JP7403480B2 - 二重特異性抗ｃｄ３×ｍｕｃ１６抗体および抗ｐｄ－１抗体で癌を治療する方法 - Google Patents

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本出願は、２０１９年６月１２日に作成され、３３，５６７バイトを含むファイル１０４６９ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み入れる。

本発明は、癌を治療する方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に、ムチン１６（ＭＵＣ１６）およびＣＤ３に結合する二重特異性抗体と組み合わせて、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）受容体に特異的に結合する治療有効量の抗体を投与することを含む。

癌抗原１２５、細胞癌抗原１２５、炭水化物抗原１２５、またはＣＡ－１２５としても既知であるムチン１６（ＭＵＣ１６）は、卵巣癌において高発現する内在性膜糖タンパク質が高度にグリコシル化された単一の膜貫通ドメインである。ＭＵＣ１６は、３つの主要ドメイン、すなわち細胞外Ｎ末端ドメイン、ウニ精子、エンテロキナーゼ、およびアグリン（ＳＥＡ）ドメインが点在する大きな縦列反復ドメイン、ならびに膜貫通領域のセグメントおよび短い細胞質テールを含むカルボキシル末端ドメイン、からなる。タンパク質分解の切断は、ＭＵＣ１６の細胞外部分の血流への流出をもたらす。ＭＵＣ１６は、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、非小細胞肺癌、肝内胆管癌－腫瘤形成型、子宮頸部腺癌、および胃腸腺癌を含む癌、ならびに炎症性腸疾患、肝硬変、心不全、腹膜感染症および腹部手術を含む疾患および病態において過剰発現する。（非特許文献１）。癌細胞上での発現は腫瘍細胞を免疫系から保護することが示されている。（非特許文献２）。ＭＵＣ１６に対する抗体を使用して卵巣癌を治療するための方法が研究されている。オレゴボマブおよびアブゴボマブは、限られた成果を収めた抗ＭＵＣ１６抗体である。（非特許文献３）。

ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）と共にＴ細胞上に発現されるホモ二量体またはヘテロ二量体抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要とされる。機能的ＣＤ３は、４つの異なる鎖：イプシロン、ゼータ、デルタ、およびガンマのうちの２つの二量体会合から形成される。ＣＤ３の二量体配置は、ガンマ／イプシロン、デルタ／イプシロン、およびゼータ／ゼータを含む。ＣＤ３に対する抗体はＴ細胞上でＣＤ３をクラスター化し、それによってペプチド負荷ＭＨＣ分子によるＴＣＲの関与と同様の様式でＴ細胞活性化を引き起こすことが示されている。したがって、抗ＣＤ３抗体はＴ細胞の活性化を含む治療目的のために提案されている。さらに、ＣＤ３および標的抗原に結合することができる二重特異性抗体は、標的抗原を発現する組織および細胞に対するＴ細胞免疫応答を標的とすることを含む治療的使用のために提案されている。

腫瘍微小環境におけるプログラム細胞死１（ＰＤ－１）受容体シグナル伝達は、腫瘍細胞が宿主免疫系による免疫監視を回避することを可能にする上で重要な役割を果たす。ＰＤ－１シグナル伝達経路の遮断は、多発腫瘍型を有する患者で臨床効果を示しており、ＰＤ－１を遮断する抗体療法（例えば、ニボルマブおよびペムブロリズマブ）は、転移性黒色腫ならびに転移性扁平上皮非小細胞肺癌の治療用に承認されている。最近のデータは、高悪性度ＮＨＬおよびホジキンリンパ腫を有する患者でＰＤ－１遮断の臨床効果を示している（非特許文献４）。

卵巣癌は、婦人科悪性腫瘍の中で最も致死性が高く、アメリカ人女性の卵巣癌の新規症例の推定数は他の特定の癌よりもはるかに少ないが、卵巣癌の罹患率に対する死亡率は、大幅に高くなっている（非特許文献５）。卵巣癌は、進行期で診断されることが多く、その致死性の一因となっている。卵巣癌に対する現在の標準治療は、手術であり、続いて化学療法、すなわち白金剤とタキサンとの組み合わせである。大多数の患者は初回治療に対して応答するが、ほとんどの患者は疾患の再発を経験し、手術と追加の化学療法のサイクルを繰り返すことになる。再発性卵巣癌はさらなる治療に対して応答する可能性があるが、ほぼ全てが、最終的に現在利用可能な療法に対して耐性を示すようになる。ＢＲＣＡまたは他の相同組換え修復欠損（ＨＲＤ）変異を保有する患者に対するＰＡＲＰ阻害剤などの療法の最近の進歩にもかかわらず、進行卵巣癌は、依然としてアンメットニーズが高い疾患である。

証拠は、卵巣癌がいくつかの形式の免疫療法に適し得ることを示唆している（非特許文献６）。例えば、腫瘍が上皮内ＣＤ８^＋Ｔリンパ球浸潤について陽性であった卵巣癌患者は、上皮内ＣＤ８^＋Ｔリンパ球浸潤のない患者よりも、全生存期間および無増悪生存期間が著しく優れていた（非特許文献７；および非特許文献８）。さらに一部の患者は、進行疾患を有する患者の血液、腫瘍または腹水中の腫瘍反応性Ｔ細胞および抗体の検出によって示されるように、腫瘍に対して自然免疫応答を示す（非特許文献９）。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１チェックポイント経路の遮断は、卵巣癌ではいくつかのベネフィットを示しており、ＰＤ－１遮断単剤療法は、初期の臨床試験で約１０～１５％の全奏効率（ＯＲＲ）をもたらした（非特許文献１０）。ただし、この経路の遮断だけでは明らかに十分ではない。

卵巣癌の有効な療法に対するアンメットニーズが高いことから、本明細書に示されるように、標的抗原に対する薬剤（二重特異性抗ＭＵＣ１６抗体／抗ＣＤ３抗体）と共に、Ｔ細胞の機能を増強する薬剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体などのＰＤ－１阻害剤）による治療を組み合わせることが有用であり得る。

Ｈａｒｉｄａｓ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２８：４１８３－４１９９ Ｆｅｌｄｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ，１３：１２９ Ｆｅｌｄｅｒ，ｓｕｐｒａ，Ｄａｓ，Ｓ．ａｎｄ Ｂａｔｒａ，Ｓ．Ｋ．２０１５，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７５：４６６０－４６７４ Ｌｅｓｏｋｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．２０１４，Ａｂｓｔｒａｃｔ ２９１，５６ｔｈ ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．；Ａｎｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２（４）：３１１－９ Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ６６：７－３０，２０１６ Ｋａｎｄａｌａｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２９：９２５－９３３，２０１１ Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０４：３３６０－６５，２００７ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４８：２０３－２１３，２００３ Ｓｃｈｌｉｅｎｇａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，９：１５１７－１５２７，２００３ Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ

ある特定の実施形態によれば、本発明は、対象において癌を治療する、少なくとも１つの癌の症状もしくは徴候を寛解する、または癌の増殖を阻害するための方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片を、ＭＵＣ１６およびＣＤ３に特異的に結合する治療有効量の二重特異性抗体と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。

本発明のある特定の実施形態では、対象において癌を治療する、少なくとも１つの癌の症状もしくは徴候を寛解する、または癌の増殖を阻害するための方法が提供される。本発明のある特定の実施形態では、腫瘍の増殖を遅延させる、または腫瘍再発を予防するための方法が提供される。本発明のこの態様および他の態様による方法は、ＰＤ－１に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片の１回以上の用量を、ＭＵＣ１６およびＣＤ３に特異的に結合する治療有効量の二重特異性抗体の１回以上の用量と組み合わせて、それを必要とする対象に連続的に投与することを含む。

一態様では、本発明は、腫瘍を治療またはその増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に（ａ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む治療有効量の二重特異性抗体とを投与することを含む。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体は、二重特異性抗体の前に、同時にまたは後に投与される。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体は、二重特異性抗体の前に投与される。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体は、二重特異性抗体の少なくとも１週間前に投与される。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量は、二重特異性抗体の１回以上の用量と組み合わせて投与される。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体は、対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体の各用量は、１０～８０００マイクログラムを含む。場合によっては、二重特異性抗体は、対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。場合によっては、二重特異性抗体の各用量は、１０～８０００マイクログラムを含む。場合によっては、抗ＰＤ－１抗体の各用量は、直前の用量の０．５～１２週間後に投与される。場合によっては、二重特異性抗体の各用量は、直前の用量の０．５～１２週間後に投与される。様々な実施形態では、抗体は、静脈内、皮下、または腹腔内に投与される。

いくつかの実施形態では、腫瘍は卵巣癌を含む。いくつかの実施形態では、対象は、以前の療法に耐性があるか、もしくは応答が不十分であるか、または以前の療法後に再発している。

場合によっては、この方法は、第３の治療薬または療法を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の治療薬または療法は、放射線、手術、化学療法剤、癌ワクチン、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、アンギオポエチン－２（Ａｎｇ２）阻害剤、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、カルメット－ゲラン桿菌ワクチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、細胞毒素、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）阻害剤、インターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、抗体－薬物複合体、抗炎症剤、および栄養補助食品からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含む。場合によっては、ＨＣＤＲ１は配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１は配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号４０のアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＨＣＶＲは配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは配列番号３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第１の抗原結合アームは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含む。場合によっては、Ａ－ＨＣＤＲ１は配列番号８のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ２は配列番号９のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ３は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ１は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ２は配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ３は配列番号１３のアミノ酸配列を含む。場合によっては、Ａ－ＨＣＶＲは配列番号１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＶＲは配列番号２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。場合によっては、Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３は、配列番号１４－１５－１６、１７－１８－１９、２０－２１－２２、２３－２４－２５および２６－２７－２８からなる群より選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含み、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３は、配列番号１１－１２－１３のアミノ酸配列をそれぞれ含む。場合によっては、Ｂ－ＨＣＶＲは、配列番号３、４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＶＲは配列番号２のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体、二重特異性抗体、またはそれらの両方が、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。

別の態様では、本発明は、腫瘍を治療またはその増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に（ａ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む治療有効量の二重特異性抗体とを投与することを含み、ここで（ａ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｂ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｃ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗体は、それぞれ以下を含む：（ａ）ＨＣＤＲ１が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を含み、（ｂ）Ａ－ＨＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、（ｃ）Ｂ－ＨＣＤＲ１が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ２が配列番号１５のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ３が配列番号１６のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

この方法のいくつかの実施形態では、その抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗体は、それぞれ以下を含む：（ａ）ＨＣＶＲが配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、（ｂ）Ａ－ＨＣＶＲが配列番号１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＶＲが配列番号２のアミノ酸配列を含み、（ｃ）Ｂ－ＨＣＶＲが配列番号３のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＶＲが配列番号２のアミノ酸配列を含む。

この方法のいくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、二重特異性抗体の第１の抗原結合アームは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、腫瘍は卵巣癌を含む。

別の態様では、本発明は、腫瘍を治療またはその増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、それを必要とする対象に（ａ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む治療有効量の二重特異性抗体とを投与することを含み、ここで（ａ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｂ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｃ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗体は、それぞれ以下を含む：（ａ）ＨＣＤＲ１が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を含み、（ｂ）Ａ－ＨＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、（ｃ）Ｂ－ＨＣＤＲ１が配列番号２６のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ２が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ３が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含む。

この方法のいくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗体は、それぞれ以下を含む：（ａ）ＨＣＶＲが配列番号３３のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、（ｂ）Ａ－ＨＣＶＲが配列番号１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＶＲが配列番号２のアミノ酸配列を含み、（ｃ）Ｂ－ＨＣＶＲが配列番号７のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＶＲが配列番号２のアミノ酸配列を含む。

この方法のいくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、二重特異性抗体の第１の抗原結合アームは、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含み、二重特異性抗体の第２の抗原結合アームは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、腫瘍は卵巣癌を含む。

上記または本明細書で論じられている方法のいずれか１つの様々な実施形態では、二重特異性抗体の抗腫瘍活性は、最大１０ｋＵ／ｍｌの濃度でＣＡ－１２５を循環させることによって著しく妨げられない。上記または本明細書で論じられている方法のいずれか１つの様々な実施形態では、対象は卵巣癌と診断されて、対象が最大１０ｋＵ／ｍｌのＣＡ－１２５の循環レベルを有する。上記または本明細書で論じられている方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療を開始する前に、ＣＡ－１２５の高い血清レベルを有する。上記または本明細書で論じられている方法のいくつかの実施形態では、対象は、治療を開始する前に、正常ＣＡ－１２５血清レベルの上限の２倍以上のＣＡ－１２５の血清レベルを有する。上記または本明細書で論じられている方法のいくつかの実施形態は、ＣＡ－１２５の血清レベルをモニタリングすること、例えば、治療中または治療後の様々な時点でＣＡ－１２５の血清レベルを、特定の患者の血清ＣＡ－１２５のベースラインレベルまたは総患者集団の血清ＣＡ－１２５のベースラインレベルと比較することによって、治療の有効性を測定することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で論じられている抗体は、上記または本明細書で論じられているいずれかの方法で使用するための薬剤の製造に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられている抗体は、上記または本明細書で論じられているように、医薬に使用するまたは癌の治療に使用するためのものである。例えば、本開示は以下を含む：
（Ａ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせた、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体の使用、
（Ｂ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の使用で、
（Ｃ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせた、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体の使用であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、使用、
（Ｄ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体と組み合わせた、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の使用であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、使用、
（Ｅ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせた、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体の使用であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、使用、
（Ｆ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体と組み合わせた、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うための薬剤の製造における、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の使用であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、使用、
（Ｇ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用するための、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体、
（Ｈ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用するための、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、
（Ｉ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用するための、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、二重特異性抗体、
（Ｊ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用するための、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、抗体またはその抗原結合断片、
（Ｋ）プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用するための、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、二重特異性抗体、ならびに
（Ｌ）ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームおよびＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームを含む二重特異性抗体と組み合わせて、腫瘍の治療またはその増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行うために使用するための、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、（ｉ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）と、配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉ）二重特異性抗体の第１の抗原結合アームが、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含み、（ｉｉｉ）二重特異性抗体の第２の抗原結合アームが、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ｂ－ＨＣＶＲ）の３つの重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ｂ－ＬＣＶＲ）の３つの軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む、抗体またはその抗原結合断片。

本発明の他の実施形態は、後述の詳細な説明の総説から明らかとなるであろう。

ＥＬＩＳＡ（本明細書の実施例２に記載）によって決定されるように、様々な濃度の抗ＭＵＣ１６クローン３Ａ５およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１のＣＡ１２５への結合を示す。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびそのＭＵＣ１６親抗体は、ＭＵＣ１６の反復領域に結合する抗ＭＵＣ１６クローン３Ａ５と比較して、試験した全ての濃度で、著しく減少した結合シグナルを示した。 ＣＤ３結合対照＋アイソタイプ対照（Δ）、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５＋アイソタイプ対照（□）、ＣＤ３結合対照＋抗ＰＤ－１（▲）およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５＋抗ＰＤ－１（■）で処置されたマウス群（群あたり５）の平均腫瘍増殖曲線を示す（本明細書の実施例３に記載されるように）。抗ＰＤ－１抗体と抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６二重特異性抗体との組み合わせは、相乗的に腫瘍増殖を阻害した。 ＰＤ－１陽性Ｔ細胞の割合に対するＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１とのＴ細胞インキューベーションの影響を示す。

本発明を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るため、このような方法および条件に制限されないことは理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。上記または本明細書で論じられている任意の特定の値は、上記または本明細書で論じられている別の関連する値と組み合わせて、範囲の上限および下限を表す値を有する範囲を列挙することができ、そのような範囲は、本開示の範囲内に含まれる。

別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用する場合、「約」との用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本発明で使用する場合、「約１００」との表現は、９９および１０１、ならびにその間の全値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

癌を治療またはその増殖を阻害するための方法
本発明は、対象において癌を治療する、少なくとも１つの癌の症状もしくは徴候を寛解する、または癌の増殖を阻害するための方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、ＰＤ－１に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片を、ＭＵＣ１６およびＣＤ３に対する治療有効量の二重特異性抗体と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療すること」または同様の用語は、一時的または永続的のいずれかで、症状を軽減し、症状の原因を排除すること、腫瘍の増殖を遅延させるもしくは阻害すること、腫瘍細胞量もしくは腫瘍量を減少させること、腫瘍退縮を促進すること、腫瘍縮小、壊死および／もしくは消失を引き起こすこと、腫瘍再発を予防すること、ならびに／または対象の生存期間を増加させることを意味する。

本明細書で使用する場合、「それを必要とする対象」という表現は、癌の１つ以上の症状もしくは徴候を示し、かつ／または卵巣癌を含む癌と診断されたヒトまたは非ヒト哺乳動物、ならびにそれらの治療を必要とするヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。多くの実施形態では、「対象」という用語は、「患者」という用語と区別なく使用され得る。例えば、ヒト対象は、原発性もしくは転移性腫瘍、および／またはリンパ節（複数可）の肥大、腹部腫脹、胸部痛／胸部圧迫感、原因不明の体重減少、発熱、寝汗、持続性の疲労、食欲不振、脾臓の肥大、痒みを含むが、これらに限定されない１つ以上の症状もしくは徴候を有すると診断され得る。その表現は、原発性または定着した卵巣腫瘍を有する対象を含む。特定の実施形態では、その表現は、卵巣癌またはＭＵＣ１６を発現する別の腫瘍を有し、治療を必要とするヒト対象を含む。他の特定の実施形態では、その表現は、ＭＵＣ１６＋腫瘍（例えば、フローサイトメトリーによって決定されるＭＵＣ１６発現を伴う腫瘍）を有する対象を含む。ある特定の実施形態では、「それを必要とする対象」という表現は、以前の療法（例えば、従来の抗癌剤による治療）に対して耐性を示すかもしくは不応性であるか、または十分に制御されない卵巣癌を有する患者を含む。例えば、その表現は、白金ベースの化学療法剤（例えば、シスプラチン）またはタキソール化合物（例えば、ドセタキセル）などの化学療法で治療された対象を含む。その表現はまた、例えば毒性の副作用のために従来の抗癌療法が推奨されない卵巣腫瘍を有する対象を含む。例えば、その表現は、毒性の副作用を伴う化学療法を１サイクル以上受けた患者を含む。ある特定の実施形態では、「それを必要とする対象」という表現は、治療されたが、その後再発または転移した卵巣腫瘍を有する患者を含む。例えば、腫瘍退縮につながる１つ以上の抗癌剤による治療を受けたが、その後、その１つ以上の抗癌剤に対して耐性を示す癌（例えば、化学療法耐性癌）によって再発した卵巣腫瘍を有する患者を、本発明の方法で治療する。

「それを必要とする対象」という表現はまた、卵巣癌を発病するリスクのある対象、例えば、卵巣癌の家族歴を有する人、卵巣癌に関連する感染症の既往歴を有する人、ＢＲＣＡ１／２遺伝子の変異を有する人、またはＨＩＶ感染症によってもしくは免疫抑制剤によって免疫系が損なわれている人を含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の癌関連バイオマーカー（例えば、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＡ１２５、ヒト精巣上体タンパク質４（ＨＥ４）、および／または癌胎児性抗原（ＣＥＡ））の高いレベルを示す患者を治療するために使用されてよい。例えば、本発明の方法は、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、高いレベルのＰＤ－Ｌ１および／またはＣＡ１２５を有する患者に投与することを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、卵巣癌を有する対象に使用される。「腫瘍」、「癌」および「悪性腫瘍」という用語は、本明細書では区別なく使用される。「卵巣癌」という用語は、本発明で使用する場合、卵巣および卵管の腫瘍を指し、漿液性癌、類内膜癌、明細胞癌および粘液性癌を含む。

ある特定の実施形態によれば、本発明は、腫瘍を治療する、または腫瘍の増殖を遅延させるもしくは阻害するための方法を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、腫瘍退縮を促進するための方法を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞量を減少させるまたは腫瘍量を減少させるための方法を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、腫瘍再発を予防するための方法を含む。本発明のこの態様による方法は、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、それを必要とする対象に連続的に投与することを含み、各抗体は、例えば特定の治療投薬レジメンの一部として、複数回用量で対象に投与される。例えば、治療投薬レジメンは、約１日に１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、４日ごとに１回、５日ごとに１回、６日ごとに１回、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、月に１回、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、またはそれ以下の頻度で、抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量を対象に投与することを含み得る。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量が、治療有効量の二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の１回以上の用量と組み合わせて投与され、ここで、二重特異性抗体の１回以上の用量は、約１日に１回、２日ごとに１回、３日ごとに１回、４日ごとに１回、５日ごとに１回、６日ごとに１回、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、月に１回、２か月ごとに１回、３か月ごとに１回、４か月ごとに１回、またはそれ以下の頻度で、対象に投与される。

ある特定の実施形態では、抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の各用量は、２つ以上の画分、例えば、所与の投与期間内に２～５つの画分（「分割投与」）で投与される。抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、抗体の投与に応答して誘導されるサイトカインの「スパイク」を減少させるまたは排除するために、分割用量で投与されてよい。サイトカインスパイクは、サイトカイン放出症候群（「サイトカインストーム」）および注入関連反応の臨床症状を指す。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の１回以上の用量と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含み、二重特異性抗体の用量は、分割用量として、または２つ以上の画分として、例えば、２つの画分として、３つの画分として、４つの画分として、または５つの画分として所与の投与期間内に投与される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体の用量は、２つ以上の画分に分割され、各画分は、他の画分に等しい量の抗体を含む。例えば、１０００マイクログラムを含む抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の用量は、週に１回投与されてもよく、用量は週内に２つの画分で投与され、各画分は５００マイクログラムを含む。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体の用量は、２つ以上の画分に分割投与され、各画分は、例えば、第１の画分を超えるかまたは第１の画分より少ない、不等な量の抗体を含む。例えば、１０００マイクログラムを含む抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の用量は、週に１回投与されてもよく、用量は週内に２つの画分で投与され、第１の画分は７００マイクログラムを含み、第２の画分は３００マイクログラムを含む。別の例として、１０００マイクログラムを含む抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の用量は、２週に１回投与されてもよく、用量は２週内に３つの画分で投与され、第１の画分は４００マイクログラムを含み、第２の画分は３００マイクログラムを含み、第３の画分は３００マイクログラムを含む。

ある特定の実施形態では、本発明は、末梢器官への腫瘍転移または腫瘍浸潤を阻害、遅延または停止させるための方法を含む。この態様による方法は、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体を、それを必要とする対象に、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて投与することを含む。

特定の実施形態では、本発明は、抗腫瘍効果の増加または腫瘍阻害の増加のための方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、治療有効量の二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体を投与する前に、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体を、卵巣癌を有する対象に投与することを含み、ここで、抗ＰＤ－１抗体は、二重特異性抗体の約１日前に、１日前よりも前に、２日前よりも前に、３日前よりも前に、４日前よりも前に、５日前よりも前に、６日前よりも前に、７日前よりも前に、または８日前よりも前に投与されてよい。ある特定の実施形態では、この方法は、抗ＰＤ－１抗体の前に二重特異性抗体を投与された対象と比較して、例えば、約２０％、２０％より多く、３０％より多く、４０％より多く、５０％より多く、６０％より多く、７０％より多く、または８０％より多く増加した腫瘍阻害を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体および治療有効量の二重特異性抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６抗体を、卵巣癌を有する対象に投与することを含む。特定の実施形態では、卵巣癌は漿液性癌である。さらなる実施形態では、卵巣癌は無痛性または高悪性度である。ある特定の実施形態では、対象が、以前の療法に応答しないか、または以前の療法後に再発している。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、追加の治療薬を対象に投与することをさらに含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、治療有効量の二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体を、ＭＵＣ１６＋癌を有する対象に投与することを含む。特定の実施形態では、癌は卵巣癌である。さらなる実施形態では、卵巣癌は無痛性または高悪性度である。いくつかの実施形態では、癌は白金耐性の卵巣癌である。いくつかの実施形態では、癌はタキソール耐性の卵巣癌である。いくつかの実施形態では、癌は卵管癌である。いくつかの実施形態では、癌は原発性腹膜癌であり、任意に、患者は血清ＣＡ－１２５の高いレベルを有する。特定の実施形態では、癌は膵臓癌（例えば、膵臓腺癌）である。ある特定の実施形態では、対象が、以前の療法に応答しないか、または以前の療法（例えば、化学療法）後に再発している。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、「第一選択」治療（例えば、初回治療）として、抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。他の実施形態では、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体は、「第二選択」治療として（例えば、以前の療法後）投与される。例えば、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体は、例えば化学療法による以前の療法後に再発した対象に「第二選択」治療として投与される。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＭＲＤ陽性疾患を有する患者を治療するために使用される。微小残存病変（ＭＲＤ）とは、治療中または治療後に患者に残る少数の癌細胞を指し、患者は疾患の症状または徴候を示す場合と示さない場合がある。そのような残存癌細胞は、排除されない場合、疾患の再発につながることがよくある。本発明は、ＭＲＤ試験時に患者の残存癌細胞を阻害および／または排除する方法を含む。ＭＲＤは、当技術分野で既知である方法（例えば、ＭＲＤフローサイトメトリー）に従ってアッセイすることができる。本発明のこの態様による方法は、抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、それを必要とする対象に投与することを含む。

ある特定の実施形態によれば、本発明の方法は、第３の治療薬と組み合わせて、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体のそれぞれを対象に投与することを含む。第３の治療薬は、例えば、放射線、化学療法、手術、癌ワクチン、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＬＡＧ３阻害剤（例えば、抗ＬＡＧ３抗体）、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、Ａｎｇ２阻害剤、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ムチン－１、ＭＡＲＴ－１およびＣＡ１９－９）、ワクチン（例えば、カルメット－ゲラン桿菌）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、細胞毒素、化学療法剤、ＩＬ－６Ｒ阻害剤、ＩＬ－４Ｒ阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５）抗炎症剤（例えばコルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬）、および栄養補助食品（例えば抗酸化剤）からなる群より選択される薬剤であってよい。ある特定の実施形態では、抗体は、化学療法剤（例えば、パクリタキセル、カルボプラチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、シスプラチン、ゲムシタビンまたはドセタキセル）、放射線および手術を含む療法と組み合わせて投与されてよい。本明細書で使用する場合、「と組み合わせて」という句は、抗体が、第３の治療薬の投与と同時に、その直前、または直後に対象に投与されることを意味する。ある特定の実施形態では、第３の治療薬は、抗体を有する共製剤として投与される。関連する実施形態では、本発明は、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、バックグラウンド抗癌治療レジメンのある対象に投与することを含む方法を含む。バックグラウンド抗癌治療レジメンは、例えば、化学療法剤または放射線の投与経過を含み得る。二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体は、バックグラウンドの抗癌治療レジメンにさらに追加され得る。いくつかの実施形態では、抗体は「バックグラウンドステップダウン」方式の一部として追加され、一定用量で、または増加用量で、または減少用量で、抗体を、時間をかけて対象に投与しながら、バックグラウンド抗癌療法は、時間をかけて（例えば、段階的な方法で）対象から徐々に中止される。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体を投与することを含み、ここで抗体の投与は、腫瘍増殖の阻害の増加をもたらす。ある特定の実施形態では、腫瘍増殖は、未治療の対象または単剤療法としていずれかの抗体を投与された対象と比較して、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％阻害される。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与は、腫瘍退縮、腫瘍縮小および／または消失の増加をもたらす。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与は、腫瘍増殖および発症の遅延をもたらし、例えば、腫瘍増殖は、未治療の対象または単剤療法としていずれかの抗体で治療された対象と比較して、約３日、３日より長く、約７日、７日より長く、１５日より長く、１か月より長く、３か月より長く、６か月より長く、１年より長く、２年より長く、または３年より長く遅延され得る。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体の投与は、腫瘍の再発を予防し、かつ／または対象の生存期間を増加させ、例えば、未治療の対象もしくは単剤療法としていずれかの抗体を投与される対象に比べて、生存期間を１５日より長く、１か月より長く、３か月より長く、６か月より長く、１２か月より長く、１８か月より長く、２４か月より長く、３６か月より長く、または４８か月より長く増加させる。ある特定の実施形態では、抗体の組み合わせの投与は、無増悪生存期間または全生存期間を増加させる。ある特定の実施形態では、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体の投与は、対象の応答および応答期間を、未治療の対象または単剤療法としていずれかの抗体を投与された対象より、例えば２％より多く、３％より多く、４％より多く、５％より多く、６％より多く、７％より多く、８％より多く、９％より多く、１０％より多く、２０％より多く、３０％より多く、４０％より多くまたは５０％より多く増加させる。ある特定の実施形態では、卵巣癌を有する対象への抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与は、腫瘍細胞の全ての証拠の完全な消失（「完全奏功」）をもたらす。ある特定の実施形態では、卵巣癌を有する対象への抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与は、腫瘍細胞または腫瘍サイズの少なくとも３０％以上の減少（「部分奏功」）をもたらす。ある特定の実施形態では、卵巣癌を有する対象への抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与は、新しい測定可能な病変を含む腫瘍細胞／病変の完全または部分的な消失をもたらす。腫瘍減少は、当技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、Ｘ線、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、細胞学、組織学または分子遺伝子解析によって測定できる。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与は、単独で投与された場合の２つの薬剤の複合効果を超える相乗的な抗腫瘍効果を生み出す。

ある特定の実施形態では、投与された抗体の組み合わせは、安全であり、患者によって十分に許容され、単剤療法として二重特異性抗体を投与された患者と比較して、有害な副作用の増加（例えば、サイトカイン放出の増加（「サイトカインストーム」）またはＴ細胞活性化の増加）はない。

抗ＰＤ－１抗体およびその抗原結合断片
本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、この方法は、治療有効量の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む。「抗体」という用語は、本発明で使用する場合、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。典型的な抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに細分することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明の異なる実施形態では、抗ＩＬ－４Ｒ抗体（もしくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全抗体分子の抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」という用語、およびこれらに類するものは、本発明で使用する場合、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合断片は、例えば、抗体可変ドメインおよび場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な立体配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。

抗体結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基、または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドからなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール型免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用する「抗原結合断片」という表現に包含される。

抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているか、または１つ以上のフレームワーク配列とインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。Ｖ_Ｌドメインと結合したＶ_Ｈドメインを有する抗体結合断片において、Ｖ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置し得る。例えば、可変領域は二量体であり、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ二量体を含み得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインを含み得る。

ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に見出すことができる可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的立体配置としては、（ｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ３、（ｉｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｖ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｖｉｉ）Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｌ、（ｖｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１、（ｉｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２、（ｘ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２、（ｘｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、（ｘｉｉｉ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３、および（ｘｉｖ）Ｖ_Ｌ－Ｃ_Ｌが挙げられる。先に列挙した例示的立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの任意の立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の連結をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとのおよび／または１つ以上の単量体Ｖ_ＨドメインもしくはＶ_Ｌドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。

本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を含む。多重特異性抗体または抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別々の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。任意の多重特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体または抗体の抗原結合断片の文脈において使用に適合し得る。例えば、本発明は、二重特異性抗体の使用を含む方法を含み、免疫グロブリンの一方のアームがＰＤ－１またはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他方のアームが第２の治療標的に特異的であるか、または治療部分にコンジュゲートしている。本発明の文脈において使用することができる例示的な二重特異性フォーマットとしては、例えば、ｓｃＦｖベースのまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、クワドローマ（Ｑｕａｄｒｏｍａ）、ノブズ－イントゥ－ホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ．ｓｕｐ．２二重特異性フォーマットが挙げられるが、限定するものではない（上述のフォーマットの総説については、例えばＫｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびこの中で引用されている参考文献を参照のこと）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸結合を用いて構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド複合体を生成し、これが次に、規定される組成物、原子価および幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照のこと）。

本発明の方法で使用される抗体は、ヒト抗体であり得る。「ヒト抗体」という用語は、本発明で使用する場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが企図される。それにもかかわらず、本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。ただし、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列へと移植された抗体を含むことを意図するものではない。

本発明の方法で使用される抗体は、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体など組換え手段によって調製、発現、作成または単離される全てのヒト抗体（後述）、組換え型コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（後述）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離される抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。ただし、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニック動物が使用される場合は、インビボ体細胞変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ配列に由来し関連してはいるが、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。

ある特定の実施形態によれば、本発明の方法で使用される抗体はＰＤ－１に特異的に結合する。「特異的に結合する」または同様の用語は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定である抗原と複合体を形成することを意味する。抗体が抗原に特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。例えば、本発明の文脈において使用されるＰＤ－１に「特異的に結合する」抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイで測定した場合に、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満もしくは約０．５ｎＭ未満のＫ_ＤでＰＤ－１またはその部分に結合する抗体を含む。ただし、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する単離された抗体は、他の（非ヒト）種由来のＰＤ－１分子などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。

本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、抗ＰＤ－１抗体、またはその抗原結合断片は、米国特許公開第２０１５／０２０３５７９号に記載の抗ＰＤ－１抗体のいずれかのアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の方法の文脈において使用することができる抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）、および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む。ある特定の実施形態によれば、抗ＰＤ－１抗体、またはその抗原結合断片は、３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）ならびに３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３３を含むＨＣＶＲ、および配列番号３４を含むＬＣＶＲを含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、抗ＰＤ－１抗体の使用を含み、抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む例示的な抗体は、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブとしても既知）として既知である完全ヒト抗ＰＤ－１抗体である。ある特定の例示的な実施形態によれば、本発明の方法は、ＲＥＧＮ２８１０またはその生物学的等価物の使用を含む。本明細書で使用される「生物学的等価物」という用語は、類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および／または吸収の程度が、ＲＥＧＮ２８１０との有意差を示さない医薬的等価物または医薬的選択肢である、抗ＰＤ－１抗体またはＰＤ－１結合タンパク質またはその断片を指す。本発明の文脈において、この用語は、安全性、純度、および／または効力において、ＲＥＧＮ２８１０と臨床的に意味のある差を有さない、ＰＤ－１に結合する抗原結合タンパク質を指す。

本発明の方法の文脈において使用することができる他の抗ＰＤ－１抗体としては、例えば、ニボルマブ（米国特許第８，００８，４４９号）、ペムブロリズマブ（米国特許第８，３５４，５０９号）、ＭＥＤＩ０６０８（米国特許第８，６０９，０８９号）、ピディリズマブ（米国特許第８，６８６，１１９号）、または米国特許第６，８０８，７１０号、同第７，４８８，８０２号、同第８，１６８，７５７号、同第８，３５４，５０９号、同第８，７７９，１０５号、もしくは同第８，９００，５８７号に示される抗ＰＤ－１抗体のいずれかとして呼ばれかつ当技術分野で既知である抗体が挙げられる。

本発明の方法の文脈において使用される抗ＰＤ－１抗体は、ｐＨ依存性の結合特性を有し得る。例えば、本発明の方法において使用される抗ＰＤ－１抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでＰＤ－１への結合の低下を示し得る。あるいは、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨでその抗原への増強された結合を示し得る。「酸性ｐＨ」との表現は、約６．２未満、例えば、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０、またはそれ未満のｐＨ値を含む。本発明で使用する場合、「中性ｐＨ」との表現は、約７．０～約７．４のｐＨを意味する。「中性ｐＨ」との表現は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、および７．４のｐＨ値を含む。

ある特定の場合では、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでＰＤ－１への結合の低下」は、中性ｐＨでＰＤ－１に結合する抗体のＫ_Ｄ値に対する酸性ｐＨでＰＤ－１に結合する抗体のＫ_Ｄ値の比に関して、表される（またはその逆）。例えば、抗体またはその抗原結合断片が約３．０以上の酸性／中性Ｋ_Ｄ比を示す場合、本発明の目的のために、抗体またはその抗原結合断片は「中性ｐＨと比較して酸性ｐＨではＰＤ－１への結合の低下」を示すとみなされ得る。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片の酸性／中性Ｋ_Ｄ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０、またはそれ以上であり得る。

ｐＨ依存性結合特性を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで特定の抗原への結合の低下（または増強）について抗体の集団をスクリーニングすることによって得ることができる。さらに、アミノ酸レベルでの抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存的特性を有する抗体を産生し得る。例えば、抗原結合ドメイン（例えばＣＤＲ内）の１つ以上のアミノ酸をヒスチジン残基で置換することにより、中性ｐＨに対して酸性ｐＨで抗原結合が低下した抗体を得ることができる。本発明で使用する場合、「酸性ｐＨ」との表現は６．０以下のｐＨを意味する。

二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体
本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、この方法は、ＣＤ３およびＭＵＣ１６に特異的に結合する治療有効量の二重特異性抗体を投与することを含む。そのような抗体は、本明細書において、例えば、「抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３」、または「抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３」もしくは「ＭＵＣ１６×ＣＤ３」二重特異性抗体、または他の同様の用語と呼ばれてもよい。

本発明で使用する場合、「二重特異性抗体」という表現は、少なくとも第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質を指す。本発明の文脈において、第１の抗原結合ドメインは第１の抗原（例えばＭＵＣ１６）に特異的に結合し、第２の抗原結合ドメインは第２の異なる抗原（例えばＣＤ３）に特異的に結合する。二重特異性抗体の各抗原結合ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲを含む、重鎖可変ドメイン（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変ドメイン（ＬＣＶＲ）を含む。二重特異性抗体の文脈において、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは接頭辞「Ａ」を付けて指定され、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは接頭辞「Ｂ」を付けて指定され得る。したがって、第１の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＡ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２、およびＡ－ＨＣＤＲ３と呼ばれてもよく、第２の抗原結合ドメインのＣＤＲは、本明細書においてＢ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、およびＢ－ＨＣＤＲ３と呼ばれてもよい。

第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、それぞれ別々の多量体化ドメインに連結される。本発明で使用する場合、「多量体化ドメイン」は、同一または類似の構造または構成の第２の多量体化ドメインと会合する能力を有する任意の高分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはアミノ酸である。本発明の文脈において、多量体化成分は、免疫グロブリンのＦｃ部分（Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインを含む）、例えばアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧのＦｃドメイン、ならびに各アイソタイプ群内のアロタイプである。

本発明の二重特異性抗体は、典型的には２つの多量体化ドメイン、例えば、それぞれ別々の抗体重鎖の一部である２つのＦｃドメインを含む。第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ１、ＩｇＧ２／ＩｇＧ２、ＩｇＧ４／ＩｇＧ４などの同じＩｇＧアイソタイプであり得る。あるいは、第１および第２の多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、ＩｇＧ１／ＩｇＧ４、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４などの異なるＩｇＧアイソタイプのものであり得る。

任意の二重特異性抗体フォーマットまたは技術を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製することができる。例えば、第１の抗原結合特異性を有する抗体またはその断片は、第２の抗原結合性を有する他の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合などにより）機能的に連結されて、二重特異性抗原結合分子を生成することができる。本発明の文脈において使用できる特定の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ－イントゥ－ホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ_２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ４：６，１－１１、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。

本発明の二重特異性抗体の文脈において、Ｆｃドメインは、野生型の、天然に存在するＦｃドメインと比較して、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、挿入、欠失または置換）を含んでもよい。例えば、本発明は、ＦｃとＦｃＲｎとの間の修飾された結合相互作用（例えば、増強または減少）を有する修飾Ｆｃドメインをもたらす、Ｆｃドメイン中の１つ以上の修飾を含む二重特異性抗原結合分子を含む。一実施形態では、二重特異性抗原結合分子は、Ｃ_Ｈ２またはＣ_Ｈ３領域に修飾を含み、この修飾は酸性環境（例えば、ｐＨ範囲約５．５～約６．０のエンドソーム内）において、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を高める。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例は、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１５／０２６６９６６号に開示されている。

本発明はまた、第１のＣ_Ｈ３ドメインおよび第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインを含む二重特異性抗原結合分子を含み、第１および第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を欠いている二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態では、第１のＩｇＣ_Ｈ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇＣ_Ｈ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによる、ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣ_Ｈ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号を参照のこと。第２のＣ_Ｈ３内に見出され得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴであって、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。

ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するＦｃ配列を組み合わせたキメラであり得る。例えば、キメラＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４のＣ_Ｈ２領域に由来するＣ_Ｈ２配列の一部または全て、およびヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４に由来するＣ_Ｈ３配列の一部または全てを含むことができる。キメラＦｃドメインはまた、キメラヒンジ領域を含み得る。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」配列を含むことができる。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの特定の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ４Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ４上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ＣＨ２］－［ＩｇＧ４ＣＨ３］を含む。本明細書に記載の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインの別の例は、Ｎ末端からＣ末端に、［ＩｇＧ１Ｃ_Ｈ１］－［ＩｇＧ１上部ヒンジ］－［ＩｇＧ２下部ヒンジ］－［ＩｇＧ４ＣＨ２］－［ＩｇＧ１ＣＨ３］を含む。本発明の抗原結合分子のいずれかに含まれ得るキメラＦｃドメインのこれらおよび他の例は、米国特許公開第２０１４／０２４３５０４号に記載されており、その全体が本明細書に組み込まれる。これらの一般的な構造配置を有するキメラＦｃドメイン、およびその変異体は、Ｆｃ受容体結合を変えることができ、そのことがＦｃエフェクター機能に影響を及ぼす。

本発明のある特定の例示的な実施形態によれば、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲおよびＢ－ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲおよびＢ－ＬＣＶＲ）、ならびに／または米国特許公開第２０１８／０１１２００１号に記載されている二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の任意のアミノ酸配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の方法の文脈において使用することができる二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（Ａ－ＨＣＶＲ）の重鎖相補性決定領域（Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２、およびＡ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（Ａ－ＬＣＶＲ）の軽鎖相補性決定領域（Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２、およびＡ－ＬＣＤＲ３）とを含む第１の抗原結合アームと、（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ（Ｂ－ＨＣＶＲ）の重鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２およびＢ－ＨＣＤＲ３）と、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ（Ｂ－ＬＣＶＲ）の軽鎖ＣＤＲ（Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３）とを含む第２の抗原結合アームと、を含む。ある特定の実施形態によれば、Ａ－ＨＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＨＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ａ－ＬＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ１が配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３または配列番号２６のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ２が配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４または配列番号２７のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＨＣＤＲ３が配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２５または配列番号２８のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、Ｂ－ＬＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含む。さらに他の実施形態では、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１を含むＨＣＶＲ（Ａ－ＨＣＶＲ）および配列番号２を含むＬＣＶＲ（Ａ－ＬＣＶＲ）を含む第１の抗原結合アームと、（ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７を含むＨＣＶＲ（Ｂ－ＨＣＶＲ）および配列番号２を含むＬＣＶＲ（Ｂ－ＬＣＶＲ）を含む第２の抗原結合アームとを含む。ある特定の例示的な実施形態では、二重特異性抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＭＵＣ１６結合アームと、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＣＤ３結合アームとを含む。ある特定の例示的な実施形態では、二重特異性抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＭＵＣ１６結合アームと、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗ＣＤ３結合アームとを含む。

ある特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗ＣＤ３×ＭＵＣ１６抗体の抗腫瘍活性は、高レベル（例えば、最大１０，０００Ｕ／ｍｌ）の循環ＣＡ１２５の存在によって実質的に妨げられない。ＣＡ１２５の血清レベルは、大多数の卵巣癌患者の血清で増加している（公表されているレベルの中央値は約６５６Ｕ／ｍｌである）。以下の実施例２に示されるように、血清または腹水中の高レベルのＣＡ１２５は、本発明の二重特異性抗体の抗腫瘍プロファイルを著しく妨げない。

本発明の方法の文脈において使用することができる他の二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体には、例えば、米国特許公開第２０１８／０１１２００１号に記載の任意の抗体が含まれる。

併用療法
ある特定の実施形態によれば、本発明の方法は、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて、抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、癌、好ましくは卵巣癌を治療するための相加的または相乗的活性のための抗体を投与することを含む。本発明で使用する場合、「と組み合わせて」という表現は、抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体が、抗ＰＤ－１抗体の前に、後に、または同時に投与されることを意味する。「と組み合わせて」という用語はまた、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の連続的または同時投与を含む。例えば、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の「前に」投与される場合、抗ＰＤ－１抗体は、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与の１５０時間前より前に、約１５０時間前に、約１００時間前に、約７２時間前に、約６０時間前に、約４８時間前に、約３６時間前に、約２４時間前に、約１２時間前に、約１０時間前に、約８時間前に、約６時間前に、約４時間前に、約２時間前に、約１時間前に、約３０分前に、約１５分前にまたは約１０分前に投与され得る。二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の「後に」投与される場合、抗ＰＤ－１抗体は、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与の約１０分後に、約１５分後に、約３０分後に、約１時間後に、約２時間後に、約４時間後に、約６時間後に、約８時間後に、約１０時間後に、約１２時間後に、約２４時間後に、約３６時間後に、約４８時間後に、約６０時間後に、約７２時間後に、または７２時間後より後に投与され得る。二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と「同時」投与することは、抗ＰＤ－１抗体が、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の投与の５分未満以内（前に、後にまたは同時に）に別々の剤形で対象に投与されるか、または抗ＰＤ－１抗体と二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の両方を含む単一の併用剤形として対象に投与されることを意味する。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、第３の治療薬の投与を含み、第３の治療薬は抗癌剤である。本発明で使用する場合、「抗癌剤」は、細胞毒素、ならびに代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’－（ＤＤＤ））、生物製剤（例えば、抗体およびインターフェロン）、および放射性薬剤などの薬剤を含む癌を治療するために有用な任意の薬剤を意味するが、これらに限定されない。本発明で使用する場合、「細胞毒素または細胞毒性剤」は、化学療法剤も指し、細胞に有害である任意の薬剤を意味する。例としては、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）、テモゾラミド、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、シスプラチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンビアスチン、コイチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、放射線、手術、癌ワクチン、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤（例えば、イピリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤またはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０またはＶＩＳＴＡに対する抗体）、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、「ＶＥＧＦ－トラップ」（例えば、米国特許第７，０８７，４１１号に記載のアフリベルセプトもしくは他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ベバシズマブもしくはラニビズマブ）、もしくはＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブもしくはパゾパニブ））］、Ａｎｇ２阻害剤（例えば、ネスバクマブ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、共刺激受容体に対するアゴニスト（例えば、糖質コルチコイドを誘導されたＴＮＦＲ関連タンパク質に対するアゴニスト）、腫瘍特異性抗原に対する抗体（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、黒色腫関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ムチン－１、ＭＡＲＴ－１およびＣＡ１９－９）、ワクチン（例えば、カルメット‐ゲラン桿菌、癌ワクチン）、抗原提示を増加させるアジュバント（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、細胞毒素、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロマイド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキセート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセルおよびビンクリスチン）、放射線治療、ＩＬ－６Ｒ阻害剤（例えば、サリルマブ）、ＩＬ－４Ｒ阻害剤（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ－１０阻害剤、サイトカイン（例えばＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５）抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９－ＤＭ４ ＡＤＣおよび抗ＤＳ６－ＤＭ４ ＡＤＣ）、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（例えば、ＣＤ１９標的化Ｔ細胞）、抗炎症剤（例えば、コルチコステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬）、ならびに栄養補助食品（例えば抗酸化剤）からなる群より選択される第３の治療薬の投与を含む。

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、放射線療法と組み合わせて、抗ＰＤ－１抗体および抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体を投与して、長期持続性の抗腫瘍応答を生成し、および／または癌を有する患者の生存を高めることを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、癌患者に抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体を投与する前に、同時に、または後に放射線療法を投与することを含む。例えば、放射線療法は、抗体の１回以上の用量を投与後に、腫瘍病変に１回以上の用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、放射線療法は、抗ＰＤ－１抗体および／または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の全身投与後に、患者の腫瘍の局所免疫原性を増強（作用性放射線）および／または腫瘍細胞を死滅（切除性放射線）するために、腫瘍病変に局所投与されてもよい。ある特定の実施形態では、抗体は、放射線療法および化学療法剤（例えば、カルボプラチンおよび／またはパクリタキセル）またはＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト）と組み合わせて投与されてもよい。

医薬組成物および投与
本発明は、抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、対象に投与することを含む方法を含み、抗体は、別々または組み合わせた（単一）医薬組成物の中に含まれる。本開示の医薬組成物は、好適な担体、賦形剤、および好適な移動、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に製剤化され得る。多くの適切な製剤は、製薬化学者全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａにおいて見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。

様々な送達系は既知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルにおける封入、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。投与方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、硝子体内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮もしくは粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通じての吸収による何らかの簡便な経路によって投与され得、他の生物学的に活性のある薬剤と共に投与され得る。

本発明の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。さらに、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の医薬組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の医薬組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された医薬組成物が事前に充填されている。一度、貯蔵器が医薬組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。

特定の状況において、医薬組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａを参照されたい。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、それによって全身用量のほんの一部のみが必要となる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の徐放系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３による総説で論じられている。

注入可能な調製物には、静脈内注入、皮下注入、皮内注入、および筋肉内注入、点滴注入などのための投薬形態が含まれ得る。これらの注入可能な調製物は、既知の方法により調製され得る。例えば、注入可能な調製物は、例えば、注入用に従来どおり使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注入用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。

有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。単位用量におけるこのような投薬形態には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル剤）、坐剤などが含まれる。

投与レジメン
本発明は、週に約４回、週に２回、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、８週ごとに１回、１２週ごとに１回の投薬頻度、または治療応答が達成される限りそれ以下の頻度で、対象に抗ＰＤ－１抗体を投与することを含む方法を含む。ある特定の実施形態では、本発明は、週に約４回、週に２回、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、８週ごとに１回、１２週ごとに１回の投薬頻度、または治療応答が達成される限りそれ以下の頻度で、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体を対象に投与することを含む方法を含む。ある特定の実施形態では、方法は、週に約４回、週に２回、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、５週ごとに１回、６週ごとに１回、８週ごとに１回、９週ごとに１回、１２週ごとに１回の投薬頻度、または治療応答が達成される限りそれ以下の頻度で、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、抗ＰＤ－１抗体を投与することを含む。

本発明のある特定の実施形態によれば、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ－１抗体の複数回用量は、既定される時間経過にわたって対象に投与され得る。本発明のこの態様による方法は、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の１回以上の用量と組み合わせて、抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量を対象に連続的に投与することを含む。本発明で使用する場合、「連続的に投与すること」は、抗体の各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、または数か月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。本発明には、抗ＰＤ－１抗体の単回の１次用量と、それに続く抗ＰＤ－１抗体の１回以上の２次用量、次いで場合により抗ＰＤ－１抗体の１回以上の３次用量を患者へ連続的に投与することを含む方法が含まれる。ある特定の実施形態では、方法は、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の単回の１次用量と、それに続く二重特異性抗体の１回以上の２次用量、次いで場合により二重特異性抗体の１回以上の３次用量を患者へ連続的に投与することをさらに含む。

本発明のある特定の実施形態によれば、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の複数回用量は、既定される時間経過にわたって対象に投与され得る。本発明のこの態様による方法は、抗ＰＤ－１抗体および二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の複数回用量を対象へ連続的に投与することを含む。本発明で使用する場合、「連続的に投与すること」は、抗ＰＤ－１抗体の各用量が、二重特異性抗体と組み合わせて、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、または数か月）よって分けられた異なる日に、対象へ投与されることを意味する。

「１次用量」、「２次用量」、および「３次用量」という用語は、投与の時系列を指す。したがって、「１次用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称する）であり、「２次用量」とは、１次用量後に投与される用量であり、「３次用量」とは、２次用量後に投与される用量である。１次用量、２次用量、および３次用量は全て、同じ量の抗体（抗ＰＤ－１抗体または二重特異性抗体）を含み得る。ただし、ある特定の実施形態では、１次用量、２次用量および／または３次用量に含まれる量は、治療経過の間、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態では、１回以上（例えば、１回、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。例えば、抗ＰＤ－１抗体は、約１～３ｍｇ／ｋｇの負荷用量で卵巣癌を有する患者に投与され得、続いて、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の維持用量で投与され得る。

本発明の一例示的な実施形態では、各２次用量および／または３次用量は、直前の用量の１／２～１４（例えば、１／２、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本発明で使用する場合、一連の複数回投与において、抗ＰＤ－１抗体（および／または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体）の用量を意味し、これは、介入用量のない直後の用量の投与の前に患者へ投与される。

本発明のこの態様による方法は、抗ＰＤ－１抗体（および／または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体）の２次用量および／または３次用量の任意の回数を患者へ投与することを含んでよい。例えば、ある特定の実施形態では、単回の２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の２次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単回の３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の３次用量が患者に投与される。

複数回の２次用量を伴う実施形態では、各２次用量は他の２次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各２次用量は、直前の用量の１～２週間後に患者に投与されてもよい。同様に、複数の３次用量を含む実施形態において、各３次用量は他の３次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各３次用量は、直前の用量の２～４週間後に患者に投与されてもよい。あるいは、２次用量および／または３次用量が患者へ投与される頻度は、治療計画の経過にわたって変動し得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。

ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体および／または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の１回以上の用量は、治療レジメンの開始時に、「誘導用量」としてより高い頻度ベースで（週に２回、週に１回または２週間に１回）投与され、続いて、その後の用量（「強化用量」または「維持量」）が低い頻度ベースで（例えば、４～１２週間に１回）投与される。

本発明は、抗ＰＤ－１抗体を、二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体と組み合わせて、卵巣癌（例えば、漿液性癌）を治療する患者に連続投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量、続いて二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の１回以上の用量を投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、抗ＰＤ－１抗体の単回投与、続いて二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の１回以上の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、卵巣癌を有する対象において腫瘍増殖を阻害し、および／または腫瘍再発を予防するために、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体の１回以上の用量を投与され得、続いて、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体の１回以上の用量を投与され得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は１回以上の用量で投与され、続いて、二重特異性抗体の１回以上の用量を投与され、その結果抗腫瘍効果の増加をもたらす（例えば、未治療の対象または単剤療法としていずれかの抗体を投与された対象と比較して、腫瘍増殖のより大きな阻害、腫瘍再発のより大きな予防）。本発明の代替の実施形態は、抗ＰＤ－１抗体と同様のまたは異なる頻度で別々の投与量で投与される、抗ＰＤ－１抗体と二重特異性抗体の同時投与に関する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＰＤ－１抗体の前に、後に、または同時に投与される。ある特定の実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＰＤ－１抗体を有する単一剤形として投与される。

投与量
本発明の方法に従って対象に投与される抗ＰＤ－１抗体および／または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の量は、一般には治療有効量である。本発明で使用する場合、「治療有効量」という句は、以下の１つ以上をもたらす抗体の量（抗ＰＤ－１抗体または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体）を意味する：（ａ）癌（例えば、卵巣癌）の重症度または症状の持続期間の減少、（ｂ）腫瘍増殖の阻害、または腫瘍壊死、腫瘍縮小および腫瘍消失の増加、（ｃ）腫瘍増殖および発症の遅延、（ｄ）腫瘍転移の阻害または遅延または停止、（ｅ）腫瘍増殖の再発の予防、（ｆ）癌を有する対象の生存の増加、ならびに／または（ｇ）未治療の対象もしくは単剤療法としていずれかの抗体を投与された対象と比較した、従来の抗癌剤療法の使用または必要性の減少（例えば、化学療法剤もしくは細胞傷害性薬剤の使用の減少または排除）。

抗ＰＤ－１抗体の場合では、治療有効量は、約０．０５ｍｇ～約６００ｍｇの抗ＰＤ－１抗体、例えば、約０．０５ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇまたは約６００ｍｇである。ある特定の実施形態では、２５０ｍｇの抗ＰＤ－１抗体が投与される。

二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体の場合では、治療有効量は、約１０マイクログラム（ｍｃｇ）～約８０００ｍｃｇの二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体、例えば、約１０ｍｃｇ、約２０ｍｃｇ、約５０ｍｃｇ、約７０ｍｃｇ、約１００ｍｃｇ、約１２０ｍｃｇ、約１５０ｍｃｇ、約２００ｍｃｇ、約２５０ｍｃｇ、約３００ｍｃｇ、約３５０ｍｃｇ、約４００ｍｃｇ、約４５０ｍｃｇ、約５００ｍｃｇ、約５５０ｍｃｇ、約６００ｍｃｇ、約７００ｍｃｇ、約８００ｍｃｇ、約９００ｍｃｇ、約１０００ｍｃｇ、約１０５０ｍｃｇ、約１１００ｍｃｇ、約１５００ｍｃｇ、約１７００ｍｃｇ、約２０００ｍｃｇ、約２０５０ｍｃｇ、約２１００ｍｃｇ、約２２００ｍｃｇ、約２５００ｍｃｇ、約２７００ｍｃｇ、約２８００ｍｃｇ、約２９００ｍｃｇ、約３０００ｍｃｇ、約４０００ｍｃｇ、約５０００ｍｃｇ、約６０００ｍｃｇ、約７０００ｍｃｇまたは約８０００ｍｃｇであり得る。

個々の用量に含有される抗ＰＤ－１抗体または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体のいずれかの量は、患者の体重キログラム当たりの抗体のミリグラム（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）に関して表され得る。ある特定の実施形態では、本発明の方法で使用される抗ＰＤ－１抗体または二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体のいずれかが、対象の体重の約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇの用量で、対象に投与され得る。例えば、抗ＰＤ－１抗体は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。二重特異性抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３抗体は、患者の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。

本明細書で参照される配列および対応する配列番号のまとめを、以下の表１に示す。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。

実施例１：卵巣細胞特異的（ＭＵＣ１６）およびＣＤ３に結合する二重特異性抗体の産生
本発明は、ＣＤ３およびＭＵＣ１６に結合する二重特異性抗原結合分子を提供し、このような二重特異性抗原結合分子はまた、本明細書において「抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３または抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性分子」とも呼ばれる。抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性分子の抗ＭＵＣ１６部分は、ＭＵＣ１６（ＣＡ－１２５としても既知）を発現する腫瘍細胞を標的化するのに有用であり、二重特異性分子の抗ＣＤ３部分は、Ｔ細胞を活性化するのに有用である。腫瘍細胞上のＭＵＣ１６およびＴ細胞上のＣＤ３の同時結合は、活性化Ｔ細胞によって標的腫瘍細胞の直接死滅（細胞溶解）を促進する。

抗ＭＵＣ１６特異的結合ドメインおよび抗ＣＤ３特異的結合ドメインを含む二重特異性抗体を、標準的な方法を用いて構築し、抗ＭＵＣ１６抗原結合ドメインおよび抗ＣＤ３抗原結合ドメインがそれぞれ共通のＬＣＶＲと対をなす異なる別個のＨＣＶＲを含む。例示的な二重特異性抗体では、抗ＣＤ３抗体由来の重鎖、抗ＭＵＣ１６抗体由来の重鎖、および抗ＭＵＣ１６抗体由来の共通軽鎖を利用して分子を構築した。他の例では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３抗体由来の重鎖、抗ＭＵＣ１６抗体由来の重鎖、および抗ＣＤ３抗体由来の軽鎖、または乱雑であって、あるいは様々な重鎖アームと効果的に対をなすことが既知である抗体軽鎖を利用して構築され得る。

２０１４年８月２８日に公開された米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２４３５０４Ａ１号に記載の、ＩｇＧ１Ｆｃドメイン（ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、－００２、－００３、および－００４）または修飾（キメラ）ＩｇＧ４Ｆｃドメイン（ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５）を有する例示的な二重特異性抗体を製造した。

構築した様々な抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の抗原結合ドメインの構成部分のまとめを表２に示す。

実施例２：ＣＡ－１２５はインビトロで抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３抗体活性を妨げない
ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の活性に対する可溶性ＣＡ－１２５（ＭＵＣ１６の排出型）の影響は、卵巣癌患者の腹水から精製したＣＡ－１２５の高レベルの存在下で、ＦＡＣＳ結合および細胞傷害性アッセイを使用して評価された。ＣＡ－１２５レベルは、大多数の卵巣癌患者の血清で増加し、循環レベルは、抗原シンクとして作用することで任意のＭＵＣ１６標的化療法に影響を与える可能性がある。アッセイで使用されるＣＡ－１２５のレベル（１０，０００Ｕ／ｍｌ）は、卵巣癌患者の公表されているレベルの中央値６５６．６Ｕ／ｍＬをはるかに上回る。ヒトの腹水から濃縮された可溶性ＣＡ－１２５（ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ，ＮＹ，ＵＳＡ）またはＭＵＣ１６（ＭＵＣ１６Δ）の５つのカルボキシ末端ＳＥＡドメインを発現する膜近位構築および膜近傍領域の存在下で、ＭＵＣ１６発現ＯＶＣＡＲ－３細胞を死滅するＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の能力は、固定濃度（１００ｐＭ）のＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１またはＣＤ３結合対照抗体、およびＭＵＣ１６－１ＨまたはＭＵＣ１６Δのいずれかの段階希釈物を用いて、３７℃で７２時間、４：１のエフェクター／標的比率で実施された。ＭＵＣ１６保有標的細胞の特異的死滅をモニタリングするために、ＯＶＣＡＲ－３細胞を１ｕＭのバイオレット細胞トラッカーで標識した。標識後、細胞を３７℃で一晩播種した。別に、ヒトＰＢＭＣを１×１０^６細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地に播種し、粘着細胞を枯渇させることによってリンパ球を濃縮するために３７℃で一晩インキュベートした。翌日、標的細胞を、粘着細胞除去ナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞４：１の比率）、およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１またはＣＤ３結合対照のいずれかの段階希釈物と共に３７℃で７２時間インキュベートした。トリプシンを使用して細胞を細胞培養プレートから取り出し、ＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞を死／生の遠赤細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。死滅の特異性を評価するために、細胞をバイオレット細胞トラッカー標識集団にゲートした。調整生存率の計算のために、以下のように生きている標的細胞の割合を報告した。調整生存率＝（Ｒ１／Ｒ２）^＊１００であり、Ｒ１＝抗体の存在下で生きている標的細胞の％、およびＲ２＝試験抗体の非存在下で生きている標的細胞の％。Ｔ細胞活性化は、細胞をＣＤ２、ＣＤ６９およびＣＤ２５に直接コンジュゲートした抗体と共にインキュベートし、全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）のうち活性化された（ＣＤ６９＋）Ｔ細胞または（ＣＤ２５＋）Ｔ細胞の割合を報告することによって評価された。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびヒトの腹水から得られたＣＡ１２５にＣＡ－１２５（クローン３Ａ５）を結合することが既知である抗体の結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定された。簡潔に説明すると、ＰＢＳに４０００ユニット／ｍＬの濃度で可溶性ＣＡ－１２５（ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ，ＮＹ，ＵＳＡ）を、９６ウェルマイクロタイタープレートに４℃で一晩受動的に吸着させた。次に、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡにより１時間遮断した。ビオチン化ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＭＵＣ１６親抗体、ａ－ＭＵＣ１６ ３Ａ５および非結合対照（ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１アイソタイプ対照およびａ－ＭＵＣ１６ ３Ａ５アイソタイプ対照）を、ＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡに１０、１、０．３、または０．１ｎＭの濃度で１時間プレートに加え、続いて、ＰＢＳＴで洗浄した。１．０ｍｇ／ｍＬストック溶液の１：１００００希釈で、西洋ワサビペルオキシダーゼでコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ－ＨＲＰ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）をウェルに加えて、プレート結合ビオチン化抗体を検出するために１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、製造元の指示に従って３－３’，５－５’－テトラメチルベンジジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）基質で発色させた。Ｖｉｃｔｏｒ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）で、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を記録した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析した。

過剰なＣＡ－１２５は、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－０００１のＯＶＣＡＲ－３細胞への結合に最小限の影響しか与えず、ＣＡ－１２５への最小限の結合を示唆している（図１）。対照的に、ＣＡ－１２５は、ＭＵＣ１６の反復領域に結合する可能性が高い対照薬抗体（抗体クローン３Ａの自社バージョン）の能力を大幅に阻害した（図１）。さらに、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８／０６７３３１により詳細に示すように、ＭＵＣ１６（ＭＵＣ１６Δ）の５番目ＳＥＡドメインまでの近位領域を含む可溶性ＭＵＣ１６構築は、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の結合を劇的に阻害し、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１が膜近位領域に結合することを示した。結合試験と一致して、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、ＣＡ－１２５の存在下でもＴ細胞媒介性死滅を誘導する可能性があるが、高濃度のＭＵＣ１６Δの存在下では誘導する可能性はない（データは示さず）。したがって、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１はＭＵＣ１６に結合し、高濃度のＣＡ－１２５の存在下でもＴ細胞の再指向性死滅を誘導することができる。

実施例３：ＰＤ－１遮断は、異種および同系腫瘍モデルにおいて抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍活性を増強する。
ＰＤ－１遮断と組み合わせて抗ＭＵＣ１６／抗ＣＤ３二重特異性抗体のインビボでの有効性を、異種および同系腫瘍モデルで評価した。

Ａ．異種モデル－ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ
異種モデルについては、免疫不全ＮＳＧマウスに、ヒトＰＢＭＣを移植した１３日後に予めインビボで継代培養した（０日目）ＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。マウスを１２．５ｕｇ／マウスＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１で腹腔内処置するか、５日目と８日目に１２．５ｕｇのＣＤ３結合対照を単独でまたは１００ｕｇのＲＥＧＮ２８１０と組み合わせて投与した。腫瘍量は、腫瘍移植後４、８、１２、１５、２０および２５日目にＢＬＩによって評価された。２５日目のＢＬＩ測定によって決定されるように、１２．５ｕｇのＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１による処置は、ＢＬＩ測定によって決定された有意な抗腫瘍効果をもたらし、ＲＥＧＮ２８１０（抗ＰＤ－１）との組み合わせは抗腫瘍効果をさらに増強した。全ての群は、投与開始前にＢＬＩによって評価されたものと同様の腫瘍量を有していた。群間の腫瘍量に有意差はなかった。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、１２．５ｕｇで腫瘍量を有意に減少し、抗ＰＤ－１の追加により、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１単独の場合よりも抗腫瘍効果が増強する。ヒトＴ細胞を移植したＮＳＧマウスにヒトＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞を移植した。マウスを５日目および８日目に１２．５ｕｇのＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１を静脈内投与で、またはＣＤ３結合対照もしくは非結合対照（１２．５ｕｇ静脈内）で処置した。以下の表３に示すデータは、腫瘍移植後２５日目にＢＬＩによって評価された腫瘍量である。統計的有意性は、対応のないノンパラメトリックなマン・ホイットニーｔ検定を用いて決定された。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１＋／－ＲＥＧＮ２８１０による処置をＣＤ３結合対照と比較して（ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１について^＊ｐ＜０．０５、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびＲＥＧＮ２８１０について^＊＊ｐ＜０．０１）、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１単独の処置をＲＥＧＮ２８１０との組み合わせと比較した（＃ｐ＜０．０５）。

Ｂ．同系モデル－ＩＤ８－ＶＥＧＦ／ｈｕＭＵＣ１６
免疫適格モデルにおける有効性を調べるために、マウスＣＤ３遺伝子をヒトＣＤ３と置き換え、マウスＭＵＣ１６遺伝子の一部をヒト配列と置き換えた。置換により、そのＴ細胞がヒトＣＤ３を発現し、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５二重特異性抗体が結合するヒトＭＵＣ１６の一部を含むキメラＭＵＣ１６分子を発現するマウスが得られた。

この最初の同系腫瘍モデルでは、ヒトＭＵＣ１６の一部を発現するように操作されたＩＤ８－ＶＥＧＦ細胞株を使用した。マウスにＩＤ８－ＶＥＧＦ／ｈｕＭＵＣ１６細胞を腹腔内移植し、移植後３日目に、アイソタイプ対照と共にまたは抗ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ静脈内）と組み合わせて、５ｍｇ／ｋｇのＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１またはＣＤ３結合対照で処置した。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１での処置は、ＣＤ３結合対照を受けた群と比較して生存期間中央値が拡張するが、抗ＰＤ－１遮断の追加によってもマウスの５０％の生存率をもたらした。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、ＩＤ８－ＶＥＧＦ腹水モデルの生存期間中央値を有意に増加させ、ＰＤ－１（ＲＥＧＮ２８１０）遮断を追加すると、複数のマウスの生存が可能になる。マウスＣＤ３およびキメラＭＵＣ１６分子の代わりにヒトＣＤ３を発現するマウスに、ヒトＭＵＣ１６の一部を発現するマウス卵巣腫瘍株を移植した。移植後３日目に、アイソタイプ対照と共にまたは抗ＰＤ－１と共に、マウスにＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１（５ｍｇ／ｋｇ静脈内）を投与するか、またはＣＤ３結合対照（５ｍｇ／ｋｇ静脈内）を投与した。腫瘍移植後３、７、１０，１４、１７日目にマウスを処置した。示されるデータは生存期間中央値である。腹水誘導された腹部膨満のために体重増加が２０％を超えたときにマウスを屠殺した。統計的有意性は、Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ法を使用して決定された。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１とＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１＋抗ＰＤ－１との処置が、生存期間中央値の増加をもたらし、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１＋抗ＰＤ－１の組み合わせが５０％の生存率をもたらし、ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体と抗ＰＤ－１抗体との相乗効果を示した。結果を以下の表４に示す。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１を１ｍｇ／ｋｇで抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて投与した場合に同様の結果が観察された。

Ｃ．同系モデル－ＭＣ３８／ｈｕＭＵＣ１６
上述したように、本実験で使用したマウスは、マウスＣＤ３遺伝子をヒトＣＤ３と置き換え、マウスＭＵＣ１６遺伝子の一部をヒト配列と置き換えるように操作された。置換により、そのＴ細胞がヒトＣＤ３を発現し、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５二重特異性抗体が結合するヒトＭＵＣ１６の一部を含むキメラＭＵＣ１６分子を発現するマウスが得られた。

この２番目の同系腫瘍モデルでは、ヒトＭＵＣ１６の一部を発現するように操作されたＭＣ３８株を使用した。マウスにＭＣ３８／ｈｕＭＵＣ１６細胞を皮下移植し、腫瘍移植後７日目に、アイソタイプ対照（１ｍｇ／ｋｇ静脈内）と共にまたは抗ＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇ静脈内）と組み合わせて、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５またはＣＤ３結合対照で処置した。本実験で使用した抗ＰＤ－１抗体は、市販のマウス抗体（クローンＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）であった。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５と抗ＰＤ－１との組み合わせは、相乗的な抗腫瘍効果を示した。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５と抗ＰＤ－１遮断との組み合わせは、ＭＣ３８ＳＣモデルにおいてＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５単独よりも優れた抗腫瘍効果をもたらした。マウスＣＤ３およびキメラＭＵＣ１６分子の代わりにヒトＣＤ３を発現するマウスに、ヒトＭＵＣ１６の一部を発現するマウス腫瘍株ＭＣ３８を移植した。移植後７日目に、アイソタイプ対照と共にまたは抗ＰＤ－１抗体（５ｍｇ／ｋｇ静脈内）と共に、マウスにＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５を投与するか、またはＣＤ３結合対照（１ｍｇ／ｋｇ静脈内）を投与した。腫瘍移植後７、１１および１４日目にマウスを処置した。結果を図２に示す。統計的有意性は、テューキーの多重比較検定の二元配置分散分析を使用して決定された。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５＋抗ＰＤ－１により、ＣＤ３結合対照よりも有意かつ相乗的に腫瘍増殖が阻害された。

実施例４：操作されたマウスにおける免疫ＰＥＴイメージングは、Ｔ細胞に富む器官への抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の局在を示した
ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５のインビボでの局在ならびにＭＵＣ１６タンパク質の発現は、ＰＥＴイメージングを使用して、野生型および遺伝的ヒト化マウスで評価された。^８９Ｚｒ－標識抗ＭＵＣ１６抗体（二重特異性と同じ抗ＭＵＣ１６重鎖および軽鎖を使用して生成された二価抗ＭＵＣ１６抗体、ここでは「親」と呼ばれる）の生体内分布は、野生型マウスとヒト化マウスの両方で類似しており、抗体に対するヒト化ＭＵＣ１６タンパク質の発現／有無が低いことを示唆している。対照的に、マウスは^、８９のＺｒ標識ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１二重特異性抗体の治療上適切な用量を投与し、脾臓およびリンパ節の分布（データは示さない）、これらのリンパ器官におけるＣＤ３陽性Ｔ細胞の認識によるもので明らかでした。個々の組織におけるｅｘｖｉｖｏ生体内分布分析により、リンパ節および脾臓への局在が確認されました（データは示していません）。リンパ組織における^８９Ｚｒ－標識ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５二重特異性抗体の取り込みは、ＣＤ３に対する親和性が低いため、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１と比較して大幅に減少した。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５が、ＭＵＣ１６発現腫瘍に蓄積するかどうかを評価するために、^８９Ｚｒ－標識ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１および^８９Ｚｒ－標識ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５を、ＩＤ８－ＶＥＧＦ－ｈｕＭＵＣ１６Δ腫瘍を保有するマウスに投与した。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１のリンパ系取り込みが高いにもかかわらず、二重特異性抗体間の腫瘍取り込みに有意差はなかった（データは示さず）。

免疫複合体の調製と小動物用ＰＥＴ：ＰＮＧａｓｅＦで抗体を脱グリコシル化した後、微生物のトランスグルタミナーゼによるアミド基転移により、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１および対照抗体をＤＦＯと２９５位のグルタミン残基にコンジュゲートした。次に、ＤＦＯにコンジュゲートした抗体をジルコニウム－８９（^８９Ｚｒ）でキレート化した。マウスは、尾静脈注射を介して最終用量０．５ｍｇ／ｋｇで抗体を投与された。次に、ＰＥＴイメージングを実施して、エクスビボでの生体内分布試験の前に、投与後６日目に放射性免疫複合体のインビボでの局在を評価した。担癌マウスでの実験では、マウスは、１０×１０^６ＩＤ８－ＶＥＧＦ－ｈｕＭＵＣ１６Δ腫瘍細胞を皮下移植した。担癌マウスに、腫瘍の平均が１５０ｍｍ^３である移植後２０日目に^８９Ｚｒ放射標識抗体を投与した。

事前に較正されたＳｏｆｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｇ８ ＰＥＴ／ＣＴ装置（Ｓｏｆｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｕｌｖｅｒ ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、ＰＥＴおよびＣＴ画像を取得した。エネルギーウィンドウは１５０～６５０ｋｅＶの範囲で、視野の中心で１．４ｍｍの再構成された解像度であった。投与後６日目に、マウスはイソフルランを使用した麻酔導入を受け、１０分間の静的ＰＥＴ取得の間、イソフルランを継続的に流す状態で維持した。ＣＴ画像はＰＥＴ取得後に取得された。その後、ＰＥＴ画像は事前構成された設定を使用して再構築された。崩壊補正されたＰＥＴデータおよびＣＴデータは、ＶｉｖｏＱｕａｎｔソフトウェア（ｉｎｖｉＣＲＯ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を使用して、１回の注入量（％ＩＤ／ｇで表される）の０～３０％の信号範囲を示すように較正されたカラースケールで偽色の同時登録ＰＥＴ－ＣＴ最大強度投影に処理された。エクスビボでの生体内分布分析のために、投与後６日目のイメージング後にマウスを安楽死させた。血液は心臓穿刺してカウントチューブに採取された。次に、正常組織（鼠径部および腋窩リンパ節、胸腺、脾臓、心臓、肺、胃、小腸、肝臓、腎臓、骨、および卵巣）を切除して、カウントチューブに入れた。腫瘍も同様にカウントチューブに採取された。全てのチューブは事前に計量され、その後、血液および組織の重量を決定するために再計量された。次に、全てのサンプルのγ放射放射能を自動ガンマカウンタ（Ｗｉｚａｒｄ ２４７０，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でカウントし、結果を１分当たりのカウント数（ｃｐｍ）で報告した。各サンプルの％ＩＤは、元の注入された材料から調製された用量標準カウントと比較したサンプルカウントを使用して決定した。続いて、個々の％ＩＤ／ｇ値は、％ＩＤ値を適切な血液、組織、または腫瘍サンプルのそれぞれの重量で割ることによって導き出された。

^８９Ｚｒ－標識ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１と^８９Ｚｒ－標識ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００５は、相対性ＣＤ３親和性に関連するリンパ系に分布して、ＭＵＣ１６＋腫瘍およびＣＤ３＋リンパ組織に特異的な局在を示した。ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性は両方、ＣＤ３＋組織の存在下で同等の腫瘍局在を示した。

実施例５：カニクイザルの毒性試験は、抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体に対して明白な毒性を示さなかった
ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、サルのＭＵＣ１６およびＣＤ３と交差反応する。安全性と忍容性を決定し、二重特異性抗体の薬物動態を特徴づけるために、カニクイザルで反復投与毒性試験を実施した。６匹のサル／性別／群にＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１を週１回投与し、０．０１、０．１または１ｍｇ／ｋｇで合計５回投与した。投与期間の終了時、３匹の動物／性別／群を安楽死させて、組織を顕微鏡所見で検査し、一方、残りの３匹の動物／性別／群は、任意のＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１に関する作用の可逆性または持続性を評価するために１２週間の非投与回復を受けた。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は十分な許容性があり、全ての動物は予定された剖検時まで生存した。毒性動態分析は、性差は認められずに、用量群全体で用量比例曝露と線形動態を示した（データは示さず）。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１への継続的な曝露は投与段階を通して観察され、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の曝露は、全ての動物（ｎ＝６）ならびに０．１および１．０ｍｇ／ｋｇ群の５０％の動物それぞれで回復期の終わりまで維持された。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は、回復８週後、０．０１ｍｇ／ｋｇ群の任意の動物の血清で検出されなかった。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の消失半減期は約１０日であった。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１に関連する臨床観察はなく、投与期間中もしくは回復期間中の尿検査パラメータ、末梢血免疫表現型検査、摂食量、または体重の変化もなかった。重要なことに、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の投与は、ＥＣＧパラメータの変化を含め、呼吸器系、神経性、または心血管系の安全性薬理評価に変化をもたらさなかった。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１に関連する臓器重量の変化は見られず、最終剖検または回復剖検のいずれにおいても肉眼的変化は認められなかった。循環免疫マーカー（Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびＩＬ－６）の用量関連性、可逆的上昇は、１．０または０．１ｍｇ／ｋｇのいずれかの１次用量後１日以内に観察されたが、これらの上昇はその後の投与後には明らかではなかった（データは示さず）。血清サイトカインの最小限の増加に従って、血液腫瘍に対するいくつかのＣＤ３二重特異性分子について記載されているものとは対照的に、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１投与後にＴ細胞の再分布は検出されなかった（データは示さず）。

カニクイザルの試験は、ＩＡＣＵＣのガイドラインに従って実施された。カニクイザル（６匹／性別／群）に、対照物質（プラセボ希釈）またはＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１（０．０１、０．１、または１ｍｇ／ｋｇ）を週１回３０分間の静脈内注入により投与した。対照物質は、注射用０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰ（滅菌生理食塩水）で希釈した、ｐＨ６、１０％スクロースおよび０．０５％ポリソルベート２０を含む１０ｍＭヒスチジンであった。血液サンプルまたは組織は、臨床病理学および組織病理学のために様々な時点で採取された。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１濃度はＥＬＩＳＡによって決定され、毒性動態分析はＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェアを使用して行われた。ＣＲＰはＲｏｃｈｅ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｐ８００システムで分析された。サイトカインは、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）によって測定された。Ｔ細胞はフローサイトメトリーを使用して定量化された。簡潔に説明すると、血液をカリウムＥＤＴＡチューブに採取し、溶解し、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを使用して各表現型の相対値を決定する。次に、これらの値にリンパ球の絶対値（血液学的分析による）を掛けて、各表現型の絶対細胞数を列挙する。

ＭＵＣ１６の免疫組織化学的染色は、予想した組織、膵臓（中皮、管上皮）、心臓および卵巣（データは示さず）および唾液腺（杯細胞）、肝臓（中皮、胆管）、肺（中皮、細気管支／気管支上皮）、小腸（中皮）、精巣（中皮、精巣網／排出管）ならびにトンシル（上皮、粘液腺）扁桃（上皮、粘液腺）（示さず）に存在した。ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）組織染色によって評価されたＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１に関連する顕微鏡的変化は、炎症（白血球の浸潤）が挙げられ、漿膜内層ならびに／または多数の胸部および腹膜器官の中皮下結合組織の非有害な肥大をもたらす、中皮細胞のサイズおよび細胞充実性を増加させた。これらの変化は一般的に性質上、限局性または多発性であって、重症度は軽微ないしわずかであって、漿膜上皮（中皮）細胞に発現するＭＵＣ１６の関与およびＴ細胞の活性化に起因するＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の標的と考えられた。重要なことに、漿膜の変化は、回復期間終了後、回復の逆方向に向かうか、または回復に向かった（データは示さず）。

カニクイザルの毒性試験では、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１投与後、明白な毒性を示さずに、血清サイトカインおよびＣ反応性タンパク質の最小限かつ一過性の増加を示した。

実施例６：担癌マウスにおける血清サイトカイン誘導の評価
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、ＣＤ３二重特異性およびＣＡＲＴ細胞療法の高頻度の重篤な副作用であるため、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１による処置後の関連モデルで血清サイトカインをモニタリングする試験が実施された。腫瘍のない遺伝的ヒト化ＭＵＣ１６／ＣＤ３マウスでは、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１投与時に血清サイトカイン応答は明らかではなかった。

ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１によるインビボでのＴ細胞活性化を評価するために、担癌マウスの血清サイトカインレベルを測定した。血清サンプルは、０．５ｍｇ／ｋｇのＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１、ＣＤ３結合対照、および非結合対照群において、初回の抗体用量の４時間後に採取された。非結合対照およびＣＤ３結合対照と比較して、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１による処置は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＩＬ－１０の誘導によって決定されるようにＴ細胞を活性化した（データは示さず）。ＯＶＣＡＲ３／Ｌｕｃ細胞のみを保有するマウスは、血清に検出可能なヒトＩＦＮγを持たず、架橋としてＭＵＣ１６を提供される腫瘍細胞を保有しないマウスは、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１に応答する血清ＩＦＮγの増加を示さなかった（データは示さず）ので、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１誘導サイトカイン応答には、Ｔ細胞とＯＶＣＡＲ－３／Ｌｕｃ細胞の存在が必要であった。

血清サイトカインレベルの測定：ＢＳＭＵＣ１６ ／ ＣＤ３－００１による治療に応答したＴ細胞活性化は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の血清濃度を測定することによって評価されました。 ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、およびＩＬ－１Ｂは、最初の０．５ ｍｇ ／ ｋｇ投与の４時間後です。サイトカインレベルは、Ｖ－ｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ－１０ Ｐｌｅｘキットを使用して、製造元の指示（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＡ）に従って分析された。サイトカインは、群当たり４～６匹のマウスを用いた２つの別々の試験で測定された。

実施例７：ヒト化マウスにおけるＭＵＣ１６発現およびＭＵＣ１６陽性組織に対する抗ＭＵＣ１６×ＣＤ３二重特異性抗体の効果
完全に無傷の免疫系を有するマウスにおけるＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の抗腫瘍効果を調査するために、マウスは、内因性マウス遺伝子座の両方で、Ｔ細胞および抗体結合領域をカバーするＭＵＣ１６の領域にヒトＣＤ３を発現するように遺伝子操作された（ノックインマウス）。これらのマウスを検証するために、ＭＵＣ１６発現をＲＴ－ＰＣＲとＩＨＣの両方で調べた。ＲＮＡ発現は気管で検出され、肺、心臓、卵巣、膵臓、および膀胱でも低レベルで検出され（データは示さず）、これは、マウスのＭＵＣ１６発現に関する公開データと同様である。ＭＵＣ１６タンパク質の発現を評価するために、ＭＵＣ１６の膜近位領域を認識する抗ヒトＭＵＣ１６抗体を使用して、選択した組織に対してＩＨＣを実施した。ＭＵＣ１６タンパク質の発現は、これらのマウスの卵巣および胃の上皮表面で確認された。ＭＵＣ１６は、ヒトで報告されているように、気管内層／上皮および粘膜下腺でも観察された（データは示さず）。

マウス組織の組織学：ヒト化マウスまたはＷＴマウスの組織を収集し、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ；Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用したＩＨＣにより、ＭＵＣ１６の膜近位ドメインに結合する抗ＭＵＣ１６抗体で染色した。５μｍのパラフィン切片をＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＰＬＵＳスライドにカットし、６０°Ｃで１時間焼きました。免疫組織化学的染色は、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＡＢＭａｐ検出キットを使用してＤｉｓｃｏｖｅｒｙＸＴ ＡｕｔｏｍａｔｅｄＩＨＣ染色システムで実行されました。脱パラフィンは、ＥＺ Ｐｒｅｐ溶液を７５℃で８分間使用して行われた。ＶｅｎｔａｎａのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファーｐＨ９（ＣＣ１）を使用して、マイルド抗原賦活化を行った（９５℃、８分、続いて１００℃、２４分）。これに続いて、複数のブロッキング工程が行われた。組織切片を抗ＭＵＣ１６抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に室温で８時間インキュベートした。無関係な非結合抗体を認識するアイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。一次抗体および陰性対照を手動で適用した。二次抗体（１μｇ／ｍｌ）としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、サンプルを室温で１時間インキュベートした。発色シグナルは、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＡＢ ＭＡＰキットを使用して発色させた。スライドをヘマトキシリンで手動で対比染色し（２分）、脱水してカバーガラスで覆った。画像をＡｐｅｒｉｏ ＡＴ２スライドスキャナ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）で取得して、Ｉｎｄｉｃａ ＨＡＬＯソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ；Ｃｏｒｒａｌｅｓ，ＮＭ）を使用して分析した。Ｈ＆Ｅ染色は、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ，Ｉｎｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）によって行われた。

これらのマウスのＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβの使用によって評価されるようにポリクローナルであり、ヒトＣＤ３を発現し、野生型マウスと同様の数で存在する（データは示さず）。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１が、これらの動物の正常組織に任意のＴ細胞活性化または影響を誘導したかどうかを決定するために、非担癌マウスに高用量のＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１（１０ｍｇ／ｋｇ）注射して、次に、血中のＴ細胞数、血清サイトカイン、および組織病理学を調べた。血液からのＴ細胞の辺縁趨向およびの高レベルの血清サイトカインによって測定されるように（データは示さず）、抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）によってＴ細胞を活性化することができるが、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１はそのような効果をまったく誘導せず、ＭＵＣ１６標的への接近性が限定的であることを示唆している（データは示さず）。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１がＭＵＣ１６発現組織に任意の顕微鏡的変化を誘導したかどうかを決定するために、ＭＵＣ１６およびＣＤ３ヒト化マウスに、０日目と３日目に１０ｍｇ／ｋｇで２回用量のＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１を投与した。５日目に、いくつかのＭＵＣ１６発現組織（気管、胃および卵巣）を調べて、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１投与後、これらの組織に細胞浸潤や壊死は見られなかった（データは示さず）。
組織病理学検査では、検査時にＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１投与後、マウスのＭＵＣ１６発現組織の炎症または浸潤を示さなかった。

この試験の結果は、実施例５で論じられているカニクイザルの試験と同様に、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１の安全性プロファイルを示す。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１は最小限の血清サイトカインのみを誘導し、ＭＵＣ１６発現では炎症の限局性誘導および漿膜内層の肥大があり、標的活性を示唆したが、これらの効果は回復期間終了までに解消し、炎症および回復を意味している細胞充実性の増加と一致していた。観察された漿膜の変化は、臨床的観察、臨床病理学（炎症反応を除く）、または根底にある実質の顕微鏡的変化とは相関していなかった。したがって、遺伝的ヒト化マウスおよびカニクイザルの両方における試験は、ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１が十分な許容性があったことを示している。

実施例８：ナイーブヒトエフェクター細胞を使用するＦＡＣＳベースの細胞傷害性アッセイにおけるＰＤ－１発現のモニタリング
フローサイトメトリーによってＭｕｃ１６を保有する標的細胞の特異的な死滅をモニタリングするために、卵巣細胞株ＯＶＣＡＲ－３を１ｕＭのバイオレット細胞トラッカーで標識した。標識後、細胞を３７℃で一晩播種した。別に、ヒトＰＢＭＣを１×１０^６細胞／ｍＬで補充ＲＰＭＩ培地に播種し、付着マクロファージ、樹状細胞、およびいくつかの単球を枯渇させることによってリンパ球を濃縮するために３７℃で一晩インキュベートした。翌日、標的細胞を、粘着細胞除去ナイーブＰＢＭＣ（エフェクター／標的細胞４：１）、およびＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１またはＣＤ３結合対照のいずれかの段階希釈物と共に３７℃で７２時間インキュベートした。トリプシンを使用して細胞を細胞培養プレートから取り出し、ＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳ分析のために、細胞を死／生の遠赤細胞トラッカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。死滅の特異性を評価するために、細胞をバイオレット細胞トラッカー標識集団にゲートした。

ＰＤ－１発現は、細胞をＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８およびＰＤ－１に直接コンジュゲートした抗体と共にインキュベートし、全Ｔ細胞（ＣＤ２＋）のうちＰＤ－１／ＣＤ４陽性Ｔ細胞またはＰＤ－１／ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を報告することによって評価された。ＢＳＭＵＣ１６／ＣＤ３－００１とのインキューベーションにより、対照と比較して、ＰＤ－１＋Ｔ細胞の割合が、１０倍以上（ＣＤ４＋Ｔ細胞）または３倍以上（ＣＤ８＋Ｔ細胞）増加した。結果を図３に示す。

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (19)

1. ＭＵＣ１６を発現する腫瘍を治療またはその増殖を阻害する方法において、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームとＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームとを含む治療有効量の二重特異性抗体と組み合わせて使用するための、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物であって、前記方法は、それを必要としている対象に、前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と、前記二重特異性抗体とを投与することを含み、
   ここで：
   （ａ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖相補性決定領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３とを含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０のアミノ酸配列を含み；
   （ｂ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原結合アームは、３つの重鎖相補性決定領域、Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２、およびＡ－ＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域、Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２、およびＡ－ＬＣＤＲ３とを含み、前記Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２、Ａ－ＨＣＤＲ３、Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２、およびＡ－ＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８、９、１０、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含み；
   （ｃ）前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合アームは、３つの重鎖相補性決定領域、Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、およびＢ－ＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３とを含み、前記Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、Ｂ－ＨＣＤＲ３、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４、１５、１６、１１、１２、および１３、または、それぞれ、２６、２７、２８、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含む；
   上記医薬組成物。
2. ＭＵＣ１６を発現する腫瘍を治療またはその増殖を阻害する方法において、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）に特異的に結合する治療有効量の抗体またはその抗原結合断片と組み合わせて使用するための、ＭＵＣ１６に特異的に結合する第１の抗原結合アームとＣＤ３に特異的に結合する第２の抗原結合アームとを含む治療有効量の二重特異性抗体を含む医薬組成物であって、前記方法は、それを必要としている対象に、前記二重特異性抗体と、前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片とを投与することを含み、
   ここで：
   （ａ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、３つの重鎖相補性決定領域、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３とを含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、および４０のアミノ酸配列を含み；
   （ｂ）前記二重特異性抗体の前記第１の抗原結合アームは、３つの重鎖相補性決定領域、Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２、およびＡ－ＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域、Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２、およびＡ－ＬＣＤＲ３とを含み、前記Ａ－ＨＣＤＲ１、Ａ－ＨＣＤＲ２、Ａ－ＨＣＤＲ３、Ａ－ＬＣＤＲ１、Ａ－ＬＣＤＲ２、およびＡ－ＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含み；
   （ｃ）前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合アームは、３つの重鎖相補性決定領域、Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、およびＢ－ＨＣＤＲ３と、３つの軽鎖相補性決定領域、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３とを含み、前記Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、Ｂ－ＨＣＤＲ３、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４、１５、１６、１１、１２、および１３、または、それぞれ、２６、２７、２８、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含む；
   上記医薬組成物。
3. 前記方法は：
   （ａ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を、前記二重特異性抗体の前に、同時にまたは後に投与すること；
   （ｂ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を、前記二重特異性抗体の前に投与すること；または
   （ｃ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の１回以上の用量を、前記二重特異性抗体の１回以上の用量と組み合わせて投与すること、
   を含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記方法は、前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を、前記二重特異性抗体の少なくとも１週間前に投与することを含む、請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記方法は：
   （ａ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与すること；
   （ｂ）前記二重特異性抗体を、前記対象の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与すること；
   （ｃ）前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の各用量を、直前の用量の０．５～１２週間後に投与すること；
   （ｄ）前記二重特異性抗体の各用量を、直前の用量の０．５～１２週間後に投与すること；および／または
   （ｅ）前記抗体を、静脈内、皮下、または腹腔内に投与すること、
   を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の各用量が、１０～８０００マイクログラムを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記二重特異性抗体の各用量が、１０～８０００マイクログラムを含む、請求項５または６に記載の医薬組成物。
8. （ａ）前記腫瘍は、卵巣癌を含む、または前記腫瘍は、膵臓癌を含む；および／または
   （ｂ）前記対象は、以前の療法に耐性があるか、もしくは応答が不十分であるか、または以前の療法後に再発している、
   請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 前記方法は、第３の治療薬または療法を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
10. 前記第３の治療薬または療法は、放射線、手術、化学療法剤、癌ワクチン、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＬＡＧ－３阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト、アンギオポエチン－２（Ａｎｇ２）阻害剤、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、カルメット－ゲラン桿菌ワクチン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、細胞毒素、インターロイキン６受容体（ＩＬ－６Ｒ）阻害剤、インターロイキン４受容体（ＩＬ－４Ｒ）阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、抗体－薬物複合体、抗炎症剤、および栄養補助食品からなる群より選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記二重特異性抗体の前記第１の抗原結合アームは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合アームの、前記Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、Ｂ－ＨＣＤＲ３、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１４、１５、１６、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
13. 前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合アームは、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）とを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合アームの、前記Ｂ－ＨＣＤＲ１、Ｂ－ＨＣＤＲ２、Ｂ－ＨＣＤＲ３、Ｂ－ＬＣＤＲ１、Ｂ－ＬＣＤＲ２、およびＢ－ＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２６、２７、２８、１１、１２、および１３のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
15. 前記二重特異性抗体の前記第２の抗原結合アームが、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３のアミ
    ノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲとを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
17. 前記二重特異性抗体が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖と対をなす配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖と対をなす配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖とを含む、請求項１～１３および１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
18. 前記二重特異性抗体が、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖と対をなす配列番号２９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖と対をなす配列番号３２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖とを含む、請求項１～１１および１４～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
19. 前記ＰＤ－１に特異的に結合する抗体が、配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

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