JP7405736B2 - ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤に関し、詳しくは、ウロリチン類を含有する、造血幹細胞の破骨細胞への分化抑制剤に関する。

骨組織では、破骨細胞によって古い骨が壊され（骨吸収）、骨芽細胞によって新しい骨が作られる（骨形成）という骨代謝が絶えず行われ、この骨代謝によって骨の強度や血中カルシウム濃度が調整されている。この骨吸収と骨形成のバランスが崩れて正常な骨代謝が行われなくなると、骨粗しょう症や骨転移等の骨疾患が引き起こされる。骨の再構築（リモデリング）において骨代謝の亢進、低下あるいは正常のいずれにおいても、骨吸収が相対的に骨形成を上回る病態では骨量は減少する。例えば、骨粗しょう症では、骨吸収亢進型と骨形成抑制型があり、骨粗しょう症の８割を占める閉経後の女性の病態は骨吸収亢進型である。また、がん細胞の骨転移でも、がん細胞の産生する因子によって破骨細胞による骨吸収が亢進し、骨はがん細胞に増殖場所を提供することになる。

このような骨代謝の異常を予防又は改善するために、骨形成を促進する薬剤や骨吸収を抑制する薬剤等について、これまでに種々研究されている。骨代謝に寄与する成分の一つとしてフコイダンやコンドロイチン硫酸等の酸性多糖が知られている。例えば、軟骨に多い成分であるコンドロイチン硫酸－Ｅが、所定の細胞から破骨細胞への分化を抑制することが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、自然界で極僅かしか採取できない希少品であるため、大量に調製することが困難である。
また、フコイダンが、所定の細胞から破骨細胞への分化を抑制し得ることが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、フコイダンは、褐藻にしか含まれておらず、調製が困難である。

一方、ウロリチンと呼ばれるポリフェノールが存在する。ウロリチンＡに代表されるウロリチン類は、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、イチゴ、クルミなどに含まれるエラジタンニンに由来するエラグ酸の代謝物として知られている。エラジタンニンは加水分解性タンニンに分類され、摂取されると体内で加水分解され、エラグ酸に変換されることが知られている。
エラジタンニンやエラグ酸は体内での腸管吸収性は非常に低いと言われているが、これらが摂取された際、ヒト結腸微生物叢によって更に代謝されることによってウロリチン類に変換されることが知られている。このようにして生成されるウロリチン類は生体内で最も重要な化合物の１つである。近年、ウロリチン類を生成する腸内細菌としてGordonibacter urolithinfaciensが報告されている（非特許文献３）。

生体内におけるウロリチン類の産生については、ゲラニインなどのエラジタンニンをラットに摂取させた後、尿中のウロリチン類を分析することによって、ウロリチン類が生じることが報告されている（非特許文献４）。また、ヒトにおいて、プニカラジンを主としたエラジタンニンを含むザクロ抽出物を摂取後、尿中においてウロリチン類縁体が検出され、特にウロリチンＡが主な代謝物として機能することが報告されている（非特許文献５）。このほかにも、ウロリチンＡには抗酸化作用や抗炎症作用など様々な有効性があることが報告されており（非特許文献６～８）、肥満、新陳代謝速度低下、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症などの症状の治療又は予防のための、ウロリチンＡを含有する食品等も報告されている（特許文献１）。さらには、ウロリチン類を用いてオートファジーを亢進させ、脂肪肝を予防及び治療する試みもある（特許文献２）。
しかし、ウロリチン類が、造血幹細胞の破骨細胞への分化を抑制する作用を有することは知られていない。

特表２０１４－５０１７６４号公報 特表２０１５－５２３３６２号公報

Dental Materials J., 29, 403-10 (2010) Int. J. Mol. Sci., 15, 18840-55 (2014) Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 64, 2346-2352 (2014) J. Agric. Food Chem., 56(2), 393-400 (2008) Mol. Nutr. Food Res., 58, 1199-1211 (2014) Biosci. Biotechnol. Biochem., 76(2), 395-399 (2012) J. Agric. Food Chem., 60(36), 8866-8876 (2012) Mol. Nutr. Food Res., 55, S35-S43 (2011)

本発明は、前記現状に鑑みて、効果的で安全性の高い破骨細胞分化抑制剤、ならびに、破骨細胞分化抑制効果を奏する飲食品、医薬、サプリメントおよび化粧料の提供を課題とする。

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、意外にも、ウロリチン類が、優れた破骨細胞分化抑制作用を有することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤。
〔２〕前記ウロリチン類がウロリチンＡである、〔１〕に記載の破骨細胞分化抑制剤。
〔３〕前記ウロリチン類がウロリチンＢである、〔１〕に記載の破骨細胞分化抑制剤。
〔４〕ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用飲食品。
〔５〕ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用医薬。
〔６〕ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用化粧料。
〔７〕ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用サプリメント。

本発明によれば、効果的で安全性の高い破骨細胞分化抑制剤、ならびに、破骨細胞分化抑制効果を奏する飲食品、医薬、サプリメントおよび化粧料を提供できる。これらは効果的で高い安全性の下、造血幹細胞から破骨細胞への分化を抑制する。体内において、造血幹細胞から破骨細胞へ分化する細胞の数が抑制されることに伴い、体内に吸収される骨量が小さく抑えられることから、骨粗しょう症等の治療又は予防に寄与し得る。

本発明の一実施態様における、ウロリチンＡ濃度と多核破骨細胞数（相対値）との関係を示すグラフである。 本発明の一実施態様における、ウロリチンＢ濃度と多核破骨細胞数（相対値）との関係を示すグラフである。 本発明の一実施態様における、ウロリチンＡ濃度と多核破骨細胞数（相対値）との関係を示すグラフである。

本発明は、ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤に係る第一の実施態様を含む。
本発明の第一の実施態様は、下記一般式（１）で表されるウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤である。尚、本実施態様の破骨細胞分化抑制剤は、破骨細胞分化抑制用組成物であってもよい。また、本実施態様の破骨細胞分化抑制剤及び破骨細胞分化抑制用組成物は、混合物であってよく、その成分が均一でも不均一でもよい。

（ウロリチン類）
第一の実施態様におけるウロリチン類は特に限定されないが、その構造が上記一般式（１）で表される物質である。また、表１に示すように、ウロリチン類は化学式におけるＲ１～Ｒ６によって、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ、ウロリチンＣ、ウロリチンＤ、ウロリチンＥ、ウロリチンＭ３、ウロリチンＭ４、ウロリチンＭ５、ウロリチンＭ６、ウロリチンＭ７、及びイソウロリチンＡなどを含む。

このうち、破骨細胞分化抑制作用が高いことから、ウロリチンＡ又はウロリチンＢが好ましい。

ウロリチン類を得る方法は特段限定されず、市販されているものを用いてもよく、化学合成により合成してもよい。
市販のウロリチン類としては、例えば、ウロリチンＡ、ウロリチンＢ、ウロリチンＣ、ウロリチンＤ、ウロリチンＥ（Ｄａｌｔｏｎ Ｐｈａｒｍａ社製）などを挙げることができる。
また、化学合成による合成方法としては常法に従うことができ、例えば、本明細書の実施例で説明するように、２－ブロモ－５－メトキシ安息香酸と塩化アルミニウムとを原料に用いてウロリチンＡを合成する方法が挙げられる。

また、植物からエラジタンニンの一種であるプニカラジンを抽出し、これをエラグ酸に加水分解した後、もしくはエラグ酸を抽出し、微生物を用いてウロリチン類に変換してもよい。
植物の種類は特段限定されず、ザクロ、ラズベリー、ブラックベリー、クラウドベリー、ボイセンベリー、イチゴ、クルミ、ゲンノショウコ等が挙げられる。このうち、エラジタンニン及び／又はエラグ酸を高含有していることから、ザクロ、ボイセンベリー、ゲンノショウコが好ましく、ザクロがより好ましい。
これらの植物は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。また、該植物からの抽出方法及び抽出条件は特段限定されず、常法に従えばよい。例えば、水抽出、熱水抽出、温水抽出、アルコール抽出、超臨界抽出等の公知の抽出方法を用いることができる。

溶媒抽出を行う場合、溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール等の低級アルコールや、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール等の多価アルコール等のアルコール類（無水、含水の別を問わない）；アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン等が挙げられ、好ましくは水、エタノール等である。これらの溶媒は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
抽出したプニカラジンなどのエラジタンニンをエラグ酸に加水分解する方法としては特段限定されないが、酸、酵素、微生物によって加水分解する方法が挙げられる。
微生物を用いてエラグ酸をウロリチン類に変換する方法としては特段限定されないが、例えば、Food Funct., 5, 8, 1779-1784 (2014)に記載にされている公知の方法を用いることができる。

得られたウロリチン類をそのままの状態で使用することもできるが、乾燥させて粉末状のものを用いてもよい。また、必要に応じて、得られたウロリチン類に精製、濃縮処理等を施してもよい。精製処理としては、濾過又はイオン交換樹脂や活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮処理としては、エバポレーター等の常法を利用できる。

また、得られたウロリチン類（又は精製処理物若しくは濃縮物）を凍結乾燥処理に供して粉末化する方法、デキストリン、コーンスターチ、アラビアゴム等の賦形剤を添加してスプレードライ処理により粉末化する方法等、公知の方法に従って粉末化してもよい。さらにその後に、必要に応じて純水、エタノール等に溶解して用いてもよい。

ウロリチン類が、破骨細胞分化抑制作用を有することは、従来から全く知られておらず、本発明により得られた新知見である。
ウロリチン類は、高い安全性で卓越した破骨細胞分化抑制作用を有しており、破骨細胞分化抑制のほか、骨粗しょう症の治療又は予防などの用途に好ましく用いられる。尚、治療は、改善を含むものとする。
ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤の好ましい形態としては、飲食品、医薬、サプリメント及び化粧料である。

（破骨細胞分化抑制剤）
本実施態様に係る破骨細胞分化抑制剤とは、造血幹細胞から破骨細胞への分化を抑制する剤である。これは、体内において、造血幹細胞から破骨細胞へ分化する細胞の数が抑制されることである。好ましくは、造血幹細胞から分化したマクロファージが破骨細胞へ分化することを抑制する剤である。破骨細胞には単核破骨細胞と多核破骨細胞とがあるが、好ましくは多核破骨細胞である。また、本発明において「多核」とは、３核以上をいうものとする。造血幹細胞から破骨細胞への分化が抑制されると、体内に吸収される骨量が小さく抑えられることから、骨粗しょう症等を治療又は予防できる。破骨細胞分化抑制能（活性）は公知の方法に従って評価することができる。例えば、実施例に記載されるようなTRAP法により染色し、定量することにより評価できる。

本実施態様に係る破骨細胞分化抑制剤は、上記したウロリチン類のうち一種を含有してもよく、複数種を含有してもよい。また、ウロリチン類を単独で含有してもよいが、ウロリチン類以外に公知の賦形剤、香料、着色料、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酵素、防腐剤、滑沢剤、界面活性剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、結合剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、可溶化剤、保存剤、風味剤、甘味剤等を、本実施態様の効果を損なわない範囲で必要に応じて配合することができる。

本発明は、破骨細胞分化抑制のためのウロリチン類の使用を他の態様として含む。また、本発明は、破骨細胞分化抑制に用いられるウロリチン類を他の態様として含む。

本実施態様に係る破骨細胞分化抑制剤全量に対するウロリチン類の含有量は、本実施態様による所望の効果が奏される限り特に限定されないが、ウロリチン類の総量として、通常０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、また、通常２０質量％以下、好ましくは３質量％以下、より好ましくは１質量％以下である。

（医薬）
ウロリチン類を破骨細胞分化抑制用医薬の素材として用いる場合、医薬としての適用方法は、経口投与又は非経口投与のいずれも採用することができる。投与に際しては、有効成分を経口投与、直腸内投与、注射などの投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられ、これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングルコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

破骨細胞分化抑制用医薬全量に対するウロリチン類の含有量は、所望の効果が奏される限り特に限定されないが、ウロリチン類の総量として、通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、また、通常１０質量％以下、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。

有効投与量は、患者の年齢、体重、症状、患者の程度、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、経口投与の場合、一般に１日当たり、ウロリチン類の総量として、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度であり、１日に数回に分けて投与してもよい。

本発明は、ウロリチン類、破骨細胞分化抑制剤又は破骨細胞分化抑制用医薬をヒトに投与する段階を含む、造血幹細胞の破骨細胞への分化を抑制する方法を他の態様として含む。
また、本発明は、ウロリチン類、破骨細胞分化抑制剤又は破骨細胞分化抑制用医薬をヒトに投与する段階を含む、造血幹細胞の破骨細胞への分化を抑制することによって緩和、予防又は治療され得る疾患、症候、症状又は障害等の緩和方法、予防方法又は治療方法を他の態様として含む。

（飲食品）
ウロリチン類を破骨細胞分化抑制用飲食品の素材として用いる場合、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品、食品添加物等（これらには飲料も含まれる。本明細書において同じ。）として使用できる。飲食品の形態としては、ウロリチン類を含有する植物自体や動物自体ではない形態でもよく、例えば、適当な助剤を添加した後、慣用の手段を用いて、食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して食用に供してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージなどの食肉加工食品、かまぼこ、ちくわなどの水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵乳製品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料などの飲料に添加して使用してもよい。

ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用飲食品は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分とすることができる。タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれらの加水分解物、バターなどが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品及び／又はこれらを多く含む飲食品を用いてもよい。

ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用飲食品は、常法に従って製造することができる。また、ウロリチン類の飲食品への配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。

破骨細胞分化抑制用飲食品全量に対するウロリチン類の含有量は、所望の効果が奏される限り特に限定されないが、ウロリチン類の総量として、通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、また、通常１０質量％以下、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。

有効摂取量は、摂取者の年齢、体重、症状、摂取者の程度、摂取経路、摂取スケジュール、加工形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、一般に１日当たり、ウロリチン類の総量として、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度であり、１日に数回に分けて摂取してもよい。

（サプリメント）
サプリメントとは、dietary supplementからなる飲食品区分の１つであり、本明細書では、破骨細胞分化抑制作用等を発揮する機能補助物質をいう。
ウロリチン類を破骨細胞分化抑制用サプリメントの素材として用いる場合、固形物、ゲル状物、液状物の何れの形態とすることができる。サプリメントの形態としては、例えば、各種加工飲食品、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、ゼリー、顆粒等の形態にすることができる。
ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用サプリメントは、デキストリン等の賦形剤、ビタミンＣ等の保存剤、バニリン等の嬌味剤、ベニバナ色素等の色素、単糖、オリゴ糖および多糖類（例、グルコース、フルクトース、スクロース、サッカロース、およびこれらを含有する糖質）、酸味料、香料、油脂、乳化剤、全脂粉乳、または寒天などの添加剤を含有していてもよい。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品及び／又はこれらを多く含んでもよい。

ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用サプリメントは、常法に従って製造することができる。また、ウロリチン類のサプリメントへの配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
破骨細胞分化抑制用サプリメント全量に対するウロリチン類の含有量は、所望の効果が奏される限り特に限定されないが、ウロリチン類の総量として、通常０．０００１質量％以上であり、好ましくは０．００１質量％以上であり、より好ましくは０．０１質量％以上である。また、通常１０質量％以下、好ましくは１質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。

有効摂取量は、摂取者の年齢、体重、症状、摂取者の程度、摂取経路、摂取スケジュール、加工形態、素材の阻害活性の強さなどにより、適宜選択・決定されるが、例えば、一般に１日当たり、ウロリチン類の総量として、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ体重程度であり、１日に数回に分けて摂取してもよい。

（化粧料）
ウロリチン類を破骨細胞分化抑制用化粧料の素材として使用する場合、例えば、ウロリチン類を小麦胚芽油あるいはオリーブ油に添加して破骨細胞分化抑制剤含有組成物とし、これを化粧料素材として使用することができる。ウロリチン類の添加量は、特に限定されるものではないが、一例としてあげると、小麦胚芽油あるいはオリーブ油に対して、ウロリチン類の総量として、０．１質量％以上６０質量％以下、好ましくは０．５質量％以上５０質量％以下である。
また、ウロリチン類を化粧料成分としてそのまま使用し、破骨細胞分化抑制作用を有する化粧料を製造することができる。

化粧料としては特に限定されるものではないが、機能面からは、例えばフェイス又はボディ用乳液、化粧液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、シートなどが好ましい。このような化粧料は、常法に従って製造することができる。ウロリチン類の添加量は、特に限定されるものではないが、一例としてあげると、破骨細胞分化抑制用化粧料全量に対して、ウロリチン類の総量として、０．０１質量％以上２０質量％以下である。

ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用化粧料は、常法に従って製造することができる。また、ウロリチン類の化粧料への配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。

また、一部上記と重複するが、破骨細胞分化抑制用化粧料には、通常用いられる公知の成分を適宜加えて用いることができる。
例えば、アニオン性界面活性剤（脂肪酸石鹸、スルホン酸塩型アニオン性界面活性剤、硫酸エステル型アニオン性界面活性剤、リン酸エステル型アニオン性界面活性剤、アシルメチルタウリン塩、モノアルキルリン酸塩、アシルグルタミン酸塩、イセチオン酸エステル塩等）、カチオン性界面活性剤（アミン塩型カチオン性界面活性剤、第四アンモニウム型カチオン性界面活性剤（テトラアルキルアンモニウム型、ピリジニウム型））、非イオン性界面活性剤（グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）、両性界面活性剤（イミダゾリン型、ベタイン型、アミノ酸型）、フッソ系界面活性剤、シリコーン系界面活性剤等の天然、合成界面活性剤、
アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、アラビアガム、キサンタンガム、ペクチン、トラガント、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カチオン化セルロース、カチオン化デキストラン、カチオン化デキストリン、キトサン、カチオン化ビニルピロリドンポリマー、塩化Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，５－メチレンピペリジニウムポリマー、乳タンパク、大豆タンパク、ゼラチン、卵タンパク、カゼインナトリウム、ホエータンパク等の水溶性高分子、
イチョウ、ツボクサ、トウヤク、ニンジン、シコッピ、カイカ、インチコウ、ヤシャジツ、甘草分画物、ゴカヒ、センプクカ、ヒカイ、ユズリハ、カミツレ、マロニエ、エスシン、テルミナリア、ルスコゲニン、ブッチャーブルーム、コラ、ガラナ、マテ、コーヒー、カカオ、プレクトランタス、タンジン、ビスナガ、シリマリン、ロイコシアニン、オトギリ草、クマハゼ、シソ、オウゴン、ケイガイ、ローズマリー、セージ、タイム、ヨモギ、カワラヨモギ、ソウジュツ、セイヨウノコギリソウ、シコン、ウイキョウ、オウバク、ショウキョウ、トウキ、センキュウ、チンビ、カノコソウ、ビャクシ、トウヒ、芍薬、紅花、菖蒲、ブクリョウ、ハッカ等の植物成分、
コハク酸、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸、グルクロン酸、２－ヒドロキシ酪酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タルトロン酸、ピルビン酸メチル、ピルビン酸エチル、ビタミンＡ酸、ビタミンＣ誘導体、ビタミンＤ、ビタミンＥ、オリゴペプチド、トラネキサム酸エステル等の活性成分、多価アルコール、アミノ酸、ムコ多糖類、蛋白質、生体抽出物、発酵代謝物、多糖類、植物抽出物、リン脂質、セラミドなどの保湿剤、
油脂類（大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、カカオ油、オリーブ油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油およびミリスチン酸グリセリド、２－エチルヘキサン酸グリセリド等の合成トリグリセリド、ジグリセリド等）、ロウ類（カルナウバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等）、炭化水素類（流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、プリスタン等）、高級脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等）、高級アルコール類（ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、２－ヘキシルデカノール等）、エステル類（オクタン酸セチル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレスチール等）、精油類（ハッカ油、ジャスミン油、シヨウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、シヨウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、ペパーミント油、タイム油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等）、シリコーン油類等の油脂成分（エモリエント成分）、
炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、ホウ砂、硫酸ナトリウム、硫化ナトリウム、硝酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、りん酸ナトリウム、塩化カリウム、硫化カリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等の無機塩類、
ホウ酸、メタケイ酸、無水ケイ酸等の無機酸類、
黄色４号、青色１号、黄色２０２号、クロロフィル、リボフラビン、紅花、クロシン、アントラキノン等の色素類、
香料類、
アクリル樹脂、スチレン樹脂、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリテトラフルオロエタン等の高分子、これらの高分子のコポリマー、ケイ酸、ケイ酸カルシウム、天然ケイ酸アルミニウム、合成ケイ酸アルミニウム、ゼオライト、酸化チタン、タルク、カオリン、マイカ、ベントナイト等の微粉体、
硫黄、湯の花、鉱砂、雲母末、中性白土、いり糠、殺菌剤、防腐剤、
をはじめ、その他製剤上必要な成分などが挙げられる。

（表示）
ウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤、破骨細胞分化抑制用飲食品、破骨細胞分化抑制用医薬、破骨細胞分化抑制用サプリメント、破骨細胞分化抑制用化粧料は、破骨細胞分化抑制のために用いられるものである旨の表示を付した飲食品、医薬、サプリメント、化粧料として販売することができる。例えば、「破骨細胞分化抑制用」や「破骨細胞への分化を抑制する旨」等の表示であってもよく、さらに、破骨細胞分化抑制によって生じる効果の表示も含まれる。

さらに、破骨細胞分化抑制用飲食品には、一般的な飲食品のほか、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、医薬部外品など、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる飲食品が含まれる。「健康食品」等の「食品」には「飲料」も含まれる。健康食品としては、例えば、栄養補助食品、健康補助食品、美容飲食品の名称で提供される食品が挙げられる。また、保健機能食品とは、食品衛生法又は健康増進法により定義されるものであり、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減などが表示できる。保健機能食品には、特定保健用食品（トクホ；条件付き特定保健用食品を含む。）及び栄養機能食品（トクホと異なり、個別に消費者庁長官の許可を受けている食品ではない。）が含まれる。本発明における「表示」には、このような飲食品や医薬部外品としての表示が含まれる。

本発明は、破骨細胞分化抑制剤、破骨細胞分化抑制用飲食品、破骨細胞分化抑制用医薬、破骨細胞分化抑制用化粧料、又は破骨細胞分化抑制用サプリメントの製造におけるウロリチン類を他の態様として含む。

以下に実施例を挙げて具体的に説明するが、これに限定されるものではない。
本実施例における統計解析は、市販のソフトウェア（StatMate3, ATMS社）を使用して行った。実施例３、比較例３を除き、作用効果の比較にはテューキー検定を用いた。全てのテストでＰ値が０．１％以下の場合を有意差ありとした。実施例３、比較例３の作用効果の比較にはダネット検定を用い、Ｐ値が１％以下の場合を有意差ありとした。

＜動物実験＞
動物は、７週齢ｄｄＹ雌性マウス（東京実験動物式会社）を用いた。マウスは恒温恒湿度（室温：２１±１℃、湿度：４５～５０％）、１２時間明暗サイクル（明期：７：００～１９：００）の環境下で飼育を行った。本実験は、城西大学動物実験指針に基づき、「実験動物の飼育及び保管に関する基準」（昭和５５年３月総理府告示第６号）に基づいて行われた。

＜ウロリチン類の分析方法＞
ウロリチン類の一例としてウロリチンＡを用いた場合を説明する。ウロリチンＡの分析はＨＰＬＣを用いて行った。即ち、ウロリチンＡ（Ｄａｌｔｏｎ Ｐｈａｒｍａ社製）を適当な溶媒に溶解させて調製した溶液を下記のＨＰＬＣ条件下で分析し、純度（％）（Ａ）およびＨＰＬＣにおけるピーク面積値（Ｂ）を用いて、下記算出式（１）及び算出式（２）によりウロリチンＡのファクター及びサンプルのウロリチンＡ濃度を算出した。

（ウロリチンＡのファクター算出式）
ウロリチンＡのファクター＝（Ｂ）／（ウロリチンＡの標準液の濃度（ｍｇ／Ｌ）×（Ａ）／１００） ・・・（１）
（サンプルのウロリチンＡ濃度算出式）
サンプルのウロリチンＡ濃度（ｍｇ／Ｌ）＝サンプル中のウロリチンＡのピーク面積値／ウロリチンＡのファクター ・・・（２）

＜分析条件＞
分析カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３（２５０×４．６ｍｍ）（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）
検出波長：３０５ｎｍ
移動相：水／アセトニトリル／酢酸 ＝ ７４／２５／１
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
上記条件下、ウロリチンＡは１６．５分に保持時間を有した。

＜ウロリチンＡの調製＞
２－ブロモ－５－メトキシ安息香酸５ｇ（和光純薬工業株式会社製）と塩化アルミニウム１５ｇを１５０ｍＬのクロロベンゼン中で２．５時間還流した。冷却後、反応液を氷水に移し、２５０ｍＬのジエチルエーテルを用いて３回抽出を行った。得られた抽出液を減圧濃縮してジエチルエーテルを留去し、２－ブロモ－５－ヒドロキシ安息香酸４．２ｇを得た。得られた２－ブロモ－５－ヒドロキシ安息香酸３．９ｇとレゾルシノール３．９ｇ（東京化成工業株式会社製）を９ｍＬの４Ｍ ＮａＯＨ水溶液中で６０℃、３０分間加熱した。この反応液に１０％硫酸銅水溶液１．８ｍＬを加えた後、更に８０℃、１０分間の加熱を行った。生成した沈殿物をろ過によって回収し、ウロリチンＡの白色粉末を得た。

＜ウロリチンＢの調製＞
水（３８ｍＬ）中のレゾルシノール（８．４０ｇ）、２－ブロモ安息香酸（７．６０ｇ）およびＮａＯＨ（３．３４ｇ）の混合物を、２時間還流させながら加熱および撹拌した。水（３０ｍＬ）およびＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（０．９５ｇ）を加え、その混合物をさらに１時間還流させながら撹拌した。次に、反応物を室温まで冷却し、沈殿物を濾過した。次に、生成物を無水エタノールに溶解し、濃縮した。未精製物を熱メタノールに溶解し、濾紙上で濾過して、ウロリチンＢの白色粉末を得た。

＜マウス骨髄由来造血幹細胞の単離＞
マウスの大腿骨と脛骨を摘出し、両骨端を各々約２ｍｍ切断除去後、０．２ｍＬ容マイクロチューブに長管骨を入れ、２，０００×ｇで遠心し、骨髄液を回収した。骨髄液を４ｍＬの１０％ＦＢＳ（JBS-011115）含有α－ＭＥＭ培地（#. 11900-016, Gibco）で懸濁し、６ｃｍのディッシュに播種した。３７℃、５％ＣＯ_２濃度で２４時間インキュベート後、培地を回収した。培地中の浮遊細胞を造血幹細胞として単離した。

＜マウス骨髄由来造血幹細胞からマクロファージへの分化誘導＞
上記と同様にして得たマウス骨髄由来造血幹細胞を、９６ウェルプレートに４．０×１０^４細胞／ウェルで播種した。播種と同時にマクロファージへの分化誘導剤として、３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（macrophage-colony stimulating factor, R&D Systems)をすべてのウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内に静置して３日間培養して、マウス骨髄由来造血幹細胞から分化したマクロファージを得た。

＜破骨細胞分化抑制試験＞
（実施例１）
単離したマウス骨髄由来造血幹細胞を、９６ウェルプレートに４．０×１０^４細胞／ウェルで播種した。播種と同時に破骨細胞への分化誘導剤として、３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（macrophage-colony stimulating factor, R&D Systems)、５０ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬ（receptor activator of nuclear factor κ-B ligand, PeproTech Inc.）をすべてのウェルに添加した。また、該分化誘導剤と同時にウロリチンＡ（１、１０、２５μＭ）を添加した。３７℃、５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内に静置して８日間培養後、各ウェルの培地を取り除き、１０Ｎのマイルドホルムで１０分間静置し、細胞を固定後、３回純水で洗浄した。その後、５０μＬのＴＲＡＰ染色液（ＳＩＧＭＡ）を各ウェルに加え、遮光した状態で１時間、３７℃でインキュベートした。各ウェルのＴＲＡＰ染色液を捨て、純水で洗浄後、マイヤーヘマトキシリン溶液を５０μＬ加え、２分間放置し、核染色を行った。純水で１０回洗浄し、１日以上乾燥させ、ウェル上に存在する３核以上の多核破骨細胞数を全て計測した。また、スキャナー（EPSON, GT-X970, 800pixel/inch）を用いて染色画像をスキャンし、画像解析ソフトウェアImage Jを用いて染色面積を測定した。

（比較例１）
ウロリチンＡを添加しなかったこと以外は実施例１と同様にした。

（結果）
試料無添加群の染色面積（比較例１）に対する試料添加群の染色面積（実施例１）の割合を求め、破骨細胞数（相対値）とした。その結果を表２及び図１に示す。ウロリチンＡ濃度が１０、２５μＭのときに、破骨細胞の分化が有意に抑制された。尚、表２及び図１中の「※」が付された条件は、比較例１との間で有意差ありとされた条件である。

（実施例２）
ウロリチンＡをウロリチンＢに変更し、添加するウロリチンＢを２５、５０μＭにしたこと以外は実施例１と同様にした。

（比較例２）
ウロリチンＢを添加しなかったこと以外は実施例２と同様にした。

（結果）
試料無添加群の染色面積（比較例２）に対する試料添加群の染色面積（実施例２）の割合を求め、破骨細胞数（相対値）とした。その結果を表３及び図２に示す。ウロリチン濃度が５０μＭのときに、破骨細胞の分化が有意に抑制された。尚、表３及び図２中の「※」が付された条件は、比較例２との間で有意差ありとされた条件である。

（実施例３）
単離したマウス骨髄由来造血幹細胞から分化させたマクロファージを、９６ウェルプレートに４．０×１０^４細胞／ウェルで播種した。播種と同時に破骨細胞への分化誘導剤として、３０ｎｇ／ｍＬ Ｍ－ＣＳＦ（macrophage-colony stimulating factor, R&D Systems)、５０ｎｇ／ｍＬ ＲＡＮＫＬ（receptor activator of nuclear factor κ-B ligand, PeproTech Inc.）をすべてのウェルに添加した。また、該分化誘導剤と同時にウロリチンＡ（１０μＭ）を添加した。３７℃、５％ＣＯ_２濃度のインキュベーター内に静置して３日間培養後、各ウェルの培地を取り除き、１０Ｎのマイルドホルムで１０分間静置し、細胞を固定後、３回純水で洗浄した。その後、５０μＬのＴＲＡＰ染色液（ＳＩＧＭＡ）を各ウェルに加え、遮光した状態で１時間、３７℃でインキュベートした。各ウェルのＴＲＡＰ染色液を捨て、純水で洗浄後、マイヤーヘマトキシリン溶液を５０μＬ加え、２分間放置し、核染色を行った。純水で１０回洗浄し、１日以上乾燥させ、ウェル上に存在する３核以上の多核破骨細胞数を全て計測した。また、スキャナー（EPSON, GT-X970, 800pixel/inch）を用いて染色画像をスキャンし、画像解析ソフトウェアImage Jを用いて染色面積を測定した。

（比較例３）
ウロリチンＡを添加しなかったこと以外は実施例３と同様にした。

（結果）
試料無添加群の染色面積（比較例３）に対する試料添加群の染色面積（実施例３）の割合を求め、破骨細胞数（相対値）とした。その結果を表４及び図３に示す。ウロリチン濃度が１０μＭのときに、破骨細胞の分化が有意に抑制された。尚、表４及び図３中の「※」が付された条件は、比較例３との間で有意差ありとされた条件である。

本発明は、医薬、飲食品、サプリメント、化粧料等の製剤技術に適用できる。これらは、破骨細胞分化抑制、骨粗しょう症等の治療又は予防のために用いられる。

Claims (4)

1. 有効量のウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制剤であって、
   前記ウロリチン類がウロリチンＡである、破骨細胞分化抑制剤。
2. 有効量のウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用飲食品であって、
   前記ウロリチン類がウロリチンＡである、破骨細胞分化抑制用飲食品（ただし、ウロリチン類を含有する植物自体ではない態様、及びウロリチン類を含有する動物自体ではない態様に限る）。
3. 有効量のウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用医薬であって、
   前記ウロリチン類がウロリチンＡである、破骨細胞分化抑制用医薬。
4. 有効量のウロリチン類を含有する破骨細胞分化抑制用サプリメントであって、
   前記ウロリチン類がウロリチンＡである、破骨細胞分化抑制用サプリメント（ただし、ウロリチン類を含有する植物自体ではない態様、及びウロリチン類を含有する動物自体ではない態様に限る）。

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