されており、前記第1の遷移が、分析物の分析物リガンドとの結合に対応し、前記第2の遷移が、分析物の分析物リガンドからの解離に対応する、前記コンピュータープロセッサー;
を含む、
前記システム。 - 流体溶液中の分析物の濃度が、同定された第1の遷移および同定された第2の遷移に少なくとも部分的に基づいて決定される、請求項19に記載のシステム。
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