JP7374246B2 - Ｇｏｌｄ最適化ＣＡＲ Ｔ細胞 - Google Patents

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Description

配列表、表またはコンピュータプログラムに関する言及
[0001]配列表の公的なコピーは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じてＡＳＣＩＩフォーマットテキストファイルとして、明細書とともに同時に提出されており、ファイル名は「ＣＢＩＯ０２４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、生成日は２０１７年８月２８日であり、そしてサイズは９キロバイトである。ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて提出された配列表は、本明細書の一部であり、そしてその全体が本明細書に援用される。
[0002]キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞に、ＣＡＲによって認識されるターゲットを攻撃させることが可能であるように、ヒトが操作した受容体である。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、急性リンパ芽球性白血病および他のＢ細胞関連悪性腫瘍に対する完全な反応を誘導する際に有効であることが示されてきており、そして難治性／再発性急性リンパ芽球性白血病に対する寛解を達成し、そして維持する際に有効であることが示されてきている（Ｍａｕｄｅら， ＮＥＪＭ， ３７１：１５０７， ２０１４）。しかし、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）、Ｂ細胞形成不全、およびオン腫瘍、オフターゲット（ｏｎ－ｔｕｍｏｒ， ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）毒性に関連する危険な副作用が何人かの患者で見られてきている。
[0003]ＣＡＲ技術を制御するため、現在、２つの現存する戦略がある。第一のものは、誘導性「殺傷スイッチ」である。このアプローチにおいて、アポトーシス経路を開始する１またはそれより多い「自殺」遺伝子が、ＣＡＲ構築物中に取り込まれている（Ｂｕｄｄｅら ＰＬоＳ１， ２０１３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）。これらの自殺遺伝子の活性化は、脂質浸透性タクロリムス類似体であるＡＰ１９０３（リミデュシッド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ）としてもまた知られる）によって開始され、該化合物は、アポトーシス誘導性タンパク質が翻訳の際に融合しているヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２（Ｆｖ）のホモ二量体化を開始する。理想的シナリオにおいて、これらの殺傷スイッチは、ＣＡＲ技術の長期監視の利点を犠牲にして、毒性に対して保護するよう努める。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでは、これらの自殺スイッチは、ＡＰ１９０３に反応しないＣＡＲ Ｔ細胞に関する強力な選択圧に対して不利に働くため、この目的を達成しないようであり、この状況は、親Ｔ細胞内への安定な導入遺伝子の挿入に関連する有害な誤りがちなレトロウイルスコピーによって悪化する。このシナリオでは、非反応性ＣＡＲ Ｔ細胞クローンが増殖し続け、そして抗原依存性方式で、ターゲット細胞を殺し続けるであろう。したがって、殺傷スイッチ技術は、毒性に対する適切な保護を提供する可能性が低い。
[0004]第二のＣＡＲ制御アプローチは、一過性ＣＡＲ発現であり、これはいくつかの方式で達成されうる。１つのアプローチにおいて、関連しないドナーからＴ細胞を採取し、遺伝子編集技術によってＨＬＡ遺伝子を欠失させ、そしてＣＡＲをコードする導入遺伝子をこれらの細胞ゲノム内に挿入する。養子移入に際して、これらのＣＡＲ Ｔ細胞は、レシピエントの免疫系によって、外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）であると認識され、そして破壊され、したがって、この系におけるＣＡＲ曝露は一過性である。別の一過性ＣＡＲ曝露アプローチにおいて、ＣＡＲがコードする遺伝子のｍＲＮＡを、採取した患者Ｔ細胞に導入する（Ｂｅａｔｔｙ， ＧＬ ２０１４． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２（２）：１１２－２０．ｄｏｉ：１０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－１３－０１７０）。ｍＲＮＡは短い半減期を持ち、そして細胞において複製されないかまたは安定に維持されないため、ＣＡＲを発現するＴ細胞の永続的な改変はなく、したがってＣＡＲ発現および活性は短期のものであろう。しかし、殺傷スイッチアプローチと同様、これらの一過性ＣＡＲ曝露アプローチはＣＡＲの監視の利点を犠牲にする。さらに、これらの一過性の系では、急性毒性を制御することが困難でありうる。
Ｍａｕｄｅら， ＮＥＪＭ， ３７１：１５０７， ２０１４ Ｂｕｄｄｅら ＰＬоＳ１， ２０１３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２ Ｂｅａｔｔｙ， ＧＬ ２０１４． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２（２）：１１２－２０．ｄｏｉ：１０．１１５８／２３２６－６０６６．ＣＩＲ－１３－０１７０
[0005]１つの側面において、本明細書は、ＲＮＡ不安定化要素（ＲＤＥ）の制御下にあるＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、または他のターゲティングポリペプチド、および導入遺伝子を含む真核細胞を開示する。単数のＲＤＥが多数の導入遺伝子を制御してもよいし、または多数のＲＤＥが多数の導入遺伝子を制御してもよい。多数の導入遺伝子は、連続しておよび／または鎖状体としておよび／または他の配置で配置されてもよい。多数のＲＤＥを用いて導入遺伝子を制御してもよく、そしてこれらの多数のＲＤＥを鎖状体として構築するか、転写物領域内に分散させるか、または転写物の異なる部分に配置してもよい。多数の導入遺伝子は、１つのＲＤＥによってまたはＲＤＥの組み合わせによって制御されてもよい。ＲＤＥは、３’－ＵＴＲ、５’－ＵＴＲおよび／またはイントロン中に位置してもよい。１つの側面において、ＲＤＥを操作して、ＲＤＥと相互作用するＲＮＡ結合タンパク質（単数または複数）の結合アフィニティを増加させるかまたは減少させることも可能である。ＲＮＡ結合タンパク質のアフィニティの改変は、ＲＮＡ結合タンパク質によって制御される際の導入遺伝子発現のタイミングおよび反応を変化させることも可能である。１つの側面において、ＲＤＥでのＲＮＡ結合タンパク質結合は、細胞の代謝状態によって改変され、そしてＲＮＡ結合タンパク質に関するＲＤＥの結合アフィニティの変化は、細胞の代謝状態とともに、導入遺伝子発現に対する反応および／または導入遺伝子発現のタイミングを改変する。１つの側面において、ＲＤＥでのＲＮＡ結合タンパク質結合は、細胞の酸化還元状態によって改変され、そしてＲＮＡ結合タンパク質に関するＲＤＥの結合アフィニティの変化は、細胞の酸化還元状態とともに、導入遺伝子発現に対する反応および／または導入遺伝子発現のタイミングを改変する。
[0006]１つの側面において、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体、あるいは他のターゲティング受容体またはターゲティングポリペプチドは、ターゲット部位（例えば腫瘍細胞または他の疾患組織／細胞）で抗原を認識し、そしてこれが細胞を活性化させる。導入遺伝子は、ターゲット部位で第二の抗原を認識する別のＣＡＲであってもよく、そして第一のＣＡＲ、Ｔ細胞受容体または他のターゲティングポリペプチドによる細胞の活性化が、第二のＣＡＲを誘導し、真核細胞が第二の抗原によってターゲット部位を認識することを可能にする。１つの側面において、真核細胞は、ターゲット部位で抗原を認識する第一のＣＡＲを有し、そしてこれが細胞の活性化状態を直接または間接的に減少させるポリペプチドをコードする導入遺伝子を活性化する（ＲＤＥを通じて）。例えば、導入遺伝子は、第一のＣＡＲが非ターゲット細胞で抗原と反応した際、真核細胞が健康な細胞抗原（ターゲット部位には存在しないかまたは減少した量でしか存在しない）との第二のＣＡＲ相互作用によって不活性化されるであろうように、健康な組織上の抗原を認識する第二のＣＡＲをコードしてもよい。
[0007]いくつかの側面において、真核細胞は、免疫細胞、例えばＴ細胞、ナチュラルキ
ラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞である。これらの側面において、ＣＡＲによる細胞の活性化、または他の方法での免疫細胞の代謝状態の変化は、ＲＤＥを通じて、導入遺伝子の発現を誘導可能である。導入遺伝子を制御するＲＤＥは、マイクロＲＮＡ結合部位を有してもよく、そしてこれらのマイクロＲＮＡ結合部位の１またはそれより多くを除去するように操作可能である。ＲＤＥは、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）によって結合可能である。理論によって束縛されることは望ましくないが、ＨｕＲはいくつかのＲＤＥに結合可能であり、そしてｍＲＮＡを安定化するように作用し、翻訳増進を導くと予期される。いくつかのＲＤＥは、真核細胞が活性化されていない（低解糖活性）か、静止しているか、または休止している際に、ＲＤＥに結合可能である酵素、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、他のデヒドロゲナーゼ、他のオキシドレダクターゼ、または他の解糖酵素を通じて、真核細胞の解糖状態に関連しうる。ＧＡＰＤＨまたは他の酵素がＲＤＥに結合した際、これは、ＲＤＥを持つＲＮＡの半減期を減少させうる。この側面において、真核細胞（例えばＴリンパ球）のＣＡＲ活性化は、細胞において解糖を誘導可能であり、これがＲＮＡのＧＡＰＤＨ結合を減少させ、ＲＮＡの半減期を増加させ、これがＲＮＡにコードされ、そしてＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現増加を生じる。理論によって束縛されることは望ましくないが、ＧＡＰＤＨがＲＤＥから離れる（ｖａｃａｔｅ）につれて、ＨｕＲまたは他のＲＤＥ結合タンパク質が続いて同じＲＤＥに結合するか、または以前にはアクセス不能であった（ＧＡＰＤＨの存在によって立体的に妨害されていた）ＲＤＥに結合するかいずれかが可能になり、ｍＲＮＡをさらに安定化し、ｍＲＮＡの半減期を増加させ、そしてＲＮＡによってコードされ、そして前記ＲＤＥによって制御されている導入遺伝子のさらなる増加を生じうる。したがって、ＣＡＲ活性化は、導入遺伝子発現を誘導しうる。他の側面において、免疫細胞の他の活性化は、ＧＡＰＤＨを解糖に従事させ、そしてしたがって、ＲＤＥの制御下で、導入遺伝子の発現を誘導することも可能である。
[0008]ＲＤＥ（単数または複数）を含む転写物からの発現は、細胞の代謝状態に反応することも可能である。例えば、ＲＤＥを、代謝または解糖酵素に結合させてもよく、これによってこれらの代謝または解糖酵素を通じて、細胞の活性化状態に導入遺伝子の発現が結びつけられる。いくつかの代謝または解糖酵素は、転写物中のＲＤＥに結合し、そして転写物を分解するかまたは分解のためにターゲティングする。これらの代謝または解糖酵素が活性になると、酵素はもはやＲＤＥに結合せず、転写物はより長い期間、安定であり、そして転写物は、このより長い期間、翻訳されうる。また、こうしたＲＤＥの制御下で導入遺伝子を発現する細胞がＣＡＲを発現するように操作して、これによって所望の時点で細胞の代謝状態を改変し、所望の時点での導入遺伝子の発現を生じることも可能である。あるいは、他の刺激を用いて、真核細胞の代謝状態を改変して、導入遺伝子の発現を生じることも可能である。例えば、細胞の代謝状態を改変して、例えば小分子（例えばＰＭＡ／イオノマイシン）、サイトカイン、ＴＣＲおよびリガンドとの共刺激ドメイン結合、酸素レベル、細胞ストレス、温度、または光／放射線照射を含む刺激によって、導入遺伝子発現を引き起こす（または発現を阻害する）ことも可能である。
[0009]ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合を、細胞に、例えばラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸（３－ｂｒｏｍｏｐｈｙｒｕｖｉｃ ａｃｉｄ）、ヨードアセテート、フッ化物、オキサメート（ｏｘａｍａｔｅ）、プログリタゾン（ｐｌｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ジクロロ酢酸などの解糖を阻害する小分子、または他の代謝阻害剤、例えばデヒドロエピアンドロステロンを導入することによって増加させてもよい。他の小分子を用いて、ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合を減少させてもよい。こうした小分子は、例えばＣＧＰ３４６６Ｂマレートまたはヘプテリジン酸（どちらもＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．によって販売されている）、ペンタレノラクトン、または３－ブロモピルビン酸を含めて、ＧＡＰＤＨのＲＤＥ結合部位を遮断しうる。他の小分子を用いて、他の酵素またはポリペプチドがＲＤＥに結合するのを同様に阻害することも可能である。他の小分子を用いて、ＧＡＰＤＨの酸化還元状態を変化させて、ＲＤＥに関するＧＡＰＤＨのアフィニティ改変を導くことも可能である。
[00010]１つの側面において、免疫細胞の活性化は、ターゲット（活性化）部位に送達
しようとするペイロードをコードしうる導入遺伝子の発現を誘導する。該導入遺伝子は、ＣＡＲ活性化および／または免疫細胞活性化の部位に送達するためのペイロードをコードしてもよい。ペイロードは、サイトカイン、抗体、レポーター（例えば画像化のため）、受容体（ＣＡＲなど）、またはターゲット部位で所望の効果を有しうる他のポリペプチドであってもよい。ペイロードは、細胞中または細胞表面上に留まり、細胞の振る舞いを修飾してもよい。ペイロードは、細胞内タンパク質、例えばキナーゼ、ホスファターゼ、代謝酵素、エピジェネティック修飾酵素、遺伝子編集酵素等であってもよい。ペイロードは、遺伝子制御ＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム等、あるいはＣＲＩＳＰＲ系で使用するためのガイドＲＮＡであってもよい。ペイロードはまた、膜結合タンパク質、例えばＧＰＣＲ、トランスポーター等であってもよい。ペイロードはターゲット部位が画像化されることを可能にする画像化剤であってもよい（ターゲット部位は、ＣＡＲによって結合される所望の量のターゲット抗原を有する）。ペイロードはチェックポイント阻害剤であってもよく、そしてＣＡＲおよび／または他の結合タンパク質（例えばＴ細胞受容体、抗体または自然免疫受容体）が腫瘍関連抗原を認識することも可能であり、したがって真核細胞は、腫瘍にチェックポイント阻害剤を優先的に送達する。ペイロードは、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導剤、細胞傷害性小分子、または補体を含む、細胞傷害性化合物であってもよい。いくつかの側面において、ＣＡＲの発現は、誘導性プロモーター、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／またはＲＤＥの制御下にある。細胞表面上のＣＡＲの量は、真核細胞が腫瘍部位で優先的に活性化され、そして正常組織では活性化されないことを可能にすることが可能であり、これは腫瘍がより多量のターゲット抗原をディスプレイするためである（例えばＣＡＲの量を調節して、健康な組織に対して腫瘍部位でのアビディティを増加させることも可能である）。さらに、ＣＡＲ発現のこの調節性制御は、真核細胞およびペイロードのその送達に対する別のレベルの制御を提供する。１つの側面において、ペイロードは（ターゲットに対して分泌されるよりも）細胞中または細胞表面上に留まり、細胞の振る舞いを修飾することも可能である。
[00011]いくつかの側面において、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－Ｃ
ＡＲポリペプチドの発現を、少なくとも部分的に、ＲＤＥ結合活性を持つ解糖酵素、例えばＧＡＰＤＨと相互作用するＲＤＥによって制御する。解糖酵素はＲＤＥに結合し、そしてＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド、および／または他の導入遺伝子産物の産生を減少させることも可能である。ポリペプチド産生におけるこの減少は、翻訳の阻害および／またはｍＲＮＡ分解速度の増加のために起こりうる（ＲＤＥ結合は、ｍＲＮＡの半減期を短縮しうる）。いくつかのＲＤＥ結合タンパク質は、ＲＮＡの翻訳を減少させ、そして分解を増進させて、作製されるポリペプチドレベルを減少させることも可能である。ＲＤＥは、転写物（例えばＩＬ－２またはＩＦＮ－γをコードする転写物）の３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチ要素であってもよいし、あるいは１またはそれより多いマイクロＲＮＡ部位を除去するように操作されている修飾３’ＵＴＲ（例えばＩＬ－２またはＩＦＮ－γの修飾３’－ＵＴＲ）であってもよい。１つの側面において、解糖酵素（単数または複数）、例えばＧＡＰＤＨによって結合されるＲＤＥの制御下にある導入遺伝子、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの発現は、解糖遂行に際して、酵素（単数または複数）の活性が増加することによって増加する。解糖における酵素の活性は、細胞に、細胞培地中で増加したグルコースを提供するか、細胞におけるトリオースイソメラーゼ活性を増加させるか、または細胞において解糖を増加させる化合物、例えばタモキシフェンまたはグルコースを細胞に提供することによって、増加させうる。ＲＤＥは、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）に結合してもよい。理論によって束縛される
ことは望ましくないが、ＨｕＲはいくつかのＡＵリッチＲＤＥおよびＵ－リッチＲＤＥに結合し、そしてｍＲＮＡを安定化させて、翻訳増進を導くように作用することも可能であると予期される。したがって、ＨｕＲ発現増加を生じる細胞条件は、適切なＡＵ－リッチ要素および／またはＵ－リッチ要素を持つ導入遺伝子の発現を増加させることが可能であり、そしてＨｕＲ発現を減少させる条件は、これらの導入遺伝子の発現を減少させることが可能である。導入遺伝子（または天然遺伝子）の３’ＵＴＲとＨｕＲの相互作用はまた、ＨｕＲ結合部位を含有する組換え転写物を発現することによっても改変可能である。これらの転写物の発現は、導入遺伝子転写物または天然ＨｕＲ調節転写物への結合に利用可能であるＨｕＲの量を減少させ、そしてこれらの転写物の半減期を減少させて、発現減少を生じるであろう。
[00012]１つの側面において、二シストロン性（または多重シストロン性）ベクターを
用いて、２またはそれより多い導入遺伝子－ＲＤＥ構築物を導入する。これらの二シストロン性構築物は、レンチウイルスに由来してもよい。２つの導入遺伝子を、２つの導入遺伝子をコードする核酸の間に位置する制御領域から、反対鎖上で、反対方向に発現させてもよい。２より多い導入遺伝子が構築物中に配置される場合（多重シストロン性構築物）、第三の（そしてさらなる）導入遺伝子を、反対方向で発現される導入遺伝子の一方または両方と連続して配置してもよい。これらのさらなる導入遺伝子を同じ制御領域から発現させてもよいし、またはこれらは別個の制御領域を有してもよい。１つの導入遺伝子がＣＡＲをコードしてもよく、そして他の導入遺伝子（単数または複数）が、ＣＡＲが活性化された際に送達されるべきペイロードをコードしてもよい。多重シストロン性または二シストロン性構築物において、ペイロードをコードする核酸は、細胞の解糖またはエネルギー状態に反応するＲＤＥによって制御されていてもよい。ＣＡＲをコードする導入遺伝子を、高レベルの転写活性、低レベルの転写を有し、そして／または誘導性プロモーターである制御領域に機能可能であるように連結してもよく、そしてペイロードをコードする導入遺伝子を、より低いレベルの転写活性、より高いレベルの転写を有し、そして／または誘導性である制御領域に機能可能であるように連結してもよい。また、ＣＡＲをより高いレベルの転写を有する（そして／または誘導性である）制御領域に機能可能であるように連結してもよく、そしてペイロードをコードする導入遺伝子を、より低いレベルの転写を有する（そして／または誘導性である）制御領域に機能可能であるように連結してもよい。また、ＣＡＲを、より低いレベルの転写を有する（そして／または誘導性である）制御領域に機能可能であるように連結してもよく、そしてペイロードをコードする導入遺伝子を、より高いレベルの転写を有する（そして／または誘導性である）制御領域に連結してもよい。
[00013]１つの側面において、核酸を用いて、免疫細胞の刺激に際しての免疫細胞の反
応をブーストしてもよい。例えば、免疫細胞は、より迅速な産生動力学で、より多量の免疫ポリペプチド（より高いＣｍａｘ）を生じることも可能である。免疫ポリペプチドには、例えば、サイトカイン、パーフォリン、グランザイム、アポトーシス誘導性ポリペプチド等が含まれることも可能である。ＲＮＡへの核酸の発現に際して、ＲＮＡ中のＲＤＥが、ポリペプチド、例えばサイトカイン、パーフォリン、グランザイム、および他の免疫ポリペプチドの発現を抑制するＲＤＥ結合タンパク質に結合するように、免疫反応をブーストする核酸は、選択されたＲＤＥ結合タンパク質に関するＲＤＥをコードする核酸に機能可能であるように連結された制御領域を含むことも可能である。ＲＤＥを含むＲＮＡの発現は、ＲＤＥによって制御されるポリペプチドの発現のため、真核細胞を準備させることも可能である。例えば、ＲＤＥを含むＲＮＡの発現を免疫細胞において行って、免疫細胞の刺激に際して、免疫ポリペプチドを発現するように細胞を準備させることも可能である。
[00014]特定のＲＤＥは、被験体における特定の疾患状態と関連付けることも可能であ
る。いくつかの疾患関連ＲＤＥは、疾患のまたは異常な細胞（組織）由来の転写物におけるＲＤＥに対して、正常細胞（組織）由来の転写物におけるＲＤＥを比較することによって見出されうる。すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｃａｓｔｅｌｌｏら， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ ６３：６９６－７１０（２０１６）に記載する方法を用いて、そのＲＮＡ結合タンパク質でＲＤＥをトラップすることによって、正常な（健康な）細胞（単数または複数）由来のＲＤＥおよびその対応するＲＮＡ結合タンパク質を、疾患のまたは異常な細胞（単数または複数）におけるものと比較することも可能である。ＲＮＡ結合タンパク質と異常な相互作用を有するＲＤＥを、疾患状態と関連付けることも可能であり、そして個体由来の遺伝子または転写物におけるＲＤＥの配列決定は、被験体の疾患への感受性および／または疾患状態を示しうる。
[00015]ＣＡＲ、導入遺伝子ペイロード、および／または導入遺伝子のＲＤＥ制御は、
真核細胞の代謝状態に反応性であるＲＤＥを通じて制御可能である。例えば、ＲＤＥを解糖酵素または他の代謝酵素に結合させてもよく、そして真核細胞の代謝状態を変化させることによって、ＣＡＲ、導入遺伝子ペイロード、および／または導入遺伝子の発現を阻害してもよい。ＲＤＥをＧＡＰＤＨに結合させてもよく、そして（例えば解糖阻害剤を用いて）細胞における解糖を停止させることによって、ＣＡＲ、導入遺伝子ペイロード、および／または導入遺伝子の発現を阻害することも可能である。この発現の阻害を用いて、ＣＡＲ、導入遺伝子ペイロード、および／または導入遺伝子の発現によって引き起こされる不都合な事象を減少させることも可能である。
[00016]１つの側面において、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド
、および／または他の受容体を、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上に見られる抗原に対して向けてもよく、これには例えばＣＤ ３３、ＣＤ ３４、ＣＤ ３８、ＣＤ ４４、ＣＤ ４５、ＣＤ ４５ＲＡ、ＣＤ ４７、ＣＤ ６４、ＣＤ ６６、ＣＤ １２３、ＣＤ １３３、ＣＤ １５７、ＣＬＬ－１、ＣＸＣＲ４、ＬｅＹ、ＰＲ１、ＲＨＡＭＭ（ＣＤ １６８）、ＴＩＭ－３、および／またはＷＴ１が含まれる。モノクローナル抗体２９３Ｃ３－ＳＤＩＥをＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの細胞外要素として用いてもよい（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用されるＲｏｔｈｆｅｌｄｅｒら、２０１５、ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ）。ＡＭＬに関する他の抗原が当該技術分野に知られており、そしてこれらは、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または他の受容体のターゲットでありうる。１つの側面において、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド、および／または他の受容体を、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ５、ＣＤ１０、およびＣＤ４３を含む、びまん性巨細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞上に見られる抗原に対して向けてもよい。ＤＬＢＣＬに対する他の抗原が当該技術分野に知られており、そしてこれらは、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または他の受容体のターゲットでありうる。
[00017]１つの側面において、所望の量のＣＡＲ発現は、ターゲット細胞濃度、ターゲ
ット細胞上のターゲット抗原の密度、ターゲット抗原に関する細胞外要素（抗原結合要素）の結合アフィニティ（Ｋｄ）、ＣＡＲを含む真核細胞の濃度を考慮してもよい。これらのパラメータおよび他のパラメータを用いて、所望のレベルのＣＡＲ発現を規定するであろう、真核細胞上のＣＡＲの所望の密度に到達してもよい。ＣＡＲ発現の所望の量はまた、真核細胞上で発現される阻害性受容体（ＩＲ）の量、およびターゲット（および他の）細胞上で発現される阻害性受容体リガンド（ＩＲＬ）の量も考慮してもよい。ＣＡＲポリペプチドの所望の量に到達するために、少なくとも部分的に、以下の等式を用いてもよい：
細胞活性＝［ターゲット細胞］［ターゲット抗原密度］［Ｋｄ］［真核細胞］ Ｉ
細胞活性＝［ターゲット細胞］［ターゲット抗原密度］［Ｋ ｄ ］［真核細胞］ ＩＩ
［ＩＲ］［ＩＲＬ］
[00018]ＣＡＲ発現の所望の量は、真核細胞表面上に所望の数のＣＡＲを生じうる。Ｃ
ＡＲ発現の所望の量は、真核細胞表面上に２～１００，０００ＣＡＲ（またはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。真核細胞は、Ｔリンパ球であってもよく、そしてＴリンパ球表面上のＣＡＲ（またはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）の数は、２～１００，０００であってもよい。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、マイクロモル濃度（μＭ）範囲のアフィニティでターゲットリガンドに結合してもよく、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、１００～５００，０００であってもよい。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、ナノモル濃度（ｎＭ）範囲のアフィニティでターゲットリガンドに結合してもよく、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、２～１００，０００であってもよい。
[00019]選択したＲＤＥを含む転写物をコードする核酸構築物を、免疫細胞、例えばＴ
リンパ球において発現させてもよい。枯渇させるＲＤＥ結合タンパク質によって制御されるポリペプチドをコードする転写物が、他の細胞シグナルに関する活性化の異なる閾値で発現されるように、選択したＲＤＥを含む組換え転写物が、Ｔリンパ球においてＲＤＥ結合タンパク質に結合して、そしてそのレベルを枯渇させることも可能である。ＲＤＥ構築物の使用は、その発現がＲＤＥによって制御されるポリペプチドの発現の動力学および／または発現のＣｍａｘを増加させうる。
[00020]図１は、キメラ抗原受容体－ＲＮＡ制御デバイス（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ）の模式図を提供する。 [00021]図２は、キメラ抗原受容体－不安定化要素（ＤＥ－ＣＡＲ）の模式図を提供する。 [00022]図３は、キメラ抗原受容体－不安定化要素－ＲＮＡ制御デバイス（Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ）の模式図を提供する。 [00023]図４は、ＣＡＲ受容体数に関する、経時的なエフェクター機能（Ｅ）、活性化シグナル伝達（ＮＡ）および阻害シグナル伝達（ＮＩ）を示すグラフを提供する。 [00024]図５は、経時的な、連続抗原刺激を受けたＣＤ８＋ Ｔ細胞に関するエフェクター機能、Ｔ細胞能およびＴ細胞消耗（または機能不全）を示す図を提供する。 [00025]図６は、異なる濃度のテオフィリン（ＲＮＡ制御デバイスのリガンド）の存在下での、経時的な、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に関する細胞殺傷活性のグラフを提供する。 [00026]図７は、エフェクター機能（Ｅ）、ターゲット細胞数（ｎＴ）、ＣＡＲ受容体数（ｎＲ）、およびＣＡＲ受容体－ターゲット細胞相互作用の数（ｎＲＴ）に対する時間を示す、ＣＡＲ Ｔリンパ球に関するグラフを提供する。 [00027]図８は、３つの変数がＣＡＲコピー数、ターゲットエピトープコピー数およびＣＡＲ結合アフィニティである場合の最適なＣＡＲ活性に関する図を示す。 [00028]図９は、新規テトラサイクリンＲＮＡ制御デバイス（配列番号１）を示す。 [00029]図１０は、別の新規テトラサイクリンＲＮＡ制御デバイス（配列番号２）を示す。 [00030]図１１は、６Ｒ－フォリン酸に結合するアプタマー（配列番号３）を示す。 [00031]図１２は、６Ｒ－フォリン酸に結合する別のアプタマー（配列番号４）を示す。 [00032]図１３は、新規６Ｒフォリン酸ＲＮＡ制御デバイス（配列番号５）を示す。 [00033]図１４は、別の６Ｒフォリン酸ＲＮＡ制御デバイス（配列番号６）を示す。 [00034]図１５は、さらなる別の６Ｒフォリン酸ＲＮＡ制御デバイス（配列番号７）を示す。 [00035]図１６は、休止状態のＴ細胞の生物発光に比較した際の、Ｒａｊｉターゲット細胞（ＣＡＲを活性化する）による、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）によるＴ細胞活性化後の、ＲＤＥによって制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。 [00036]図１７は、休止状態のＴ細胞の生物発光に比較した際の、Ｒａｊｉターゲット細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥ Ｇｏｌｄ１、Ｇｏｌｄ２、またはＧｏｌｄ３によって制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。 [00037]図１８は、休止状態のＴ細胞のＩＬ－１２発現に比較した際の、Ｒａｊｉターゲット細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥによって制御されるＩＬ－１２発現を含むＴ細胞からのＩＬ－１２発現に関するグラフを示す。
[00038]多様な態様を記載する前に、本開示の解説は、記載する特定の態様に限定され
ず、そしてこうしたものとして、もちろん、多様でありうることが理解されるものとする。本明細書に用いる用語が、特定の態様を記載する目的のためのみのものであり、そして本解説の範囲は、付随する請求項によってのみ限定されるため、該用語は、限定することを意図しないこともまた、理解されるものとする。
[00039]別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、
本開示が属する技術分野の一般の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似であるかまたは同等である任意の方法および材料もまた、本解説の実施または試験において使用可能であるが、いくつかの例示的な方法および材料をここで記載する。
[00040]本明細書において、そして付随する請求項において、背景が明らかに別に示さ
ない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれることに注目しなければならない。請求項は、いかなる場合による要素も排除するように立案されうることがさらに注目される。こうしたものとして、本言及は、請求要素の列挙と関連して、「単独で（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」等の排除的用語の使用、あるいは「負の」限定の使用のための前提として働くよう意図される。物質の濃度またはレベルに関して提供する数値の限定は、背景が明らかに別に示さない限り、およそのものであると意図される。したがって、濃度が（例えば）１０μｇと示される場合、濃度は、少なくともおよそまたは約１０μｇであると理解されるよう意図される。
[00041]本開示を読んだ際に当業者には明らかであろうように、本明細書に記載し、そ
して例示する個々の態様は各々、本解説の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴と容易に分離するかまたは組み合わせることが可能な、別個の構成要素および特徴を有する。いかなる列挙される方法も、列挙される事象の順で、または論理的に可能な任意の他の順で実行されてもよい。
定義
[00042]本開示を参照して、本明細書の説明に用いる技術的および科学的用語は、別に
明確に定義しない限り、一般の当業者によって一般的に理解される意味を有するであろう。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するよう意図される。
[00043]本明細書において、「アクチュエーター要素」は、ＲＮＡ制御デバイスの系制
御機能をコードするドメインと定義される。アクチュエータードメインは、場合によって、遺伝子制御機能をコードしてもよい。
[00044]本明細書において、「抗体」は、機能的にはリガンド結合タンパク質と定義さ
れ、そして構造的には免疫グロブリンの可変領域に由来すると当業者に認識されるアミノ酸配列を含むと定義される、タンパク質であると定義される。抗体は、免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子の断片、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子（異なる動物由来の遺伝情報を組み合わせることによって作製される）、または合成免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１またはそれより多いポリペプチドからなることも可能である。認識される天然免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子ならびに多数のＤセグメントおよびＪセグメントが含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、次にこれらは、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。抗体は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）免疫グロブリンとして、多様なペプチダーゼでの消化によって生じるよく特徴付けられたいくつかの断片として、または組換えＤＮＡ技術によって作製された多様な断片として存在する。抗体は、多くの異なる種（例えばウサギ、ヒツジ、ラクダ、ヒトまたは齧歯類、例えばマウスもしくはラット）から得られることも可能であるし、あるいは合成であってもよい。抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒューマニア化（ｈｕｍａｎｅｅｒｅｄ）であってもよい。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル、多重鎖または一本鎖、断片または損なわれていない免疫グロブリンであってもよい。
[00045]本明細書において、「抗体断片」は、損なわれていない抗体の少なくとも１つ
の部分、またはその組換え変異体であると定義され、そしてターゲット、例えば抗原に対する抗体断片の認識および特異的結合を与えるために十分である、抗原結合ドメイン、例えば損なわれていない抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例には、限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨいずれか）、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）ＶＨＨドメイン、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、および重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む、融合タンパク質と定義され、ここで軽鎖および重鎖可変領域が短い柔軟なポリペプチドリンカーを通じて隣接して連結され、そして一本鎖ポリペプチドとして発現されることが可能であり、そしてｓｃＦｖは由来した、損なわれていない抗体の特異性を保持する。別に明記しない限り、本明細書において、ｓｃＦｖは、例えばポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、いずれかの順でＶＬおよびＶＨ可変領域を有することも可能であり、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよいし、またはＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。
[00046]本明細書において、「抗原」は、免疫反応を誘発する分子と定義される。この
免疫反応は、抗体産生、または特定の免疫適格細胞の活性化、あるいはその両方のいずれかを伴うことも可能である。当業者は、限定されるわけではないが、グリコシル化ポリペプチド、リン酸化ポリペプチド、および脂質で修飾されたポリペプチドを含む他の翻訳後修飾ポリペプチドを含む、実質的にすべてのタンパク質またはポリペプチドを含む、任意
の巨大分子が、抗原として作用しうることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来してもよい。当業者は、免疫反応を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む、任意のＤＮＡが、したがって、該用語を本明細書で用いた際の「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定されるわけではないが、１より多い遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用が含まれ、そして所望の免疫反応を誘発するポリペプチドをコードするようにこれらのヌクレオチド配列を多様な組み合わせで配置することが容易に明らかであろう。さらに、当業者は、抗原が、「遺伝子」によってコードされる必要もまったくないことを理解するであろう。抗原を合成してもよく、または抗原は生物学的試料に由来してもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子であってもよいことが容易に明らかである。こうした生物学的試料には、限定されるわけではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生物学的構成要素を含む液体が含まれることも可能である。
[00047]本明細書において、用語「キメラ抗原受容体」および用語「ＣＡＲ」は、交換
可能に用いられる。本明細書において、「ＣＡＲ」は、抗原認識部分および細胞活性化要素を含む、融合タンパク質と定義される。
[00048]本明細書において、「ＣＡＲ Ｔ細胞」または「ＣＡＲ Ｔリンパ球」は、交
換可能に用いられ、そして実際の発現レベルに関わらず、ＣＡＲポリペプチドを産生する能力を含有するＴ細胞と定義される。例えば、ＣＡＲを発現可能な細胞は、細胞におけるＣＡＲの発現のための核酸配列を含有するＴ細胞である。
[00049]本明細書において、「共刺激要素」または「共刺激シグナル伝達ドメイン」ま
たは「共刺激ポリペプチド」は、共刺激ポリペプチドの細胞内部分であると定義される。共刺激ポリペプチドは、以下のタンパク質ファミリーに代表されてもよい：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ナチュラルキラー細胞受容体。こうしたポリペプチドの例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＭｙＤ８８等が含まれる。
[00050]本明細書において、「Ｃｍａｘ」は、細胞がポリペプチドを産生するように刺
激されるかまたは活性化された後に、細胞によって産生されるポリペプチドの最大濃度を意味するよう定義される。
[00051]本明細書において、「サイトカインＣｍａｘ」は、サイトカインを産生するよ
うに刺激または活性化された後、免疫細胞によって産生されるサイトカインの最大濃度を意味するよう定義される。
[00052]本明細書において、「細胞傷害性ポリペプチドＣｍａｘ」は、細胞傷害性ポリ
ペプチドを産生するように刺激または活性化された後、免疫細胞によって産生される細胞傷害性ポリペプチドの最大濃度を意味するよう定義される。
[00053]本明細書において、「不安定化要素」または「ＤＥ」または「Ｄｅｇｒｏｎ」
は、交換可能に用いられ、そしてリガンドの添加または排除（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）によって、細胞背景において、分解に対して、誘導性に耐性であるかまたは感受性であり、そしてシスに融合された同時翻訳ポリペプチドに対して、この安定調節を与えるポリペプチド配列と定義される。
[00054]本明細書において、「有効量」または「療法的有効量」は、交換可能に用いら
れ、そして本明細書において、特定の生物学的結果を達成するために有効である、化合物、配合物、材料、または組成物の量と定義される。
[00055]本明細書において、「エピトープ」は、免疫反応を誘発可能な抗原の部分、ま
たは抗体に結合する抗原の部分と定義される。エピトープは、抗体によって認識されるタンパク質配列または下位配列であってもよい。
[00056]本明細書において、「発現ベクター」および「発現構築物」は、交換可能に用
いられ、そしてどちらも、プラスミド、ウイルス、または細胞におけるタンパク質発現のために設計された他の核酸と定義される。ベクターまたは構築物は、宿主細胞内に遺伝子を導入するために用いられ、それによって、ベクターは、細胞におけるポリメラーゼと相互作用して、ベクター／構築物中にコードされるタンパク質を発現するであろう。発現ベクターおよび／または発現構築物は、細胞において、染色体外に存在してもよいし、または染色体内に組み込まれていてもよい。染色体内に組み込まれている場合、発現ベクターまたは発現構築物を含む核酸は、発現ベクターまたは発現構築物であろう。
[00057]本明細書において、「細胞外要素」は、キメラ抗原受容体の抗原結合または認
識要素と定義される。
[00058]本明細書において、「造血細胞」は、造血幹細胞から生じる細胞と定義される
。これには、限定されるわけではないが、骨髄前駆細胞、リンパ前駆細胞、巨核細胞、赤血球、マスト細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、マクロファージ、血小板、単球、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および形質細胞が含まれる。
[00059]本明細書において、「異種」は、核酸および／またはポリペプチドが宿主細胞
に対して同種でないことを意味するよう定義される。例えば、構築物は、宿主細胞に見られない方式で配置されたいくつかの同種配列を含有し、そして／または宿主細胞に見られないいくつかの異種配列を含有する場合、宿主細胞に対して異種である。
[00060]本明細書において、「細胞内要素」は、真核細胞の細胞質膜の細胞質側に存し
、そして真核細胞内にシグナルを伝達するキメラ抗原受容体の部分と定義される。「細胞内シグナル伝達要素」は、真核細胞に特殊な機能を実行させるエフェクター機能シグナルを形質導入する細胞内要素部分である。
[00061]本明細書において、「ＲＮＡ不安定化要素」または「ＲＤＥ」は、交換可能に
用いられ、そしてどちらも、タンパク質に結合され、そしてそのタンパク質結合が、ＲＮＡの安定性および／または翻訳を変化させるＲＮＡ中の核酸配列と定義される。ＲＤＥの例には、クラスＩ ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）、クラスＩＩ ＡＲＥ、クラスＩＩＩ ＡＲＥ、Ｕリッチ要素、ＧＵリッチ要素、およびステム－ループ不安定化要素（ＳＬＤＥ）が含まれる。理論によって束縛されることは望ましくないが、ＲＤＥはまた、ＨｕＲのようなＲＮＡ安定化ポリペプチドに結合することも可能である。
[00062]本明細書において、「ＲＮアーゼＩＩＩ基質」は、ＲＮアーゼＩＩＩファミリ
ーのエンドリボヌクレアーゼによって認識され、そして切断されるＲＮＡ配列モチーフと定義される。
[00063]本明細書において、「ＲＮＡｉ基質」は、アルゴノートファミリーのエフェク
ターエンドヌクレアーゼに複合体化した小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって結合されそして／または切断されるＲＮＡ配列と定義される。
[00064]本明細書において、「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、抗原結合活性における機
能を持つ免疫グロブリン分子と定義される。ｓｃＦｖ（一本鎖断片可変）形式の抗体は、柔軟なペプチドリンカーによってともに連結された、重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖の可変領域からなる。
[00065]本明細書において、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、通常、胸腺で発達す
る、造血細胞と定義される。Ｔリンパ球またはＴ細胞には、限定されるわけではないが、ナチュラルキラーＴ細胞、制御Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞および粘膜インバリアントＴ細胞が含まれる。
[00066]本明細書において、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形
質導入」は、外因性核酸を宿主細胞にトランスファーするかまたは導入するプロセスと定義される。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクション、形質転換または形質導入されているものである。該細胞には、初代被験体細胞およびその子孫が含まれる。
[00067]本明細書において、「膜貫通要素」は、細胞外要素および細胞内要素の間の要
素と定義される。膜貫通要素の部分は、細胞膜内に存在する。
不安定化要素
[00068]不安定化要素（ＤＥ）は、小分子リガンドと相互作用可能な安定性に影響を及
ぼすポリペプチドであり、そのリガンドの存在、非存在、または量を用いて、関心対象のＤＥ－ポリペプチドの安定性を調節する。関心対象のポリペプチドは、免疫調節ポリペプチドであってもよい。関心対象のポリペプチドはまた、ＣＡＲであってもよい。ＤＥ－ＣＡＲによるリガンドの結合は、真核細胞におけるＤＥ－ＣＡＲポリペプチドの分解速度を減少させうる。ＤＥ－ＣＡＲによるリガンドの結合はまた、真核細胞におけるＤＥ－ＣＡＲの分解速度を増加させうる。
[00069]例示的な不安定化要素またはＤＥは、２０１６年３月１５日提出の米国特許出
願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載され、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。例えば、ＵＳＳＮ １５／０７０，３５２は、ＦＫＢＰタンパク質の変異体、ＤＨＦＲタンパク質の変異体、変異体エストロゲン受容体結合ドメイン（ＥＲＢＤ）、およびエンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）の変異体フォトトロピン１（ＡｓＬＯＶ２）に由来するＤＥを記載する。変異体ＦＫＢＰ核酸およびポリペプチドの他の例は、２０１２年７月１２日公表のＵＳ公開特許出願２０１２０１７８１６８Ａ１に記載され、該文献は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。変異体ＤＨＦＲ核酸およびポリペプチドの他の例は、２０１２年７月１２日公表の米国公開特許出願２０１２０１７８１６８Ａ１に記載され、該文献は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。変異体ＥＲＢＤ核酸、ポリペプチドおよびリガンドの他の例は米国特許出願２０１４０２５５３６１に記載され、該文献は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。変異体ＡｓＬＯＶ２ ＤＥの他の例は、Ｂｏｎｇｅｒら， ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１４， ｖｏｌ．９， ｐｐ．１１１－１１５およびＵｓｈｅｒｅｎｋｏら， ＢＭＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１４， ｖｏｌ．８， ｐｐ．１２８－１４３に記載され、これらの文献は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[00070]他のＤＥは、２０１６年３月１５日出願の米国特許出願第１５／０７０，３５
２号、および２０１６年１２月５日出願の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されるような他のリガンド結合ポリペプチドに由来してもよく、これらの文献はどちらも
、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[00071]ＤＥとして使用するために変異体を作製可能な他のリガンド結合ポリペプチド
には、例えば、酵素、抗体または抗体断片または可変ドメインを用いた組換えＤＮＡ法によって操作される抗体断片、リガンド結合受容体、または他のタンパク質が含まれる。酵素の例には、ブロモドメイン含有タンパク質、ＦＫＢＰ変異体、または原核ＤＨＦＲ変異体が含まれる。ＤＥを作製する際に有用な受容体要素の例には：変異体ＥＲＢＤ、または哺乳動物、特にヒトに非毒性であるリガンドを有する他の受容体が含まれる。
[00072]ＤＥのリガンド（単数または複数）を、例えば２０１６年３月１５日出願の米
国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日出願の米国特許出願第１５／３６０，１３２号に記載されるような、療法的魅力のための特定の特質の最適化のために選択してもよく、これらの文献はどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
ＲＮＡ制御デバイス
[00073]本明細書に開示するリボ核酸（ＲＮＡ）制御デバイスは、遺伝子発現の調節可
能な制御、モジュール方式設計、およびターゲット特異性を示しうる。ＲＮＡ制御デバイスは、細胞ネットワークを通じた情報フローを配線し直すように作用し、そして細胞環境における変化に反応して、細胞の振る舞いを再プログラミングすることも可能である。ポリペプチド発現を制御する際、ＲＮＡ制御デバイスは、多様なインプット分子のレベルにおける時間的および空間的変動を監視する合成細胞センサーとして働きうる。ＲＮＡ制御デバイスは、多様な生存系において、ターゲットＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物のＲＮＡ制御を可能にする特異的エフェクター分子に反応して、本発明のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの発現を調節するようあつらえられたリガンド制御遺伝子調節系を構築するための強力なツールに相当する。
[00074]本明細書に開示するＲＮＡ制御デバイスは、調節要素およびセンサー要素を含
む。本明細書に開示するＲＮＡ制御デバイスは調節機能および感知機能の両方を含む単一要素を含むことも可能である。本明細書に開示するＲＮＡ制御デバイスは、調節機能および感知機能を含むことも可能である。本明細書に開示するＲＮＡ制御デバイスは、調節要素、センサー要素、ならびに調節要素およびセンサー要素と機能的にカップリングする情報伝達要素（ＩＴＥ）を含むことも可能である。ＩＴＥは、例えば鎖置換機構、静電相互作用、コンホメーション変化、または立体効果に基づいてもよい。ＲＮＡ制御デバイスの感知機能は、ＲＮＡ制御デバイスの構造変化につながり、作用機能活性の改変につながる。これらの構造変化が起こりうるいくつかの機構には、立体効果、疎水性駆動効果（ｌоｇ ｐ）、静電的駆動効果、ヌクレオチド修飾効果（例えばメチル化、プソイドウリジン化等）、二次リガンド相互作用効果および他の効果が含まれる。鎖置換機構は、２つの核酸配列（例えば競合鎖およびＲＮＡ制御デバイス鎖）の、ＲＮＡ制御デバイスの一般的な伝達領域（例えばアプタマーのベースステム）への競合的結合を用いて、センサー要素へのリガンド結合に反応した制御要素の破壊または回復を生じうる。
[00075]ＲＮＡ制御デバイスは、センサー要素および制御要素を含んでもよい。センサ
ー要素はＲＮＡアプタマーであってもよい。ＲＮＡ制御デバイスは、１より多いセンサー要素を有してもよい。いくつかの側面において、制御要素はリボザイムであってもよい。リボザイムはハンマーヘッドリボザイムであってもよい。リボザイムはまた、ヘアピンリボザイム、または肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、またはＶａｒｋｕｄ Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ（ＶＳ）リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、および／または当該技術分野に知られる他のリボザイムであってもよい。
[00076]単数または複数のＲＮＡ制御デバイスを、ＤＮＡ配列内に包埋してもよい。Ｒ
ＮＡ制御デバイスは、メッセンジャーＲＮＡ中にコードされてもよい。多重ＲＮＡ制御デバイスは、導入遺伝子コードｍＲＮＡとシスにコードされてもよい。多重ＲＮＡ制御デバイスは同じであってもよく、そして／または異なるＲＮＡ制御デバイスの混合物が反復されてもよい。ＲＮＡ制御デバイスをコードするために用いられる核酸を反復してもよい。多重ＲＮＡ制御デバイスを含めることによって、感受性および用量反応をあつらえるかまたは最適化することも可能である。多重ＲＮＡ制御デバイスは、各々、異なるリガンドに特異的であってもよい。これは、センサー要素と相互作用する内因性に産生されるリガンドによる、意図されない発現を軽減しうる。
ＲＮＡ制御デバイス：センサー要素
[00077]例示的なセンサー要素が、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／
０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載され、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。センサー要素は、アプタマーに由来してもよい。「アプタマー」は、高アフィニティおよび特異性で、特異的分子に結合可能な核酸分子、例えばＲＮＡまたはＤＮＡである（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３４６， ８１８－２２（１９９０）；およびＴｕｅｒｋら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ５０５－１０（１９９０）、どちらもすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）。小分子を認識するアプタマーの概説に関しては、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｆａｍｕｌｏｋ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：３２４－９（１９９９）を参照されたい。
[00078]本発明のＲＮＡ制御デバイスが、「オン」および「オフ」状態の間で切り替わ
るように、そのリガンドに対するアプタマーの結合アフィニティは、十分に強くなければならず、そしてそのリガンドに結合した際にアプタマーによって形成される構造は、有意に十分でなければならない。アプタマーおよび会合するリガンドに関する会合定数は、被験体へのリガンドの投与に際して得られるリガンド濃度で、リガンド（単数または複数）がアプタマーに結合し、そして所望の効果を有するようなものである。ｉｎ ｖｉｖｏ使用のため、例えば、会合定数は、血清または他の組織中で達成可能であるリガンド濃度よりもはるかに低い濃度で、あるいは細胞膜は、細胞内リガンド濃度が血清または細胞外環境におけるレベルに近付くことを可能にするために十分に浸透性ではない可能性があるため、細胞内で達成可能である濃度よりもはるかに低い濃度で、結合が起こるようなものでなければならない。ｉｎ ｖｉｖｏ使用のために必要なリガンド濃度はまた、被験体に対して望ましくない効果を有しうるものよりも下であることも可能である。
ＲＮＡ制御デバイスに関するリガンド
[00079]ＲＮＡ制御デバイスは、例えば、どちらも、すべての目的のため、その全体が
本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されるような、所望の結合特性、動力学、生物学的利用能等を持つ、外因性リガンドの添加、または内因性リガンドの合成（または添加）を通じて制御可能である。
[00080]リガンドは天然存在分泌代謝物であってもよい。例えば、腫瘍によってユニー
クに産生されるか、または腫瘍微小環境中に存在するリガンドは、センサー要素に関するリガンドであり、そしてセンサー要素へのこのリガンドの結合は、ＲＮＡ制御デバイスの活性を変化させる。したがって、制御デバイスは、反応性であり、そして化学的シグナル伝達または腫瘍への近接性を通じて制御される。
[00081]リガンドは、その薬力学的またはＡＤＭＥの振る舞いに関して選択されてもよ
い。例えば、リガンドは、ヒト解剖学および生理学の特定の部分に局在してもよい。例えば、特定の分子は、腸、肝臓、腎臓等において、優先的に吸収されるかまたは代謝される。リガンドは、特定の臓器において優先的な薬力学的振る舞いを示すように選択されていてもよい。例えば、リガンドのピーク濃度が必要な部位である一方、身体の残りの部位での濃度は最小限であり、望ましくない非特異的な毒性を防止するように、結腸直腸癌のため、結腸に優先的に局在するリガンドを有することが有用であろう。リガンドは、非優先的な薬力学的振る舞いを示すように選択されてもよい。例えば、血液学的悪性疾患のような播種性腫瘍に関しては、身体全体で、リガンドの非変動濃度を有することが有用であろう。
[00082]ＲＮＡ制御デバイス（またはＤＥ）に関するリガンドは、フォリン酸、Ｓ－フ
ォリン酸、Ｒ－フォリン酸、ビタミンＣ（アスコルビン酸）、アシクロビル等であってもよい。
ＲＮＡ制御デバイス：制御要素
[00083]制御要素は、リボザイム、アンチセンス核酸、またはｓｉＲＮＡもしくはｍｉ
ＲＮＡを生じさせるＲＮＡｉ配列もしくは前駆体、またはｓｈＲＮＡもしくはその前駆体、またはＲＮアーゼＩＩＩ基質、または選択的スプライシング要素、または転写ターミネーター、またはリボソーム結合部位、またはＩＲＥＳ、またはポリＡ部位を含んでもよい。本発明で有用な制御要素は、例えば、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載され、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[00084]アンチセンス技術において有用なオリゴマーを構築するための一般的なアプロ
ーチは、例えばｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（１９８８） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
６：９５８－９７６；およびＳｔｅｉｎら（１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４８：２６５９－２６６８に概説され、これらは、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。本発明で使用されうる特定のｍｉＲＮＡは、Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら， Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：２２８（２００３）； Ｋｉｍら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌｓ． １９：１－１５ （２００５）に記載され、これらは、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[00085]ＲＮＡ制御デバイスは、多重制御要素、および／または多重センサー要素を有
してもよい。多重センサー要素は、同じまたは異なるリガンドを認識可能である。多重センサー要素は、制御要素に対して、異なる（例えば増分性の、付加的なまたは相乗的な）効果を有してもよい。
ＲＮＡ不安定化要素
[00086]ＲＮＡ不安定化要素（ＲＤＥ）は、ＲＮＡ分子の安定性またはＲＮＡ分子の翻
訳動力学に影響を及ぼすかまたはこれらを維持する核酸である。いくつかのＲＤＥは、ＲＮＡを不安定化する（例えば切断する）か、または翻訳を防止するポリペプチドに結合し、ＲＮＡに関する機能喪失を導く。いくつかのＲＤＥ結合ポリペプチドは、ＲＮＡを安定化させて、ＲＮＡの半減期を増加させる。ＲＤＥを用いて、導入遺伝子、例えばキメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子の発現を制御することも可能である。ＲＤＥをＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、および／またはＳｉｄｅ ＣＡＲとともに用いて、導入遺伝子の発現を制御することも可能である。また、ＲＤＥを用いて、ＣＡＲ以外のポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御することも可能である。他の導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導剤、補体、細胞傷害性小分子、他の細胞傷害性化合物、画像化のためのポリペプチド、または所望の
効果を有しうる他のポリペプチドをコードしてもよい。ＲＤＥは、導入遺伝子ペイロードの送達を制御してもよい。ＲＤＥの例には、例えば、ＡＵリッチ要素、Ｕリッチ要素、ＧＵリッチ要素、および特定のステム－ループ要素が含まれる。例示的なＲＤＥは、Ｋｏｖａｒｉｋら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８９：２１－２６ （２０１７）； Ｒａｙら， Ｎａｔｕｒｅ ４９９：１７２－１７７ （２０１３）； Ｃａｓｔｅｌｌｏら， Ｃｅｌｌ １４９：１３９３－１４０６ （２０１２）； Ｖｌａｓｏｖａら， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． ２９：２６３－２７０ （２００８）； Ｂａｒｒｅａｕら， Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ｖｏｌ ３３， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ１０１２ （２００６）； Ｍｅｉｓｎｅｒら， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ５：１４３２－１４４７ （２００４）； Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら， Ｇｅｎｅ ２６５：１１－２３ （２００１）に記載され、これらはすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[00087]ＲＤＥは、クラスＩ ＡＵリッチ要素（Ｕリッチ背景における分散ＡＵＵＵＡ
（配列番号８））、クラスＩＩ ＡＵリッチ要素（重複（ＡＵＵＵＡ）ｎ）、クラスＩＩＩ ＡＵリッチ要素（Ｕ－リッチストレッチ）、ステム－ループ不安定化要素（ＳＬＤＥ）、サイトカイン３’ ＵＴＲ（例えば、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－２、Ｔ－細胞受容体α鎖、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ等）、およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡの配列（配列番号９）であってもよい。Ｋｈａｂａｒ， ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ ２０１６， ｄｏｉ：１０．１００２／ｗｒｎａ．１３６８（２０１６）； Ｐａｌａｎｉｓａｍｙら， Ｊ． Ｄｅｎｔ． Ｒｅｓ． ９１：６５１－６５８ （２０１２）、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。ＲＤＥは、例えばＵＵＧＵＵ（配列番号１０）、ＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号１１）、またはＧＵＵＵＧ（配列番号１２）の１またはそれより多くで構成される、ＧＵリッチ要素であってもよい。ＲＤＥは、例えば、ＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号１３）、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ（配列番号１４）、ＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号１５）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１６）、ＵＵＡＧＡ（配列番号１７）、またはＡＧＵＵＵ（配列番号１８）の１またはそれより多くで構成されるＵリッチ要素であってもよい。いくつかの側面において、多重ＲＤＥを組み合わせて、調節単位を作製してもよく、例えば同じ配列を有する多重ＲＤＥを鎖状体に配置してもよいし、あるいはＲＤＥのいくつかまたはすべての間に介在配列を含めて配置してもよい。ＲＤＥ配列を修飾して、ＲＤＥに関するＲＮＡ結合タンパク質（単数または複数）のアフィニティを増加させるかまたは減少させてもよい。例えば、ＡＵリッチＲＤＥを変化させて、ＲＤＥへのグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のアフィニティを改変してもよい。アフィニティのこの変化は、ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥによって制御される導入遺伝子の発現に関するＧＡＰＤＨ－活性化閾値を改変することも可能である。
[00088]ＲＤＥは、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、Ｉ
Ｌ－８、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＶＥＧ Ｆ、ＰＧＥ２、ＣＯＸ－２、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテイナーゼ）、ｂＦＧＦ、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ベータ（ｂｅｔａｌ）－ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン－ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ－２、ＮＯＳ ＨＡＮＯＳ、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－アルファ、ｂｃｌ－２、インターフェロン－ベータ、ｃ－ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ミオゲニン、ＮＦ－Ｍ、またはＧＡＰ－４３、リンパ球抗原９６、ＳＵＰＶ３Ｌ１、ＳＦｔＰＡ２、ＢＬＯＣ１Ｓ２、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ８Ｄ１、ＴＲＰＴ１，ＣＩＰ２９、ＥＰ４００、ＰＬＥ２、Ｈ３ＳＴ３Ａ１、ＺＮＦ５７１、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＳＰＡＧ４Ｌ、ＯＲ１０Ａ６およびＫＩＲ３ＤＬをコードする遺伝子の３’ＵＴＲに由来してもよい。他のＲＤＥは、例えば、ＧＬＭＮ、ＡＭＹ２Ｂ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ１Ａ、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＣＳＲＰ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＫＣＮＨ１、レティキュロン４、ＭＲＰＬ３０、Ｎａｖ１．２、組織因子経路阻害剤、ＥＥＦ１Ｂ２、ＣＲＹＧＢ、ＡＲＭＣ９、ＲＰＬ１５、ＥＡＦ２、ＭＲＰＳ２２、ＭＲＰＳ２２、ＣＯＰＢ２、ＰＤＣＤ１０、ＲＥ１－サイレンシング転写因子、アンフィレギュリン、ＡＰ１ＡＲ、ＴＬＲ３、ＳＫＰ２、ペプチドグリシンアルファアミド化モノオキシゲナーゼ、ＴＮＦＡＩＰ８、インターロイキン９、ＰＣＤＨＡ２、ＰＣＤＨＡ１２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ５ファミリーメンバーＡ１、ＫＣＮＱ５、ＣＯＸ７Ａ２、モノカルボキシレート・トランスポーター１０、ＭＬＬＴ４、ＰＨＦ１０、ＰＴＰＮ１２、ＭＲＮＡ（グアニン－Ｎ７－）－メチルトランスフェラーゼ、ＷＨＳＣ１Ｌ１、毛髪・鼻・指節症候群１型、インターフェロン・アルファ－１、ＺＣＣＨＣ６、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御因子、ＭＥＤ１４、ＣＬＣＮ５、ＤＮＡ２Ｌ、ＯＲ５２Ｄ１、ＮＥＬＬ１、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＳＬＣ２２Ａ１０、ＴＲＰＣ６、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＥＰＳ８、ＣＴ２（遺伝子）、ミトコンドリア・リボソーム・タンパク質Ｌ４２、ＴＡＯＫ３、ＮＵＰＬ１、Ｂ型エンドセリン受容体、生存運動ニューロンタンパク質相互作用タンパク質１、ＰＯＬＥ２、肝臓リパーゼ、ＴＰＳＧ１、ＴＲＡＰ１、ＲＰＳ１５Ａ、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＣＲＯＰ（遺伝子）、アポリポタンパク質Ｈ、ＧＲＢ２、ＣＥＰ７６、ＶＰＳ４Ｂ、インターロイキン２８Ｂ、ＩＺＵＭＯ１、ＦＧＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＬＩＮ７Ｂ、およびＣＤＣ４５関連タンパク質由来の３’－ＵＴＲに見られる。
[00089]さらに他のＲＤＥが、例えばＳＣＦＤ１、ＭＡＬ２、ＫＨＳＲＰ、ＩＱＣＢ１
、ＣＡＭＰ反応性要素調節剤、ＭＦＡＰ５、ＳＢＦ２、ＦＫＢＰ２、ＰＤＣＤ１０、ＵＢＥ２Ｖ２、ＮＤＵＦＡＢ１、コイルドコイルドメイン含有タンパク質、ＡＬＧ１３、ＴＰＴＥ、エナプチン、サイモポエチン、デルタ様１、Ｃ１１ｏｒｆ３０、アクチニン・アルファ４、ＴＭＥＭ５９、ＳＰ１１０、ダイサー、ＴＡＲＤＢＰ、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１４、ＺＭＹＭ３、インターロイキン９、Ｉ型、ＯＰＮ１ＳＷ、ＴＨＳＤ１、ＥＲＧＩＣ２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＷＤＲ８、ＦＸＲ１、チミン－ＤＮＡグリコシラーゼ、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ＯＳＢＰＬ３、Ｒａｎ、ＧＹＰＥ、ＡＫＡＰ４、ＬＯＣ６４２６５８、Ｌ２ＨＧＤＨ、ＡＫＡＰ１、ジンクフィンガータンパク質３３４、ＴＣ２Ｎ、ＦＫＢＰＬ、ＧＲＢ１４、ＣＸｏｒｆ６７、ＣＸｏｒｆ６６、ＣＥＰ７６、ガストリシン、ＣＥＰ７０、ＣＹＰ２６Ａ１、ＮＡＡ３５、アリール炭化水素受容体核内輸送体、ＫＬＣ４、ＧＰＲ１１２、ＬＡＲＰ４、ＮＯＶＡ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＩＴＧＡ６、ＧＰＲ１８、ＭＧＳＴ Ａ型、ＲＥ１サイレンシング転写因子、ＡＳＰＭ、ＺＮＦ４５２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＡＨＳＡ１、ＴＭＴＣ４、ＶＳＸ１、Ｐ１６、ＭＲＰＬ１９、ＣＣＬ２０、ＴＲＰＴ１、肝臓リパーゼ、ＰＤＬＩＭ５、ＣＣＤＣ５３，’ＣＣＤＣ５５、ＧＡＰＶＤ１、ＨＯＸＢ２、ＫＣＮＱ５、ＢＲＣＣ３、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＣＤＫ５ＲＡＰ３、転写因子ＩＩ＿Ｂ、ＺＥＢ１、ＩＲＧＭ、ＳＬＣ３９Ａ６、ＲＨＥＢ、ＰＳＩＰ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ウロキナーゼ受容体、ＧＦＭ１、ＤＮＡＪＣ７、ホスホイノシチド依存性キナーゼ－１、ＬＭＯＤ３、ＴＴＣ３５、ＲＲＰ１２、ＡＴＸＮ２、ＡＣＳＭ３、ＳＯＡＴ１、ＦＧＦ８、ＨＮＲＰＨ３、ＣＴＡＧＥ５、ＰＯＬＧ２、ＤＹＲＫ３、ＰＯＬＫ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｃ、ＣＤ１３７、カルモジュリン１、ＺＮＦ５７１、ＣＮＯＴ２、ＣＲＹＺＬ１、ＳＭＣ３、ＳＭＣ４、ＳＬＣ３６Ａ１、デコリン、ＨＫＲ１、ＥＲＣ１、Ｓ１００Ａ６、ＲＩＭＳ１、ＴＭＥＭ６７、ミトコンドリア・リボソーム・タンパク質Ｌ４２、ＭＥＣＰ２、ＲＮＦ１１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＭＹＬＫ３、ＴＩＮＡＧ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＧＰＤ５、ＵＢＥ２Ｖ１、ＳＡＲ１Ｂ、ＳＬＣ２７Ａ６、ＺＮＦ６３８、ＲＡＢ３３Ａ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＵＣＬ１、ＣＡＤＰＳ２、ＭＣＦ２Ｌ、ＴＢＣＡ、ＳＬＣ１７Ａ３、ＬＥＯ１、ＩＦＮＡ２１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＰＲＫＤ２、ＡＴＰ１１Ｂ、ＭＯＲＣ２、ＲＢＭ６、ＫＬＲＤ１、ＭＥＤ３１、ＰＰＨＬＮ１、ＨＭＧＢ２、ＤＮＡ修復組換えタンパク質ＲＡＤ５４様、ＲＢＭ９’、ＡＲＬ１１、ＨｕＤ、ＳＰＥＦ２、ＣＢＬＬ１、ＳＬＣ３８Ａ１、「カスパーゼ１」、Ｓ１００Ｇ、ＣＡ１＿、ＣＥＬＡ１、ＰＴＳ、ＩＴＭ２Ｂ、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ、ＴＲＰＰ３、ＩＭＰＤＨ２、ＤＰＹＳ、ＣＤＣＡ３、ＥＦＣＡＢ６、ＳＬＩＴ２、ＳＩＰＡ１Ｌ１、ＦＩＰ１Ｌ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＮＤＵＦＣ１、ＣＲＯＰ、ＣＤ４８、ＡＰＰＢＰ１、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ヒストンデアセチラーゼ２ ＸＩ型、インターロイキン４、毛髪・鼻・指節症候群１型、ＳＥＣ６１Ｇ、ＴＲＩＰ１２、ＰＬＥＫＨＯ１、ＳＥＣ６１Ｂ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＣＰＶＬ、Ｅ２Ｆ７、ＵＴＰ２０、Ｅ２Ｆ５、ＰＡＲＤ３、ＥＸＯＣ７、ＨＥＸＢ、カスパーゼ補充ドメイン含有タンパク質８、ＭＢＤ４、ＰＰＰ４Ｃ、ヘリカーゼ、ホスデューシン、ＳＰＧ１１、ＣＧＧＢＰ１、ＰＳＫＨ１、カテプシンＳ、オレキシン、ＩＭＭＰ２Ｌ、Ｃ２ｏｒｆ２８、ラミニン、ＥＩＦ３Ｓ６、ＬＲＲＣ４１ ＸＩＩ型、カテプシンＣ、ＨＰＳ６、ＡＲＡＦ、ジンクフィンガーおよびＢＴＢドメイン含有タンパク質１６、性ホルモン結合グロブリン、ＦＢＬＮ２、サイトカインシグナル伝達抑制因子１、ＴＭＥＭ１２６Ａ、ＤＯＭ３Ｚ、ＴＳＦＭ＿ＰＯＬＱ様、ＤＹＮＬＴ３、ＣＤＨ９、ＥＡＦ２、ＭＩＰＥＰ、ＮＤＵＦＡ１２、ＨＤＡＣ８、ＭＫＫＳ、ＦＧＧ、ＩＬ３６Ｇ、ＣＤＣＡ７、ＣＲＩＳＰＬＤ２、オルファクトメジン様２ｂ、ＭＲＰＬ３２、ＭＲＰＬ３３、ＡＨＩ１、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＵＴＰ１４Ａ、ＳＳＨ２、ディストニン、コンタクチン６、ＰＰＦＩＢＰ１、ＴＨＯＣ１、ＣＮＯＴ１、ＲＨＣＥ、ＳＬＣ４１Ａ３、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＮＡＰ２３、ＲＦＸ３、ＧＮＧ４、ＭＲＰＬ４０、ＬＳＲ、アンギオゲニン、ＴＲＩＰ４、ＶＲＫ１、ＣＯＵＰ－ＴＦＩＩ、ＦＯＸＰ２、ＳＮＸ２、ヌクレオポリン８５、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ２７Ａ、ＳＥＣ６２、カルシウム活性化カリウムチャネルサブユニットアルファ－１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＲＰＬ１７、ＣＥＰ１０４、ＣＥＰ２９０、ＶＰＳ２９、ＡＮＸＡ４、ジンクフィンガータンパク質７３７、ＤＤＸ５９、ＳＡＰ３０、ＮＥＫ３、エキソソーム構成要素９、活性化Ｃキナーゼ受容体１、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ、ＴＩＮＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＤＩＳＣ１、ＬＲＲＴＭ１、ＰＯＰ１ラミンＢ１、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質、ＣＯＸ６Ｃ、ＴＬＲ＿１、ＡＲＩＤ２、ＬＡＣＴＢ、ＭＭＳ２２Ｌ、ＵＢＥ２Ｅ３、ＤＡＰ３、ＺＮＦ２３、ＳＫＰ２、ＧＰＲ１１３、ＩＲＦ９グレリンＯ－アセチルトランスフェラーゼ、ＮＥＩＬ３、ＥＥＦ１Ｅ１、ＣＯＸ１７、ＥＳＤ、デンチン・シアロホスホタンパク質、ＨＤＡＣ９、ＲＦＣ４、ＣＹＬＤ、ＲＰＬＰ０、ＥＩＦ２Ｂ３、ＵＧＴ２Ａ１、ＦＡＢＰ７、ＴＲＩＰ１１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＩＮＴＳ１２、ＭＹＨ１、ＺＢＴＢ１７、ＭＹＨ４、ＮＬＲＰ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＹＨ８、サーモゲニン受容体２、ＩＦＩ１６、ＴＨＹＮ１、ＲＡＢ１７、ＥＴＦＡ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、Ｆ１３Ｂ、ＲＡＢ６Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＡＴＢ２、ＳＡＴＢ１、ＨＭＧ２０Ｂ、ＵＨＲＦ１、ＣＮＯＴ３、プロスタグランジンＥＰ２受容体、ＦＡＭ６５Ｂ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、ＫｖＬＱＴ２、ＧＲＩＫ５、ＳＨＯＣ２、コルタクチン、ＦＡＮＣＩ、ＫＩＡＡ１１９９、キヌレニナーゼ、デコイ受容体１、ＮＥＵ３、ＰＨＦ１０、メチル－ＣｐＧ結合ドメインタンパク質２、ＲＡＢＧＡＰ１、ＣＥＰ５５、ＳＦ３Ｂ１、ＭＳＨ５、ＭＳＨ６、ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＬＩＭＳ１、ＳＬＣ５Ａ４、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＲＮＦ３４、ＳＯＲＢＳ２、ＵＩＭＣ１、ＳＯＸ５、ＹＷＨＡＺ、ＩＣＯＳＬＧ、ＮＯＰ５８、ジンクフィンガータンパク質６７９、ＰＨＫＢ、ＭＥＤ１３、ＡＢＣＢ７、ＣＯＱ９、Ｃ１４ｏｒｆ１０４、ジンクフィンガータンパク質５３０、ＫＬＲＣ２、ＬＳＭ８、ＮＢＲ１、ＰＲＫＣＤ、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＭＴＳＳ１、ソマトスタチン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼＬ５、ＷＤＲ７２、ＦＥＲＭＴ３、核受容体関連－１タンパク質、クエン酸シンターゼ、ＶＰＳ１１、ＫＩＺ、ＺＦＹＶＥ２７、ＢＣＫＤＨＢ、ヒポクレチン、ＣＡＣＮＧ２、ＰＴＣＨ１、カルボニックアンヒドラーゼ４、ヌクレオポリン１０７、ＬＤＬ受容体、ＬＥＫＴＩ、ＦＢＸＯ１１、ＮＤＵＦＢ３、ＦＣＨＯ２、ＣＥＰ７８、ＲＡＰＧＥＦ６、ＰＰＩＬ３、ＮＩＮ、ＲＡＰＧＥＦ２、成長ホルモン１、成長ホルモン２、ＭＮＡＴ１、Ｎａｖ１、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＵＧＴ１、ＬＡＩＲ１、ヒアルロナン仲介性運動受容体、ＭＡＰ３Ｋ２、ＭＰＰ２、ＴＦＢ２Ｍ、ＣＲＢ３、ＭＰＰ５、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＤＬＧＡＰ２、ＩＮＨＢＡ、ＭＡＧＩ２、ＣＩＰ２９、ＳＥＴＤＢ１、チトクロムｂ５、ＴＲＰＶ２、インターロイキン１受容体、ＨＯＸＤ８、ＴＩＭＭ１０、ＡＴＸＮ２Ｌ、ＣＬＣＮ２、ＣＲＥＢ１、ＴＮＩＰ１、ＣＢＬＢ、因子Ｖ、ＵＳＰ３３、ＳＯＮ、ＲＢＢＰ８、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＰＴＰＮ１２、ＡＤＣＹ８、ＭＹＬＫ、ＫＩＦ２３、ＲＥＸＯ２、ＢＳＴ１、ＴＯＰ３Ｂ、ＣＯＰＢ１、ＡＸＩＮ２、ＣＯＰＢ
２、ＴＮＲＣ６Ｂ、グアニジノアセテートＮ－メチルトランスフェラーゼ、アシル－ＣｏＡチオエステラーゼ９、Ｃ４ｏｒｆ２１、ＴＳＨＢ、ＦＲＳ３、ＥＰＢ４１、サイクリンＴ２、ＬＡＩＲ２、ヌクレオポリン４３、ＡＰＬＰ２、ＴＮＦＲＳＦ１９、死関連タンパク質６、上皮細胞接着分子、ＣＬＥＣ７Ａ、ゲフィリン、ＣＬＤＮＤ１、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＣＤＨＡＣ２、骨形成タンパク質４、ＮＶＬ、ＲＢＭ３３、ＲＮＦ１３９、精子関連抗原５、ＰＬＣＢ１、グリア細胞株由来新神経栄養因子、ＰＡＲＰ４、ＰＡＲＰ１、ＭＡＮ２Ａ１、骨形成タンパク質１、ＰＡＸ４、ＢＣＣＩＰ、ＭＭＰ７、デコイ受容体３、ＲＡＭＰ２、ＮＣＡＰＤ３、ＬＲＲＣ３７Ａ、ＲＷＤＤ３、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｃ、ＳＬＣ３Ａ１、ＭＲＰＳ２２、ＣＤＣ１４Ａ、ＩＴＳＮ１、ＰＯＬＥ２、ＭＹＣ－誘導性核抗原、ＴＭＬＨＥ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＧＰＲ１７７、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＫＩＡＡ１３３３、ＲＰＰ３８、ＭＹＯ１Ｆ、ファルネソイドＸ受容体、カルデスモン、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＯＰＮ１ＭＷ、ＰＩＧＮ、ＡＲＮＴＬ２、ＢＣＡＳ３、Ｃ６ｏｒｆ５８、ＰＨＴＦ２、ＳＥＣ２３Ａ、ＮＵＦＩＰ２、ＯＡＺ１、オステオプロテジェリン、ＡＮＡＰＣ４、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＳＰＡＭ１、ＰＳＭＡ６、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＲＡＢＥＰ１、ＤＰＭ３、ＳＬＣ６Ａ１５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＡＲＨＧＡＰ２４、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＥＲＣＣ５、転写開始タンパク質ＳＰＴ３相同体、ＯＲ１Ｅ１、ＺＮＲＦ１、ＧＭＥＢ１、ＣＣＴ２＿ＧＮＡＱ、ムチン６、ムチン４、ＬＲＰ５、ＰＤＥ９Ａ、Ｃ２ｏｒｆ３、ＥＺＨ２、上皮増殖因子受容体、ＴＭＴＣ２、ＰＤＥ４Ａ、ＥＰＨ受容体Ａ４、ＰＰＩＢ、ＤＥＮＮＤ４Ａ、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２、ヌクレオポリン８８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＣＯＧ８、ＲＢＭＳ１、ＭＡＰ７、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＡＥＢＰ２、ＤＣＬＲＥ１Ａ、ＲＰＬ２４、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２３、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＡＴＧ７、ＳＥＲＰＩＮＩ２、ＧＹＬＴＬ１Ｂ、ＡＴＰ５Ｇ２、ＤＩＰ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＣＥＰ６３、ＴＤＲＤ７、ＰＩＥＺＯ１、ＣＬＤＮ２０、ＧＲＸＣＲ１、ＰＭＥＬ、ＮＩＦ３Ｌ１、ＭＣＣ＿、ＰＣＮＸ、ＴＭＢＩＭ４、ＤＵＳＰ１２、ＺＭＹＮＤ８、ＧＯＳＲ１、インターフェロンガンマ受容体１、ＬＤＢ３、ＰＯＮ３、Ｃ１Ｄ、ＡＢＣＣ８、ＣＯＱ７、ＣＯＱ６、ＡＭＥＬＹ、ＨＡＶＣＲ１、ＰＩＣＡＬＭ、シェーグレン症候群抗原Ｂ、ＰＬＫ４、ＨＢＢ、ＡＫＴ１、ＰＣＤＨＧＢ７、Ｃ６ｏｒｆ１０、ＵＢＲ１、網膜芽細胞腫様タンパク質１、ＧＲＫ６、ＷＷＣ２、ＧＲＫ４、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＳＬＣ３４Ａ１、ＧＯＬＧＡ２、ＭＹＣＢＰ２、ＰＴＰ４Ａ２、ＮＵＣＢ２、ＭＡＧＯＨ、ＲＰＰ４０、アルファ－２Ａアドレナリン受容体、ＳＰＡＧ１１Ｂ、ヌクレオポリン２０５、ＣＯＧ１、運動性精子ドメイン含有３、ＫＣＮＭＢ３、運動性精子ドメイン含有１、ＫＬＨＬ７、ＫＣＮＮ２、ＴＳＰＡＮ８、ＧＰＲ２１、輸送体タンパク質、ＨＮＲＮＰＬＬ、ＡＢＨＤ５、ＣＡＢ３９Ｌ、アンフィレギュリン、ＧＰＲ１、インターロイキン１８、ＥＩＦ４Ｇ３、インターロイキン１５、ＣＣＤＣ８０、ＣＤ２ＡＰ、ＮＦＳ１、ＧＲＢ２、ＵＬＢＰ２、血管内皮増殖因子Ｃ、ＲＰＳ３、ＴＬＲ８、ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１、ＲＨＯＴ１、コラーゲン、中心体タンパク質Ｅ、ＳＴＭＮ２、ＨＥＳＸ１、ＲＰＬ７、Ｋａｌｉｒｉｎ、ＰＣＭＴ１、ＨＬＡ－Ｆ、ＳＵＭＯ２、ＮＯＸ３、ＥＰ４００、ＤＮＭ３、ＥＥＤ、ＮＧＬＹ１、ＮＰＲＬ２、ＰＬＡＣ１、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有タンパク質３、Ｃ７ｏｒｆ３１、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＨＡＵＳ３、ＩＦＮＡ１０、ＭＹＳＴ４、ＤＣＨＳ１、ＳＩＲＴ４、ＥＦＥＭＰ１、ＡＲＰＣ２、ＭＥＤ３０、ＩＦＴ７４、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＤＹＮＣ１ＬＩ２、ＰＯＬＲ２Ｂ、ＰＯＬＲ２Ｈ、ＫＩＦ３Ａ、ＰＲＤＭ１６、ＰＬＳＣＲ５、ＰＥＸ５、副甲状腺ホルモン１受容体、ＣＤＣ２３、ＲＢＰＭＳ、ＭＡＳＴ１、ＮＲＤ１、ＢＡＴ５、ＢＡＴ２、Ｄｏｃｋ１１、ＧＣＳＨ、ＰＯＦ１Ｂ、ＵＳＰ１５、ＰＯＴ１、ＭＵＴＹＨ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＦＡＭ１２２Ｃ、Ａ１ポリペプチド、フラビン含有モノオキシゲナーゼ３、ＨＰＧＤ、ＬＧＡＬＳ１３、ＭＴＨＦＤ２Ｌ、生存運動ニューロンドメイン含有１、ＰＳＭＡ３、ＭＲＰＳ３５、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ、ＳＧＣＥ、ＲＥＰＳ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＰＡＢＰＣ１、ＭＡＰＫ８、ＰＤＣＤ５、ホスホグルコムターゼ３、ユビキチンＣ、ＧＡＢＰＢ２、ミトコンドリア翻訳放出因子１、ＰＦＤＮ４、ＮＵＢ１、ＳＬＣ１３Ａ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ガレクチン－３、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＧＣＡ、組織因子経路阻害剤、ＵＣＫＬ１、ＩＴＦＧ３、ＳＯＳ１、ＷＷＴＲ１、ＧＰＲ８４、ＨＳＰＡ１４、ＧＪＣ３、ＴＣＦ７Ｌ１、マトリックスメタロペプチダーゼ１２、ＩＳＧ２０、ＬＩＬＲＡ３、血清アルブミン、ホスデューシン様、ＲＰＳ１３、ＵＴＰ６、ＨＰ１ＢＰ３、ＩＬ１２Ａ、ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ２、ＬＡＴＳ１、ＢＭＦ、サイモシン・ベータ－４、Ｂ細胞リンカー、ＢＣＬ２Ｌ１１、凝固因子ＸＩＩＩ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＰＲＰＦ１９、ＳＦＲＳ５、インターロイキン２３サブユニット・アルファ、ＮＲＡＰ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１４、Ｃ９ｏｒｆ６４、テスチン、ＶＰＳ１３Ａ、ＤＧＫＤ、ＰＴＰＲＢ、ＡＴＰ５Ｃ１、ＫＣＮＪ１６、ＫＡＲＳ、ＧＴＦ２Ｈ２、ＡＭＢＮ、ＵＳＰ１３、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＴＲＯ＿、ＲＴＦ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ２、ＳＳＢＰ１、ＳＮＲＰＮ上流リーディングフレームタンパク質、ＲＰＳ２９、ＳＮＲＰＧ、ＡＢＣＣ１０、ＰＴＰＲＵ、ＡＰＰＬ１、ＴＩＮＦ２、ＴＭＥＭ２２、ＵＮＣ４５Ａ、ＲＰＬ３０、ＰＣＤＨ７、ガラクトサミン－６スルファターゼ、ＵＰＦ３Ａ、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＣＴＬ６Ｂ、ＩＬ３ＲＡ、ＳＤＨＢ、カテプシンＬ２、ＴＡＳ２Ｒ７、カテプシンＬ１、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、ＲＰＮ２、ＤＹＮＬＬ１、ＫＬＫ１３、ＮＤＵＦＢ３、ＰＲＰＦ８、ＳＰＩＮＴ２、ＡＨＳＡ１、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＤＲＡＰ１、ＲＮＡＳＥ１、オルファクトメジン様２ｂ、ＶＲＫ１、ＩＫＫ２、ＥＲＧＩＣ２、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＭＫ２Ｂ、エストロゲン受容体ベータ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＲＰＬ１９、ＮＵＣＢ２、ＫＣＴＤ１３、ユビキノン、Ｈ２ＡＦＹ、ＣＥＰ２９０、ＰＡＢＰＣ１、ＨＬＡ－Ｆ、ＤＨＸ３８、ＫＩＡＡ０９２２、ＭＰＨＯＳＰＨ８、ＤＤＸ５９、ＭＩＢ２＿、ＺＢＰ１、Ｃ１６ｏｒｆ８４、ＵＡＣＡ、Ｃ６ｏｒｆ１４２、ＭＲＰＬ３９、サイクリン依存性キナーゼ７、遠位上流要素結合タンパク質＿１、ＳＧＯＬ１、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＡＴＧ１０、デルムシジン、ＥＰＳ８Ｌ２、デコリン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＤＣ２０、ＭＹＢ、ＷＮＴ５Ａ、ＲＢＰＪ、ＤＥＦＢ１０３Ａ、ＲＰＳ１５Ａ、ＡＴＰ５Ｈ、ＲＰＳ３、ＦＡＢＰ１、ＳＬＣ４Ａ８、血清アミロイドＰ構成要素、ＡＬＡＳ１、ＭＡＰＫ１、ＰＤＣＤ５、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＣＨＲＮＡ３、ＡＴＸＮ１０、ＭＮＡＴ１、ＡＬＧ１３、アタクシン３、ＬＲＲＣ３９、ＡＤＨ７、デルタ－サルコグリカン、ＴＡＣＣ１、ＩＦＮＡ４、胸腺間質リンホポエチン、ＬＧＴＮ、ＫＩＡＡ１３３３、ＭＳＨ６、ＭＹＯＴ、ＲＩＰＫ５、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＲＰＬ２７、Ｒｎｄ１、血小板因子４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＬＳＭ８、ＣＥＰ６３、ＩＮＴＳ８、ＣＴＮＳ、ＡＳＡＨＬ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＨＥＸＢ、ＳＬＣ１６Ａ５、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＦＲＭＤ６の３’ＵＴＲに見られうる。
[00090]ＲＤＥは、例えばｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆоｓ、ベータ－ＡＲ、ＰＴＨ、インター
フェロン－ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ－２またはＮＯＳ ＨＡＮＯＳをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩ ＡＵリッチ要素であってもよい。ＲＤＥはまた、クラスＩＩ ＡＵリッチ要素であってもよく、そして例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－アルファ、ＣＯＸ－２、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ｂｃｌ－２、インターフェロン－ベータ、またはＶＥＧ－Ｆをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じる。ＲＤＥは、例えば、ｃ－ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ｈｓｐ７０、ミオゲニン、ＮＦ－Ｍ、またはＧＡＰ－４３をコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じる、クラスＩＩＩ ＡＵリッチ要素であってもよい。他のＲＤＥを、Ｔ細胞受容体サブユニット（α、β、γ、またはδ鎖）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、および他のチェックポイント阻害剤の３’－ＵＴＲから得てもよい。さらに他のＲＤＥを、すべての目的のためにその全体が本明細書に援用される、Ｃｏｐｐｅら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐａｔｈｏｌ． ５：９９－１１８ （２０１０）に開示される老化関連分泌表現型遺伝子の３’－ＵＴＲから得てもよい（例えば表１を参照されたい）。
[00091]ＲＤＥは、例えばＡＲＥポリ（Ｕ）結合／分解因子（ＡＵＦ－１）、トリステ
トラプロリン（ＴＴＰ）、ヒト抗原関連タンパク質（ＨｕＲ）、酪酸反応因子（ＢＲＦ－１）、酪酸反応因子２（ＢＲＦ－２）、Ｔ細胞制限細胞内抗原－１（ＴＩＡ－１）、ＴＩＡ－１関連タンパク質（ＴＩＡＲ）、ＣＵＧ３つ組リピート、ＲＮＡ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ－１）、ＣＵＧ３つ組リピート、ＲＮＡ結合タンパク質２（ＣＵＧＢＰ－２）、ヒトニューロン特異的ＲＮＡ結合タンパク質（Ｈｅｌ－Ｎ１、Ｈｅｌ－Ｎ２）、ＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＡ、ＨｕＢおよびＨｕＣ、ＫＨ型スプライシング制御タンパク質（ＫＳＲＰ）、３－メチルグルタコニル－ＣｏＡヒドラターゼ（ＡＵＨ）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）、熱ショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１０）、異種核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰ Ａ１）、異種核リボ核タンパク質Ａ２（ｈｎＲＮＰ Ａ２）、異種核リボ核タンパク質Ａ３（ｈｎＲＮＰ Ａ３）、異種核リボ核タンパク質Ｃ（ｈｎＲＮＰ Ｃ）、異種核リボ核タンパク質Ｌ（ｈｎＲＮＰ Ｌ）、Ｂｃｌ－２ ＡＵリッチ要素ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＩＮＯ）、ポリ（Ａ）結合タンパク質相互作用タンパク質２（ＰＡＩＰ２）、ＩＲＰ１、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、およびアルドラーゼを含む、特定のポリペプチドに結合されてもよい。ＲＤＥ結合タンパク質はまた、解糖または炭水化物代謝に関与する酵素であってもよく、例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ－２）、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）であってもよい。ＲＤＥ結合タンパク質は、ペントースリン酸シャントに関与する酵素であってもよく、これには例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）またはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）が含まれる。さらなる例示的なＲＮＡ結合タンパク質は、Ｃａｓｔｅｌｌｏら， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ ６３：６９６－７１０ （２０１６）； Ｋｏｖａｒｉｋら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８９：２１－２６ （２０１７）； Ｒａｙら， Ｎａｔｕｒｅ ４９９：１７２－１７７ （２０１３）； Ｃａｓｔｅｌｌｏら， Ｃｅｌｌ １４９：１３９３－１４０６ （２０１２）； Ｖｌａｓｏｖａら， Ｍｏｌｃ． Ｃｅｌｌ． ２９：２６３－２７０ （２００８）； Ｂａｒｒｅａｕら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ｖｏｌ ３３， ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｉ１０１２ （２００６）； Ｍｅｉｓｎｅｒら， ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ５：１４３２－１４４７ （２００４）； Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉら， Ｇｅｎｅ ２６５：１１－２３ （２００１）に記載され、これらの文献はすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[00092]ＲＤＥ結合タンパク質は、例えばＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（配列番号１９）および
ＡＵＵＵＡ（配列番号８）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合可能なＴＴＰ、あるいはＡＵリッチＲＤＥに結合するＫＳＲＰ、あるいは例えばＵＵＧＡ（配列番号２０）、ＡＧＵＵＵ（配列番号１８）、またはＧＵＵＵＧ（配列番号１２）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＡｕｆ１、あるいは例えばＵＵＧＵＵ（配列番号１０）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＣＥＬＦ－１、あるいは例えばＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号１５）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１６）、またはＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号１３）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＨｕＲ、あるいは例えばＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号２１）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＥＳＲＰ１またはＥＳＲＰ２、あるいは例えばＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号１３）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＥＬＡＶであってもよい。ＲＤＥ結合タンパク質は、解糖に関与する酵素であってもよく、これには例えばＡＵＵＵＡ（配列番号８）要素の１またはそれより多くを含むＡＵリッチ要素に結合するＧＡＰＤＨ、あるいは例えばＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号２２）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＥＮＯ３／ＥＮＯ１、あるいは例えばＡＵＵＧＡ（配列番号２３）の１またはそれより多くを含むＲＤＥに結合するＡＬＤＯＡが含まれる。
[00093]いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥに結合した後、ＲＮＡ分解速度を
増加させる。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥに結合した後、ＲＮＡ分解速度を減少させる。１より多いＲＮＡ結合タンパク質がＲＤＥに結合することも可能である。いくつかのＲＤＥ調節単位において、１より多いＲＮＡ結合タンパク質が、１より多いＲＤＥに結合する。１またはそれより多いＲＤＥに対する１またはそれより多いＲＮＡ結合タンパク質の結合は、ＲＮＡの分解速度を増加させうる。１またはそれより多いＲＮＡ結合タンパク質の結合は、ＲＮＡの分解速度を減少させうる。分解を増加させるＲＮＡ結合タンパク質が、分解を減少させるＲＮＡ結合タンパク質と、ＲＤＥへの結合に関して競合し、こうしてＲＮＡの安定性が、２つのＲＮＡ結合タンパク質の相対的結合に依存することも可能である。他のタンパク質がＲＤＥ結合タンパク質に結合し、そしてＲＤＥを含むＲＮＡに対するＲＮＡ結合タンパク質の効果を調節することも可能である。ＲＮＡ結合タンパク質へのタンパク質の結合が、ＲＮＡ安定性を増加させることもまたはＲＮＡ安定性を減少させることも可能である。ＲＮＡは、タンパク質ＨｕＲおよびＴＴＰに結合される多数のＲＤＥを有することも可能である。ＨｕＲタンパク質はＲＮＡを安定化させることも可能であり、そしてＴＴＰタンパク質はＲＮＡを不安定化させることも可能である。ＲＮＡは、タンパク質ＫＳＲＰ、ＴＴＰおよび／またはＨｕＲと相互作用する少なくとも１つのＲＤＥを有することも可能である。ＫＳＲＰは、ＲＮＡを不安定化させ、そしてＲＮＡを安定化させうるＨｕＲタンパク質との結合に関して競合することも可能である。ＫＳＲＰタンパク質はＲＤＥに結合可能であり、そしてＲＮＡを不安定化し、そしてＴＴＰタンパク質はＫＳＲＰに結合可能であり、そしてＲＮＡの分解を防止しうる。異なるタンパク質が同じ転写物に結合可能であり、そして分解および安定化速度に対して、競合する影響を有しうる。異なるタンパク質が同じ転写物に結合可能であり、そして分解および安定化速度に対して、協調する影響を有しうる。異なるタンパク質が異なる時点で同じ転写物に結合して、分解および安定化に対する異なる影響を与えることも可能である。
[00094]ＲＤＥはクラスＩＩ ＡＵリッチ要素であってもよく、そしてＲＮＡ結合タン
パク質はＧＡＰＤＨであってもよい。ＧＡＰＤＨが結合するクラスＩＩ ＡＵリッチ要素は、ＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡ（配列番号９）であってもよい。クラスＩＩ ＡＵリッチ要素およびＧＡＰＤＨを用いて、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの発現を制御してもよい。また、クラスＩＩ ＡＵリッチ要素およびＧＡＤＰＨを用いて、Ｔリンパ球において、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの発現を達成してもよい。クラスＩＩ ＡＵリッチ要素およびＧＡＤＨＰを用いて、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球において、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの発現を達成してもよい。クラスＩＩ ＡＵリッチ要素およびＧＡＤＰＨを用いて、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球において、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの発現を達成してもよい。クラスＩＩ ＡＵリッチ要素およびＧＡＤＰＨを用いて、ナチュラルキラー細胞において、導入遺伝子、ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの発現を達成してもよい。
[00095]ＲＤＥはマイクロＲＮＡ結合部位を有してもよい。ＲＤＥを操作して、これら
のマイクロＲＮＡ結合部位の１またはそれより多くを除去してもよい。マイクロＲＮＡ結合部位の除去は、少なくとも５、１０、１５、２０、５０または１００倍、ＲＤＥを含む構築物からの発現を増加させうる。マイクロＲＮＡ部位を含むＲＤＥは、ＧＡＰＤＨに結合されるＲＤＥであってもよい。ＧＡＰＤＨに結合されるＲＤＥからマイクロＲＮＡ部位を除去すると、ＧＡＰＤＨ感受性ＲＤＥを含む構築物の発現は、少なくとも５～１０倍増加しうる。ＲＤＥを通じたこのＧＡＰＤＨ制御を用いて、ターゲット部位にペイロードを
送達することも可能である。ＧＡＰＤＨ制御を、ターゲット部位に優先的に見られる抗原を認識するＣＡＲによる、真核細胞の活性化と結びつけてもよい。
[00096]ＲＤＥは、ＩＬ－２またはＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲであってもよく、そして
マイクロＲＮＡ部位の除去は、ＲＤＥを含む導入遺伝子ＲＮＡからの発現の速度および／または発現のダイナミックレンジを増加させうる。ＲＤＥはＩＬ－２の３’－ＵＴＲであってもよく、そして除去されるマイクロＲＮＡ部位はＭＩＲ－１８６部位であってもよく、この欠失は、約５０倍、発現の動力学を増加させ、そして発現のダイナミックレンジを増加させる。ＲＤＥはまた、ＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲであってもよく、そして除去されるマイクロＲＮＡ部位はＭＩＲ－１２５部位であってもよい。
キメラ抗原受容体
[00097]キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合／認識要素、受容体を細胞膜
に係留する膜貫通要素、および少なくとも１つの細胞内要素を含む、融合タンパク質であってもよい。これらのＣＡＲ要素は当該技術分野に知られ、例えば本明細書のすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、特許出願ＵＳ２０１４０２４２７０１に記載される通りである。ＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合要素、膜貫通要素、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む構築物から発現される組換えポリペプチドであってもよい。刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合するゼータ鎖であってもよい。細胞質シグナル伝達要素は、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１またはそれより多い機能的シグナル伝達要素をさらに含んでもよい。共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８より選択されてもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質であってもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質であってもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、ならびに１またはそれより多い共刺激分子（単数または複数）に由来する２つの機能的シグナル伝達要素および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質であってもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素、膜貫通要素、ならびに１またはそれより多い共刺激分子（単数または複数）に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達要素および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達要素を含む細胞内シグナル伝達要素を含む、キメラ融合タンパク質であってもよい。ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に場合によるリーダー配列を含んでもよい。ＣＡＲは、細胞外抗原認識要素のＮ末端にリーダー配列をさらに含んでもよく、該リーダー配列は、場合によって、細胞プロセシングおよびＣＡＲの細胞膜への局在の間に、抗原認識要素（例えばｓｃＦｖ）から切断される。
キメラ抗原受容体－細胞外要素
[00098]ＣＡＲを作製する際に有用な例示的な細胞外要素は、例えば、どちらも、すべ
ての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載される。
[00099]細胞外要素（単数または複数）は、どちらも、すべての目的のため、その全体
が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されるように、疾患に対して免疫になっている被験体の免疫細胞から得られる抗体のレパートリーから得られることも可能である。
[000100]細胞外要素は、そのすべてが、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号、米国特許第５，３５９，０４６号、第５，６８６，２８１号および第６，１０３，５２１号に記載されるように、リガンド結合および／またはシグナル伝達に関連する、多様な細胞外要素または分泌タンパク質のいずれかから得られることも可能である。
[000101]どちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載されるように、ウイルス、感染性疾患、細菌、腫瘍関連抗原、炎症性疾患関連抗原、神経障害に関連する抗原、糖尿病に関連する抗原、老化細胞に関連する抗原、心臓血管疾患に関連する抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、および／またはアレルギーに関連する抗原由来の抗原に結合可能である、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを提供する。これらの適用に有用な抗原の例は、例えば、どちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に見られる。
細胞内要素
[000102]細胞内要素は、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの細胞外要素が抗原に結合した（抗原と相互作用した）際に、細胞内にシグナルを伝達可能である分子であってもよい。細胞内シグナル伝達要素は、一般的に、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）が導入されている免疫細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つの活性化の原因となりうる。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。したがって、用語「細胞内シグナル伝達要素」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、そして細胞に特殊化された機能を実行させる、タンパク質部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用してもよいが、多くの場合、細胞内要素または細胞内シグナル伝達要素は、ドメイン全体からなる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの一部切除部分を使用する限り、こうした一部切除部分は、エフェクター機能シグナルを伝達できるならば使用可能である。したがって、用語、細胞内シグナル伝達要素はまた、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分な細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる一部切除部分も含むよう意味される。本発明のＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達要素の例には、抗原受容体結合後に、シグナル伝達を開始するように協調して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびに同じ機能的能力を有する、これらの配列の任意の誘導体または変異体および任意の組換え配列が含まれる。
[000103]細胞内要素とともにまたは細胞内要素として有用な細胞内要素およびポリペプチドの組み合わせは、例えば、どちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および
２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載される。
膜貫通要素およびスペーサー要素
[000104]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは膜貫通要素を含んでもよい。膜貫通要素は、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの細胞外要素に付着してもよい。膜貫通要素には、膜貫通領域に隣接する１またはそれより多いさらなるアミノ酸、例えば膜貫通要素が由来するタンパク質の細胞外領域に関連する１またはそれより多いアミノ酸（例えば細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５アミノ酸）および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域に関連する１またはそれより多いさらなるアミノ酸（例えば細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大１５アミノ酸）が含まれてもよい。膜貫通要素は、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲに用いられる他の要素の１つと会合していてもよい。膜貫通要素は、こうした要素が同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通要素に結合するのを回避するため、例えば受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするため、選択されるかまたはアミノ酸置換によって修飾されてもよい。膜貫通要素は、細胞表面上の別のＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲとホモ二量体化可能であってもよい。同じ細胞に存在する天然結合パートナーの結合要素との相互作用を最小限にするように、膜貫通要素のアミノ酸配列を修飾するかまたは置換してもよい。
[000105]膜貫通要素は、多重特異性細胞外誘導因子クラスター化要素を提供するタンパク質、エフェクター機能シグナル伝達要素を提供するタンパク質、増殖シグナル伝達部分を提供するタンパク質によって、あるいは完全に異なるタンパク質によって提供されてもよい。ほとんどの場合、要素の１つに天然に関連する膜貫通要素を有することが好適であろう。いくつかの場合、ジスルフィド結合可能なシステイン残基を含有し、したがって生じるキメラタンパク質がそれ自体と、あるいはζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の非修飾型または関連タンパク質と、ジスルフィド連結二量体を形成可能であるように、ζ、ηまたはＦｃεＲ１γ鎖の膜貫通要素を使用することが望ましいであろう。膜貫通要素は、こうした要素が同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通要素に結合するのを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするため、選択されるかまたはアミノ酸置換によって修飾されてもよい。受容体複合体の他のメンバーとの物理的会合を保持するため、ζ、η、ＦｃεＲ１－γおよび－β、ＭＢ１（Ｉｇα）、Ｂ２９またはＣＤ３－γ、ζ、またはεの膜貫通要素を用いてもよい。
[000106]本発明において有用である膜貫通要素は、例えば、どちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載される。
不安定化要素とカップリングしたキメラ抗原受容体（ＤＥ－ＣＡＲ）
[000107]真核細胞中のＣＡＲポリペプチドの量がＤＥの制御下にあるように、上述のような不安定化要素を、上述のようなＣＡＲとシスに組み合わせてもよい。ＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥの選択、および１または多数のＤＥの使用は、例えば、どちらも、すべての目的のた
め、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載される。
キメラ抗原受容体：Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ
[000108]ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲは、機能性ＣＡＲまたはＤＥ－ＣＡＲを形成するように会合する、少なくとも２つの部分で構成されてもよい。細胞外抗原結合要素は、ＣＡＲの膜貫通要素、場合によるスペーサー、および細胞内要素と別個の部分として発現されてもよい。別個の細胞外結合要素は、宿主細胞膜と（膜貫通ポリペプチド以外の手段を通じて）会合していてもよい。細胞内要素は、細胞外要素、膜貫通要素、および場合によってスペーサーと別個の部分として発現されてもよい。細胞外要素および細胞内要素は、別個に発現されてもよく、そして各々が膜貫通要素、および場合によってスペーサーを有してもよい。ＣＡＲまたはＤＥ－ＣＡＲの各部分は、２つの部分をともにするための会合要素（「Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ」）を有して、機能的ＣＡＲまたはＤＥ－ＣＡＲを形成してもよい。
[000109]Ｓｉｄｅ ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ ＣＡＲの選択、およびテザーを伴うまたは伴わないその使用は、例えば、どちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載される。
リンパ球拡大分子および他の制御因子
[000110]リンパ球拡大分子（「ＬＥＭ」）、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＴＮＦα、および／またはＩＦＮγの発現を制御するためのＤＥ、ＲＤＥ、および／またはＲＮＡ制御デバイスの使用は、例えば、どちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、２０１６年３月１５日提出の米国特許出願第１５／０７０，３５２号、および２０１６年１２月５日提出の米国特許出願第１５／３６９，１３２号に記載される。
ＣＡＲオフスイッチとしてのドミナントネガティブ制御因子
[000111]制御デバイスは、ＣＡＲがＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞を活性化する能力を阻害するかまたは減少させるポリペプチドの発現を制御しうる。このポリペプチドは、ＣＡＲ活性化を阻害するかまたは減少させることが可能であり、例えばＴリンパ球で発現された際、ドミナントネガティブ効果を有するＺＡＰ－７０の突然変異体がある。こうしたＺＡＰ－７０突然変異体は、ＺＡＰ－７０のΔ２７７－６１９（残基１～２７６を残す）、Ｙ３１９Ｆ、またはＫ３６９Ａ突然変異体であってもよい。
[000112]いくつかの側面において、ドミナントネガティブ突然変異体を用いて、所望の時点で、活性化ＣＡＲからのシグナル伝達を停止する。ドミナントネガティブ突然変異体は、活性化ＣＡＲからの細胞内シグナル伝達を妨害するポリペプチドである。ドミナントネガティブ突然変異体を、ＣＡＲによって活性化されるシグナル伝達カスケード由来のポリペプチドまたは該カスケードと相互作用するポリペプチドから用いてもよい。こうした突然変異体は、いくつかのシグナル伝達構成要素と相互作用可能であるが、ＣＡＲからのシグナルを伝播することができず、そしてしたがって、ＣＡＲによる宿主細胞のさらなる活性化を防止する。ドミナントネガティブ突然変異体は、ＺＡＰ７０タンパク質由来であってもよい。ドミナントネガティブ突然変異体は、ＺＡＰ－７０のΔ２７７－６１９（残基１～２７６を残す）、ＺＡＰ－７０のＹ３１９Ｆ、またはＺＡＰ－７０のＫ３６９Ａ突然変異体であってもよい。
[000113]ドミナントネガティブ突然変異体の発現は、ＲＮＡ制御デバイス、ＲＤＥ、不安定化要素（ＤＥ）、および／または誘導性プロモーターの誘導性制御下にあってもよい。この誘導性制御は、所望の時点で、ドミナントネガティブ突然変異体の発現を可能にし、この構築物がＣＡＲ真核細胞に関するオフスイッチとして作用することを可能にする。所望の時点で、ドミナントネガティブ突然変異体は、誘導性刺激に反応して発現され、そしてドミナントネガティブ突然変異体は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲからのシグナル伝達を停止する。
[000114]上述のようなＴｅｔＲＮＡ制御デバイスまたは（６Ｒ）－フォリン酸ＲＮＡ制御デバイスを用いて、ＺＡＰ７０ドミナントネガティブ突然変異体（例えばＺａｐ－７０のΔ２７７－６１９（残基１－２７６を残す）、ＺＡＰ ７０のＹ３１９Ｆ、またはＺＡＰ ７０のＫ３６９Ａ）の発現を制御してもよい。これらの構築物では、Ｚａｐ７０のドミナントネガティブ突然変異体は、培地にテトラサイクリンまたは（６Ｒ）－フォリン酸を添加した際に、宿主細胞において発現されうる。このテトラサイクリンまたは（６Ｒ）－フォリン酸ＲＮＡ制御デバイスは、テトラサイクリンまたは（６Ｒ）－フォリン酸によって誘導性であるＣＡＲ活性に関するオフスイッチを提供する。
[000115]ＺＡＰ－７０のドミナントネガティブ突然変異体を、適切なＲＤＥ、ＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの制御下に置いてもよい。ＲＮＡ制御デバイスは、制御デバイスリガンド（例えばＴｅｔまたは（６Ｒ）－フォリン酸）が導入された際に、ドミナントネガティブＺＡＰ－７０突然変異体が発現され、そしてＺＡＰ－７０突然変異体の発現がＣＡＲによるＴリンパ球の活性化を阻害するように、Ｔｅｔまたは（６Ｒ）－フォリン酸反応性ＲＮＡ制御デバイスであってもよい。ＺＡＰ－７０突然変異体は、Ｔｅｔ制御デバイスの制御下である、Ｔリンパ球に関するオフスイッチとして作用してもよい。
受容体
[000116]ＣＡＲを、細胞およびＲＤＥ－導入遺伝子とともに、受容体として用いてもよい。ＣＡＲは上述の通りである。ＣＡＲに加えて、他の受容体を用いて、ＲＤＥの制御下の導入遺伝子が発現されるように、活性化するかまたはそうでなければ細胞中の条件を変化させてもよい。化学シグナルを認識しそしてこれに反応する受容体を、ＲＤＥを通じた導入遺伝子の発現にカップリングしてもよい。例えば、イオンチャネル連結（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質連結（代謝調節型）受容体、および酵素連結受容体を、導入遺伝子の発現にカップリングしてもよい。
[000117]導入遺伝子発現にカップリングしうる受容体の１つのクラスは、免疫受容体、例えばＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体（別名抗原受容体または免疫グロブリン受容体）および自然免疫受容体である。
[000118]Ｔ細胞受容体は、２つの異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体である。ヒトにおいて、大部分のＴ細胞は、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖で作製されるＴ細胞受容体を有し、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）で作製されるＴ細胞受容体を有する。リンパ球由来のＴ細胞受容体をコードする核酸を増幅するための技術およびプライマーは、当該技術分野に周知であり、そして例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより商業的に販売されるＳＭＡＲＴｅｒヒトＴＣＲ ａ／ｂプロファイリングキット、Ｂｏｒｉａら， ＢＭＣ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：５０－５８ （２００８）； Ｍｏｏｎｋａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １６９：４１－５１ （１９９４）； Ｋｉｍら， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ３７３３８ （２０１２）； Ｓｅｉｔｚら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０３：１２０５７－６２ （２００６）に記載されており、これらはすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。ＴＣＲレパートリーを別個の鎖として用いて、抗原結合ドメインを形成してもよい。ＴＣＲレパートリーを一本鎖抗原結合ドメインに変換してもよい。一本鎖ＴＣＲを、例えば、米国特許出願公報第ＵＳ２０１２／０２５２７４２号、Ｓｃｈｏｄｉｎら， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３：８１９－８２９ （１９９６）； Ａｇｇｅｎら， “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｈａｉｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，” イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の博士論文（２０１０） ｉｄｅａｌｓ．ｉｌｌｉｎｏｉｓ．ｅｄｕ／ｂｉｔｓｔｒｅａｍ／ｈａｎｄｌｅ／２１４２／１８５８５／Ａｇｇｅｎ＿Ｄａｖｉｄ．ｐｄｆ？ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝１でコピー入手可能に記載されるものを含む、当該技術分野に周知の技術を用いて、ヒト・アルファおよびベータ鎖をコードする核酸から作製可能であり、これらの文献はすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[000119]Ｂ細胞受容体には、膜結合型である免疫グロブリン、シグナル伝達部分、ＣＤ７９、およびＩＴＡＭが含まれる。ヒト抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための技術およびプライマーは当該技術分野に周知であり、そして例えば、ＰｒｏＧｅｎのヒトＩｇＧおよびＩｇＭライブラリープライマーセット、カタログ番号Ｆ２０００； Ａｎｄｒｉｓ－Ｗｉｄｈｏｐｆら， “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｆａｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｃｏｄｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，” Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１１； Ｌｉｍら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３１：１０８－１１７ （２０１０）； Ｓｕｎら， Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８：３８１－３８６ （２０１２）； Ｃｏｒｏｎｅｌｌａら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２８：ｅ８５ （２０００）に記載され、これらの文献はすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。マウス抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための技術およびプライマーは、当該技術分野に周知であり、そして例えば、米国特許第８，１４３，００７号； Ｗａｎｇら， ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ． ７（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ９ （２００６）に記載され、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。抗体レパートリーは、抗原結合ドメインにおいて別個の鎖として用いられてもよいし、または一本鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。一本鎖抗体は、当該技術分野に周知の技術を用いて、ヒト軽鎖および重鎖をコードする核酸から作製されてもよく、これには、例えば、Ｐａｎｓｒｉら， ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９：６ （２００９）； Ｐｅｒａｌｄｉ－Ｒｏｕｘ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｃ． Ｂｉｏｌ． ９０７：７３－８３ （２０１２）に記載されるものが含まれ、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。一本鎖抗体は、当該技術分野に周知の技術を用いて、マウス軽鎖および重鎖をコードする核酸から作製されてもよく、こうした技術には、例えば、Ｉｍａｉら， Ｂｉｏｌ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ２９：１３２５－１３３０ （２００６）； Ｃｈｅｎｇら， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ２７４０６ （２０１１）に記載されるものが含まれ、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[000120]自然免疫受容体には、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー（例えばＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ）、２Ｂ４受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ８０受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＲＰ１０５）が含まれる。
[000121]７回膜貫通ドメイン受容体としてもまた知られるＧタンパク質連結受容体は、リガンドの受容体結合を、Ｇタンパク質を通じて細胞反応にカップリングする、受容体の
大きなファミリーである。これらのＧタンパク質は、α、β、およびγサブユニット（それぞれＧα、Ｇβ、およびＧγとして知られる）の三量体であり、ＧＴＰに結合した際に活性であり、そしてＧＤＰに結合した際に不活性である。受容体がリガンドに結合した際、コンホメーション変化を経て、そしてアロステリックに、Ｇタンパク質を活性化して、結合したＧＤＰに対してＧＴＰを交換する。ＧＴＰ結合後、Ｇタンパク質は、受容体から解離して、Ｇα－ＧＴＰ単量体およびＧβγ二量体を生じる。Ｇタンパク質連結受容体は、例えばロドプシン様受容体、セクレチン受容体、代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体、真菌交配フェロモン受容体、サイクリックＡＭＰ受容体、およびｆｒｉｚｚｌｅｄ／ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ受容体を含むクラスに、ともにグループ分けされている。Ｇタンパク質受容体は、電磁放射の検出、味覚（味）、臭い感覚、神経伝達、免疫系制御、増殖、細胞密度感知等を含む、非常に多様な生理学的プロセスで用いられる。
[000122]触媒受容体としてもまた知られる酵素連結受容体は、膜貫通受容体であり、細胞外リガンドの結合が、細胞内側で酵素活性を引き起こす。酵素連結受容体は、ポリペプチドの膜貫通部分（またはドメイン）によってともに連結された２つのドメインを有する。２つの末端ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインおよび触媒機能を有する細胞内ドメインである。例えばＥｒｂ受容体ファミリー、グリア細胞由来神経栄養因子受容体ファミリー、ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリー、ｔｒｋ神経栄養受容体ファミリー、およびＴｏｌｌ様受容体ファミリーを含む、酵素連結受容体の多数のファミリーがある。
[000123]リガンドゲート型イオンチャネルとしてもまた知られるイオンチャネル連結受容体は、受容体へのリガンドの結合に反応して、膜を通じて、例えばＮａ＋ Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＣｌ－などのイオンを通過させる受容体である。例えばカチオンｃｙｓ－ループ受容体、アニオンｃｙｓループ受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＮＭＤＡ受容体）、ＧＡＢＡ受容体、５－ＨＴ受容体、ＡＴＰ－ゲート化チャネル、およびＰＩＰ２ゲート化チャネルを含む、リガンドゲート化イオンチャネルの多数のファミリーがある。
真核細胞
[000124]本発明の真核細胞として、多様な真核細胞を用いてもよい。真核細胞は動物細胞であってもよい。真核細胞は、哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌのものであってもよい。哺乳動物細胞は、限定されるわけではないが、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含む霊長類の細胞であってもよい。哺乳動物細胞はマウス細胞であってもよく、これは、マウスが、他の哺乳動物、とりわけヒトのモデルとしてルーチンに機能するためである（例えば、Ｈａｎｎａ， Ｊ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９２０－２３， ２００７； Ｈｏｌｔｚｍａｎ， Ｄ．Ｍ．ら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． １０３（６）：Ｒ１５－Ｒ２１， １９９９； Ｗａｒｒｅｎ， Ｒ．Ｓ．ら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ９５： １７８９－１７９７， １９９５；各刊行物は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）。動物細胞には、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば腎、乳腺、前立腺、肺）、角化細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞が含まれる。動物細胞は、成体細胞（例えば最終分化、分裂性、または非分裂性）または胚細胞（例えば胚盤胞細胞等）または幹細胞であってもよい。真核細胞はまた、動物または他の供給源に由来する細胞株であってもよい。
[000125]真核細胞は幹細胞であってもよい。多様な幹細胞タイプが当該技術分野に知られ、そして例えば胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、上皮神経冠幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅覚性成体幹細胞、精巣細胞、および前駆細胞（例えば神経、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵臓、上皮等）を含めて、真核細胞として使用可能である。幹細胞は、被験体から採取した細胞に由来する幹細胞であ
ってもよい。
[000126]真核細胞は、ヒトを含む哺乳動物の循環系に見られる細胞であってもよい。例示的な循環系細胞には、とりわけ、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球等、およびこれらの前駆細胞が含まれる。グループとして、これらの細胞は、本発明の循環性真核細胞と定義される。真核細胞は、これらの循環性真核細胞のいずれに由来してもよい。導入遺伝子を、これらの循環細胞または循環細胞由来の真核細胞のいずれかとともに用いてもよい。真核細胞は、Ｔ細胞あるいはＴ細胞前駆体または前駆細胞であってもよい。真核細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、あるいは前述のものの前駆体または前駆細胞であってもよい。真核細胞は、ナチュラルキラー細胞、あるいはナチュラルキラー細胞の前駆体または前駆細胞であってもよい。真核細胞は、Ｂ細胞、あるいはＢ細胞の前駆体または前駆細胞であってもよい。真核細胞は、好中球、あるいは好中球前駆体または前駆細胞であってもよい。真核細胞は、巨核細胞、あるいは巨核細胞の前駆体または前駆細胞であってもよい。真核細胞は、マクロファージ、あるいはマクロファージの前駆体または前駆細胞であってもよい。
[000127]真核細胞は植物細胞であってもよい。植物細胞は、単子葉または双子葉植物の細胞であってもよく、こうした植物には、限定されるわけではないが、アルファルファ、アーモンド、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ブラックベリー、アブラナ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、柑橘類、コーヒー、ワタ、キュウリ、ユーカリ、大麻、レタス、レンズマメ、トウモロコシ、マンゴー、メロン、オーツムギ、パパイヤ、エンドウマメ、ピーナッツ、パイナップル、プラム、イモ（サツマイモを含む）、カボチャ、ラディッシュ、ナタネ、ラズベリー、イネ、ライムギ、ソルガム、ダイズ、ホウレンソウ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、タバコ、トマト、カブ、コムギ、ズッキーニ、および他の結実菜類（例えばトマト、ピーマン（ｐｅｐｐｅｒ）、チリ、ナス、キュウリ、カボチャ等）、他の鱗茎菜類（例えばニンニク、タマネギ、リーキ等）、他の仁果類（例えばリンゴ、ナシ等）、他の核果類（例えばピーチ、ネクタリン、アプリコット、ナシ、プラム等）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、木本植物、例えば針葉樹および落葉樹、観賞植物、多年生牧草、飼料作物、花、他の野菜、他の果物、他の農業作物、ハーブ、草、あるいは多年生植物部分（例えば球根；塊茎；根茎；冠（ｃｒｏｗｎ）；茎；走根；ひこばえ；シュート；無根切穂、有根切穂、およびカルス切穂またはカルス生成小植物を含む切穂；頂端分裂組織）が含まれる。用語「植物」は、種子、苗木、若木、根茎、塊茎、茎、柄、葉および果実を含む、植物のすべての物理的部分を指す。
[000128]真核細胞はまた、限定されるわけではないが、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、セネデスムス属（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、デュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）、ナノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、またはプロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）の藻類を含む藻類であってもよい。真核細胞は、限定されるわけではないが、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはシゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の真菌を含む真菌細胞であってもよい。
[000129]真核細胞は被験体から得られてもよい。被験体は、任意の生存生物であってもよい。細胞は、被験体から得られる細胞に由来してもよい。被験体の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞を、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得てもよい。当該技術分野で利用可能である多くのＴ細胞株のいずれもまた用いてもよい。Ｔ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ分離など、当業者に知られる多くの技術のいずれを用いて、被験体から収集した血液単位から得てもよい。個体の循環血から、アフェレーシスによって細胞を得てもよい。アフェレーシス産物は、典型的にはリンパ球を含有し、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む。アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿分画を除去し、そして続くプロセシング工程のために、適切な緩衝剤または培地中に細胞を入れてもよい。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してもよい。別の側面において、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、そしてマグネシウムを欠くことも可能であるし、またはすべてではなくても多くの二価陽イオンを欠くことも可能である。カルシウムの非存在下での最初の活性化工程は、活性化増大を導きうる。
[000130]負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択された細胞にユニークな表面マーカーに対して向けられる抗体の組み合わせで達成可能である。細胞上に存在する細胞表面マーカーに対して向けられるモノクローナル抗体のカクテルを用いて、細胞ソーティングおよび／または負の磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを通じた選択によって、細胞を濃縮してもよい。例えば、ＣＤ４＋細胞を濃縮するため、モノクローナル抗体カクテルには、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体が含まれる。典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する、制御性Ｔ細胞を濃縮することが望ましい可能性もある。あるいは、特定の側面において、Ｔ制御性細胞を、抗Ｃ２５コンジュゲート化ビーズまたは他の類似の選択法によって枯渇させる。
[000131]一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；第６，５３４，０５５号；第６，９０５，６８０号；第６，６９２，９６４号；第５，８５８，３５８号；第６，８８７，４６６号；第６，９０５，６８１号；第７，１４４，５７５号；第７，０６７，３１８号；第７，１７２，８６９号；第７，２３２，５６６号；第７，１７５，８４３号；第５，８８３，２２３号；第６，９０５，８７４号；第６，７９７，５１４号；第６，８６７，０４１号；および米国特許出願第２００６０１２１００５号に記載されるような方法を用いて、Ｔ細胞を活性化させ、そして拡大してもよく、これらの特許文書の各々は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[000132]ＮＫ細胞は、膜結合性ＩＬ－１５および４－１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）を発現するように遺伝的に修飾されている骨髄細胞株の存在下で拡大させることも可能である。ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を持たない、こうした方法で修飾された細胞株は、ＮＫ細胞溶解に非常に感受性であり、そしてＮＫ細胞を活性化する。例えば、Ｋ５６２骨髄細胞に、ヒトＣＤ８αおよびＧＦＰのシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインに融合した、ヒトＩＬ－１５成熟ペプチドからなるキメラタンパク質構築物を形質導入してもよい。次いで、形質導入細胞を、限界希釈によって、単細胞クローニングし、そして最高のＧＦＰ発現および表面ＩＬ－１５を持つクローンを選択してもよい。次いで、このクローンにヒトＣＤ１３７Ｌを形質導入して、Ｋ５６２－ｍｂ１５－１３７Ｌ細胞株を生成してもよい。ＮＫ細胞を優先的に拡大するため、ＮＫ細胞を含有する末梢血単核細胞培養物を、１０ ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で、Ｋ５６２－ｍｂ１５－１３７Ｌ細胞株と、ＮＫ細胞集団を活性化し、そして濃縮するために十分な期間、培養する。この期間は、２～２０日の範囲であってもよく、好ましくは約５日間である。次いで、拡大ＮＫ細胞に、抗ＣＤ１９－ＢＢ－ζキメラ受容体を形質導入してもよい。
核酸
[000133]本開示にやはり記載するのは、少なくとも部分的に、本明細書記載の個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、およびＲＮＡ制御デバイスをコードする核酸である。核酸は、天然、合成、またはその組み合わせであってもよい。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｃＤＮＡであってもよい。
[000134]本発明の核酸にはまた、発現ベクター、例えばプラスミド、またはウイルスベクター、または直鎖ベクター、または染色体ＤＮＡ内に組み込まれるベクターが含まれてもよい。発現ベクターは、ベクターが１またはそれより多い選択された宿主細胞において複製されることを可能にする核酸配列を含有してもよい。こうした配列は、多様な細胞に関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に関して適切である。真核宿主細胞、例えば哺乳動物細胞において、発現ベクターは、宿主細胞染色体内に組み込まれ、そして次いで宿主染色体とともに複製されることも可能である。同様に、ベクターは、原核細胞の染色体内に組み込まれることも可能である。
[000135]発現ベクターはまた、一般的に、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有する。選択可能マーカーは、本発明の宿主細胞を含む、原核および真核細胞に関して当該技術分野に周知である。一般的に、選択遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに耐性を与えるか、（ｂ）栄養要求不全を補完するか、あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない必須栄養素、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｉ）に関してはＤ－アラニン・ラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。例示的な選択スキームは、薬剤を利用して、宿主細胞の増殖を抑制してもよい。異種遺伝子で成功裡に形質転換された細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、そしてしたがって、選択レジームを生き延びるであろう。細菌または真核（哺乳動物を含む）系で使用するための他の選択マーカーが当該技術分野に周知である。
[000136]哺乳動物Ｔ細胞においてＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ導入遺伝子を発現可能なプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動し、これはアミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素送達に関与する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物発現プラスミドにおいて、広範に用いられており、そしてレンチウイルスベクター内にクローニングされる導入遺伝子からのＣＡＲ発現を駆動する際に有効であることが示されてきている。例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｍｉｌｏｎｅら， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １７（８）： １４５３－１４６４ （２００９）を参照されたい。プロモーターの別の例は、極初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、該配列に機能可能であるように連結されたいかなるポリヌクレオチド配列の高レベル発現も駆動可能な、強い恒常性プロモーター配列である。他の恒常性プロモーター配列もまた使用可能であり、これには限定されるわけではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを含む修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター、例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｌｉら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌ． １８９， ｐｐ． ５６－６４ （２０１０）を参照されたい）、鳥類白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン－バーウイルス極初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば限定されるわけではないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが含まれる。さらに、本発明は恒常性プロモーターの使用に限定されない。
[000137]本開示における使用には、誘導性または抑制性プロモーターもまた意図される。誘導性プロモーターの例には、限定されるわけではないが、活性化Ｔ細胞誘導性プロモーターの核因子（ＮＦＡＴ）、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、テトラサイクリンプロモーター、ｃ－ｆоｓプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターからの発現をテトラサイクリンオペレーター（単数または複数）の制御下に置くＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＴ－ＲＥｘ系、およびＩｎｔｒｅｘｏｎのＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターが含まれる。Ｍａｃｉａｎら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：２４７６－２４８９ （２００１）； Ｋａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ， Ｄ．ら， ＢｉｏＴｅｃｈｉｑｕｅｓ ３９：１９１－１９６ （２００５）； Ｄａｉ， Ｘ．ら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ ４２：２３６－２４５ （２００５）； Ｐａｌｌｉ， Ｓ． Ｒ．ら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７０：１３０８－１５１５ （２００３）； Ｄｈａｄｉａｌｌａ， Ｔ． Ｓ．ら， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． ４３：５４５－５６９ （１９９８）； Ｋｕｍａｒ， Ｍ． Ｂ，ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９：２７２１１－２７２１８ （２００４）； Ｖｅｒｈａｅｇｅｎｔ， Ｍ．ら， Ａｎｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７４：４３７８－４３８５ （２００２）； Ｋａｔａｌａｍ， Ａ． Ｋ．，ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：Ｓ１０３ （２００６）；およびＫａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ， Ｄ．ら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：Ｓ１９４ （２００６）、米国特許第８，８９５，３０６号、第８，８２２，７５４号、第８，７４８，１２５号、第８，５３６，３５４号、これらはすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[000138]発現ベクターは、典型的には、転写開始頻度を調節するプロモーター要素、例えばエンハンサーを有する。典型的には、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にもまた、機能要素を含有することが示されてきている。要素が互いに対して反転するかまたは移動している際もプロモーター機能が保持されるように、プロモーター要素間のスペーシングは、しばしば柔軟である。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間のスペーシングは、活性が減少し始めるまでに５０ｂｐ離れるまで増加させることも可能である。プロモーターに応じて、個々の要素は、転写を活性化するために協調してまたは独立にのいずれで機能することも可能であるようである。
[000139]発現ベクターは、二シストロン性構築物または多重シストロン性構築物であってもよい。二シストロンは、２つのシストロン間に位置するシストロンに関する制御領域と反対の方向で配置されていてもよい。構築物が二シストロンより多い場合、シストロンは、転写に関して反対の方向に配向した２つの群である２群に配置されていてもよい。例示的な二シストロン性構築物は、Ａｍｅｎｄｏｌａら， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３：１０８－１１６ （２００５）に記載され、該文献は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。１つのシストロンに関する制御領域は、高転写活性が可能であってもよく、そしてもう一方が使用条件下で低転写活性を有してもよい。一方または両方の制御領域は誘導性であってもよい。高転写活性制御領域の例には、例えば、ＭＮＤ、ＥＦ１－アルファ、ＰＧＫ１、ＣＭＶ、ユビキチンＣ、ＳＶ４０初期プロモーター、テトラサイクリン反応性要素プロモーター、細胞特異的プロモーター、ヒトベータ－アクチンプロモーター、および場合によってＣＭＶ初期エンハンサーを含むＣＢＧ（ニワトリベータ－グロビン）が含まれる。低転写活性制御領域の例には、例えば、ＴＲＥ３Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって商業的に販売される、基底発現を減少させる突然変異を含む、テトラサイクリン反応性要素プロモーター）、Ｔ－ＲＥｘＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによって商業的に販売される）、および最小ＴＡＴＡプロモーター（Ｋｉｒａｎら， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １４２：３６４－３７６ （２００６）、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、ＨＳＰ６８、および最小ＣＭＶプロモーターが含まれる。誘導性制御領域の例には、例えば、ＮＦＡＴ制御領域（Ｍａｃｉａｎら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：２４７６－２４８９ （２００１））、および上記の誘導性制御領域が含まれる。
[000140]二シストロン性構築物は、ＣＡＲ、およびターゲット部位に送達しようとするペイロードである（またはペイロードを作製する）ポリペプチドをコードしてもよい。例示的なペイロードを上および下に記載する。ＣＡＲをコードする核酸を、強いプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに機能可能であるように連結してもよく、そして場合によって、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、または前述のものの組み合わせに機能可能であるように連結されてもよい。ＣＡＲは、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ形式で核酸にコードされてもよい。ポリペプチドをコードする核酸は、強いプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに機能可能であるように連結されていてもよい。ペイロードである（またはペイロードを作製する）ポリペプチドをコードする核酸は、ＲＤＥの制御下にあってもよい。ＲＤＥは、例えば解糖酵素、例えばグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１またはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、またはホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）を通じて、細胞の活性化状態に反応するものであってもよい。ＲＤＥはまた、他のエネルギー代謝酵素、例えばトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ２）、スクシニルＣｏＡシンテターゼ（ＳＵＧＬＧ１）、クエン酸ＡＴＰリアーゼ（ＡＣＬＹ）、またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１／２）によって結合され、そして制御されてもよい。宿主細胞は、被験体において、ターゲット部位でその抗原に結合するＣＡＲを発現してもよい。ターゲット部位での抗原のこの結合は、細胞を活性化し、細胞での解糖を増加させ、これがＲＤＥ（解糖または他のエネルギー代謝酵素によって結合される）の制御下でポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する。
[000141]多重シストロン性構築物は、各々が導入遺伝子のいくつかまたはすべてに機能可能であるように連結された制御領域（場合によって誘導性）およびＲＤＥを有する、３またはそれより多いシストロンを有してもよい。これらのカセットは、構築物上で、反対方向に転写される２つの群に編成されていてもよい。２またはそれより多い導入遺伝子は、同じ制御領域から転写されてもよいし、そして２またはそれより多い導入遺伝子は、下流導入遺伝子に機能可能であるように連結されたＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列を有してもよい。あるいは、２またはそれより多い導入遺伝子は、ｂｌｏｇ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｐｌａｓｍｉｄｓ－１０１－ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｎｉｃ－ｖｅｃｔｏｒｓに見られるＰｌａｓｍｉｄｓ １０１： Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｖｅｃｔｏｒｓに記載されるように、２Ａ要素によってともに機能可能であるように連結されている。一般的に用いられる２Ａ配列には、例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）（配列番号２４）、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｐ２Ａ）（配列番号２５）； ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｅ２Ａ）（配列番号２６）；およびＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｆ２Ａ）（配列番号２７）が含まれ、これらはすべて、場合によってアミノ末端に配列ＧＳＧが含まれていてもよい。これによって、多数の導入遺伝子が、ＲＤＥ（または多数のＲＤＥ）を含む３’－ＵＴＲによって制御される、単一の転写物上に転写されることが可能になる。
[000142]二シストロン性／多重シストロン性ベクターは、（別個の構築物上のシストロンの導入に対して）２またはそれより多いシストロンの全体の発現を増加させることも可能である。二シストロン性／多重シストロン性構築物は、レンチウイルスベクターに由来してもよい。二シストロン性／多重シストロン性構築物は、ＣＡＲ、および導入遺伝子（単数または複数）上にコードされるポリペプチド（単数または複数）（例えばペイロード）をコードしてもよく、そして二シストロン性構築物は、細胞がＣＡＲによって活性化された際、導入遺伝子（単数または複数）にコードされるポリペプチドの発現を増加させうる。
[000143]本明細書に記載するポリペプチドを修飾することが望ましい可能性もある。当業者は、変異体ポリペプチドを生成するため、所定の核酸構築物における改変を生成する、多くの方法を認識するであろう。こうした周知の方法には、部位特異的突然変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅、突然変異誘発剤または放射線照射に対する、核酸を含有する細胞の曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば大きい核酸を生成するため、連結および／またはクローニングと組み合わせる）、および他の周知の技術が含まれる（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＧｉｌｌａｍおよびＳｍｉｔｈ， Ｇｅｎｅ ８：８１－９７， １９７９； Ｒｏｂｅｒｔｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１－７３４， １９８７を参照されたい）。本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸を修飾して、選択した生物における核酸の翻訳を増進する好ましいコドンを提供してもよい。
[000144]ポリヌクレオチドにはまた、本明細書記載の他のポリヌクレオチドと実質的に同等のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドもまた含まれてもよい。ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオチドに、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、そしてさらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有してもよい。核酸もまた、本明細書に列挙するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、そしてさらにより典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補体も提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、増幅、または合成）またはＲＮＡであってもよい。こうしたポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは当業者に周知であり、そしてこれには、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドをルーチンに単離可能なハイブリダイゼーション条件を決定するための方法が含まれてもよい。
[000145]部位特異的突然変異誘発、またはプライマー（単数または複数）が所望の点突然変異を有するＰＣＲ増幅を用いて、タンパク質類似体または変異体をコードする（すなわち１またはそれより多いアミノ酸が、野生型ポリペプチドと異なるように設計されている）核酸を産生してもよい。適切な突然変異誘発技術の詳細な説明に関しては、その各々が、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌら監修， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ （１９９４）を参照されたい。当該技術分野に周知の方法を用いた化学合成、例えばＥｎｇｅｌｓら， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ Ｅｄ． ２８：７１６－３４， １９８９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）に記載されるものもまた、こうした核酸を調製するために用いてもよい。
[000146]変異体を生成するためのアミノ酸「置換」は、好ましくは、類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸での１つのアミノ酸の置換、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて実行可能である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；そして負荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
[000147]やはり本明細書に開示するのは、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲをコードする核酸である。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲをコードする核酸は、慣用的方法によって、ＲＮＡ制御デバイスの配列と組み合わされた明記するＣＡＲのアミノ酸配列から容易に調製可能である。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各要素のアミノ酸配列に関する前述のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋ寄託番号から得られることも可能であるし、そして本発明の核酸は、標準的な分子生物学的および／または化学的方法を用いて、調製可能である。例えば、塩基配列に基づいて、核酸を合成してもよく、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから得たＤＮＡ断片を組み合わせることによって、本発明の核酸を調製してもよい。
[000148]適切なプロモーターの制御下で発現されるように、核酸を別の核酸に連結してもよい。核酸の効率的な転写を達成するため、核酸はまた、プロモーターまたは転写開始部位と協調する他の制御要素、例えばエンハンサー配列、ポリＡ部位、またはターミネーター配列を含む核酸に連結されてもよい。本発明の核酸に加えて、核酸の発現を確認するためのマーカーになりうる遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）を取り込んでもよい。
[000149]核酸をｅｘ ｖｉｖｏで細胞内に導入する際、前述の賦形剤に加えて、細胞内への核酸の輸送を促進する物質、例えばリポソームまたは陽イオン性脂質などの核酸を導入するための試薬と、核酸を組み合わせてもよい。あるいは、本発明の核酸を所持するベクターもまた有用である。特に、適切なベクターによって所持される本発明の核酸を含有する、生体への投与に適した型の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法に適している。
真核細胞内への核酸の導入
[000150]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／またはＲＤＥ（単数または複数）に機能可能であるように連結された導入遺伝子を発現している細胞を産生するためのプロセスには、本明細書記載のＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸を、真核細胞内に導入する工程が含まれる。この工程は、ｅｘ ｖｉｖｏで実行可能である。例えば、細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏで、本明細書記載の核酸を所持するウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで形質転換して、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡ
Ｒ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する細胞を産生してもよい。
[000151]１つのプロセスにおいて、上述のような真核細胞を用いてもよい。真核細胞は、哺乳動物、例えばヒト細胞に由来してもよいし、あるいは非ヒト哺乳動物、例えばサル、マウス、ラット、ブタ、ウマまたはイヌ由来の細胞を用いてもよい。該プロセスに用いる細胞は特に限定されず、そして任意の細胞が使用可能である。例えば、体液、組織あるいは臓器、例えば血液（末梢血、臍帯血等）または骨髄から収集するか、単離するか、精製するかまたは誘導した細胞を用いてもよい。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞、樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞または造血細胞、臍帯血単核細胞、線維芽細胞、前駆体脂肪細胞、肝細胞、皮膚角化細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、多様な癌細胞株、または神経幹細胞が使用可能である。本発明において、特に、Ｔ細胞、Ｔ細胞前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）またはこれらを含有する細胞集団が好ましい。Ｔ細胞の例には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞およびＴ細胞前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。前述の細胞を、生体から収集するか、生体から収集した細胞の拡大培養によって得るか、または細胞株として確立してもよい。産生されたＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥ発現細胞、あるいは産生されたＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥから分化した細胞を、生体に移植することが望ましい場合、核酸を生体自体から収集した細胞内に導入することが好ましい。
[000152]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸をベクター内に挿入し、そして該ベクターを細胞に導入する。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸を、トランスフェクション（例えばＧｏｒｍａｎら Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７９．２２ （１９８２）： ６７７７－６７８１、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、形質導入（例えば、ＣｅｐｋｏおよびＰｅａｒ （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ ９．９； ＤＯＩ： １０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ０９０９ｓ３６、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、リン酸カルシウム形質転換（例えば、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｃ； ＤＯＩ： １０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｃｓ０１、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、細胞浸透性ペプチド（例えば、Ｃｏｐｏｌｏｖｉｃｉ， Ｌａｎｇｅｌ， Ｅｒｉｓｔｅ，およびＬａｎｇｅｌ （２０１４） ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１４ ８ （３）， １９７２－１９９４； ＤＯＩ： １０．１０２１／ｎｎ４０５７２６９、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、エレクトロポレーション（例えば、Ｐｏｔｔｅｒ （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ １０．１５； ＤＯＩ： １０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１０１５ｓ０３およびＫｉｍら（２０１４） Ｇｅｎｏｍｅ １０１２－１９． ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１
３２２．１１３。Ｋｉｍら、２０１４は最適化エレクトロポレーション系であるＡｍａｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを記載する。これらの参考文献のどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、マイクロインジェクション（例えば、ＭｃＮｅｉｌ （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｕｎｉｔ ２０．１； ＤＯＩ： １０．１００２／０４７１１４３０３０．ｃｂ２００１ｓ１８、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、リポソームまたは細胞融合（例えば、Ｈａｗｌｅｙ－ＮｅｌｓｏｎおよびＣｉｃｃａｒｏｎｅ
（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｅｎｄｉｘ １Ｆ； ＤＯＩ： １０．１００２／０４７１１４２３０１．ｎｓａ０１ｆｓ１０、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、機械的操作（例えば、Ｓｈａｒｏｎら （２０１３） ＰＮＡＳ ２０１３ １１０（６）； ＤＯＩ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１８７０５１１０、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）または真核細胞に核酸を送達するための他の周知の技術によって、真核細胞に導入される。ひとたび導入されたら、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥ核酸は、エピソームで一過性に発現されてもよいし、あるいは例えば組換え（例えば、ＬｉｓｂｙおよびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ （２０１５） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ． Ｍａｒ ２；７（３）． ｐｉｉ： ａ０１６５３５． ｄｏｉ： １０．１１０１／ｃｓｈｐｅｒｓｐｅｃｔ．ａ０１６５３５、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、または非相同組込み（例えば、ＤｅｙｌｅおよびＲｕｓｓｅｌｌ （２００９） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００９ Ａｕｇ；１１（４）：４４２－７、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）などの周知の技術を用いて、真核細胞ゲノム内に組み込まれてもよい。相同および非相同組換えの効率は、ターゲティング二本鎖ブレーク（ＤＳＢ）を導入するゲノム編集技術によって促進されうる。ＤＳＢ生成技術の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、または同等の系である（例えば、Ｃｏｎｇら Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９．６１２１ （２０１３）： ８１９－８２３， Ｌｉら Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ （２０１１）： ｇｋｒ１８８， Ｇａｊら Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１．７ （２０１３）： ３９７－４０５、これらのすべてが、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、トランスポゾン、例えばスリーピングビューティー（例えば、Ｓｉｎｇｈら（２０１４） Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２０１４ Ｊａｎ；２５７（１）：１８１－９０． ｄｏｉ： １０．１１１１／ｉｍｒ．１２１３７、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、例えばＦＬＰレコンビナーゼを用いたターゲティング組換え（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ， ＦｏｘおよびＷａｈｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９１） １５：２５１（４９９９）：１３５１－１３５５、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）、ＣＲＥ－ＬＯＸ（例えば、ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ ＰＮＡＳ （１９８８）： ８５； ５１６６－５１７０）、または同等の系、あるいはＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲをコードする核酸を、真核細胞ゲノム内に組み込むための当該技術分野に知られる他の技術である。
[000153]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞の染色体内に組み込まれてもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードするポリヌクレオチドは、真核細胞中で染色体外に存在
してもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードするポリヌクレオチドは、ゲノム編集酵素（ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、および適切な核酸（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸を含む）を用いて、組み込まれていてもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸は、例えば、ＣＣＲ５、ＡＡＶＳ１、ヒトＲＯＳＡ２６、またはＰＳＩＰ１遺伝子座などのゲノム安全ハーバー部位で真核細胞染色体内に組み込まれていてもよい（Ｓａｄｅｌａｉｎら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． １２：５１－５８ （２０１２）； Ｆａｄｅｌら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８８（１７）：９７０４－９７１７ （２０１４）； Ｙｅら， ＰＮＡＳ １１１（２６）：９５９１－９５９６ （２０１４）、これらはすべて、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）。遺伝子編集系、例えばＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、スリーピングビューティートランスポザーゼ、ピギーバック（ＰｉｇｇｙＢａｃ）トランスポザーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼ系を用いて、ＣＣＲ５、ＰＳＩＰ１、またはＴＲＡＣ遺伝子座（Ｔ細胞受容体α定常遺伝子座）でのＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸の組み込みを行ってもよい。Ｅｙｑｕｅｍら， Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７ （２０１７）、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。真核細胞は、ヒトＴリンパ球であってもよく、そしてＣＲＩＳＰＲ系を用いて、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをＣＣＲ５またはＰＳＩＰ１遺伝子座に組み込む。ＣＲＩＳＰＲ系を用いたＣＣＲ５、ＰＳＩＰ１、またはＴＲＡＣ遺伝子座での核酸の組込みは、ＣＣＲ５遺伝子、ＰＳＩＰ１遺伝子、またはＴＲＡＣ遺伝子座の一部またはすべてを欠失させることもまた可能である。真核細胞におけるＣａｓ９は、Ｃａｓ９をコードするプラスミド、Ｃａｓ９をコードする外因性ｍＲＮＡ、あるいは単独のまたはリボ核タンパク質複合体中の組換えＣａｓ９ポリペプチドに由来してもよい（Ｋｉｍら（２０１４） Ｇｅｎｏｍｅ １０１２－１９． ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．１７１３２２．１１３．； Ｗａｎｇら（２０１３） Ｃｅｌｌ １５３ （４）． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．： ９１０－１８． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０４．０２５、これらはどちらも、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）。
[000154]宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球体、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系はリポソーム（例えば人工膜小胞）である。核酸の最新技術のターゲティング送達の他の方法、例えばターゲティングナノ粒子でのポリヌクレオチドの送達または他の適切なミクロン未満のサイズの送達系が利用可能である。
[000155]レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびプソイド型ベクターを含む）などのウイルスベクターで形質導入を行ってもよく、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウ
イルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはセンダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、およびＨＳＶベクターが使用可能である。好ましくは、ウイルスベクターとして、感染細胞において自己複製しないように、複製能を欠くウイルスベクターを用いる。
[000156]レトロウイルスベクターを用いて宿主細胞に形質導入する場合、ベクターによって所持されるＬＴＲ配列およびパッケージングシグナル配列に基づいて、適切なパッケージング細胞を選択し、そしてパッケージング細胞を用いてレトロウイルス粒子を調製することによって、プロセスを実行してもよい。パッケージング細胞の例には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、米国特許第５，２７８，０５６号）、およびＰｓｉ－Ｃｒｉｐ（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ｖｏｌ． ８５， ｐｐ． ６４６０－６４６４ （１９８８））が含まれる。また、高トランスフェクション効率を有する２９３細胞またはＴ細胞を用いて、レトロウイルス粒子を調製してもよい。レトロウイルスに基づいて産生される多くの種類のレトロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞が、多くの企業から、広く商業的に入手可能である。
[000157]哺乳動物細胞内への遺伝子移入のため、多くのウイルスに基づく系が開発されてきている。当該技術分野に知られる技術を用いて、選択される遺伝子をベクター内に挿入し、そしてウイルス粒子中にパッケージングすることも可能である。次いで、組換えウイルスを単離し、そしてｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏのいずれかで、被験体の細胞に送達してもよい。いくつかのウイルス系が当該技術分野に知られる。アデノウイルスベクターを使用してもよい。いくつかのアデノウイルスベクターが当該技術分野に知られ、そしてこれらが使用可能である。さらに、レンチウイルスベクターを用いてもよい。
[000158]ＲＮＡウイルス由来のウイルスベクターを用いて、細胞に、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードするポリヌクレオチドを導入してもよい。ＲＮＡウイルスベクターは、ＲＮＡ制御デバイスおよびＣＡＲ構築物をコードするポリヌクレオチドの逆相補体またはアンチセンスをコードしてもよい（相補鎖は、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物のセンス鎖をコードする）。したがって、ＲＮＡ制御デバイスは、一本鎖ＲＮＡウイルスベクターにおいては活性でないはずである。ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子をコードするＲＮＡウイルス構築物のセンス鎖を用いてもよく、そしてＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物を含むウイルスベクターは、ＲＮＡ制御デバイスのセンサー要素のリガンドの存在下（または非存在下）で（あるいはＲＤＥが安定である条件下で）維持され、そして複製されて、ＲＮＡの切断を防止する。次いで、ウイルスベクター中でＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子構築物のセンス鎖をコードするウイルスベクターをセンサー要素のリガンドとともに（またはこれを伴わずに）維持し、そして複製することも可能である。
[000159]ＷＯ ９６／１００３８、ＷＯ ９７／１８１８５、ＷＯ ９７／２５３２９、ＷＯ ９７／３０１７０およびＷＯ ９７／３１９３４（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）に記載されるように、リポソームおよび凝集剤（ｃｏｎｄｅ
ｎｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば陽イオン性脂質と組み合わせて、非ウイルスベクターを用いてもよい。リン酸カルシウム形質導入、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、または粒子銃によって、本発明の核酸を細胞内に導入してもよい。
[000160]安定性および／または翻訳効率を促進する能力を持つ化学構造を用いてもよい。ＲＮＡは好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。５’ＵＴＲは、長さ１～３０００ヌクレオチドの間であってもよい。コード領域に付加すべき５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、限定されるわけではないが、ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲプライマーの設計を含む異なる方法によって、改変可能である。このアプローチを用いて、一般の当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲの長さを修飾することも可能である。５’および３’ＵＴＲは、関心対象の核酸の天然存在内因性５’および３’ＵＴＲであることも可能である。順方向および逆方向プライマー内に、ＵＴＲ配列を取り込むことによって、あるいはテンプレートに適用される他の修飾技術によって、関心対象の核酸に対して内因性ではないＵＴＲ配列を付加することも可能である。関心対象の核酸に対して内因性でないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を修飾するために有用でありうる。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を減少させうることが知られる。したがって、当該技術分野に周知のＵＴＲの特性に基づいて、転写されるＲＮＡの安定性を増加させるように、３’ＵＴＲを選択するかまたは設計することも可能である。
[000161]ｍＲＮＡは、５’および３’ポリ（Ａ）テール上の両方に、細胞におけるｍＲＮＡのリボソーム結合、翻訳開始および安定性を決定するキャップを有することも可能である。循環ＤＮＡテンプレート、例えばプラスミドＤＮＡ上で、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞における発現に適切でない、長い鎖状産物を生じる。３’ＵＴＲ端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、通常のサイズのｍＲＮＡを生じ、これは、転写後にポリアデニル化されたとしても、真核細胞トランスフェクションには有効ではない。
[000162]核酸を細胞に導入する工程において、導入効率を改善するための機能的物質もまた使用可能である（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ９５／２６２００およびＷＯ ００／０１８３６）。導入効率を改善するための物質の例には、ウイルスベクターに結合する能力を有する物質、例えばフィブロネクチンおよびフィブロネクチン断片が含まれる。フィブロネクチン断片は、ヘアピン結合部位を有してもよく、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標、ＣＨ－２９６、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ．によって製造）として商業的に入手可能である断片を用いてもよい。また、細胞内へのレトロウイルス感染効率を改善する効果を有する合成ポリカチオンであるポリブレン、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲン、ポリリジンまたはＤＥＡＥ－デキストランも使用可能である。
[000163]機能物質を適切な固相、例えば細胞培養に用いた容器（プレート、ペトリ皿、フラスコまたはバッグ）またはキャリアー（マイクロビーズ等）上に固定してもよい。
Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを発現する真核細胞
[000164]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する細胞は、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸が導入されそして
発現されている細胞であってもよい。
[000165]真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを通じて、特定の抗原に結合して、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを真核細胞内へのシグナルに伝達することも可能であり、そしてその結果、真核細胞が活性化されることも可能である。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを発現する真核細胞の活性化は、真核細胞の種類、ならびにＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの細胞内要素の種類に応じて多様であることも可能であり、そして例えば、指標として、サイトカイン放出、細胞増殖速度の改善、細胞表面分子の変化等に基づいて確認することも可能である。例えば、活性化細胞からの細胞傷害性サイトカイン（腫瘍壊死因子、リンホトキシン等）の放出は、抗原を発現するターゲット細胞の破壊を引き起こす。さらに、サイトカイン放出または細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えばＢ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、および／またはマクロファージを刺激する。
[000166]ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物を発現する真核細胞は、プロテインＬ（免疫グロブリンの可変軽鎖（カッパ鎖）に選択的に結合する、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）から単離された細菌表面タンパク質）を用いて検出可能である。プロテインＬをレポーター（例えば光放出または吸収部分）で直接標識してもよいし、またはビオチンなどの剤で標識してもよい。ビオチンまたは関連分子を用いてプロテインＬを標識する場合、レポーター（例えばフィコエリトリン）で標識されたストレプトアビジン（または類似の対分子）を添加することによって、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドをディスプレイする真核細胞へのプロテインＬの結合を検出可能である。すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｚｈｅｎｇら， Ｊ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄ．， １０：２９ （２０１２）。ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物を含有する真核細胞に対するプロテインＬ結合は、真核細胞上の、抗体軽鎖、ＣＡＲの細胞外ドメインの存在を示しうる。真核細胞上でのＣＡＲ発現を検出するこの方法を用いて、真核細胞表面上でのＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量を定量化することもまた可能である。ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ構築物を含む真核細胞を作製するため、ＱＣおよびＱＡ方法論で、プロテインＬを用いてもよい。
[000167]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞を療法剤として用いて、疾患を治療してもよい。この療法剤は、活性成分として、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞を含んでもよく、そして適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための薬学的に許容さ
れうる賦形剤が含まれる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞を投与する疾患は、疾患が真核細胞に対する感受性を示すならば、特に限定されない。本発明の疾患の例には、癌（血液癌（白血病）、固形腫瘍（卵巣癌）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、ならびにその原因がウイルス、例えばインフルエンザおよびＨＩＶ、細菌、または真菌である感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症が含まれる。自己免疫疾患（例えば尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ）を、自己免疫疾患を引き起こす免疫タンパク質に結合する、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥで治療してもよい。例えば、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞は、自己免疫疾患を引き起こす抗体を作製する細胞をターゲティングしうる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞は、自己免疫疾患を引き起こすＴ－リンパ球をターゲティングしうる。
[000168]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを療法剤として用いて、アレルギーを治療してもよい。こうした療法剤は、活性成分として、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞を含んでもよく、そして適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための薬学的に許容されうる賦形剤が含まれる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞で治療可能なアレルギーの例には、例えば、花粉、動物のふけ、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、シーフード、貝、およびダイズに対するアレルギーが含まれる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物のふけ、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、シーフード、貝、およびダイズに対するアレルギー性反応を引き起こす抗体を作製する細胞をターゲティングしうる。ターゲティングされる細胞は、Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、プレＢ細胞、および前駆体Ｂ細胞の１またはそれより多くであってもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物のふけ、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、シーフード、貝、およびダイズに対するアレルギー性反応を引き起こすＴ－リンパ球をターゲティングしうる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥは、抗体またはＴ細胞受容体のイディオタイプ決定基に結合可能である。
[000169]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞を、疾患または状態の治療のために投与してもよい。これらの真核細胞を、骨髄移植後または放射線曝露後、再発性白血病の寛解の目的のためのドナーリンパ球輸血後の感染性疾患などの防止のために利用してもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する真核細胞を含む療法剤が活性成分であることも可能であり、そしてこれらを、皮内、筋内、皮下、腹腔内、鼻内、動脈内、静脈内、腫瘍内で、あるいは輸入リンパ管内に、非経口投与によって、例えば注射または注入によって投与することも可能であるが、投与経路は限定されない。
[000170]被験体への投与前に、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを含む真核細胞を特徴付けてもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを含む真核細胞を試験して、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥ発現を確認してもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを含む真核細胞を、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド発現の所望のレベルを生じるリガンド（単数または複数）のレベルに曝露してもよい。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドのこの所望のレベルは、被験体に配置された際、抗ターゲット細胞活性の所望のレベル、および／または増殖活性の所望のレベルを持つ真核細胞を生じることも可能である。
[000171]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを、攻撃的抗腫瘍特性を有するＴリンパ球、例えばすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｐｅｇｒａｍら， ＣＤ２８ｚ ＣＡＲｓ ａｎｄ ａｒｍｏｒｅｄ ＣＡＲｓ， ２０１４， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． ２０（２）：１２７－１３３に記載されるものとともに用いてもよい。ＲＮＡ制御デバイスを、Ｔリンパ球中で、アーマード（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドとともに用いてもよい。
[000172]上述のＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥ態様にはまた、ＬＥＭまたはＤＥ－ＬＥＭの制御された発現を提供する、ＤＥ－ＬＥＭ、ＲＤＥ－ＬＥＭ、ＳｍａｒｔＬＥＭ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＬＥＭ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＬＥＭ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＬＥＭ、および／またはＳｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＬＥＭもまた含まれてもよい。その拡大シグナルが、所望の時点で提供されるように、ＬＥＭまたはＤＥ－ＬＥＭの量を制御してもよい。拡大シグナルのこの制御は、ＬＥＭまたはＤＥ－ＬＥＭと関連するＤＥ（単数または複数）および／またはＲＮＡ制御デバイスのリガンド（単数または複数）の量を改変し、それによってＬＥＭまたはＤＥ－ＬＥＭの量を改変することによって達成される。ＬＥＭ拡大シグナルの制御はまた、所望の時点で、真核細胞に外因性ＬＥＭを添加することによっても達成可能である。
薬学的組成物
[000173]本発明の薬学的組成物は、本明細書に記載するようなＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する細胞、例えば複数のＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子－ＲＤＥを発現する細胞を、１またはそれより多い薬学的または生理学的に許容されうるキャリアー、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでもよい。こうした組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質：ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤：ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は、１つの側面において、静脈内投与のために配合される。
[000174]薬学的組成物を、治療しようとする（または予防しようとする）疾患に適した方式で投与することも可能である。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような要因によって決定されるであろうが、適切な投薬量は臨床試験によって決定されうる。
[000175]適切な薬学的に許容されうる賦形剤は当業者に周知である。薬学的に許容されうる賦形剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸、０．１３８Ｍ
ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、鉱酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩を含有する水溶液、生理食塩水、グリコールまたはエタノールの溶液、および有機酸塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩が含まれる。湿潤剤または乳化剤のようなアジュバント、およびｐＨ緩衝剤もまた使用可能である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．、ニュージャージー州、１９９１）（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される）に記載される薬学的に許容されうる賦形剤は適切に使用可能である。組成物を、非経口投与、例えば注射または注入に適した既知の型に配合してもよい。組成物は、配合添加剤、例えば懸濁剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤、および貯蔵中の有効期間を延長させるための保存剤を含んでもよい。
[000176]活性成分として本明細書に記載する真核細胞を含む組成物を、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドが結合する抗原に依存して、癌（血液癌（白血病）、固形腫瘍（卵巣癌）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、湿疹）、肝炎、ならびにその原因がウイルス、例えばインフルエンザおよびＨＩＶ、細菌、または真菌である感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、または深在性真菌症などの疾患の治療のために投与してもよい。
[000177]エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植え込みまたは移植によるものを含めた、任意の好適な方式で、対象組成物の投与を実行してもよい。本明細書記載の組成物を、患者に、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）、髄内、筋内、鼻内、動脈内、腫瘍内、輸入リンパ管内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹腔内で患者に投与してもよい。１つの側面において、本発明のＴ細胞組成物を、皮内または皮下注射によって患者に投与する。１つの側面において、本発明のＴ細胞組成物を、ｉ．ｖ．注射によって投与する。Ｔ細胞組成物を、腫瘍、リンパ節または感染部位内に直接注射してもよい。養子移入によって投与を行ってもよい。
[000178]「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「療法量」と示される場合、投与すべき本発明の組成物の正確な量は、患者（被験体）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の度合い、および状態の個々の相違を考慮して、医師によって決定可能である。本明細書記載の真核細胞を含む薬学的組成物を、この範囲内のすべての整数値を含む、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、いくつかの場合、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重の投薬量で投与してもよい。また、真核細胞組成物をこれらの投薬量で多数回投与してもよい。また、免疫療法に一般的に知られる注入技術を用いることによって、真核細胞を投与してもよい（例えば、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． ３１９：１６７６， １９８８を参照されたい）。
真核細胞の使用
[000179]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／または導入遺伝子－ＲＤＥ（単数または複数）をコードする核酸を用いて、真核細胞において、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子ポリペプチドを発現させてもよい。真核細胞は、例えばヒト細胞またはネズミ細胞を含む哺乳動物細胞であってもよい。真核細胞はまた、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージを含む、例えば造血細胞であってもよい。
[000180]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／または導入遺伝子－ＲＤＥ（単数または複数）をコードする核酸を用いて、真核細胞表面上で、所望のレベルのＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを発現させてもよい。この側面において、ＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、ＲＤＥ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド発現レベルを、少なくとも部分的に制御し、そしてＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、ＲＤＥ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの活性レベルを調節することによって、所望の量のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドが、真核細胞表面上で発現され、そしてディスプレイされる。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドに特異的な抗体を用いて、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量を測定してもよい。細胞外要素によって認識される抗原を用いて、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量を測定してもよい。ターゲット細胞殺傷の機能アッセイにおいて、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量を測定してもよい。（ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドによって誘導される）真核細胞増殖に関する機能アッセイにおいて、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量を測定してもよい。上記真核細胞は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞またはマクロファージまたは他の食細胞タイプであってもよい。
[000181]ＤＥのリガンド、ＲＮＡ制御デバイスセンサーのリガンド、および／またはＳ
ｉｄｅ－ＣＡＲのリガンドを、所望のレベルの真核細胞活性が得られるまで、増加する量で添加してもよい。所望の真核細胞活性は、ターゲット細胞の殺傷であってもよい。ターゲット細胞殺傷は、所望の期間に渡って起こることも可能であり、例えば特定の数のターゲット細胞の殺傷が、１２時間、または２４時間、または３６時間、または２日間、あるいは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間、あるいは２ヶ月、あるいは３、４、５、または６ヶ月間に起こることも可能である。ターゲット細胞殺傷は、ターゲット細胞の標準化された数に関する半減期として表されてもよい。ターゲット細胞殺傷の半減期は、１２時間、２４時間、３６時間、あるいは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８日間、あるいは２ヶ月、あるいは３、４、５、または６ヶ月であってもよい。所望の真核細胞活性は増殖であってもよい。細胞増殖は、１２時間、２４時間、３６時間、２日間、あるいは３、４、５、６、または７日の倍加時間で起こってもよい。上記真核細胞は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞またはマクロファージまたは他の食細胞タイプであってもよい。
[000182]異なる所望のレベルのＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドが異なる時点で真核細胞上に存在するように、異なる量の（センサー、ＤＥ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの）リガンドの投与計画を、経時的に添加してもよい。例えば、Ｓｍａｒｔ－Ｃａｒ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞、あるいはＳｍａｒｔ－Ｃａｒ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲナチュラルキラー細胞での患者における癌の治療において、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド発現の量をまず減少させて、腫瘍溶解による毒性を減少させることも可能であり、そして腫瘍塊が排除されるにつれて、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド発現の量を増加させて、腫瘍細胞が体内でより稀になるため、残りの腫瘍細胞を殺すことも可能である。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド発現を最初に増加させてもよく、そして腫瘍塊が減少するため、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド発現レベルが減少して、やはりターゲット抗原を発現しうる健康な組織の殺傷を減少させる。正常組織の殺傷に対する腫瘍細胞殺傷比が所望の範囲内で維持されるように、腫瘍細胞に対する反応性を調節することも可能である。真核細胞表面上で発現されるＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量は、真核細胞増殖によって減少しうる。真核細胞が増殖するにつれて、Ｓｍａｒｔ Ｃａｒ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ核酸からの発現レベルが、親真核細胞で見られるレベルのＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドコピー数を維持するために不十分である場合、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドは希釈されるであろう（すなわち、親細胞が、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量を倍増しなければ、各娘細胞は親細胞に比較して減少した量のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを有するであろう）。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドは、被験体における真核細胞の倍加時間に比較して、短い半減期を有するように設計可能である。リガンド（単数または複数）は、被験体における真核細胞の倍加時間に比較して、被験体において短い半減期を有してもよい。抗リガンド抗体または異なるリガンド結合分子を被験体に投与するかまたは真核細胞に提供して（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、リガンドが抗体またはリガンド結合分子に結合し、そしてＤＥ、ＲＮＡ制御デバイスセンサー、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲと反応不能であるようにしてもよい。上記真核細胞は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞またはマクロファージまたは他の食細胞タイプであってもよい。
[000183]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）を含む真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを含む真核細胞を含有する被験体が、療法レベルのターゲット細胞殺傷を生じつつ、毒性および副作用を許容されうるレベルに維持するように、所望の量のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを発現することも可能である。上記真核細胞は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞またはマクロファージまたは他の免疫細胞タイプであってもよい。例えば、本発明のＳｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）を用いて、腫瘍溶解症候群、サイトカインストーム、あるいはＳｍａｒｔ Ｃａｒ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを含むＴリンパ球による健康な組織の殺傷を減少させることも可能である。
[000184]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを２またはそれより多いＲＮＡ制御デバイスと関連付けてもよい。ＤＥ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲの２またはそれより多いリガンド、および／または２またはそれより多いＲＮＡ制御デバイスの異なる量を真核細胞に添加して、真核細胞において、所望の量のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを産生することも可能である。異なる療法措置のリガンドの組み合わせを真核細胞に適用して、真核細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドの量の経時的な所望のプロファイルを生じることも可能である。
[000185]所望の量のＣＡＲ発現は、Ｔリンパ球消耗、機能不全、および／または他の制御不全プロセス（例えば細胞運命の変化、または例えば解糖を達成する代謝の変化）を最小限の量にしながら、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞のエフェクター機能を活性化しうる。所望の量のＣＡＲ発現は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞が消耗するかまたは機能不全になるようにする細胞の阻害、消耗、および／または機能不全を最小限の量にしながら、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞のエフェクター機能を活性化しうる。所望の量のＣＡＲ発現は、ターゲット細胞に存在するターゲット抗原に反応したエフェクター機能の所望のダイナミックレンジを提供しうる。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の範囲のエフェクター機能を提供しうる。例えばターゲット細胞が高密度のターゲット抗原を有し、そして健康な非ターゲット細胞が低密度のターゲット抗原を有する場合には、所望の量のＣＡＲ発現は、小さいダイナミックレンジのエフェクター機能を提供する（オンオフスイッチのように作用する）ことも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、真核細胞が、ターゲット細胞（オン－ＣＡＲがエフェクター機能を活性化する）に対する健康な正常細胞（オフ－ＣＡＲがほとんどまたはまったくエフェクター機能を活性化しない）の間を区別することを可能にする。所望の量のＣＡＲ発現は、操作された真核細胞（例えばＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞）のターゲット細胞に関するアビディティを増加させることも可能であり、それによって、ターゲット細胞に対する効果が増加する。所望の量のＣＡＲ発現は、操作された真核細胞（例えばＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞）のターゲット細胞に関するアビディティを増加させることも可能であり、それによってターゲット細胞殺傷が増進する。所望の量のＣＡＲ発現は、操作された造血細胞（例えばＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞）のターゲット細胞に関するアビディティを増加させることも可能であり、それによってサイトカイン分泌が増進する。
[000186]Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞を、Ｓｍａｒｔ Ｃａｒ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドで操作することも可能である。ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、またはＳｉｄｅ ＣＡＲのリガンドをＴ細胞（例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞に増加する量で添加して、所望の量のエフェクター機能を得ることも可能である。所望の量のエフェクター機能は、ターゲット細胞上のターゲット抗原の既知の量（および／または密度）でのエフェクター機能の最適化された量であってもよい。エフェクター機能は、ターゲット細胞殺傷、宿主免疫細胞の活性化、サイトカイン分泌、グランザイムの産生、アポトーシス誘導性リガンドの産生、免疫系を調節する他のリガンドの産生等であってもよい。エフェクター機能は、サイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、および／またはＩＬ－１０などの分泌であってもよい。エフェクター機能は、ターゲット細胞の殺傷であってもよい。ターゲット細胞はグランザイムで殺傷されてもよい。ターゲット細胞は、アポトーシスを経るように誘導されてもよい。ＣＡＲを含む真核細胞は、アポトーシスおよびグランザイムを通じてターゲット細胞を殺傷しうる。最適なリガンド濃度は、エフェクター機能を増加させうる。リガンドの最適濃度は、エフェクター機能のダイナミックレンジ（ターゲット抗原に反応したエフェクター活性）を増加させうる。リガンドの最適濃度は、エフェクター細胞の所望の量、ならびに真核細胞（例えばＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞）の消耗、機能不全、および／または阻害の所望の（または許容されうる）量を提供しうる。活性の最適量は、所望の増殖活性を生じうる。活性の最適量は、ターゲット結合の量またはエフェクター活性（例えばターゲット細胞殺傷）の量であってもよい。最適ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ発現は、真核細胞が適切な免疫細胞である場合、メモリー細胞形成の所望の速度を提供しうる。最適化可能な他の真核細胞活性には、疾患治療に有用な任意の活性が含まれ、これには例えば、メモリー細胞形成速度、サイトカイン放出速度、食作用、ターゲット結合、生得的骨髄またはリンパ細胞の補充、エピトープ伝播、消耗の発展、細胞機能不全の発展、および／または真核細胞機能の阻害が含まれる。
[000187]ＲＤＥ、ＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、またはＳｉｄｅ ＣＡＲ制御要素を用いて、導入遺伝子発現を制御してもよい。この導入遺伝子発現は、ターゲット部位にペイロードを送達しうる。導入遺伝子発現は、真核細胞において所望の変化を引き起こしうる。ＧＡＰＤＨによって制御されるＲＤＥをペイロード送達に用いて、そして真核細胞（例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞）がターゲット部位に到達したら、これらは（例えばＣＡＲによって）活性化されうる。ＣＡＲを通じたターゲット部位での真核細胞の活性化に際して、細胞は解糖を誘導し、そしてＧＡＰＤＨがＲＤＥから放出されて、ペイロード発現および送達が可能になる。ターゲット部位は、腫瘍または感染であってもよく、そして導入遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導剤、補体、細胞傷害性小分子を作製するための酵素、ペプチドまたは糖を切断する酵素（例えばバイオフィルムを消化するため）、他の細胞傷害性化合物、あるいはターゲット部位で所望の効果を有しうる他のポリペプチドであってもよい。チェックポイント阻害剤には、免疫チェックポイントとして作用する剤が含まれ、これには例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）が含まれる。ペイロードとして使用されうるチェックポイント阻害剤の例には、例えばニボルマブ（オプディーボ）、ペムブロリズマブ（キートルーダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、イピリムマブ（エルボイ）、リリルマブ、およびＢＭＳ－９８６０１６が含まれる。ニボルマブ、アテゾリズマブおよびペムブロリズマブは、チェックポイントタンパク質ＰＤ－１で作用し、そして抗腫瘍免疫細胞のアポトーシスを阻害する。いくつかのチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１およびそのリガンドＰＤ－Ｌ１の間の相互作用を防止する。イピリムマブはＣＴＬＡ４で作用して、そして腫瘍においてＣＴＬＡ４が活性化Ｔ細胞を下方制御するのを防止する。リリルマブはＫＩＲで作用して、そしてナチュラルキラー細胞の活性化を促進する。ＢＭＳ－９８６０１６はＬＡＧ３で作用して、そして抗原特異的Ｔリンパ球を活性化し、そして腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞仲介性溶解を増進する。サイトカインには、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、および／またはＩＬ－１０が含まれうる。細胞傷害性剤には、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導剤、補体、または細胞傷害性小分子が含まれてもよい。ターゲット部位（例えば非腫瘍ターゲット部位）に送達されるペイロードは、ターゲット部位を保護する因子、例えば抗炎症性因子、Ｔ制御性細胞を部位に誘引する因子、あるいは免疫活性の抑制および減少を引き起こすサイトカインまたは他の因子であってもよい。ペイロードは、ペプチドまたは糖を切断する酵素、例えばヒアルロニダーゼ、ヘパラナーゼ、メタロプロテイナーゼ、および例えば望ましくないバイオフィルムを消化するために使用可能である他のプロテイナーゼであってもよい。ペイロードは、ターゲット部位が画像化されることを可能にする画像化剤であってもよい。ペイロードは、直接画像化可能なポリペプチドであってもよいし、または基質と相互作用して、画像化可能な産物を作製するポリペプチドであってもよく、画像化ポリペプチドには、例えばチミジンキナーゼ（ＰＥＴ）、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、ヨウ化ナトリウム輸送体（ＮＩＳ）、デオキシシチジンキナーゼ、ソマトスタチン受容体サブタイプ２、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）、カンナビノイド受容体、グルコース輸送体（Ｇｌｕｔ１）、チロシナーゼ、ヨウ化ナトリウム輸送体、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、修飾ハロアルカンデハロゲナーゼ、チロシナーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびソマトスタチン受容体２が含まれる。これらの受容体ペイロードは、例えば光学画像化、超音波画像化、コンピュータ断層撮影画像化、光干渉断層撮影画像化、Ｘ線検査画像化、核医学的画像化、陽電子放出断層撮影画像化、断層撮影画像化、光音響断層撮影画像化、Ｘ線画像化、熱画像化、蛍光顕微鏡画像化、生物発光画像化、および蛍光画像化を用いて画像化可能である。これらの画像化法には、陽イオン放出断層撮影（ＰＥＴ）または単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が含まれる。
[000188]ＰＥＴレポータープローブ、例えば［１８Ｆ］９－（４－［１８Ｆ］－フルオロ－３－ヒドロキシメチルブチル）－グアニン、チミジンキナーゼ（ＴＫ）によってリン酸化された際、細胞内に保持されるフッ素－１８－標識ペンシクロビル類似体、または５－（７６）Ｂｒ－ブロモ－２’－フルオロ－２’－デオキシウリジンとともに、チミジンキナーゼを用いてもよい。ＰＥＴレポーター各々に関する適切なレポータープローブが当業者に周知である。ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体に対する例示的なレポータープローブは、３－（２’－［１８Ｆ］フルオロエチル）スピペロン（ＦＥＳＰ）である（ＭａｃＬａｒｅｎら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６（５）：７８５－９１ （１９９９））。ヨウ化ナトリウム輸送体の例示的なレポータープローブは１２４Ｉであり、１２４Ｉは、輸送体による輸送の後に細胞に保持される。デオキシシチジンキナーゼの例示的なレポータープローブは、２’－デオキシ－２’－１８Ｆ－５－エチル－１－β－ｄ－アラビノフラノシルウラシル（１８Ｆ－ＦＥＡＵ）である。ソマトスタチン受容体サブタイプ２の例示的なレポータープローブは、１１１Ｉｎ－、９９ｍ／９４ｍＴｃ－、９０Ｙ－、または１７７Ｌｕ－標識オクトレオチド類似体、例えば９０Ｙ－、または１７７Ｌｕ－標識ＤＯＴＡＴＯＣ（Ｚｈａｎｇら， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ５０（ｓｕｐｐｌ ２）：３２３
（２００９））； ６８Ｇａ－ＤＯＴＡＴＡＴＥ；および１１１Ｉｎ－ＤＯＴＡＢＡＳＳ（例えば、本明細書に援用されるＢｒａｄｅｒら， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ５４（２）：１６７－１７２ （２０１３）を参照されたい）である。ノルエピネフリン輸送体の例示的なレポータープローブは、１１Ｃ－ｍ－ヒドロキシエピネフリンである（Ｂｕｕｒｓｍａら， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ４６：２０６８－２０７５ （２００５））。カンナビノイド受容体の例示的レポータープローブは、１１Ｃ－標識ＣＢ２リガンド、１１Ｃ－ＧＷ４０５８３３である（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅら， Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ． ５２（７）：１１０２－１１０９ （２０１１））。グルコース輸送体の例示的なレポータープローブは、［１８Ｆ］フルオロ－２－デオキシ－ｄ－グルコースである（Ｈｅｒｓｃｈｍａｎ， Ｈ．Ｒ．， Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ５１：１９１－２０４ （２００４））。チロシナーゼの例示的レポータープローブは、Ｎ－（２－（ジエチルアミノ）エチル）－１８Ｆ－５－フルオロピコリナミドである（Ｑｉｎら， Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ３：１４９０ （２０１３））。他のレポータープローブは当該技術分野に記載され、例えば本明細書に援用される、Ｙａｇｈｏｕｂｉら， Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２（４）：３７４－３９１ （２０１２）に記載される。
[000189]β－ガラクトシダーゼに関する例示的な光音響受容体プローブは、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトシダーゼ（Ｘ－ｇａｌ）である（Ｌｉら， Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｏｐｔ． １２（２）：０２０５０４ （２００７））。例示的なＸ線受容体には、とりわけ、ソマトスタチン受容体２、または受容体に基づく結合剤の他のタイプが含まれる。レポータープローブは、レポータープローブに結合し、そして例えばＸ線またはコンピュータ断層撮影によって画像化される、放射線不透過性標識部分を有してもよい。例示的な放射線不透過性標識は、ヨウ素、特に、ポリヨウ化化学基（例えば米国特許第５，１４１，７３９号を参照されたい）、および常磁性標識（例えばガドリニウム）であり、これらを慣用的手段によって、レポータープローブに付着させてもよい。光学的画像化剤には、例えば、蛍光ポリペプチドが含まれる。蛍光ポリペプチドには、例えば、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）またはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の緑色蛍光タンパク質、およびその活性変異体（例えば青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質等）、ヒドロ虫（Ｈｙｄｒｏｉｄ）、クラゲ（ｊｅｌｌｙ ｆｉｓｈｅｓ）、カイアシ類（Ｃｏｐｅｐｏｄ）、有櫛動物門（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）、花虫綱（Ａｎｔｈｒｏｚｏａ）、およびサンゴイソギンチャク（Ｅｎｔａｃｍａｅａ ｑｕａｄｒｉｃｏｌｏｒ）由来の蛍光タンパク質、およびその活性変異体；ならびにフィコビリタンパク質およびその活性変異体が含まれる。光学画像化剤はまた、生物発光ポリペプチドであってもよい。これらには、例えば、エクオリン（および他のＣａ２＋制御光タンパク質）、ルシフェリン基質に基づくルシフェラーゼ、コエレンテラジン基質に基づくルシフェラーゼ（例えばレニラ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ガウシア属（Ｇａｕｓｓｉａ）、およびメトリジナ属（Ｍｅｔｒｉｄｉｎａ））、およびシプリジナ属（Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ）由来のルシフェラーゼ、ならびにその活性変異体が含まれる。
[000190]ＣＡＲ発現の所望の量は、ターゲット細胞濃度、ターゲット抗原密度、ターゲット細胞が他のターゲット細胞と会合しているかどうか（例えば腫瘍またはバイオフィルム中）、ターゲット抗原に関する細胞外要素（抗原結合要素）の結合アフィニティ（Ｋｄ）、およびＣＡＲを含む真核細胞の濃度を考慮することも可能である。これらのパラメータを用いて、所望のレベルのＣＡＲ発現を定義するであろう、真核細胞上のＣＡＲの所望の密度に到達することも可能である。所望の量のＣＡＲ発現はまた、真核細胞上で発現される阻害性受容体（ＩＲ）の量、およびターゲット（および他の）細胞上で発現される阻害性受容体リガンド（ＩＲＬ）の量を考慮することも可能である。以下の等式を用いて、少なくとも部分的に、ＣＡＲ発現の所望の量に到達することも可能である：
ＣＡＲ発現＝［ターゲット細胞］［ターゲット抗原密度］［Ｋｄ］［真核細胞］ Ｉ
ＣＡＲ発現＝［ターゲット細胞］［ターゲット抗原密度］［Ｋ ｄ ］［真核細胞］ ＩＩ
［ＩＲ］［ＩＲＬ］
[000191]等式ＩＩには、場合によって、分母に［健康な細胞上のターゲット抗原密度］が含まれてもよい。
[000192]ＣＡＲ発現の所望の量は、真核細胞表面上に所望の数のＣＡＲを生じうる。ＣＡＲ発現の所望の量は、真核細胞表面上に２～１００，０００ＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。真核細胞は、Ｔリンパ球であってもよく、そしてＴリンパ球表面上のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）の数は、２～１００，０００であってもよい。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、マイクロモル濃度（μＭ）範囲のアフィニティでターゲットリガンドに結合してもよく、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、１００～５００，０００であってもよい。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、ナノモル濃度（ｎＭ）範囲のアフィニティでターゲットリガンドに結合してもよく、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、２～１００，０００であってもよい。
[000193]所望の量のＣＡＲ発現は、真核細胞表面上に、２～１，０００、１０～１，０００、１０～５，０００、１０～１０，０００、１０～５０，０００、１０～１００，０００、１０～５００，０００、または１０～１，０００，０００のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。所望の量のＣＡＲ発現は、真核細胞表面上に、１００～１，０００、１００～５，０００、１００～１０，０００、１００～５０，０００、１００～１００，０００、１００～５００，０００、１００～１，０００，０００、１，０００～５，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～５００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～５００，０００、または１０，０００～１，０００，０００のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。所望の量のＣＡＲ発現は、真核細胞表面上に、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、３８，０００、３９，０００、４０，０００、４１，０００、４２，０００、４３，０００、４４，０００、４５，０００、４６，０００、４７，０００、４８，０００、４９，０００、５０，０００、５１，０００、５２，０００、５３，０００、５４，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００または１００，０００のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。所望の量のＣＡＲ発現は、真核細胞表面上に、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，
０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、３８，０００、３９，０００、４０，０００、４１，０００、４２，０００、４３，０００、４４，０００、４５，０００、４６，０００、４７，０００、４８，０００、４９，０００、５０，０００、５１，０００、５２，０００、５３，０００、５４，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００または１００，０００未満のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。所望の量のＣＡＲ発現は、真核細胞表面上に、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、３６，０００、３７，０００、３８，０００、３９，０００、４０，０００、４１，０００、４２，０００、４３，０００、４４，０００、４５，０００、４６，０００、４７，０００、４８，０００、４９，０００、５０，０００、５１，０００、５２，０００、５３，０００、５４，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００または１００，０００のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）を生じうる。真核細胞は、Ｔリンパ球であってもよく、そしてＴリンパ球表面上のＣＡＲ（あるいはＤＥ－ＣＡＲまたはＳｉｄｅ－ＣＡＲ）は、１００～１００，０００であってもよい。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、マイクロモル濃度（μＭ）範囲（例えば１～５００μＭ）のアフィニティでターゲットリガンドに結合可能であり、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、１００～１００，０００でありうる。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、マイクロモル濃度（μＭ）範囲のアフィニティでターゲットリガンドに結合可能であり、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、１００～１，０００、１００～５，０００、１００～１０，０００、１００～５０，０００、１００～１００，０００、１００～５００，０００、１００～１，０００，０００、１，０００～５，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～５００，０００、１，０００～１，０００，０００、１０，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～５００，０００、または１０，０００～１，０００，０００でありうる。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、ナノモル濃度（ｎＭ）範囲のアフィニティでターゲットリガンドに結合可能であり、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、１０～１００，０００でありうる。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲは、ナノモル濃度（ｎＭ）範囲（例えば１～５００ｎＭ）のアフィニティでターゲットリガンドに結合可能であり、そしてＴリンパ球またはナチュラルキラー細胞表面上のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの所望の数は、１００～１，０００、１００～５，０００、１００～１０，０００、１００～５０，０００、１００～１００，０００、１００～５００，０００、１００～１，０００，０００、１，０００～５，０００、１，０００～１０，０００、１，０００～５０，０００、１，０００～１００，０００、１，０００～５００，０００、１，０００～１，０００
，０００、１０，０００～５０，０００、１０，０００～１００，０００、１０，０００～５００，０００、または１０，０００～１，０００，０００でありうる。
[000194]所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性（例えば時間の関数としてのターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する所望の量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する最大量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する最適な量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する所望の活性速度最大値（Ｃｍａｘと類似）を生じる量であってもよい。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する最大活性速度を生じる量であってもよい。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する最適な活性速度を生じる量であってもよい。カスタマイズ可能な真核細胞活性には、例えば、疾患の治療に有用な任意の活性が含まれ、これには例えば、増殖速度、メモリー細胞形成速度、サイトカイン放出速度、食作用、ターゲット結合、生得的骨髄またはリンパ細胞の補充、エピトープ伝播、消耗の発展、細胞機能不全の発展、および／または真核細胞機能の阻害が含まれる。1つの側面において、所望の量のＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチド（単数または複数）は、真核細胞の消耗、機能不全、および／または阻害シグナルが最小限になりうるようなものであってもよい。
[000195]所望の量のＣＡＲ発現は、所望の量の消耗、機能不全、および／または阻害性受容体活性および／または発現で、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する所望の量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、許容されうる量の阻害活性、Ｔリンパ球機能不全活性、および／または消耗で、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する所望の量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、最小量の宿主細胞機能不全、消耗、および／または阻害性受容体発現で、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する最大量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、最小量の宿主細胞機能不全で、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する最大量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、阻害活性に関する曲線下面積に対して、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する曲線下面積の所望の比で、所望の活性に関する最大量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、宿主細胞機能不全に関する曲線下面積に対して、所望の活性（例えばターゲット細胞殺傷および／またはサイトカイン放出）に関する曲線下面積の所望の比で、所望の活性に関する最大量の曲線下面積を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、阻害性受容体活性に関する曲線下面積に対する、エフェクター機能に関する曲線下面積の最大比を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、宿主細胞機能不全活性に関する曲線下面積に対する、エフェクター機能に関する曲線下面積の最大比を生じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、阻害性または機能不全活性、および／または消耗に関する曲線下面積に対する、エフェクター機能に関する曲線下面積の最大比を生じる量であることも可能である。
[000196]所望の量のＣＡＲ発現は、ある期間に渡って、所望の活性に関する所望の曲線下面積、および次のオンサイクル（エフェクター機能のためのサイクル）のため、ＣＡＲ細胞が（オフ期間中に）所望の活性を回復する（または維持する）所望の期間の長さを生
じる量であることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現は、所望の活性に関する所望の曲線下面積および（オフ期間中に）所望のエフェクター機能を回復するために所望の長さの時間を生じうる。所望の量のＣＡＲ発現は、エフェクター機能が誘導される速度、Ｔリンパ球（またはナチュラルキラー細胞）の阻害性機能、消耗、および／または機能不全が誘導される速度、ならびにＣＡＲ発現が停止された際に、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞から阻害性受容体が失われ、そして／または阻害活性が失われる速度と相関することも可能である。
[000197]所望の量のＣＡＲ発現をサイクリングして、真核細胞がオン（真核細胞およびエフェクター機能の活性化）およびオフ（活性化なし－阻害性受容体の下方制御）の期間を経験するようにすることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現をサイクリングして、ＣＡＲ真核細胞によって活性化される細胞をサイクリングし、例えばＣＡＲを含む真核細胞（および該真核細胞によって活性化される他の免疫細胞）によって発現されるサイトカインによって活性化される細胞をサイクリングすることも可能である。Ｔリンパ球および／またはナチュラルキラー細胞を操作して、例えばＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を含む阻害性受容体発現をノックアウトしてもよい。活性化および不活性化状態に沿ったＣＡＲ発現のサイクリングを集団に基づいて行ってもよい。活性化および不活性化状態に沿ったＣＡＲ発現のサイクリングを個々の真核細胞に関して行ってもよい。
[000198]時間の関数としての所望のエフェクター活性の一次導関数（最大値を見つけるため）を取ることによって、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの最適発現を決定することも可能である。以下の等式を用いて、エフェクター活性を記載することも可能であり、これは、阻害関連シグナル伝達分子の生成速度（ＦＩ）を引き、そして場合によって代謝状態における改変に依存するエフェクター機能パラメータＱｍのある程度の損失を引いた、活性化関連シグナル伝達分子の生成速度（ＦＡ）に依存しうる。
[000199]
Figure 0007374246000001
[000200]ＦＡは、ｄＮＡ／ｄｔともまた表しうる、活性化分子生成速度である。ＦＡはＮＲＴ（ターゲットに結合した受容体の瞬間的な数）、ならびに定数、ｃ活性化に線形に依存しうる。
[000201]
Figure 0007374246000002
[000201]ＮＲＴは、反応等式、ならびに会合および解離の対応する速度を通じて見出されうる。
[000203]
Figure 0007374246000003
[000204]
Figure 0007374246000004
[000205]
Figure 0007374246000005
[000206]この一次ＯＤＥをｄＮＲＴに関して解く。
[000207]
Figure 0007374246000006
[000208]平衡条件で、ｄＮＲＴ／ｄｔは０にセットされ、等式ＦＡに代入可能であるＮＲＴを残し、純粋にＮＲ（受容体数）、ＮＴ（ターゲット数）、そのターゲットに対する抗体アフィニティによって定義される、受容体ターゲット複合体の会合および解離の速度定数である受容体ｋ１およびｋ＿１に依存する。
[000209]
Figure 0007374246000007
[000210]Ｆ１に関しては、本発明者らは、活性の負のフィードバックを提供することを求め、これは観察される生物学的機能と一致する。ここで、本発明者らは、これをＮＡならびに定数ｃ２およびｃ阻害の指数関数として表す。
[000211]
Figure 0007374246000008
[000212]Ｑの場合による型は、ＮＡの任意関数であることも可能であり、これはまたしばしば活性化状態に依存する。
[000213]
Figure 0007374246000009
[000214]これらの等式を用いて、Ｅをプロットすることも可能であり、そして所定のｎＴ、ｋ１、ｋ＿１および多様なＮＲに関して、最大Ｅは図４に示すように同定されうる。
図４は、細胞上のＣＡＲ受容体の数の関数としてのエフェクター機能（Ｅ）、活性化（エフェクター機能の）シグナルまたは分子の活性化（ＮＡ）、および阻害（エフェクター機能の）シグナルまたは分子（ＮＩ）のグラフを示す。図４のグラフは、セットターゲット濃度を有し、そしてグラフは、真核細胞表面上で発現されうるＣＡＲ受容体の最大数未満のＣＡＲ受容体数で生じる、最大（およびいくつかの場合最適）エフェクター機能を示す。
[000215]所望の量のＣＡＲ発現は、真核宿主細胞活性化（ＣＡＲ発現と相関するようなもの）の競合プロセスおよび宿主細胞のエフェクター機能の阻害（不活性化、機能不全、および／または消耗）を考慮してもよい。所望の量のＣＡＲ発現は、Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞活性化（ＣＡＲ発現と相関するようなもの）の競合プロセスおよびエフェクター機能の阻害（不活性化、機能不全、および／または消耗）を考慮してもよい。図５は、阻害（消耗、機能不全および／または不活性化）が上昇するにつれて、Ｔリンパ球活性化（宿主細胞のエフェクター機能）が減少することを示す。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ宿主細胞の機能可能であるウィンドウは、図５に示すようなこれらの２つのプロセスによって定義されうる。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ宿主細胞を、エフェクター機能を機能ウインドウ中に維持するリガンドのサイクルに曝露することも可能である（ＣＡＲ発現を停止することによって、宿主細胞は活性化を減少させるはずであり、これが続いて、宿主細胞における阻害性プロセス、例えば阻害性受容体の発現を減少させるであろう）。
[000216]図７は、本明細書の最後のｐｙｔｈｏｎコードのプログラムによって計算されるような、時間に対するエフェクター機能（Ｅ）、ターゲット細胞数（ｎＴ）、ＣＡＲ受容体数（ｎＲ）、およびＣＡＲ受容体－ターゲット細胞相互作用の数（ｎＲＴ）に関する計算されたグラフを示す。最大エフェクター機能（Ｅ）は、ＣＡＲ受容体が刺激の時間全体で抗原と関連するという事実にも関わらず、時間０．７で到達可能である。明細書の最後のｐｙｔｈｏｎプログラムを、ターゲット細胞数（ｎＴ）、ＣＡＲ受容体数（ｎＲ）、およびＣＡＲ受容体－ターゲット細胞相互作用の数（ｎＲＴ）の異なるパラメータと共に用いて、最大エフェクター機能をモデリングすることも可能である。
[000217]図７は、ＣＡＲコピー数、ターゲット抗原（エピトープ）数、およびその抗原（エピトープ）に関するＣＡＲ結合アフィニティの関数として、エフェクター活性を見る図を示す。ＣＡＲコピー数、抗原に対するＣＡＲアフィニティ、およびターゲットエピトープのコピー数の変数が、細胞において所望の量のエフェクター活性を生じるように協調している場合、最適ＣＡＲ活性を得ることも可能である。制御デバイスは、ＣＡＲコピー数を制御して、図７の最適ＣＡＲ活性範囲にエフェクター機能の量を維持することも可能である。ターゲットエピトープのコピー数が減少するにつれて（ターゲット細胞が死ぬにつれて）、ＣＡＲコピー数が増加して、ＣＡＲに結合して、そしてこれらを活性化させるために利用可能なターゲット抗原の量の減少を補償することも可能である。
[000218]所望の量のＣＡＲ発現をサイクリングして、真核細胞（または真核細胞集団）がオン（細胞およびエフェクター機能の活性化）およびオフ（活性化なし－阻害性受容体、阻害剤活性、および／または機能不全の下方制御）の期間を経験するようにすることも可能である。所望の量のＣＡＲ発現をサイクリングして、ＣＡＲ真核細胞によって誘導される細胞の活性をサイクリングし、例えばＣＡＲを含む真核細胞（および該真核細胞によって活性化される他の免疫細胞）によって発現されるサイトカインによって活性化される細胞をサイクリングすることも可能である。Ｔリンパ球および／またはナチュラルキラー細胞を操作して、阻害性受容体発現をノックアウトするか、または例えばＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、Ｔ－ｂｅｔおよび／またはＢｌｉｍｐ－１を含む、機能不全および／または消耗を引き起こす他の因子をノックアウトしてもよい。活性化および不活性化状態に沿ったＣＡＲ発現のサイクリングを集団に基づいて行ってもよい。活性化および不活性化状態に沿ったＣＡＲ発現のサイクリングを個々の真核細胞に関して行ってもよい。
[000219]癌免疫療法のため、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）を、Ｔ細胞を遺伝子操作するために用いてもよい。いくつかの免疫療法適用に用いる場合、白血球フェレーシスを通じて、白血球を患者から除去して、そしてＴリンパ球を優先的にソーティングし、そして保存する。Ｔリンパ球を、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲをコードする導入遺伝子のレンチウイルスまたはレトロウイルス導入（または核酸導入の他の手段）に供し、ターゲット療法細胞濃度まで拡大し、そして患者に注入し、ほとんど移植片対宿主合併症を伴わずに、自家治療を生じる。ＣＡＲは、難治性／再発性急性リンパ芽球性白血病に対する寛解を達成し、そして維持する際に非常に有効であることが示されてきている（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｍａｕｄｅら， ＮＥＪＭ， ３７１：１５０７， ２０１４）が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）、Ｂ細胞形成不全または「オン腫瘍、オフターゲット（ｏｎ－ｔｕｍｏｒ， ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）」毒性に関連する危険な副作用が起こる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）における、ＤＥ、ＲＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの取り込みを通じたＣＡＲ発現の調節は、これらの毒性を制御しうる。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）における、ＤＥ、ＲＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの取り込みを通じたＣＡＲ発現の調節はまた、Ｔリンパ球（またはナチュラルキラー細胞）の消耗、機能不全および／または阻害も最小限にしながら、所望のレベルのエフェクター機能を提供することも可能である。
[000220]Ｔ細胞は、組み込まれたＲＮＡ制御デバイスとともに、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを含んでもよい。組み合わせたＳｍａｒｔ ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｍａｒｔ Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞を用いてもよく、ここで独立のＴ細胞は、別個の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をターゲティングする、直交性のＳｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）を発現する。多数のＴＡＡを同時にターゲティングすると、原発性腫瘍または転移に対するより高いＣＴＬ反応を導き、そして再発を防止することも可能である。ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドＴ細胞を用いる潜在的に不都合な点は、オンターゲット、オフ腫瘍効果を誘発する可能性がより高くなり、毒性を導きうることである。ＤＥ、ＲＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）Ｔ細胞中のＣＡＲにカップリングすると、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞のより強い反応および再発防止を可能にしつつ、毒性の問題が軽減される。Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、多数のリガンドによって制御可能である。ＤＥ、ＲＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、およびＳｉｄｅ－ＣＡＲを、発現クロストークが最小限であるかまたは排除されるように、異なるリガンドまたはリガンドの組み合わせに対して特異的である、組み合わせたＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞と用いてもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞を、異なる腫瘍関連表面抗原をターゲティングすることによって、単一腫瘍に対して用いてもよい。これらのＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞を、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの異なる膜貫通、ヒンジ、受容体、共刺激要素、他の側面、あるいはその組み合わせで、同じ腫瘍関連表面抗原をターゲティングすることによって、単一腫瘍に対して用いてもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞を、クローン的に異質である腫瘍タイプに対して用いてもよく、ここで、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞の各集団は、特定のＴＡＡに対して特異的である。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞の相対集団は制御可能である。リガンドの組み合わせを投与して、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞の特定の集団の発現を誘導してもよい。普遍的なＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞を用いてもよい。こうしたＣＡＲ Ｔ細胞は、１より多いＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ、あるいはＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ発現のための1より多い手段を含む、単一のＴ細胞である。
[000221]Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲおよび／または普遍的－ＣＡＲが、細菌、真菌またはウイルス起源である抗原に対する受容体を含むように設計してもよい。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単
数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）は、免疫無防備状態の患者において、毒性の供給源である、感染と闘うために利用可能であるため、こうした抗病原体Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ（単数または複数）および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ（単数または複数）を、ＴＡＡに特異的なＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞療法と組み合わせて用いてもよい。
[000222]真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを通じて、特定の抗原に結合して、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドに真核細胞内にシグナルを伝達させることも可能であり、そしてその結果、真核細胞が活性化され、そしてしたがって、適切なＲＤＥ－導入遺伝子を発現することも可能である。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを発現する真核細胞の活性化は、真核細胞の種類、ならびにＳｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲの細胞内要素に応じて多様である。真核細胞は、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲを通じた真核細胞の刺激に際して、エフェクター機能に関して細胞を平衡化する、ＲＤＥ転写物を発現することも可能である。
[000223]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ
ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を、疾患を治療する療法剤として用いてもよい。療法剤は、ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を、活性成分として含んでもよく、そして適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための薬学的に許容されうる賦形剤が含まれる。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を投与する疾患は、疾患が、該真核細胞および／またはＲＤＥ－導入遺伝子の産物に感受性を示す限り、特に限定されない。
[000224]治療可能な疾患の例には、癌（血液癌（白血病）、固形腫瘍（卵巣癌）等）、
炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、ならびにその原因がウイルス、例えばインフルエンザおよびＨＩＶ、細菌、または真菌である感染性疾患、例えば結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症、アルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性疾患などの他の免疫仲介性疾患、ならびに糖尿病のような代謝疾患が含まれる。受容体（例えばＣＡＲ）は、真核細胞を疾患細胞（単数または複数）にターゲティングし、そして受容体が疾患細胞（単数または複数）でターゲットに結合すると、受容体が真核細胞内にシグナルを送り、ＲＤＥ－導入遺伝子の発現を導くことも可能である。ＲＤＥ－導入遺伝子は、疾患細胞（単数または複数）を治療するかまたは殺す際に有用であるポリペプチドをコードする。癌および／または固形腫瘍を、上述のものなどの腫瘍関連（または癌関連）抗原に結合する受容体を発現する真核細胞で治療することも可能である。受容体が腫瘍関連抗原に結合すると、受容体は、ＲＤＥ－導入遺伝子が発現されるように、該細胞内にシグナルを送る（例えばシグナルはＲＤＥ結合タンパク質を生じさせて、ＲＤＥ－転写物の発現を導く）。ＲＤＥ－転写物は、真核細胞が癌を治療するように真核細胞を活性化するポリペプチドをコードしてもよいし、そして／またはＲＤＥ－転写物は、それ自体、癌を治療するポリペプチド（例えば細胞傷害性ポリペプチド）をコードしてもよい。
[000225]自己免疫疾患（例えば尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病）を、自己免疫疾患に関連する免疫タンパク質に結合する、ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞で治療してもよい。受容体またはターゲティングポリペプチドは、自己免疫疾患を治療する際に有用なポリペプチドをコードするＲＤＥ－導入遺伝子の発現を誘発することも可能である（例えばポリペプチドは、自己免疫疾患を引き起こす細胞を制御するかまたはこれらの細胞を殺すことも可能である）。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患に関与する抗体を作製する細胞をターゲティングすることも可能である（例えば、ＲＤＥ－導入遺伝子は、抗体産生細胞を殺すか、またはこれらの細胞による抗体の産生を阻害するポリペプチドをコードすることも可能である）。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患に関与するＴリンパ球をターゲティングすることも可能である（例えば、ＲＤＥ－導入遺伝子は、ターゲットＴリンパ球を殺すか、またはＴリンパ球の活性を制御するポリペプチドをコードすることも可能である）。
[000226]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ
ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を、アレルギーを治療する療法剤として用いることも可能である。治療可能なアレルギーの例には、例えば、花粉、動物のふけ、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、シーフード、貝、およびダイズに対するアレルギーが含まれる。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、例えば、花粉、動物のふけ、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、シーフード、貝、およびダイズに対するアレルギー性反応を引き起こす抗体を作製する細胞をターゲティングすることも可能である。ターゲティングされる細胞は、Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、形質細胞、プレＢ細胞、および前駆体Ｂ細胞の１またはそれより多くであってもよい。ターゲティングされる細胞にはまた、例えば、花粉、動物のふけ、ピーナッツ、他のナッツ、乳製品、グルテン、卵、シーフード、貝、およびダイズに対するアレルギー性反応を引き起こすＴ－リンパ球が含まれてもよい。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞は、抗体またはＴ細胞受容体のイディオタイプ決定基に結合することも可能である。
[000227]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ
ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を、疾患または状態の治療のために投与してもよい。例えば、真核細胞を利用して感染性疾患を治療することも可能である。真核細胞は、感染性疾患を引き起こす病原体またはこうした病原体に感染した細胞上に見られる抗原に結合する受容体またはターゲティングポリペプチドを発現することも可能である。受容体またはターゲティングポリペプチドは、感染性疾患に関連する抗原に結合し、そして真核細胞内にシグナルを送り、これがＲＤＥ－導入遺伝子の発現を導く。ＲＤＥ－導入遺伝子は、感染性疾患を治療するために、真核細胞を活性化可能な産物をコードする（例えば、真核細胞は、細胞傷害性ポリペプチドまたは免疫細胞を活性化するサイトカインを産生することも可能である）。ＲＤＥ－導入遺伝子はまた、それ自体、細胞傷害性ポリペプチドまたはサイトカインであるポリペプチドをコードしてもよい。真核細胞はまた、例えば骨髄移植または放射線照射に対する曝露、再発性白血病の寛解の目的のためのドナーリンパ球輸血等の後、感染性疾患の防止に利用されてもよい（予防的に用いられてもよい）。
[000228]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ
ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを発現する真核細胞を含む療法剤を、活性成分として、皮内、筋内、皮下、腹腔内、鼻内、動脈内、静脈内、腫瘍内で、あるいは輸入リンパ管内に、非経口投与によって、例えば注射または注入によって投与することも可能であるが、投与経路は限定されない。
[000229]ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合によって、Ｓｍａｒｔ
ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＲＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体またはターゲティングポリペプチドを、攻撃的抗腫瘍特性を有するＴリンパ球、例えばすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｐｅｇｒａｍら， ＣＤ２８ｚ ＣＡＲｓ ａｎｄ ａｒｍｏｒｅｄ ＣＡＲｓ， ２０１４， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ． ２０（２）：１２７－１３３に記載されるものとともに用いてもよい。ＲＤＥ転写物は、Ｔリンパ球の攻撃的抗腫瘍特性を引き起こすポリペプチドをコードしてもよい。
[000230]導入遺伝子、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ ＣＡＲポリペプチドは、ＩＬ－２をコードする遺伝子の３’－ＵＴＲまたはＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲ由来のＲＤＥによって制御可能である。これらのＲＤＥを修飾して、ＲＤＥ中に見られるマイクロＲＮＡ部位を不活性化してもよい。これらの制御要素を用いて、ＲＤＥとグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の相互作用を通じて、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子の発現を、宿主細胞の解糖状態の変化に感受性にする。宿主細胞が休止状態である場合、ＧＡＰＤＨの大部分は解糖に関与せず、そしてＲＤＥに結合可能であり、その結果、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、および／または導入遺伝子ポリペプチドをコードする転写物の翻訳が減少する。例えば、宿主細胞にグルコース、または解糖活性を増加させるであろう他の小分子を提供することによって、宿主細胞を誘導して解糖を増加させると、ＧＡＰＤＨは酵素的に活性になり、そしてＲＤＥに結合不能となる。ＲＤＥへのＧＡＰＤＨ結合の減少は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲ、または他の導入遺伝子をコードする転写物の翻訳を増加させる（例えば転写物の半減期を増加させることによって、そして／または翻訳速度を増加させることによって）。ＧＡＰＤＨの解糖活性は、トリオースイソメラーゼの量および／または活性を増加させることによって増加させてもよい。宿主細胞を誘導して、組換えトリオースイソメラーゼを過剰発現させてもよく、そしてこの過剰発現は、ＧＡＰＤＨの解糖活性を増加させる。解糖阻害剤を添加して、ＲＤＥを含む転写物の発現を減少させてもよい。こうした解糖阻害剤には、例えば、ラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸、ヨードアセテート、フッ化物、オキサメート、プログリタゾン、ジクロロ酢酸、キノン、または他の代謝阻害剤、例えばデヒドロエピアンドロステロンが含まれる。ＲＤＥ制御転写物からの発現を、ＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）によるＲＤＥの結合を阻害する、ＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）阻害剤の添加によって増加させてもよい。こうしたＧＡＰＤＨ阻害剤には、例えば、ＣＧＰ ３４６６マレイン酸塩またはヘプテリジン酸（どちらもＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．によって販売される）、ペンタレノラクトン、または３－ブロモピルビン酸が含まれる。
[000231]ＲＤＥを含む転写物をコードする構築物を、真核細胞において発現させて、ＲＤＥ結合タンパク質に結合させ、そしてこうして、これらのＲＤＥ結合タンパク質が、細胞中の天然転写物と相互作用する能力を減少させることも可能である。組換え転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質の結合に関して競合可能であり、そしてこれは、ＲＤＥ結合タンパク質による真核細胞内の天然転写物の阻害および／または活性化を減少させうる。ＲＤＥを含む転写物をコードする構築物をこの方式で用いて、真核細胞において天然転写物がいつそしてどのように発現されるかを変更することも可能である。真核細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、またはＢ細胞であってもよく、そして組換え転写物は、サイトカインまたは細胞傷害性転写物と共有するＲＤＥを（例えばその３’非翻訳領域に）有する。組換え転写物は、サイトカインまたは細胞傷害性ポリペプチドの発現を制御し、そしてサイトカインまたは細胞傷害性ポリペプチドを発現するために必要な閾値（例えばＧＡＰＤＨの解糖活性）を変化させるＲＤＥ結合タンパク質（例えばＧＡＰＤＨおよび／または上述の他の解糖酵素）との結合に関して競合することも可能である。これを用いて、免疫細胞の刺激に反応して（例えばＣＡＲまたはＴ細胞受容体を通じて）、より多量のサイトカインおよび／または細胞傷害性タンパク質を分泌するであろう（より高いＣｍａｘの）、スーパーＴ細胞（アングリーＴ細胞またはホーネットＴ細胞としても知られる）を生成することも可能である。Ｔ細胞がそのＴ細胞受容体によって刺激された際、該細胞が、より迅速な動力学で、より多くのＩＬ－２および他のエフェクターポリペプチドを生じるように、ＩＬ－２転写物由来のＲＤＥをコードする組換え転写物で、Ｔ細胞を再プログラミングすることも可能である。これらの再プログラミングされたＴ細胞はまた、他の炎症性サイトカインおよび細胞傷害性ポリペプチド（例えばグランザイムおよび／またはパーフォリン）を、より多量に、そしてより迅速な動力学で産生することも可能である。こうしたアングリー／ホーネット状態に再プログラミングされたＴ細胞およびナチュラルキラー細胞は、例えば、腫瘍、他の癌、および感染性疾患を含む疾患および障害を治療するために有用でありうる。
[000232]被験体は、被験体のＲＤＥの変化を同定することによって、特定の疾患に関して診断可能である。こうした変化は、ＲＤＥの機能獲得または機能喪失を引き起こしうる。例えば、欠失、染色体再編成、および特定の塩基置換は、ＲＤＥの機能を喪失させうる（例えばＲＤＥと通常相互作用するＲＮＡ結合タンパク質がもはや結合しない）。こうした機能喪失変化は、転写物の発現を改変し、そして異常な発現を生じる。次世代核酸配列決定、タンパク質－ＲＮＡ結合アッセイまたはＲＮＡ結合タンパク質トラップ法、例えばすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｃａｓｔｅｌｌｏら， Ｍоｌｃ． Ｃｅｌｌ ６３：６９６－７１０（２０１６）に記載する方法を用いて、異常なＲＤＥの検出を行うことも可能である。これらのＲＮＡ結合アッセイを用いて、被験体のＲＤＥの機能変化を診断することも可能である。この異常な発現は、疾患状態を生じる可能性もあり、例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、および胃腺癌（これらの癌は、ＰＤ－Ｌ１の３’－ＵＴＲのＲＤＥが改変されて、ＰＤ－Ｌ１の過剰発現を導く変異体を有する）（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｋａｔａｏｋａ Ｋら， Ｎａｔｕｒｅ （２０１６） ５３４：４０２， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１８２９４）；炎症性疾患、自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、セリアック病（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ｄｅ Ｊｏｎｇら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２０１６） １７， ７５－７８）（ＲＤＥの長さを増加させたＣＴＬＡ－４の３’－ＵＴＲにおける変化は、自己免疫と相関した）、および関節リウマチ（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｔｓｕｚａｋａら Ｍｏｄｅｒｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ． （２００２） １２：１６７－１７３）（選択的スプライシングは、Ｔ細胞受容体ζ鎖のＲＤＥを変化させ、そして発現の下方制御を生じる）；ならびに神経学的障害および疼痛障害（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＦｏｕｌｋｅｓおよびＷｏｏｄ， ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （２００８） ４（７）：ｅ１００００８６）が含まれる。
[000233]配列決定技術、増幅法、ハイブリダイゼーションに基づく技術、および配列変化を検出するための他の方法を用いて、被験体の異常なＲＤＥを検出してもよい。被験体の核酸（ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の分析によって、ＲＤＥを検出してもよい。配列決定技術には、例えばサンガー配列決定、他の鎖終結配列決定法、マクサムおよびギルバート配列決定、ポロニー配列決定、ＳＯＬＩＤ配列決定（連結による配列決定）、一分子配列決定（例えばＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、イオントレント配列決定、ピロ配列決定（例えば４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、合成による配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ナノポア配列決定等が含まれる。増幅法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、転写仲介性増幅技術、逆転写酵素ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅法、クリバーゼ・インベーダー等が含まれる。ハイブリダイゼーション法には、例えば、サザン、ノーザン、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡ－ＲＮＡハイブリダイゼーション、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等が含まれる。他の側面において、ＲＤＥとＲＤＥ結合タンパク質の相互作用の変化は、タンパク質－ＲＮＡ結合アッセイまたはＲＮＡ結合タンパク質トラップ法、例えばすべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｃａｓｔｅｌｌｏら， Ｍоｌｃ． Ｃｅｌｌ ６３：６９６－７１０（２０１６）に記載する方法を用いて同定される。
[000234]本明細書に開示する発明は、続く実験の詳細からよりよく理解されるであろう。しかし、当業者は、論じられる特定の方法および結果が、その後に続く請求項により詳細に記載されるような本発明の単なる例示であることが容易に認識されるであろう。別に示さない限り、開示は特定の方法、材料等に限定されず、これはこれらが多様でありうるためである。本明細書で用いる用語は、特定の態様を記載する目的のためであり、そして限定することを意図されないこともまた、理解されるものとする。
実施例１． Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲでのＴ細胞エフェクター活性の制御
[000235]Ｂｕｄｄｅ ２０１３（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｂｕｄｄｅら ＰＬｏＳ１， ２０１３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ
．ｐｏｎｅ．００８２７４２）に記載される第三世代抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセット、およびＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ ２００７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０４ （３６）： １４２８３－８８）を用いて、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを作製する。３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を、適切な発現ベクター中の抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセット内にあるよう操作する。
[000236]この抗ＣＤ２０ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／または初代ヒトＴ細胞）に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ２０ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000237]活性化された抗ＣＤ２０ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ２０＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｍｏｓターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｍｏｓターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、５００μＭ～１ｍＭの範囲の濃度で、培地に添加する（より低いまたはより高い濃度を用いて、Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ活性を所望のレベルに滴定することも可能である）。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞をともに４８時間培養する。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｍｏｓターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ
Ｔ細胞）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＳｍａｒｔ－ＣＡＲ発現でのＳｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
実施例２． ヒト被験体における、組み合わせＳｍａｒｔ－ＣＡＲでのＴ細胞エフェクター活性の制御
[000238]別個のＴＡＡに関する特異性を有し、そして別個の小分子リガンドに反応する直交性Ｓｍａｒｔ ＣＡＲをコードする核酸を構築し、そしてこれをレンチウイルスベクター内にパッケージングする。これらのＳｍａｒｔ ＣＡＲは各々、同族（ｃｏｇｎａｔｅ）リガンド曝露に反応して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性Ｔ細胞エフェクター機能および抗原依存性拡大を示し、そして個々に、ヒト患者における既知の療法ウィンドウを有する。
[000239]このＳｍａｒｔ ＣＡＲプールによって認識される多数のＴＡＡの定義されるセットを発現する腫瘍を有するヒト被験体を治療するため、アフェレーシスによって、患者末梢血から自己Ｔ細胞を採取し、そしてｅｘ ｖｉｖｏで、個々にまたはプールしてのいずれかで、同族Ｓｍａｒｔ ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入する。次いで、拡大されたＳｍａｒｔ ＣＡＲ ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を患者に戻して養子移入する。各Ｓｍａｒｔ ＣＡＲは、それ自体の同族小分子リガンドで個々に活性化されて、腫瘍認識および排除を開始する。各Ｓｍａｒｔ ＣＡＲが個々に制御されるため、各Ｓｍａｒｔ ＣＡＲの療法ウィンドウを調節して、許容されうる移植片対宿主反応で、最大の移植片対腫瘍反応を実施する。腫瘍免疫編集のエスケープ期に到達すると、失われたＴＡＡをターゲティングするＳｍａｒｔ ＣＡＲは、その同族リガンドの除去によって不活性化されて、移植片対腫瘍利益をもはや提供しないＳｍａｒｔ ＣＡＲに関するさらなる移植片対宿主反応は制限される。Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ毒性を制御し、そしてＴＡＡに対する分散した攻撃を平行させることによって、いかなる腫瘍タイプに関しても、迅速で、耐久性がある寛解が達成される。
実施例３． ＤＥ－ＣＡＲでのＴ細胞エフェクター活性の制御
[000240]Ｂｕｄｄｅ ２０１３（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｂｕｄｄｅら ＰＬоＳ１， ２０１３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）に記載される抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセット、およびＩｗａｍｏｔｏ ２０１０（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｉｗａｍｏｔｏら Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１０ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｈｅｍｂｉｏｌ．２０１０．０７．００９）を用いて、ＤＥ－ＣＡＲを作製する。ＤＥ－ＣＡＲはまた、ＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ ２００７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０４ （３６）： １４２８３－８）をコードすることも可能である。突然変異体ｓｃＤＨＦＲのＤＥをコードする核酸を、適切な発現ベクター中の抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセット内にあるよう操作する。あるいは、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を、さらに、ＤＥ－抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセット内にあるよう操作する。
[000241]この抗ＣＤ２０ ＤＥ－ＣＡＲを、ルーチンの方法によってＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／または初代ヒトＴ細胞）内にトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ２０ ＤＥ－ＣＡＲまたは抗ＣＤ２０ Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）で、Ｔ細胞集団を活性化する。
[000242]活性化された抗ＣＤ２０ ＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞または抗ＣＤ２０ Ｓｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ２０＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｍｏｓターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞（またはＳｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞）：Ｒａｍｏｓターゲット比で共培養する。ＤＥのリガンド、トリメトプリム、および／またはＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、５００μＭ～１ｍＭの範囲の濃度で、培地に添加する（より低いまたはより高い濃度を用いて、Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ活性を所望のレベルに滴定することも可能である）。ＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞またはＳｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞をともに４８時間培養する。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｍｏｓターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（ＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＳｍａｒｔ－ＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＳｍａｒｔ－ＣＡＲ発現でのＳｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
実施例４． Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲでのＴ細胞エフェクター活性の増加
[000243]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載される第三世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ ２００７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０４ （３６）： １４２８３－８８）を用いて、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを作製する。３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を、適切な発現ベクター中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット内にあるよう操作する。
[000244]抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／または初代ヒトＴ細胞）の異なる集団に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－
／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000245]活性化された抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｍｏｓターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、２μＭ～２ｍＭの範囲（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに４８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＳｍａｒｔ－ＣＡＲ発現でのＳｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
[000246]活性化された抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｍｏｓターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、２μＭ～２ｍＭの範囲（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに４８時間増殖させる。培地から試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－２に関して試験する。
[000247]対照として、活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、２μＭ～２ｍＭの範囲（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞をともに４８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＣＡＲ発現でのＣＡＲ Ｔ細胞のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
[000248]対照として、活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、２μＭ～２ｍＭの範囲（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに４８時間増殖させる。培地由来の試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－２に関して試験する。
実施例５：Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲでのＣＤ８＋ Ｔリンパ球によるターゲット細胞殺傷
[000249]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、およびＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ ２００７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０４ （３６）： １４２８３－８８）を用いて、Ｓｍａｒｔ Ｃａｒを作製した。３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を、発現ベクター中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット内にあるよう操作した。
[000250]抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／またはヒトＴ細胞）の異なる集団に、ルーチンの方法によっ
てトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000251]抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲまたは抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞を、０、７５および２５０μＭのテオフィリンと７２時間インキュベーションした。活性化された抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、０μＭ、７５μＭ，および２５０μＭの濃度で、培地中で維持する。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに１８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。
[000252]この実験の結果を図６に示し、これは各テオフィリン濃度に関する、そして抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを含むＴリンパ球または抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴリンパ球に関する個々の曲線を伴う、時間に対してグラフ化したターゲット細胞殺傷を示す。この図は、恒常的に発現されるＣＡＲよりもテオフィリンに制御されたＳｍａｒｔ ＣＡＲでのターゲット細胞殺傷が改善されていることを示す。改善は、２５０μＭテオフィリンで約2倍であり、そして７５μＭおよび２５０μＭテオフィリンはどちらも、恒常的に
発現されるＣＡＲよりも、ターゲット細胞殺傷を改善した。また、テオフィリン濃度はどちらも、テオフィリンを含まずに増殖させた抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを含むＴリンパ球よりも、細胞殺傷に約2倍の増加を示した（これらの細胞はまた、ある程度の基底
レベルのＣＡＲ発現を示すターゲット細胞も殺した）。
実施例６：ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＣＤ８＋ Ｔリンパ球に関する、Ｔリンパ球消耗マーカーの減少
[000253]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、およびＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ ２００７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０４ （３６）： １４２８３－８８）を用いて、Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを作製した。３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９制御デバイスをコードする核酸を、発現ベクター中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット内にあるよう操作した。
[000254]抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／または初代ヒトＴ細胞）の異なる集団に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000255]抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲまたは抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞を、０、７５および２５０μＭのテオフィリンと７２時間インキュベーションする。活性化された抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および
１０：１のＳｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、０μＭ、７５μＭ，および２５０μＭの濃度で、培地中で維持する。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに１８時間培養する。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。細胞をまた、抗ＰＤ－１、抗ＴＩＭ３および／または抗ＬＡＧ－３試薬でも染色して、ＥＬＩＳＡまたは細胞ソーティングによって、これらのＴリンパ球消耗マーカーを測定する。
[000256]ＣＤ－１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔリンパ球は、恒常的に発現されるＣＤ－１９ ＣＡＲ Ｔリンパ球に比較して、より低いレベルの消耗マーカーを有するであろう。消耗マーカーのこの減少は、ターゲットＲａｊｉ細胞上のＣＤ－１９によるＣＤ－１９ ＣＡＲリンパ球およびＣＤ－１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲリンパ球の刺激より前であっても見られうる。
実施例７． ＲＤＥ－ＣＡＲでのＴ細胞エフェクター活性の制御
[000257]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載される第三世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＩＬ－２をコードする遺伝子の３’－ＵＴＲ（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿０００５８６．３）を用いて、ＲＤＥ Ｃａｒを作製する。ＩＬ－２ ３’－ＵＴＲをコードする核酸を、適切な発現ベクター中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット内にあるよう操作する。用いたＩＬ－２、３’－ＵＴＲ配列は以下の通りであった：
Figure 0007374246000010
[000258]抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞（初代ヒトＴ細胞）の異なる集団に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化し、そしてビーズを除いたのち、休止状態に戻ることを可能にする。
[000259]休止抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。解糖活性化剤、グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭの範囲（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の濃度で培地中に添加する。ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに２４時間培養する。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＲＤＥ－ＣＡＲ発現でのＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
[000260]活性化された抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。解糖活性化剤、グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭの範囲（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに２４時間増殖させる。培地から試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－２に関して試験する。
[000261]対照として、活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。解糖活性化剤、グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭの範囲（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに２４時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。
[000262]対照として、活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。解糖活性化剤、グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭの範囲（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の濃度で、培地に添加する。ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに４８時間増殖させる。培地から試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－２に関して試験する。
実施例８：ＲＤＥからのマイクロＲＮＡ結合部位の除去
[000263]ＩＬ－２の３’－ＵＴＲ由来のＡＵ－リッチ要素は、ｍｉｒ－１８１およびｍｉｒ １８６マイクロＲＮＡ結合部位を有する。異なる組み合わせのマイクロＲＮＡ部位をＩＬ－２の３’－ＵＴＲから除去した。ＭＩＲ １８６マイクロＲＮＡ部位をＩＬ－２の３’－ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを含む構築物からの発現のダイナミックレンジは５０倍増加した。修飾ＩＬ－２、３’－ＵＴＲは、ＧＡＡを含む配列中のＣＴＴを置換し、そして以下に示すとおりである（新規ＧＡＡを配列中、下線で示す）：
Figure 0007374246000011
[000264]ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチ要素もまた、ｍｉｒ－１２５と特徴付けられるマイクロＲＮＡ結合部位を有する。ＩＦＮｇ ＲＤＥの配列は：
Figure 0007374246000012
である。
[000265]異なる組み合わせのマイクロＲＮＡ部位をＩＦＮｇの３’ＵＴＲから除去し、そして発現増加に関して試験した。ｍｉｒ１２５マイクロＲＮＡ部位を、ＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを含む構築物からの発現率は増加する。
[000266]ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化した後、ＲＤＥ－ＧＦＰに加えてマイクロＲＮＡ部位でトランスフェクションされたＴ細胞におけるＧＦＰの発現を、マイクロＲＮＡ部位が除去されているＲＤＥ－ＧＦＰを含むＴ細胞におけるＧＦＰの発現に比較する。マイクロＲＮＡ部位の除去は、マイクロＲＮＡ部位を含む細胞に比較して、２４時間後、２～５の間の係数で、ＧＦＰの発現を増加させた。
実施例９：ＡＭＬに関するキメラ抗原受容体の制御
[000267]抗ＣＤ２０細胞外ドメインを置換する細胞外要素（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｒｏｔｈｆｅｌｄｅｒら， ２０１５， ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ）に関して、Ｂｕｄｄｅ ２０１３（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｂｕｄｄｅら ＰＬｏＳ１， ２０１３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）に記載される抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセットを用いて、ＣＡＲを作製する。抗ＣＤ１３３ ＣＡＲをコードする核酸には、実施例１１に記載するような、ＭＩＲ１８６マイクロＲＮＡ部位を除去するよう操作したＩＬ－２由来の３’－ＵＴＲ、またはＭＩＲ１２５マイクロＲＮＡ部位を除去するように操作したＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲが含まれてもよい。抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセットをコードする構築物を操作して、抗ＣＤ１３３要素で抗ＣＤ２０細胞外ドメインを置換し、そしてＭＩＲ１２５マイクロＲＮＡ部位を除去するよう操作されたＩＬ－２の３’－ＵＴＲ、またはＭＩＲ１２５マイクロＲＮＡ部位を除去するよう操作されたＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲもまた、構築物内にあるよう操作する。３’－ＵＴＲを含むまたは含まない抗ＣＤ１３３ ＣＡＲを適切な発現ベクター内にクローニングする。
[000268]この抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、または抗ＣＤ１３３ ＲＤＥ－ＣＡＲの１つ（ＩＬ－２の３’ＵＴＲまたはＩＦＮ－γの３’ＵＴＲ）を、Ｔリンパ球（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／または初代ヒトＴ細胞）に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔリンパ球の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗抗ＣＤ１３３ ＣＡＲまたは抗ＣＤ１３３ ＲＤＥ ＣＡＲを含むＴリンパ球集団（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000269]活性化された抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、または抗ＣＤ１３３ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔリンパ球を、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３－ ＡＭＬターゲット細胞（例えばＵ９３７、ＭＶ４－１１、ＭＯＬＭ－１４、ＨＬ－６０および／またはＫＧ１ａ）と、２：１、５：１、
および１０：１の抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、または抗ＣＤ１３３ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔリンパ球：ＡＭＬターゲット比で共培養する。抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、または抗ＣＤ１３３ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔリンパ球およびＡＭＬ細胞をともに４８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ１３３および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ１３３＋（ＡＭＬターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、または抗ＣＤ１３３
ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔリンパ球）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＣＡＲ発現での抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、または抗ＣＤ１３３ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔリンパ球のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
実施例１０． Ｔ細胞エフェクター活性を制御するためのオフスイッチ
[000270]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｗａｎｇら， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ ２：ａ００２２７９ （２０１０）に記載されるＹ３１９Ｆ ＺＡＰ ７０突然変異体、および実施例９に記載されるＴｅｔ ＲＮＡ制御デバイスを用いて、Ｓｍａｒｔ－ＺＡＰ ７０突然変異体を作製することも可能である。Ｔｅｔ－ＲＮＡ制御デバイスをコードする核酸を、Ｙ３１９Ｆ ＺＡＰ ７０突然変異体をコードする核酸に、機能可能であるように連結して、そしてこの構築物は適切な発現ベクター中にある。
[000271]実施例８の抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を含むＴ細胞を本実施例で用いる。ＲＮＡ制御デバイスＹ３１９Ｆ ＺＡＰ ７０を、実施例８にしたがって作製された抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を含むＴ細胞に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔ細胞の安定集団を選択する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000272]活性化ＲＮＡ制御デバイスＹ３１９Ｆ ＺＡＰ７０および抗ＣＤ１９ ＲＤＥ
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｍｏｓターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養する。解糖活性化剤、グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭの範囲（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の濃度で、培地中で維持する。２μＭ～２ｍＭの範囲（２μＭ、１０μＭ、２０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、１ｍＭ、および２ｍＭ）のテトラサイクリンを細胞に添加するかまたは添加しない（細胞培養±テトラサイクリンを有する）。ＲＮＡ制御デバイスＹ３１９Ｆ ＺＡＰ７０＋ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに４８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＹ３１９Ｆ ＺＡＰ ７０発現および異なるレベルのＲＤＥ－ＸＡＰ発現での、ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞に対する、ＲＮＡ制御デバイスＹ３１９Ｆ ＺＡＰ７０＋ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。
実施例１１：抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた、ＤＬＢＣＬへのペイロード送達
[000273]実施例６の抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔリンパ球および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞リンパ球を本実施例で用いる。これらのＣＡＲ Ｔリンパ球が、ＭＩＲ１８６部位の除去によって修飾されているＩＬ２の３’－ＵＴＲの制御下でＰＤ－１阻害剤をコードする構築物を含むように、さらに操作する。構築物によって発現されるＰＤ－１阻害剤には、例えば、ペムブロリズマブ（キートルーダ（登録商標））、ニボルマブ（オプディーボ（登録商標））、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５８、ラムブロリズマブ、またはこれらの薬剤由来のポリペプチドが含まれる。構築物によって発現可能な他のＰＤ－１阻害剤には、Ｈｅｒｂｓｔら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３１：３０００ （２０１３）； Ｈｅｅｒｙら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３２：５ｓ， ３０６４ （２０１４）； Ｐｏｗｌｅｓら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ３２：５ｓ， ５０１１（２０１４）； Ｓｅｇａｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３２：５ｓ， ３００２ （２０１４）、あるいは米国特許第８，７３５，５５３号；第８，６１７，５４６号；第８，００８，４４９号；第８，７４１，２９５号；第８，５５２，１５４号；第８，３５４，５０９号；第８，７７９，１０５号；第７，５６３，８６９号；第８，２８７，８５６号；第８，９２７，６９７号；第８，０８８，９０５号；第７，５９５，０４８号；第８，１６８，１７９号；第６，８０８，７１０号；第７，９４３，７４３号；第８，２４６，９５５号；および第８，２１７，１４９に開示されるものが含まれる。
[000274]抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１９
Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ／ＰＤ－１を含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＰＤ－１を含むＴ細胞集団（ＣＤ１９－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤を含むＴ細胞を、０、７５および２５０μＭのテオフィリンと７２時間インキュベーションした。活性化された抗ＣＤ１９ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ／ＰＤ－１ Ｔ細胞または抗ＣＤ１９ ＣＡＲ／ＰＤ－１ Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋／ＣＤ２２＋／ＣＤ３－ Ｒａｊｉターゲット細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＳｍａｒｔ ＣＡＲ／ＰＤ－１ Ｔ細胞：Ｒａｊｉターゲット比で共培養した。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、０μＭ、７５μＭ，および２５０μＭの濃度で、培地中で維持する。Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ／ＰＤ－１ Ｔ細胞またはＣＡＲ／ＰＤ－１ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞をともに１８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ２２＋（Ｒａｊｉターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔ細胞）を計数する。６時間、１２時間、および１８時間でもまた培地から試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、ＰＤ－１阻害剤に関して試験する。
実施例１２：抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ Ｔ細胞を用いた、ＡＭＬへのペイロード送達
[000275]抗ＣＤ２０細胞外ドメインを置換する細胞外要素（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｒｏｔｈｆｅｌｄｅｒら， ２０１５， ａｓｈ．ｃｏｎｆｅｘ．ｃｏｍ／ａｓｈ／２０１５／ｗｅｂｐｒｏｇｒａｍ／Ｐａｐｅｒ８１１２１．ｈｔｍｌ）に関して、抗ＣＤ１３３ｍＡｂ ２９３Ｃ３－ＳＤＩＥを用いて、Ｂｕｄｄｅ ２０１３（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｂｕｄｄｅら ＰＬｏＳ１， ２０１３ ｄｏｉ：１０．１３７１／ ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２７４２）に記載される抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセットを用いて、ＣＡＲを作製する。抗ＣＤ１３３ ＣＡＲはまた、ＲＮＡ制御デバイス、３ＸＬ２ｂｕｌｇｅ９（すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷｉｎおよびＳｍｏｌｋｅ ２００７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０４ （３６）： １４２８３－８８）もコードしてもよい。抗ＣＤ２０ ＣＡＲカセットをコードする核酸を操作して、抗ＣＤ１３３で抗ＣＤ２０細胞外ドメインを置換し、そして場合によって、ＲＮＡデバイスもまた、カセット内にあるように操作する。ＲＮＡ制御デバイスを含むまたは含まない抗ＣＤ１３３ ＣＡＲを適切な発現ベクター内にクローニングする。
[000276]これらの抗ＣＤ１３３ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ構築物を、Ｔリンパ球（Ｊｕｒｋａｔ細胞および／または初代ヒトＴリンパ球）に、ルーチンの方法によってトランスフェクションし、そして適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を用いて、Ｔリンパ球の安定集団を選択する。
[000277]これらのＣＡＲ Ｔリンパ球が、ＭＩＲ１８６部位の除去によって修飾されているＩＬ２の３’－ＵＴＲ由来のＲＤＥの制御下にあるＰＤ－１阻害剤をコードする構築物を含むように、さらに操作する。構築物によって発現されるＰＤ－１阻害剤には、例えば、ペムブロリズマブ（キートルーダ（登録商標））、ニボルマブ（オプディーボ（登録商標））、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５８、ラムブロリズマブ、またはこれらの薬剤由来のポリペプチドが含まれる。構築物によって発現可能な他のＰＤ－１阻害剤は、Ｈｅｒｂｓｔら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３１：３０００ （２０１３）； Ｈｅｅｒｙら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３２：５ｓ， ３０６４ （２０１４）； Ｐｏｗｌｅｓら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ３２：５ｓ， ５０１１（２０１４）； Ｓｅｇａｌら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．， ３２：５ｓ， ３００２ （２０１４）、あるいは米国特許第８，７３５，５５３号；第８，６１７，５４６号；第８，００８，４４９号；第８，７４１，２９５号；第８，５５２，１５４号；第８，３５４，５０９号；第８，７７９，１０５号；第７，５６３，８６９号；第８，２８７，８５６号；第８，９２７，６９７号；第８，０８８，９０５号；第７，５９５，０４８号；第８，１６８，１７９号；第６，８０８，７１０号；第７，９４３，７４３号；第８，２４６，９５５号；および第８，２１７，１４９に開示されるものが含まれる。
[000278]抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの同時インキュベーションによって、抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤または抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤を含むＴリンパ球集団（ＣＤ２０－／ＣＤ２２－／ＣＤ３＋）を活性化する。
[000279]活性化された抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤または抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤Ｔリンパ球を、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３－ ＡＭＬターゲット細胞（例えばＵ９３７、ＭＶ４－１１、ＭＯＬＭ－１４、ＨＬ－６０および／またはＫＧ１ａ）と、２：１、５：１、および１０：１の抗ＣＤ１３３ ＣＡＲおよび／または抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔリンパ球：ＡＭＬターゲット比で共培養する。ＲＮＡ制御デバイスのリガンド、テオフィリンを、５００μＭ～１ｍＭの範囲の濃度で、培地に添加する（より低いまたはより高い濃度を用いて、Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ活性を所望のレベルに滴定することも可能である）。抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤および／または抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤Ｔリンパ球およびＡＭＬ細胞をともに４８時間増殖させる。培養物を洗浄し、そして次いで、抗ＣＤ１３３および抗ＣＤ３試薬で染色した後、ＣＤ１３３＋（ＡＭＬターゲット細胞）およびＣＤ３＋細胞（抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ、抗ＣＤ１３３ ＤＥ－ＣＡＲ、抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ、および／または抗ＣＤ１３３ ＤＥ－Ｓｍａｒｔ ＣＡＲ Ｔリンパ球）を計数する。これらの測定は、異なるレベルのＣＡＲ発現での抗ＣＤ１３３ ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤および／または抗ＣＤ１３３ Ｓｍａｒｔ－ＣＡＲ／ＰＤ－１阻害剤Ｔリンパ球のターゲット細胞殺傷率（例えば半減期）および増殖率を同定するであろう。また、１２、２４、２６および４８時間の時点で、培地から試料を採取し、そしてＥＬＩＳＡによって、ＰＤ－１に関して試験した。
実施例１３：ＣＡＲおよび第二の導入遺伝子を発現するための構築物
[000280]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載されるような抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥ２（ＩＬ－２由来の３’－ＵＴＲ）挿入物を用いて、構築物を作製した。これらの２つの挿入物／カセットを、異なるレンチウイルス構築物上に配置するか、または同じ二シストロン性レンチウイルス構築物中に配置した。二シストロン性構築物において、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含む挿入物およびＧＦＰ－ＲＤＥを含む挿入物は、反対方向に転写され、そして各々の制御領域は、２つの挿入物／カセットの間に位置する。単一構築物レンチベクターにおけるＧＦＰ－ＲＤＥ２挿入物に関する制御領域は、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを伴う修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター）であり、これは、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、Ｌｉら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８９：５６－６４ （２０１０）に記載される。二シストロン性レンチベクター中のＧＦＰ－ＲＤＥ２挿入物の制御領域はＭｉｎＰであり、そしてＲＤＥはＩＬ－２の内因性３’－ＵＴＲを用いた。両構築物中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域もまた、ＭＮＤであった。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、個々の抗ＣＤ１９ ＣＡＲレンチ構築物およびＧＦＰ－ＲＤＥ２レンチ構築物で二重に形質導入されるか、または抗ＣＤ１９ ＣＡＲレンチ構築物およびＧＦＰ－ＲＤＥ２レンチ構築物の両方を含む二シストロン性構築物で１回、形質導入された。
[000281]形質導入Ｔ細胞を休止状態に戻すことが可能であり、そして次いで、以下のように刺激後に試験した。「非刺激」セットに関しては、形質導入Ｔ細胞を、培地中、単独で２４時間インキュベーションした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットに関しては、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを形質導入Ｔ細胞と２４時間インキュベーションした。２４時間の時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、そしてフローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。
[000282]二重形質導入Ｔ細胞は、Ｒａｊｉターゲット細胞と培養した際（ＣＡＲを活性化させる）、１９．５％から４２．５％の蛍光増加（約２倍）を、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した際（ＴＣＲを活性化させる）、１９．５％から３４．９％の蛍光増加（約１．８倍）を示した。二重形質転換Ｔ細胞は、Ｒａｊｉ細胞と培養した際、０．９％から５６．９％の集団における活性化細胞の変化を、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した際、０．９％から９２．５％の変化を示した。
[000283]単一形質導入Ｔ細胞は、Ｒａｊｉ細胞と培養した際、３．６％から５．８％の集団における活性化細胞の変化を、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した際、３．６％から６．６％の変化を示した。
実施例１４：第二の導入遺伝子を発現するためのＲＤＥ構築物
[000284]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載されるような抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇ由来の３’－ＵＴＲ）挿入物を用いて、構築物を作製した。これらの２つの挿入物／カセットを同じレンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットおよびＧＦＰ－ＲＤＥを含む挿入物は、反対方向に転写され、そして各々の制御領域は、２つの挿入物／カセットの間に位置する。ＧＦＰ－ＲＤＥ挿入物に関する制御領域はＭｉｎＰであり、そしてＲＤＥはＩＦＮｇの内因性３’－ＵＴＲであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤであった（上述の通り）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を二シストロン性構築物で形質導入した。
[000285]形質導入Ｔ細胞を休止状態に戻すことが可能であり、そして次いで、以下のように刺激後に試験した。「非刺激」セットに関しては、形質導入Ｔ細胞を、培地中、単独で２４時間インキュベーションした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットに関しては、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを形質導入Ｔ細胞と２４時間インキュベーションした。２４時間の時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、そしてフローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。
[000286]形質導入Ｔ細胞は、Ｒａｊｉターゲット細胞と培養した際（ＣＡＲを活性化さ
せる）、１．０％から６．５％の蛍光増加（約６．５倍）を、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した際（ＴＣＲを活性化させる）、１．０％から４．４％の蛍光増加（約４．４倍）を示した。形質転換Ｔ細胞は、Ｒａｊｉ細胞と培養した際、０．９％から８４．８％の集団における活性化細胞の変化を、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した際、０．９％から９０．８％の変化を示した。
実施例１５：第二の導入遺伝子を発現するための修飾ＲＤＥ２構築物
[000287]実施例１１および１２に記載するような抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥ２．１（ＩＬ－２ ＲＤＥ）挿入物を用いて構築物を作製した。ＲＤＥ２．１を修飾してＭＩＲ１８６マイクロＲＮＡ部位を除去し、ＩＬ－２の３’－ＵＴＲからヌクレオチドを改変して、ＲＤＥ２として用いた。
[000288]これらの２つの挿入物／カセットを同じレンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットおよびＧＦＰ－ＲＤＥを含む挿入物は、反対方向に転写され、そして各々の制御領域は、２つの挿入物／カセットの間に位置する。ＧＦＰ－ＲＤＥ挿入物に関する制御領域はＭｉｎＰであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤであった（上述の通り）。ＣＤ４＋ Ｔ細胞を二シストロン性構築物で形質導入した。
[000289]形質導入Ｔ細胞を休止状態に戻すことが可能であり、そして次いで、以下のように刺激後に試験した。「非刺激」セットに関しては、形質導入Ｔ細胞を、培地中、単独で２４時間インキュベーションした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットに関しては、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを形質導入Ｔ細胞と２４時間インキュベーションした。２４時間の時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、そしてフローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。
[000290]形質導入Ｔ細胞は、Ｒａｊｉ細胞と培養した際、３．９％から１２．１％の集団における活性化細胞の変化を、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した際、３．９％から１１．１％の変化を示した。
実施例１６：ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するためのＲＤＥ構築物
[000291]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載されるような抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）挿入物またはルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に反応して、示差的導入遺伝子翻訳を与えない３’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を用いて、構築物を作製した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットおよびルシフェラーゼ－ＲＤＥ１を含む挿入物は、反対方向に転写され、そして各々の制御領域は、２つの挿入物／カセットの間に位置する。ルシフェラーゼ－ＲＤＥ１挿入物およびルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲに関する制御領域は：
Figure 0007374246000013
の配列を有するＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのいずれかであった。対照ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は二シストロン性構築物で形質導入された。
[000292]形質導入Ｔ細胞を休止状態に戻すことが可能であり、そして次いで、以下のように刺激後に試験した。「非刺激」セットに関しては、形質導入Ｔ細胞を、培地中、単独で２４時間インキュベーションした。「Ｒａｊｉ共培養」セットおよび「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」セットに関しては、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを形質導入Ｔ細胞と２４時間インキュベーションした。２４時間の時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、そしてフローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。
[000293]図１６は、形質導入Ｔ細胞が、休止状態のＴ細胞の生物発光に比較した際、Ｒａｊｉターゲット細胞と培養した場合（ＣＡＲを活性化する）、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと培養した場合（ＴＣＲを活性化する）、生物発光の増加を有したことを示す。ＮＦＡＴプロモーターおよびＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ（Ｇｏｌｄ１）を含むＴ細胞は、ＴＣＲ刺激に対して、ＣＡＲ刺激から、より大きなオン－オフ反応を示した。すべての条件下で、Ｇｏｌｄ１を含むＴ細胞は、ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ（３’－ＵＴＲ）によって制御されないルシフェラーゼを用いた同じ条件（および同じプロモーター）下で、Ｔ細胞よりもより少量の生物発光を有した。
実施例１７：ルシフェラーゼを制御するＲＤＥの比較
[000294]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載されるような抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）挿入物、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ２（ＩＬ－２の３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ２）挿入物、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ３（ｍｉｒ１８６部位を除去するために上述のように修飾されたＩＬ－２の３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ３）、またはルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に反応した示差的導入遺伝子翻訳を与えない３’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を用いて、構築物を作製した。図１７に示すこれらの挿入物／カセットの組み合わせを、類似のレンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットおよびルシフェラーゼ－ＲＤＥを含む挿入物は、反対方向に転写され、そして各々の制御領域は、２つの挿入物／カセットの間に位置する。ルシフェラーゼ－ＲＤＥ挿入物およびルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲに関する制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのいずれかであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤプロモーターであり、そしてＣＤ４＋ Ｔ細胞は二シストロン性構築物で形質導入された。
[000295]形質導入Ｔ細胞を休止状態に戻すことが可能であり、そして次いで、以下のよ
うに刺激後に試験した。「非刺激」セットに関しては、形質導入Ｔ細胞を、培地中、単独で２４時間インキュベーションした。「Ｒａｊｉ共培養」セットに関しては、ＣＤ１９＋
Ｒａｊｉ Ｂ細胞を形質導入Ｔ細胞と２４時間インキュベーションした。２４時間の時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、そしてフローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞におけるこれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。
[000296]図１７は、形質導入Ｔ細胞が、ＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）、ＲＤＥ２（Ｇｏｌｄ２）、またはＲＤＥ３（Ｇｏｌｄ３）を含む構築物に関して休止しているＴ細胞の生物発光に比較した際、Ｒａｊｉターゲット細胞（ＣＡＲを活性化する）と培養した場合の生物発光の増加を有したことを示す。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１を含むＴ細胞は、ＭｉｎＰプロモーターおよび対応するＲＤＥを含むＴ細胞よりも、より大きいオンオフ反応を示した。すべての条件下で、ＲＤＥ制御ルシフェラーゼを含むＴ細胞は、ＲＤＥによって制御されないルシフェラーゼカセットを含むＴ細胞よりもより少量の生物発光を有した。ＭｉｎＰプロモーターと組み合わせると、ＲＤＥ１は、ＣＡＲ刺激での生物発光において４．１倍の増加を生じ、ＲＤＥ２は、生物発光において１．８倍の増加を生じ、そしてＲＤＥ３は、１．４倍の増加を生じた。ＮＦＡＴプロモーターと組み合わせると、ＲＤＥ１は、ＣＡＲ刺激での生物発光において、８．５倍の増加を生じ、ＲＤＥ２は、生物発光において３．１倍の増加を生じ、そしてＲＤＥ３は、１．３倍の増加を生じた。どちらのプロモーターでも、ＲＤＥ３構築物は、最高量の生物発光を生じ、ＲＤＥ１構築物は、最低量の生物発光を生じ、そしてＲＤＥ２構築物は、ＲＤＥ３およびＲＤＥ１の間の生物発光の量を生じた。
実施例１８：ＩＬ－１２を発現するためのＲＤＥ構築物
[000297]すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される、ＷＯ ２０１２／０７９０００に記載されるような抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＩＬ－１２－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ）挿入物またはＩＬ－１２ ３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に反応して示差的導入遺伝子翻訳を与えない３’－ＵＴＲ）を用いて、構築物を作製した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットおよびＩＬ－１２－ＲＤＥ１を含む挿入物は、反対方向に転写され、そして各々の制御領域は、２つの挿入物／カセットの間に位置する。ＩＬ－１２－ＲＤＥ１挿入物およびＩＬ－１２ ３’－ＵＴＲに関する制御領域は、ｍｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのいずれかであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域はＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は二シストロン性構築物で形質導入された。
[000298]形質導入Ｔ細胞を休止状態に戻すことが可能であり、そして次いで、以下のように刺激後に試験した。「非刺激」セットに関しては、形質導入Ｔ細胞を、培地中、単独で２４時間インキュベーションした。「Ｒａｊｉ共培養」セットに関しては、ＣＤ１９＋
Ｒａｊｉ Ｂ細胞を形質導入Ｔ細胞と２４時間インキュベーションした。２４時間の時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、そしてフローサイトメトリーに供してこれらのマーカーを測定した。Ｔ細胞中のＩＬ－１２発現をＥＬＩＳＡによって測定した。
[000299]図１８は、形質導入Ｔ細胞が、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターによって制御される構築物を用いた、休止状態のＴ細胞のＩＬ－１２発現に比較した際、Ｒａｊｉターゲット細胞（ＣＡＲを活性化する）と培養した場合、ＩＬ－１２発現の増加を有することを示す。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）を含むＴ細胞は、ＣＡＲ刺激に対する休止細胞からのＩＬ－１２発現の１６８倍の変化を示した。ＮＦＡＴプロモーターおよび３’－ＵＴＲ（ＣＡＲ刺激に反応性ではない、３’－ＵＴＲ）を含むＴ細胞は、発現の５０倍の変化を示し、そしてＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）を含むｍｉｎＰプロモーターは、発現の６．３倍の変化を示した。
時間依存性エフェクター機能を計算するためのＰｙｔｈｏｎコードの開示
Figure 0007374246000014
Figure 0007374246000015
Figure 0007374246000016
[000300]本明細書に論じられ、そして引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書に援用される。開示する発明は、記載する特定の方法論、プロトコルおよび材料に限定されず、これはこれらが多様でありうるためであることが理解される。本明細書で用いる用語は、特定の態様を記載する目的のみのためのものであり、そして付随する請求項によってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定するよう意図されない。
[000301]当業者は、ルーチンの実験より多くを用いずに、本明細書に記載する本発明の特定の態様の多くの同等物を認識するかまたは確認することが可能であろう。こうした同等物は、以下の請求項に含まれると意図される。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］導入遺伝子を制御する方法であって：
受容体、およびＲＤＥをコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結された導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸を含む真核細胞を得て、ここで該異種核酸は転写されてＲＤＥに機能可能であるように連結された導入遺伝子をコードする転写物を作製し；
該真核細胞を、該受容体に対するリガンドに曝露して、ここで該受容体によるリガンドの結合が該細胞を活性化し；
そして、該導入遺伝子を発現させ、ここで該導入遺伝子から作製されるポリペプチドの量が該細胞の活性化後に増加する、
工程を含む、前記方法。
［態様２］受容体がキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体である、態様１に記載の方法。
［態様３］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドまたは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、あるいはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１に記載の方法。
［態様４］導入遺伝子がレポーターをコードし、ここで該レポーターが画像化可能であり、そしてリガンドを発現するターゲット部位を画像化する工程をさらに含む、態様１に記載の方法。
［態様５］真核細胞が免疫細胞である、態様１に記載の方法。
［態様６］免疫細胞がＴリンパ球である、態様５に記載の方法。
［態様７］リガンドがターゲット細胞上に見られる抗原である、態様１に記載の方法。
［態様８］ターゲット細胞が癌細胞または細菌であり、そしてターゲット細胞を殺傷する工程をさらに含む、態様７に記載の方法。
［態様９］ＲＤＥが、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルドラーゼＡまたはホスホグリセリン酸ムターゼからなる群より選択される解糖酵素によって結合される、態様１に記載の方法。
［態様１０］真核細胞の活性化が解糖を誘導し、ここで解糖の活性化が、解糖酵素による転写物におけるＲＤＥの結合の減少を生じる、態様９に記載の方法。
［態様１１］二シストロン性構築物であって：
第一の制御領域に機能可能であるように連結されたＣＡＲをコードする第一のポリヌクレオチド、
ＲＤＥに機能可能であるように連結され、そして第二の制御領域に機能可能であるように連結された導入遺伝子をコードする第二のポリヌクレオチドであって、第二の核酸が転写されて、ＲＤＥに機能可能であるように連結された導入遺伝子をコードする転写物を作製する、前記第二のポリヌクレオチド、および
レンチウイルス由来の構築物主鎖を含み、
そして第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドが、構築物において、反対方向で転写される、前記二シストロン性構築物。
［態様１２］転写物におけるＲＤＥが解糖酵素によって結合可能である、態様１１に記載の二シストロン性構築物。
［態様１３］解糖酵素が、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルドラーゼＡまたはホスホグリセリン酸ムターゼである、態様１２に記載の二シストロン性構築物。
［態様１４］第一の制御領域が強いプロモーターを有し、そして第二の制御領域が弱いプロモーターを有する、態様１１に記載の二シストロン性構築物。
［態様１５］導入遺伝子が、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチドまたは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、あるいはチェックポイント阻害剤をコードする、態様１１に記載の二シストロン性構築物。
［態様１６］態様１１に記載の二シストロン性構築物を含む、宿主細胞。
［態様１７］哺乳動物細胞である、態様１６に記載の宿主細胞。
［態様１８］免疫細胞である、態様１６に記載の宿主細胞。
［態様１９］免疫細胞がＴリンパ球である、態様１８に記載の宿主細胞。
［態様２０］異種導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたＲＮＡ不安定化要素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、該ポリヌクレオチドが休止状態の細胞中にある場合、該ＲＮＡ不安定化要素が解糖酵素によって結合可能である、前記核酸。
［態様２１］異種導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたＲＮＡ不安定化要素の少なくとも２コピーをコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
［態様２２］異種導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結された代謝性酵素または別のＲＮＡ結合タンパク質のいずれかによって結合される、ＲＮＡ不安定化要素をコードするポリヌクレオチドを含む、核酸。
［態様２３］ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたＲＮＡ不安定化要素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸であって、ＣＡＲが、細胞外要素、膜貫通要素、および細胞内要素で構成され、そして膜貫通要素が細胞外要素および細胞内要素の間にある、前記核酸。
［態様２４］ＲＮＡ不安定化要素がマイクロＲＮＡ結合部位をさらに含み、そしてマイクロＲＮＡ結合部位が修飾されている、態様２３に記載の核酸。
［態様２５］態様２３に記載の核酸を含む、真核細胞。
［態様２６］Ｔリンパ球の活性を制御する方法であって：
核酸を含むＴリンパ球を得て、ここで核酸が制御デバイスをコードするポリヌクレオチドおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、
Ｔリンパ球を、制御デバイスに関するリガンドに曝露し、ここで制御デバイスによるリガンド結合が、ＣＡＲポリペプチドの発現を変化させ、
そしてＴリンパ球において所望の量のＣＡＲポリペプチドを発現させ、ここでＣＡＲポリペプチドがＴリンパ球において療法活性を誘導可能である、
工程を含む、前記方法。
［態様２７］療法活性がターゲット細胞の殺傷である、態様２６に記載の方法。
［態様２８］所望の量のＣＡＲポリペプチドが、Ｔリンパ球の膜において、１００～１０，０００のＣＡＲをディスプレイする、態様２６に記載の方法。

Claims (16)

  1. キメラ抗原受容体と、ＲＮＡ不安定化要素（ＲＤＥ）をコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結された導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む異種核酸とを含む、初代Ｔ細胞であって、
    該ＲＤＥはＡＵ－リッチ要素であり、該導入遺伝子は、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、増殖因子、ケモカイン、ポリペプチド若しくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、又はチェックポイント阻害剤をコードする遺伝子であり、
    該異種核酸は転写されてＲＤＥに機能可能であるように連結された導入遺伝子をコードする転写物を作製し、該導入遺伝子から作製されるポリペプチドの量が、該キメラ抗原受容体が該初代Ｔ細胞を活性化した後に増加する、上記初代Ｔ細胞。
  2. 導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、インターフェロン－ガンマ、ＴＮＦ－α、又はＴＧＦ－βをコードする、請求項１に記載の初代Ｔ細胞。
  3. 導入遺伝子がＩＬ－１２をコードする、請求項２に記載の初代Ｔ細胞。
  4. キメラ抗原受容体が、ターゲット細胞上に見られるリガンドによって活性化される、請求項１に記載の初代Ｔ細胞。
  5. ターゲット細胞上のリガンドが、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＳＬＡＭＦ７、又はＣＬＬ－１である、請求項４に記載の初代Ｔ細胞。
  6. 導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、インターフェロン－ガンマ、ＴＮＦ－α、又はＴＧＦ－βをコードする、請求項４に記載の初代Ｔ細胞。
  7. 導入遺伝子がＩＬ－１２をコードする、請求項６に記載の初代Ｔ細胞。
  8. ターゲット細胞が癌細胞である、請求項４に記載の初代Ｔ細胞。
  9. 癌細胞が固形腫瘍の細胞である、請求項８に記載の初代Ｔ細胞。
  10. 導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、インターフェロン－ガンマ、ＴＮＦ－α、又はＴＧＦ－βをコードする、請求項９に記載の初代Ｔ細胞。
  11. 導入遺伝子がＩＬ－１２をコードする、請求項１０に記載の初代Ｔ細胞。
  12. 固形腫瘍が卵巣癌である、請求項９に記載の初代Ｔ細胞。
  13. 導入遺伝子が、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、インターフェロン－ガンマ、ＴＮＦ－α、又はＴＧＦ－βをコードする、請求項１２に記載の初代Ｔ細胞。
  14. 導入遺伝子がＩＬ－１２をコードする、請求項１３に記載の初代Ｔ細胞。
  15. ＲＤＥが、ＩＮＦｇの３’－ＵＴＲ又はＩＬ２の３’－ＵＴＲに由来する、請求項１に記載の初代Ｔ細胞。
  16. ＲＤＥが、ＩＮＦｇの３’－ＵＴＲ又はＩＬ２の３’－ＵＴＲに由来する、請求項１０に記載の初代Ｔ細胞。
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