JP2017519502A - Cd123特異的多重鎖キメラ抗原受容体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、抗原CD123に特異的な新世代のキメラ抗原受容体(CAR)(多重鎖CARと称される)に関する。このようなCARは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原CD123を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのCARを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に白血病を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。

Description

発明の分野
本発明は、抗原CD123に特異的な新世代のキメラ抗原受容体(CAR)(多重鎖CARと称される)に関する。このようなCARは、免疫細胞の特異性および反応性を、腫瘍抗原CD123を発現する悪性細胞に再指向させるためのものである。これらのCARを構成するアルファ、ベータおよびガンマポリペプチドは、最適なシグナル伝達を付与する天然受容体により近いフレキシブルなアーキテクチャを形成する膜近傍位置においてアセンブルするように設計される。本発明は、特に免疫療法に使用するための、前記多重鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクター、および表面においてそれらを発現する単離された細胞を包含する。本発明は、癌、特に急性骨髄性白血病(AML)を処置するための効率的な養子免疫療法戦略への道を開く。
発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の再指向のいずれかによって生成され得る(Park, Rosenberg et al. (2011) Treating Cancer with Genetically Engineered T Cells. Trends Biotechnol. 29(11): 550−557)。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連するウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。
T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体(CAR)の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された(Jena, Dotti et al. (2010) Redirecting T−cell specificity by introducing a tumor−specific chimeric antigen receptor. Blood. 116(7): 1035−1044)。CARは、1つ以上のシグナリングドメインに結合して一本鎖融合分子を形成するターゲティング部分からなる合成受容体である。しかしながら、このアプローチは、抗原CD19を有する悪性B細胞をターゲティングすることによって、急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者に関してのみ効果的であることがこれまでに証明されている(Porter,D.L.et al.(2011)Chimeric Antigen Receptor−Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.N.Engl.J.Med. 365:725−733)。
急性骨髄性白血病(AML)の誘導処置は、ほぼ50年間ほとんど変化しておらず、AMLは依然として、予後不良の疾患である。急性骨髄性白血病(AML)は、骨髄における未成熟骨髄細胞の急速な増殖を特徴とする疾患であり、造血機能不全をもたらす。標準的な誘導化学療法は完全寛解を誘導し得るが、最終的には多くの患者が再発して死亡することから、AMLの新規治療薬の開発が求められている。
AML細胞の免疫表現型決定における最近の進歩により、将来の治療の標的として作用し得るいくつかのAML関連細胞表面抗原が明らかにされている。インターロイキン3受容体アルファ鎖(IL−3Rα;CD123−NCBI参照:NP_001254642)は、正常な造血幹細胞と比較してAML腫瘍細胞で過剰発現されるので、免疫療法の標的候補として同定されている。加えて、CD123特異的治療薬に関する2つの第I相試験が完了し、両薬物は優れた安全性プロファイルを示した(ClinicalTrials.gov ID:NCT00401739およびNCT00397579)。
残念なことに、これらのCD123ターゲティング薬は有効性が限られており、抗白血病活性を観察するためには、別のより強力なCD123ターゲティング治療が必要であることが示唆されている。
これに関して、CARアプローチは、モノクローナル抗体(mAb)と比較していくつかの利点を提供し、より効率的な生体内分布、およびサイトカインの放出を介した免疫系との改善された相乗作用を示した。また、長期にわたる細胞性免疫応答の発生の可能性は、経時的に疾患を持続的に制御する可能性を提供し得る。
自己細胞の養子移入後にこのような治療を受けている患者では、CARアプローチで観察される欠点または副作用(例えば、高サイトカイン血症)が報告されている。
したがって、進行性CLLを有する患者では、自己CD19特異的CAR改変T細胞による大きな腫瘍塊の破壊は、腫瘍溶解症候群をもたらした。
さらに、同種T細胞の注入後には、移植片対宿主病(GVHD)の可能性がある。
したがって、宿主にとってより効率的で低毒性な新たなCD123ターゲティング治療の開発が必要である。
悪性細胞または感染細胞をターゲティングし得る治療グレードの人工免疫細胞を開発する状況において、本発明者らは、天然のものに近い改善されたCARアーキテクチャであって、任意の細胞外単一特異的または多重特異的リガンド結合ドメインを使用して作用する可能性が高い改善されたCARアーキテクチャを研究した。国際公開第2014039523号では、本発明の別個のポリペプチドサブユニットを含む新世代のCAR(多重鎖CARと称される)が記載されている。このアーキテクチャによれば、シグナリングドメインおよび共刺激ドメインは、異なるポリペプチド鎖上に配置される。このような多重鎖CARは、FcεRIアルファ鎖の高親和性IgE結合ドメインを細胞外リガンド結合ドメイン(例えば、scFv)で置換することによって、FcεRIから生成され得る一方で、FcεRIベータおよび/またはガンマ鎖のN末端および/またはC末端尾部は、それぞれシグナル伝達ドメインおよび共刺激ドメインに融合される。細胞外リガンド結合ドメインは、T細胞の特異性を細胞標的に再指向させる役割を有し、シグナル伝達ドメインは、免疫細胞応答を活性化する。FcεRI由来のアルファ、ベータおよびガンマポリペプチド由来の異なるポリペプチドが、膜近傍位置にある膜貫通ポリペプチドであるという事実は、CARに対するよりフレキシブルなアーキテクチャを提供して、標的分子に対する特異性を改善し、免疫細胞のバックグラウンド活性化を減少させる。
今回、本発明者らは、マーカーとしてCD123を有する悪性細胞をターゲティングするのに特に適切なscFv細胞外ドメイン結合CD123を有する多重鎖CARを設計した。これを達成した一方で、白血病、特にAMLを処置または予防するためにCD123陽性細胞に対して効率的に作用する抗体は、これまでにほとんど記載されていない。
国際公開第2014039523号
Park, Rosenberg et al. (2011) Treating Cancer with Genetically Engineered T Cells. Trends Biotechnol. 29(11): 550−557 Jena, Dotti et al. (2010) Redirecting T−cell specificity by introducing a tumor−specific chimeric antigen receptor. Blood. 116(7): 1035−1044 Porter,D.L.et al.(2011)Chimeric Antigen Receptor−Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia.N.Engl.J.Med. 365:725−733
本発明の目的のために、今回、本発明者らは、抗CD123多重鎖CARを発現するT細胞を提供した。これらの新たな抗CD123 CARの設計およびアーキテクチャによって、ならびに本人工免疫細胞の特性によって、人工免疫細胞の作用および活性の動態は、逃れることができる腫瘍細胞がほとんどなく、長期効果が観察され、GVHDおよび副作用が軽減される(毒性効果がより少ない)ほど予期外に改変されている。
これらの独自のCARは、CD123陽性T細胞(特に、AML中に発生する悪性CD123陽性細胞)に特異的に結合してその生存に影響を与え、これらの悪性細胞の生存可能性を選択的に変化させ、サイトカイン放出を含む毒性副作用をほとんど示さないと予想される。
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語はすべて、遺伝子治療、生化学、遺伝学および分子生物学の領域の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。国際特許出願第PCT/EP2015/055848号の文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
適切な方法および材料が本明細書およびPCT/EP2015/055848に記載されるが、本明細書に記載されるものに類似しているかまたは等価であるすべての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。
本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の従来の技術を利用するであろう。このような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984);Mullis et al.米国特許第4,683,195号;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984);Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.−in−chief,Academic Press,Inc.,New York),specifically,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)and Vol.185,“Gene Expression Technology”(D.Goeddel,ed.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986);およびManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照のこと。
特に、本発明は、
−細胞外CD123リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
本発明は、
−シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチドをさらに含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
本発明は、
−共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチドをさらに含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖に融合された前記CD123リガンド結合ドメインが、CD123に対する特異性を付与する重鎖(V)および軽鎖(V)を含む一本鎖可変断片(scFv)である上記のいずれか1つのCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記Vが、配列番号:13、15、17、19、21および23から選択される1つと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記Vが、配列番号:14、16、18、20、22および24から選択される1つと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチドを含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖が、CD8α、IgG1またはFcRIIIαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記ヒンジが、配列番号:2と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含む上記のいずれか1つのCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号:10と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記第2または第3のポリペプチドが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7−H3、CD83に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記共刺激ドメインが4−1BBに由来し、配列番号:6と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記共刺激ドメインがCD28に由来し、配列番号:7と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表6において抗CD123 7G3、抗CD123 Old4、抗CD123 26292、抗CD123 32716、抗CD123 Klon43、抗CD123 12F1と称される全長アミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
本発明は、上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)前記細胞の表面において、少なくとも1つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法を提供する。
本発明は、
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)少なくとも1つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること;
(c)前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
本発明はまた、以下の工程:
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
本発明は、
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること;
(c)前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む上記免疫細胞操作方法を提供する。
本発明は、上記方法から得られる単離された免疫細胞を提供する。
本発明は、少なくとも1つの上記多重鎖キメラ抗原受容体を含む単離された免疫細胞を提供する。
本発明は、NK細胞、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球に由来する上記単離された細胞を提供する。
本発明は、医薬として使用するための上記単離された免疫細胞を提供する。
本発明はさらに、それを必要とする患者を処置するための方法であって、
a)上記方法によって得られる免疫細胞を提供すること;
b)前記T細胞を前記患者に投与すること
を含む方法を提供する。
本発明は、前記免疫細胞が、ドナーまたは患者から回収されるものである上記患者処置方法を提供する。
本発明の多重鎖CARアーキテクチャが由来する天然FcεRIの概略図。 本発明のCD123多重鎖CARをコードするポリシストロン性構築物の一般構造。 本発明のCD123特異的多重鎖CARの異なるアーキテクチャ。左から右へ:(CD3ゼータのITAMに融合された)ポリペプチドガンマ、(ScFvに融合された)ポリペプチドアルファ、(CD28または41BBのいずれか由来の共刺激ドメインに融合された)ポリペプチドベータ。AおよびB:ポリペプチドベータは、41BB由来の共刺激ドメインに融合されており、VLおよびVH断片は逆の順序である。CおよびD:ポリペプチドベータは、CD28由来の共刺激ドメインに融合されており、VLおよびVH断片は逆の順序である。 図3Cおよび図4では、VLおよびVH断片は、図3Dの構成と比較して逆の順序である。図3Cおよび図4では、細胞外CD123リガンド結合ドメインのVL断片は、高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチドに、より正確には、CD8断片と、高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖の断片とを含むペプチドに融合されている。 アルファ断片が、CD8断片を含むポリペプチドとVH断片とに連結されたVL断片を含み、ベータ鎖が、ベータ鎖のC末端に位置する共刺激ドメインを含み、前記共刺激ドメインが41BB(mc123−41BB)またはCD28(mc123−CD28)に由来する本発明のCD123特異的多重鎖CARの2つのアーキテクチャ(mc123−41BBおよびmc123−CD28)。 MOI 5で形質導入した8日後に評価したmcCAR mc123−CD28の発現レベル。ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインがマウスIgG1由来Fc断片に融合されたものを含有する組換え融合タンパク質を使用して、CAR検出を実施した。PE結合抗Fc抗体を使用してCAR/CD123−Fc複合体を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。NTDは、非形質導入細胞を表す。 MOI 5で形質導入した8日後に評価したmcCAR mc123−41BBの発現レベル。ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインがマウスIgG1由来Fc断片に融合されたものを含有する組換え融合タンパク質を使用して、CAR検出を実施した。PE結合抗Fc抗体を使用してCAR/CD123−Fc複合体を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。NTDは、非形質導入細胞を表す。 異なるレベルのCD123を発現する細胞(KG1a<MOLM13<RPMI8226)と共に、またはCD123を発現しない細胞(ダウディ)と共に6時間共培養した場合の、一本鎖(sc)CARおよびmcCARを発現するT細胞の脱顆粒活性。共培養と同じ条件で単独で培養したT細胞、および陽性コントロール(PMA/イオノマイシンで活性化した細胞)の脱顆粒活性も示されている;フローサイトメトリーによって、(CD8+細胞の中の)CD107a+細胞の%を測定することによって、脱顆粒活性を決定した。少なくとも3つの別個のドナーにおいて、実験を行った。 mcCAR−T細胞の特異的細胞溶解活性。T細胞を、ダウディ+KG1a、ダウディ+MOLM13またはダウディ+RPMI−8226細胞と共に4時間共培養した。共培養の終了時に各細胞株の細胞生存率を決定し、各条件について、特異的細胞溶解率を計算した。得られた結果は、CD123をターゲティングする両mcCARがT細胞で発現され、CD123+標的細胞に対して同程度の活性を有することを示している。
CD123多重鎖CAR
本発明は、
−細胞外CD123リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
本発明は、
−シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチドをさらに含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
本発明は、
−共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチドを含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CARまたは抗CD123 mc CAR)は、CD123に特異的に結合する多重鎖キメラ抗原受容体を意味し、好ましくは、CD123特異的多重鎖キメラ抗原は、CD123に特異的に結合し、CD123発現細胞、特にCD123発現癌細胞の生存に影響を与える多重鎖キメラ抗原受容体を意味する。
好ましい実施形態では、本発明は、
−細胞外CD123リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチド;および
−共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチド
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)を提供する。
一実施形態では、本発明は、
細胞外CD123リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチド;および
−共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチド
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)であって、
モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:26)、RSKADGYTT(配列番号:27)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:28)およびQNVDSA(配列番号:29)、SAS(配列番号:30)、QQYYSTPWT(配列番号:31)
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
一実施形態では、本発明は、
−細胞外CD123リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の第1の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチド;および
−共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチド
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)であって、
モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む前記細胞外リガンド結合ドメインが、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:44)、RSKADGYTT(配列番号:45)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:46)およびQNVDSA(配列番号:47)、SAS(配列番号:48)、QQYYSTPWT(配列番号:49)、ならびにVHとVLとの間のヒンジ(アルファ鎖)を含み、
−前記シグナル伝達ドメイン(または細胞質膜貫通ドメイン)が、CD3ゼータシグナリングドメイン(ガンマ鎖)を含み、
−前記共刺激ドメインが、4−1BBまたはCD28由来の共刺激膜貫通ドメイン(ベータ鎖)を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)を提供する。
さらにより好ましい実施形態では、本発明は、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む上記実施形態のいずれかのCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)、または以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
この実施形態では、本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6と少なくとも90%の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7と少なくとも90%の同一性を有するCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)を提供する。
本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6と少なくとも95%の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7と少なくとも95%の同一性を有するCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)を提供する。
本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6と少なくとも98%の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7と少なくとも98%の同一性を有するCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)を提供する。
本発明は、ポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6と少なくとも99%の同一性を有するか、またはポリペプチド配列が以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7と少なくとも99%の同一性を有するCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)を提供する。
すべての上記実施形態では、前記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(CD123 mc CAR)は、CD123発現細胞に結合し、および/または前記CD123発現癌細胞の生存に影響を与える特性を継続的または一時的に保持する。
本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖に融合された前記CD123リガンド結合ドメインが、CD123に対する特異性を付与する好ましくは抗体「Klon43」由来の重鎖(V)および軽鎖(V)を含む一本鎖可変断片(scFv)である上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖に融合された前記CD123リガンド結合ドメインが、CD123に対する特異性を付与する重鎖(V)および軽鎖(V)を含む抗体「Klon43」由来の(またはそれと少なくとも90%〜99%の同一性を有する)一本鎖可変断片(scFv)であるか、またはヒトCD123に対する特異性を付与する重鎖(V)および軽鎖(V)を含むヒト化「Klon43」抗体に由来する上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
より好ましい実施形態では、本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖に融合された前記CD123リガンド結合ドメインが、配列番号:21および配列番号:22と90%〜100%の同一性を有する抗体「Klon43」由来の一本鎖可変断片(scFv)である上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記Vが、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21および配列番号:23から選択されるポリペプチド配列の1つと少なくとも100%〜少なくとも90%の同一性を有するポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記Vが、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22および配列番号:24から選択されるポリペプチド配列の1つと少なくとも100%〜少なくとも90%の同一性を有するポリペプチドを含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖が、CD8α、IgG1またはFcRIIIαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記ヒンジが、配列番号:2と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。好ましい一実施形態では、前記ヒンジは、配列番号:2のポリペプチドを含む。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含む上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインがTCRゼータ鎖に由来する上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインがFCεRβ鎖に由来する上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインがFcεRIγ鎖に由来する上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含む上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供し、好ましくは、本発明は、前記シグナル伝達ドメインが、配列番号:10と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。一実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、配列番号:10のポリペプチド配列を含む。
本発明は、前記第2または第3のポリペプチドが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7−H3、CD83に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、前記第2または第3のポリペプチドが、CD28由来の共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、前記第2または第3のポリペプチドが、4−1BB由来の共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
本発明は、前記共刺激ドメインが4−1BBに由来し、配列番号:6と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。一実施形態では、前記共刺激ドメインは4−1BBに由来し、配列番号:6のポリペプチド配列を含む。
本発明は、前記共刺激ドメインがCD28に由来し、配列番号:7と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。一実施形態では、前記共刺激ドメインはCD28に由来し、配列番号:7を有するポリペプチド配列を含む。
本発明は、上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表6において抗CD123 7G3、抗CD123 Old4、抗CD123 26292、抗CD123 32716、抗CD123 Klon43、抗CD123 12F1と称される全長アミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示されるCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、抗CD123 Klon43 VHおよびVLの全長アミノ酸配列と少なくとも80%の同一性、好ましくは配列番号:21および配列番号:22と少なくとも80%の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
より好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示されるCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、抗CD123 Klon43 VHおよびVLの全長アミノ酸配列と少なくとも90%の同一性、好ましくは配列番号:21および配列番号:22と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
別のより好ましい実施形態では、本発明は、上記に開示されるCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、抗CD123 Klon43 VHおよびVLの全長アミノ酸配列、好ましくは配列番号:21および配列番号:22と100%の同一性を示すポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。
本発明は、好ましくは、
−CD123に対する特異性を付与する重鎖(V)および軽鎖(V)を含む一本鎖可変断片(scFv)を含むCD123に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の第1の膜貫通ポリペプチド、
−シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチド;および
−共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチド
を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
一実施形態では、モノクローナル抗CD123抗体由来のVHおよびVLを含む前記細胞外リガンド結合ドメインは、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:26)、RSKADGYTT(配列番号:27)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:28)およびQNVDSA(配列番号:29)、SAS(配列番号:30)、QQYYSTPWT(配列番号:31)を含む。
より好ましい実施形態では、本発明は、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:44)、RSKADGYTT(配列番号:45)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:46)およびQNVDSA(配列番号:47)、SAS(配列番号:48)、QQYYSTPWT(配列番号:49)を含み、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6、または以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7をさらに含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)を提供する。
本発明は、FcεRIの前記アルファ鎖が、CD8α、IgG1またはFcRIIIαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されており、好ましくは、前記ヒンジが配列番号:2のポリペプチドを含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含み、好ましくは、前記シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来し、より好ましくは、配列番号:10のポリペプチド配列を含む上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、前記第2または第3の膜貫通ポリペプチドが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7−H3、CD83に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
本発明は、前記第2または第3の膜貫通ポリペプチドが、CD28および/4−1BBから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む上記実施形態のいずれかに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体に関する。
有利には、本発明は、前記共刺激ドメインが4−1BBに由来し、配列番号:6のポリペプチドを含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明はまた、前記共刺激ドメインがCD28に由来し、配列番号:7のポリペプチド配列を含む上記CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を提供する。
本発明は、上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするか、または以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするか、または以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするベクターを提供する。
上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を持つ免疫細胞を操作する方法であって、以下の工程:
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)前記細胞の表面において、少なくとも1つの上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法は、本発明の一部である。
一実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を持つ免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)上記のいずれか1つに記載のCD123多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードし;好ましくは、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6をコードするか、または以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること;
(c)前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
を含む方法を提供する。
好ましい実施形態では、前記免疫細胞操作方法は、
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
を含む。
好ましい実施形態では、前記免疫細胞操作方法は、
(a)免疫細胞を提供すること;
(b)各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む上記実施形態のいずれか1つに記載のCD123多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること;
(c)前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
をさらに含む。
したがって、本発明は、上記実施形態のいずれか1つに記載の方法から得られる単離された免疫細胞、好ましくは、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含むCD123多重鎖キメラ抗原受容体を発現する単離された免疫細胞、または以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含むCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体を発現する単離された免疫細胞を提供する。
細胞
本発明は、単離された細胞を提供し、前記単離された細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択され、好ましくは、前記単離された細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)をさらに含む。
本発明は、単離された細胞を提供し、前記単離された細胞は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球からなる群より選択され、好ましくは、前記単離された細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)をさらに含む単離された細胞を提供する。
好ましい実施形態では、本発明で提供される前記単離された細胞は、単離された免疫T細胞であり、前記単離された免疫T細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を発現する。
別の好ましい実施形態では、前記単離された免疫細胞は、単離された免疫T細胞であり、前記単離された免疫T細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を発現する。
一実施形態では、前記単離された免疫細胞はさらに操作され、本発明の少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む単離された人工初代免疫細胞である。
好ましい実施形態では、前記単離された人工初代免疫細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む。
別の好ましい実施形態では、前記単離された人工初代免疫細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む。
医薬組成物
一態様では、本発明は、上記のように医薬組成物を提供する。
本発明は、少なくとも1つの薬学的に許容され得るビヒクルと、少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を持つ少なくとも1つの初代細胞とを含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、前記医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容され得るビヒクルと、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を持つ少なくとも1つの初代細胞とを含む。
一実施形態では、前記医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容され得るビヒクルと、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を持つ少なくとも1つの初代細胞とを含む。
医薬
本発明は、医薬として使用するための上記実施形態に記載の単離された免疫細胞、好ましくは、医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、本発明のCD123 mc CARを持つ単離された免疫T細胞を提供する。
有利には、医薬として使用するための前記単離された免疫T細胞は、上記実施形態に記載の少なくとも1つのCD123 mc CARを含む。より有利には、本出願は、医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを含む単離された免疫T細胞、または医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを含む単離された免疫T細胞を提供する。
さらにより有利には、本出願は、医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを含む単離された免疫T細胞、または医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを含む単離された免疫T細胞を提供する。
治療適応症
本発明の抗CD123多重鎖CARを含むT細胞は、CD123発現細胞、特に過剰なCD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性癌症状と診断された患者において、処置として提供される。このような症状は、血液学的癌、例えば白血病、リンパ性悪性腫瘍または悪性リンパ増殖性障害、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに黒色腫で見られる。
本出願は、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫の処置のためのT細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む抗CD123多重鎖CARを含むT細胞を提供する。
したがって、本出願は、癌腫、芽細胞腫および肉腫ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫の処置のためのT細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む抗CD123多重鎖CARを含むT細胞を提供する。
好ましい実施形態では、本出願は、白血病またはリンパ性悪性腫瘍の処置のためのT細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む抗CD123多重鎖CARを含むT細胞を提供する。
好ましい実施形態では、本出願は、白血病またはリンパ性悪性腫瘍の処置のためのT細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む抗CD123多重鎖CARを含むT細胞を提供する。
本発明は、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群の処置に使用するためのT細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6、または配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7のいずれかを含む抗CD123多重鎖CARを含むT細胞を提供する。
一実施形態では、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6、または配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7のいずれかを含む抗CD123多重鎖CARを含むT細胞は、急性骨髄性白血病(AML)の処置のために提供される。
一実施形態では、本出願は、難治性/再発性AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された免疫T細胞または難治性/再発性AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫T細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された免疫T細胞を提供する。
本発明は、AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫NK細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された免疫NK細胞またはAMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された免疫NK細胞であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された免疫NK細胞を提供する。
本発明は、AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された炎症性Tリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された炎症性Tリンパ球またはAMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された炎症性Tリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された炎症性Tリンパ球を提供する。
本発明は、AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための細胞傷害性Tリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ細胞傷害性Tリンパ球、またはAMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された細胞傷害性Tリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された細胞傷害性Tリンパ球を提供する。
本発明は、AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための調節性Tリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ調節性Tリンパ球、またはAMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離された調節性Tリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離された調節性Tリンパ球を提供する。
本発明は、AMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するためのヘルパーTリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つヘルパーTリンパ球またはAMLを予防もしくは処置するための医薬として使用するための単離されたヘルパーTリンパ球であって、以下のペプチド配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つのCD123 mc CARを持つ単離されたヘルパーTリンパ球を提供する。
別の態様では、本発明は、医薬として使用するための上記医薬組成物を提供する。
好ましい態様では、本発明は、病理学的症状、例えば癌、特に造血細胞の癌、より具体的にはAMLまたはMMの予防または処置のための医薬として使用するための医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態では、前記病理学的症状は、難治性/再発性AMLである。
AMLを予防または処置するための医薬として使用するための本発明の医薬組成物は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6、または配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む抗CD123多重鎖CARを含む人工初代免疫細胞、好ましくは初代免疫T細胞と、少なくとも1つの薬学的に許容され得るビヒクルとを含む。
好ましくは、本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、
a)上記実施形態のいずれか1つに記載の方法によって得られる単離された免疫T細胞を提供すること;
b)前記T細胞を前記患者に投与すること
を含み、
前記患者が、AML、MM、ALL CLLから選択される癌、好ましくはAML、より好ましくは難治性/再発性AMLを患っている方法を提供する。
本発明は、前記免疫細胞が、ドナーから回収されるものである上記患者処置方法を提供する。
本発明は、前記免疫細胞が、患者、好ましくは患者自体、前記方法によって処置すべき患者から回収されるものである上記患者処置方法を提供する。
多重鎖キメラ抗原受容体(CAR)
本発明は、免疫療法において使用される免疫細胞に特に適合された多重鎖キメラ抗原受容体(CAR)に関する。
一般に、本発明の多重鎖CARは、少なくとも:
−少なくとも1つの細胞外リガンド結合ドメインを含む1つの膜貫通ポリペプチド;および
−少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含む1つの膜貫通ポリペプチド
を、前記ポリペプチドが共にアセンブルして多重鎖キメラ抗原受容体を形成するように含む。
本明細書で使用される場合、「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。より好ましくは、前記ドメインは、CD123細胞表面分子と相互作用することができるであろう。
本発明は、図2、図3または図4に示されているならびに請求項1、2および/または3に記載の構造を有する抗CD123多重鎖キメラ抗原受容体(CAR)(123 mcCAR抗CD123 mc)であって、前記構造が、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:26)、RSKADGYTT(配列番号:27)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:28)およびQNVDSA(配列番号:29)、SAS(配列番号:30)、QQYYSTPWT(配列番号:31)、ならびにVHとVLとの間のヒンジ(アルファ鎖)
を含むモノクローナル抗CD123抗体由来の細胞外リガンド結合ドメインVHおよびVLを含み、
−前記構造が、
−CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞質膜貫通ドメイン(ガンマ鎖)および
−4−1BBまたはCD28由来の共刺激膜貫通ドメイン(ベータ鎖)
をさらに含む抗CD123多重鎖キメラ抗原受容体(CAR)(123 mcCAR抗CD123 mc)を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む抗CD123多重鎖(CAR)を提供する。
別では、本発明は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む抗CD123多重鎖(CAR)を提供する。
より好ましい実施形態では、前記抗CD123 CARは、これらの配列を用いて構築され、図4に示されている構成に対応する。
好ましい実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、CD123に特異的な標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽(V)および重(V)可変断片がフレキシブルリンカーによって連結されたものを含む一本鎖抗体断片(scFv)である。好ましい実施形態では、前記scFvは、好ましくは表5において配列番号:13〜24、より好ましくは配列番号:21および22として提供される抗CD123 scFVである。scFv以外のCD123特異的結合ドメイン、例えば非限定的な例として、ラクダ科動物もしくはサメ類(VNAR)単一ドメイン抗体断片、または受容体リガンド、例えば血管内皮成長因子ポリペプチド、インテグリン結合ペプチド、ヘレグリンもしくはIL−13突然変異タンパク質、抗体結合ドメイン、抗体超可変ループもしくはCDRもまた、リンパ球の所定のターゲティングに使用され得る。
好ましい実施形態では、前記第1の膜貫通ポリペプチドは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にストーク領域をさらに含む。本明細書で使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインにさらなる可動性および接近性を与えるために用いられる。ストーク領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは25〜50個のアミノ酸を含み得る。ストーク領域は、天然分子のすべてもしくは一部、例えば、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は天然ストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。好ましい実施形態では、前記ストーク領域は、ヒトCD8アルファ鎖の一部である(例えばNP_001139345.1)(配列番号:2)。
したがって、免疫細胞における多重鎖CARの発現は、限定されないが、各腫瘍関連表面抗原を有する悪性細胞、またはウイルス特異的表面抗原を有するウイルス感染細胞、または系統特異的もしくは組織特異的表面抗原を有する標的細胞を含む所定の標的を選択的に排除する改変細胞をもたらす。
標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異は、一般に、癌細胞において観察され、抗原喪失エスケープ変異体を作成する。したがって、腫瘍エスケープをオフセットし、免疫細胞をより標的特異的にするために、多重鎖CARは、いくつかの細胞外リガンド結合ドメインを含み得、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強する。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上にタンデムに配置され得、場合により、リンカーによって分離され得る。別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、多重鎖CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に配置され得る。別の実施形態では、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を発現させることを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を提供すること、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む方法に関する。特定の実施形態では、免疫細胞操作方法は、細胞の表面において、シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIベータおよび/またはガンマ鎖の少なくとも一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合されたFcεRIアルファ鎖の複数の部分とを発現させることを含む。より具体的な実施形態では、前記方法は、シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIベータおよび/またはガンマ鎖の一部と、異なる細胞外リガンド結合ドメインに融合された複数のFcεRIアルファ鎖とをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含む。多重鎖CARの集団は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたはそれ以上の多重鎖CARを意味する。本発明の異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的中の異なる要素に同時に結合し、それにより、免疫細胞の活性化および機能を増強し得る。
細胞
本発明はまた、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を含む単離された免疫細胞に関する。
本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すれば、シグナル伝達ドメインは、多重鎖CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指令するタンパク質の部分を指す。
多重鎖CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するFc受容体またはT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の任意の誘導体または変異体および合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナリング配列の2つの別個のクラス(抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの)を含む。一次細胞質シグナリング配列は、ITAMの免疫受容活性化チロシンモチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含み得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内尾部に見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例としては、非限定的な例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、FcRイプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79bおよびCD66dに由来するものが挙げられ得る。好ましい実施形態では、多重鎖CARのシグナル伝達ドメインは、CD3ゼータシグナリングドメイン、またはFcεRIベータもしくはガンマ鎖の細胞質内ドメインを含み得る。
特定の実施形態では、本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。
「共刺激リガンド」は、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、限定されないが、CD7、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、PD−L1、PD−L2、4−1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS−L)、細胞間接着分子(ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7−H3に特異的に結合するリガンドが挙げられ得る。共刺激リガンドはまた、とりわけ、限定されないが、CD27、CD28、4−IBB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7−H3、CD83と特異的に結合するリガンドなどの、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体を包含する。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、これに限定されないが、増殖などの、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定されないが、MHCクラスI分子、BTLAおよびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、CD27、CD28、CD8、4−1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
別の特定の実施形態では、前記シグナル伝達ドメインは、TNFR関連因子2(TRAF2)結合モチーフ(共刺激TNFRメンバーファミリーの細胞質内尾部)である。共刺激TNFRファミリーメンバーの細胞質尾部は、主要な保存的モチーフ(P/S/A)X(Q/E)E)またはマイナーモチーフ(PXQXXD)(式中、Xは、任意のアミノ酸である)からなるTRAF2結合モチーフを含有する。TRAFタンパク質は、受容体の三量化に応じて、多くのTNFRの細胞内尾部に動員される。
好ましい実施形態では、本発明の多重鎖CARのシグナル伝達ドメインは、4−1BB(GenBank:AAA53133)およびCD28(NP_006130.1)からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。
適切な膜貫通ポリペプチドの顕著な特徴は、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞の表面において発現され、所定の標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指令するために一緒に相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメインおよび/またはシグナル伝達ドメインを含む本発明の多重鎖CARの異なる膜貫通ポリペプチドは、一緒に相互作用して、標的リガンドとの結合後のシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然起源に由来し得るか、または合成起源に由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくはδなどのT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体のp55(α鎖)、p75(β鎖)、もしくはγ鎖、Fc受容体、特に、Fcγ受容体IIIのサブユニット鎖またはCDタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。
「由来する」という用語は、Fcε受容体の配列の1つ以上のアミノ酸改変を含むFcε受容体のものと等価であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。このようなアミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失、付加またはそれらの改変の任意の組み合わせを含み得、Fc受容体のものと比べてFc結合領域の生物学的活性を変化させ得る。一方、特定のFc受容体由来のFc結合領域は、Fc受容体のものと比べてFc結合領域の生物学的活性を実質的に変化させない1つ以上のアミノ酸改変を含み得る。この種のアミノ酸改変は、典型的には、保存的アミノ酸置換を含むであろう。
特定の実施形態では、多重鎖CARは、FcεRI鎖由来の膜貫通ポリペプチドを含む。より具体的な実施形態では、FcεRI鎖は、細胞外ドメインが細胞外リガンド結合ドメイン、好ましくはCD123に対するscFVで置換されたFcεRIα鎖である。
より具体的な実施形態では、前記多重鎖CARは、FcεRIアルファ鎖の一部およびFcεRIベータ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記FcεRI鎖が一緒に自発的に二量体化して二量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原は、FcεRIアルファ鎖の一部およびFcεRIガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記FcεRI鎖が一緒に自発的に三量体化して三量体キメラ抗原受容体を形成するように含み、別の実施形態では、多重鎖キメラ抗原受容体は、FcεRIアルファ鎖の一部およびFcεRIベータ鎖の一部およびFcεRIガンマ鎖の一部またはそれらの変異体を、前記FcεRI鎖が一緒に自発的に四量体化して四量体キメラ抗原受容体を形成するように含み得る。
非限定的な例として、様々なバージョン(アーキテクチャ)の多重鎖CARが図3に示されている。好ましい実施形態では、2つのバージョン(アーキテクチャ)の多重鎖CARが図4に示されている。より好ましい実施形態では、本発明の多重鎖CARは、表6に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態では、多重鎖CARは、このようなアミノ酸配列と、または多重鎖ポリペプチド構造を構成するポリペプチドの1つ、2つもしくは3つをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
より好ましい実施形態では、本発明は、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:26)、RSKADGYTT(配列番号:27)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:28)およびQNVDSA(配列番号:29)、SAS(配列番号:30)、QQYYSTPWT(配列番号:31)、ならびにVHとVLとの間のヒンジ(アルファ鎖)を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む本発明の多重鎖抗CD123 CARを持つ細胞であって、
前記多重鎖抗CD123 CARが、
−CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞質膜貫通ドメイン(ガンマ鎖)および
−4−1BBまたはCD28由来の共刺激膜貫通ドメイン(ベータ鎖)
をさらに含む細胞を提供する。
より好ましい実施形態では、本発明は、以下の配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6、または以下の配列:配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む本発明の多重鎖抗CD123 CARを持つ細胞を提供する。
「同一性」は、2つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のためにアライメントされ得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有する位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ(University of Wisconsin,Madison,Wis.)の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび/またはプログラムが、2つの配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載される特定のポリペプチドとの少なくとも70%、85%、90%、95%、98%または99%の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示す;BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の任意の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、従来の手段によって、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって入手され得る。
ポリヌクレオチド、ベクター
本発明はまた、本発明の上記多重鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。本発明は、多重鎖CARに含まれ得る本明細書に開示される膜貫通ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAおよびRNA分子を含む)を提供する。特に、本発明は、上記多重鎖CARを構成する少なくとも1つの膜貫通ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、上記多重鎖CARを構成する膜貫通ポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドに関する。
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのウイルスベクター、例えばバキュロウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのプラスミドもしくはウイルスベクター、例えばレンチウイルス)中に存在し得る。
特定の実施形態では、異なる核酸配列は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば2Aペプチドをコードする配列を含む1つのポリヌクレオチドまたはベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされる2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす(Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013−1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13−21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227−4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803−810 (2007)を参照のこと)。「コドン」は、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA(またはDNA分子のセンス鎖)上の3ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、2Aペプチドは、多重鎖CARの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。
FcεRなどの膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指向させるために、(リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても公知の)分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、FCεRのものであり得るか、または別の分泌タンパク質(例えば、t−PA)に由来し得るか、またはデノボ合成され得る。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。すなわち、2つの配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路に指向されるよう配置される。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の5’に配置されるが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置され得る(例えば、Welch et al.,米国特許第5,037,743号;Holland et al.,米国特許第5,143,830号を参照のこと)。好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、FcεRIアルファ鎖(NP_001992.1)の残基1〜25を含み、配列番号:5のアミノ酸配列を有する。
当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所定の種の高発現遺伝子において一般に稀であるコドンを、このような種の高発現遺伝子において一般に高頻度であるコドンへ交換することを指し、このようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。
本発明はまた、本発明の抗CD123多重鎖CARをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。
好ましい実施形態では、本発明の抗CD123多重鎖CARをコードする前記ポリヌクレオチド、ベクターは、以下のCDR配列:
GFTFTDYY(配列番号:26)、RSKADGYTT(配列番号:27)、ARDAAYYSYYSPEGAMDY(配列番号:28)およびQNVDSA(配列番号:29)、SAS(配列番号:30)、QQYYSTPWT(配列番号:31)、ならびにVHとVLとの間のヒンジ(アルファ鎖)
−CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞質膜貫通ドメイン(ガンマ鎖)および
−4−1BBまたはCD28由来の共刺激膜貫通ドメイン(ベータ鎖)
を含む抗CD123多重鎖CARをコードする。
本発明は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む抗CD123多重鎖(CAR)をコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む抗CD123多重鎖(CAR)をコードするポリヌクレオチド、ベクターを提供する。
免疫細胞を操作する方法
包含される特定の実施形態では、本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、前記多重鎖CARを構成するポリペプチドを前記免疫細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、細胞を提供すること、および前記細胞の表面において、少なくとも1つの上記多重鎖CARを発現させることを含む方法に関する。特定の実施形態では、前記方法は、少なくとも1つの上記多重鎖CARを構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで細胞を形質転換すること、および前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させることを含む。
別の実施形態では、本発明は、免疫療法のための細胞を調製する方法であって、前記多重鎖CARを構成する異なるポリペプチドを前記細胞に導入すること、および前記細胞を増大させることを含む方法に関する。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、細胞において安定に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含められる。
本発明は、免疫療法のための初代免疫細胞を調製する方法であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む前記抗CD123多重鎖(CAR)を構成するポリペプチドを前記初代免疫細胞に導入することを含む方法に関する。
別の実施形態では、本発明は、免疫療法のための初代免疫細胞を調製する方法であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む前記抗CD123多重鎖(CAR)を構成するポリペプチドを前記免疫細胞に導入することを含む方法を提供する。
送達方法
上記様々な方法は、場合によりDNA末端処理酵素または外因性核酸と共に、多重鎖CAR、pTアルファまたはその機能的変異体、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、TALEヌクレアーゼ、CARを細胞に導入することを含む。
非限定的な例として、前記多重鎖CARは、1つまたは異なるプラスミド性ベクターによってコードされる導入遺伝子として導入され得る。異なる導入遺伝子は、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列、例えば2Aペプチドをコードする配列を含む1つのベクターに含められ得る。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされる2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす(Donnelly et al.,J.of General Virology 82:1013−1025(2001);Donnelly et al.,J.of Gen.Virology 78:13−21(1997);Doronina et al.,Mol.And.Cell.Biology 28(13):4227−4239(2008);Atkins et al.,RNA 13:803−810(2007)を参照のこと)。「コドン」は、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA(またはDNA分子のセンス鎖)上の3ヌクレオチドを意味する。したがって、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。このようなリボソームスキップ機序は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされる数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。非限定的な例として、本発明では、2Aペプチドは、低頻度切断エンドヌクレアーゼおよびDNA末端処理酵素または多重鎖CARの異なるポリペプチドを細胞に発現させるために使用した。
前記プラスミドベクターはまた、前記ベクターを受容した細胞の同定および/または選択を提供する選択マーカーを含有し得る。
ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で生産され、次いで、細胞に導入され得る。ポリヌクレオチド構築物を動物細胞に導入する方法は、当技術分野で公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、微量注入、エレクトロポレーションまたは微粒子銃が挙げられる。前記ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含められ得る。
−エレクトロポレーション
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションによって細胞に直接導入されるmRNAであり得る。本発明者らは、T細胞におけるmRNAエレクトロポレーションの最適条件を決定した。
本発明者は、パルス電場を用いることで、材料を細胞に送達するために生細胞を一過的に透過処理するのを可能にするcytoPulse技術を使用した。この技術は、PulseAgile(Cellectis property)エレクトロポレーション波形の使用に基づいており、パルス持続時間、強度、ならびにパルス間の間隔の正確な制御を与える(米国特許第6,010,613号および国際公開第2004083379号)。高いトランスフェクション効率と最低限の死のための最高条件に達するために、これらのパラメータはすべて変更することができる。基本的には、最初の高電場パルスによって孔が形成するのに対して、その後の低電場パルスによってポリヌクレオチドは細胞内に移動する。本発明の一態様では、本発明者は、T細胞におけるmRNAの>95%トランスフェクション効率の達成につながった工程、およびT細胞において様々な種類のタンパク質を一過的に発現させるためのエレクトロポレーションプロトコールの使用について説明する。特に、本発明は、T細胞を形質転換する方法であって、前記T細胞をRNAと接触させること、ならびに
(a)電圧範囲が2250〜3000V/センチメートルであり、パルス幅が0.1msであり、工程(a)の電気パルスと(b)の電気パルスとの間のパルス間隔が0.2〜10msである、1回の電気パルス、
(b)電圧範囲が2250〜3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程(b)の電気パルスと工程(c)の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス;および
(c)電圧が325Vであり、パルス幅が0.2msであり、4回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に適用することを含む方法に関する。
特定の実施形態では、T細胞を形質転換する方法は、前記T細胞をRNAと接触させること、ならびに
(a)電圧が2250V、2300V、2350V、2400V、2450V、2500V、2550V、2400V、2450V、2500V、2600V、2700V、2800V、2900V、または3000V/センチメートルであり、パルス幅が0.1msであり、工程(a)の電気パルスと(b)の電気パルスとの間のパルス間隔が0.2ms、0.5ms、1ms、2ms、3ms、4ms、5ms、6ms、7ms、8ms、9ms、または10msである、1回の電気パルス、
(b)電圧範囲が2250V、2250V、2300V、2350V、2400V、2450V、2500V、2550V、2400V、2450V、2500V、2600V、2700V、2800V、2900V、または3000Vであり、パルス幅が100msであり、工程(b)の電気パルスと工程(c)の最初の電気パルスとの間のパルス間隔が100msである、1回の電気パルス、および
(c)電圧が325Vであり、パルス幅が0.2msであり、4回それぞれの電気パルス間のパルス間隔が2msである、4回の電気パルス
からなる素早いパルスシーケンスをT細胞に適用することを含む。
上記値域に含まれる任意の値が、本出願において開示される。エレクトロポレーション培地は、当技術分野で公知の任意の適切な培地であり得る。好ましくは、エレクトロポレーション培地は、0.01〜1.0ミリシーメンスの範囲の伝導率を有する。
特定の実施形態では、非限定的な例として、前記RNAは、低頻度切断エンドヌクレアーゼ、低頻度切断エンドヌクレアーゼの1つのモノマー、例えば半TALEヌクレアーゼ、キメラ抗原受容体、多重鎖キメラ抗原受容体の少なくとも1つの成分、pTアルファまたはその機能的変異体、外因性核酸、1つさらなる触媒ドメインをコードする。
人工T細胞
本発明はまた、前記細胞操作方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離された細胞は、少なくとも1つの上記多重鎖CARを含む。別の実施形態では、前記単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む多重鎖CARの集団を含む。特に、前記単離された細胞は、少なくとも1つの多重鎖CARを構成するポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。
以前に記載されている方法のいずれか1つによって得られる単離された免疫細胞、好ましくはT細胞も、本発明の範囲内に包含される。
前記免疫細胞は、自然免疫応答および/または適応免疫応答の開始および/または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。本発明の前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、CD34+細胞である。
好ましい実施形態では、前記単離された細胞は、単離された幹CD34+細胞であり、前記単離された幹CD34+細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む。
別の好ましい実施形態では、前記単離された細胞は、単離された幹CD34+細胞であり、前記単離された幹CD34+細胞は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む。
前記単離された細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。
本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して被験体から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から得られ得る。本発明の特定の実施形態では、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。以前に記載されている方法による形質転換T細胞から得られる細胞株も、本発明の範囲内に包含される。免疫抑制処置に対して耐性であり、以前の方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。前述のように、このような細胞はまた、例えば、CD52、GR、TCRアルファ、TCRベータ、HLA遺伝子、免疫チェックポイント遺伝子、例えばPD1およびCTLA−4からなる群より選択される1つもしくは複数の遺伝子を不活性化するように遺伝的に操作され得るか、またはpTアルファの導入遺伝子を発現し得る。
別の実施形態では、TCRは、TCRアルファ遺伝子および/またはTCRベータ遺伝子を不活性化することによって、本発明の細胞において非機能的になる。上記戦略は、より具体的にはGvHDを避けるために使用される。本発明の特定の態様は、個体由来の改変細胞を得るための方法であって、前記細胞が、主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る方法である。前記方法は、以下の工程:
(a)前記個体から細胞を回収する工程;
(b)TCRアルファおよび/またはTCRベータ遺伝子を不活性化することによって、前記細胞をエクスビボで遺伝子改変する工程;
(c)適切な条件下で、遺伝子改変T細胞をインビトロで培養して前記細胞を増幅する工程
を含む。
本発明は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む初代人工T細胞を提供する。
本発明は、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む初代人工T細胞を提供する。
主要組織適合複合体シグナル伝達経路と無関係に増殖し得る改変細胞であって、この方法によって得られやすい改変細胞は、本発明の範囲内に包含される。前記改変細胞は、宿主対移植片(HvG)拒絶反応および移植片対宿主病(GvHD)に対して、それを必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る;したがって、宿主対移植片(HvG)拒絶反応および移植片対宿主病(GvHD)に対して、それを必要とする患者を処置する方法であって、不活性化TCRアルファおよび/またはTCRベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。
より好ましい実施形態では、前記方法は、
(a)好ましくは細胞培養物由来のまたは血液サンプル由来のT細胞を提供すること;
(b)DNA切断によって、好ましくは二本鎖切断によって、T細胞受容体(TCR)成分をコードする少なくとも1つの遺伝子を選択的に不活性化することができる低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸で前記T細胞を形質転換すること;
(c)前記低頻度切断エンドヌクレアーゼを前記T細胞に発現させること;
(d)細胞表面上においてTCRを発現しない形質転換T細胞を分類すること;
(e)前記細胞を増大させること
を含む。
別の実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALEヌクレアーゼであり得る。好ましい実施形態では、前記低頻度切断エンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼである。好ましい方法および関連TALEヌクレアーゼは、国際公開第2013176915号に記載されている。
本発明は、誘導する宿主対移植片(HvG)拒絶反応が初代非人工T細胞よりも50%〜100%少ない初代人工T細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む初代人工T細胞を提供する。
本発明は、誘導する宿主対移植片(HvG)拒絶反応が初代非人工T細胞よりも50%〜100%少ない初代人工T細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含む初代人工T細胞を提供する。
化学療法に対して耐性の抗CD123免疫細胞
本発明の好ましい実施形態によれば、抗CD123多重鎖CARを持つ免疫細胞は、化学療法薬(特に、プリンヌクレオチド類似体(PNA))に対して耐性であるように操作され、養子免疫療法および化学療法を組み合わせるための癌処置に適切である。プリンヌクレオチド類似体は、多くの癌処置(特に、白血病)の化学療法組成物に含まれる。それは、AMLにおける標準治療として特に使用されている。最も広く使用されているPNAは、単独または組み合わせのクロファラビン、フルダラビンおよびシタラビンである。PNAは、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)活性を有する酵素[EC2.7.1.74]によって、一リン酸、二リン酸および三リン酸PNAに代謝される。それらの三リン酸形態、特にクロファラビン(clorofarabine)三リン酸は、DNA合成でATPと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド産生に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ(RNR)の強力な阻害剤である。
したがって、本発明は、プリン類似体薬物に対して耐性であり、CD123陽性悪性細胞をターゲティングし得るエクスビボ免疫細胞(好ましくは、T細胞)を生産する方法を含む。前記方法は、以下の工程:
(a)患者(自己処置)またはドナー由来の免疫細胞を提供すること;
(b)デオキシシチジンキナーゼ活性(dcK−EC2.7.1.74)を有する酵素を発現する遺伝子、特にヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子(NCBI Gene ID:1633)を特異的にターゲティングする低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列で、前記免疫細胞をトランスフェクトすること、
(c)前記エンドヌクレアーゼを前記免疫細胞に発現させて、前記dck遺伝子の標的化不活性化を達成すること;
(d)場合により前記プリン類似体薬物の存在下で、工程c)で得られた人工免疫細胞を増大させること;および
(e)前記抗CD123多重鎖CARを前記免疫細胞に導入すること
の1つまたは複数を含む。
本発明者らは、特にTAL−ヌクレアーゼを使用することにより前記細胞へのdcK遺伝子発現の不活性化を媒介することによって、プリンヌクレオチド類似体、より具体的にはクロファラビンおよび/またはフルダラビンに対して耐性の抗CD123 T細胞の作製に成功した。好ましくは、国際公開第2013176915号に記載されているようにエレクトロポレーションを使用することによって、cdk遺伝子に対する特異的TAL−ヌクレアーゼをコードするmRNAを使用してT細胞をトランスフェクトして、CD123を有する細胞に対するT細胞細胞傷害活性を維持しつつ、薬物に対する有意な耐性を誘導した。
したがって、本出願は、白血病の処置のための抗CD123T細胞であって、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化されている抗CD123T細胞を提供する。
本発明は、白血病、好ましくはAMLの処置のための初代人工T細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:6を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含み、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化されている初代人工T細胞を提供する。
本発明は、白血病、好ましくはAMLの処置のための初代人工T細胞であって、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:21、配列番号:3、配列番号:22、配列番号:4、配列番号:12、配列番号:5および配列番号:7を含む少なくとも1つの抗CD123多重鎖(CAR)を含み、デオキシシチジンキナーゼの発現が抑制または不活性化されている初代人工T細胞を提供する。
T細胞の活性化および増大
T細胞は、T細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号;米国特許第6,534,055号;米国特許第6,905,680号;米国特許第6,692,964号;米国特許第5,858,358号;米国特許第6,887,466号;米国特許第6,905,681号;米国特許第7,144,575号;米国特許第7,067,318号;米国特許第7,172,869号;米国特許第7,232,566号;米国特許第7,175,843号;米国特許第5,883,223号;米国特許第6,905,874号;米国特許第6,797,514号;米国特許第6,867,041号;および米国特許出願公開第20060121005号に記載されている方法を一般に使用して、活性化させ増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。
一般に、本発明のT細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。
例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)またはフィトヘマグルチニン(PHA)などの分裂促進性レクチンなどの化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。
非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させ得る。CD4+T細胞またはCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体。例えば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあり得るか、または表面に結合され得る。当業者であれば容易に理解し得るように、粒子と細胞との比は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。本発明のさらなる実施形態では、T細胞などの細胞を薬剤コーティングビーズと結合させ、続いて、ビーズおよび細胞を分離し、次いで、細胞を培養する。代替的な実施形態では、培養前に、薬剤コーティングビーズおよび細胞を分離せず、一緒に培養する。T細胞培養のために適切な条件としては、血清(例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清)、インターロイキン2(IL−2)、インスリン、IFN−g、1L−4、1L−7、GM−CSF、−10、−2、1L−15、TGFpおよびTNF−、または当業者に公知の細胞の増殖のための任意の他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX−vivo 5(Lonza))が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加剤としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにN−アセチル−システインおよび2−メルカプトエタノール(mercaptoethanoi)などの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが追加されているか、無血清であるか、または適切な量の血清(もしくは血漿)もしくはホルモンの定義されたセットおよび/もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補充されているRPMI 1640、A1M−V、DMEM、MEM、a−MEM、F−12、X−Vivo 1およびX−Vivo 20、Optimizerが挙げられ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養物にのみ含まれ、被験体へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件;例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気+5%CO)で維持される。様々な刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。
別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させ得る。前記細胞はまた、前記細胞を被験体に投与した後、インビボで、例えば、被験体の血液中で増大させ得る。
治療用途
別の実施形態では、以前に記載されているような異なる方法によって得られる単離された細胞または前記単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。別の実施形態では、前記医薬は、CD123陽性細胞に関連する病変と診断された患者における癌または感染症を処置するために使用され得る。別の実施形態では、本発明の前記単離された細胞または前記単離された細胞由来の細胞株は、癌、特にAMLの処置のための医薬の製造に使用され得る。
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者を処置するための方法であって、以下の工程:
(a)以前に記載されている方法のいずれか1つによって入手可能な免疫細胞を提供すること;
(b)前記形質転換免疫細胞を前記患者に投与すること
の少なくとも1つを含む方法に依拠する。
一実施形態では、本発明の前記T細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。
前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原(HLA)適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。
典型的にはドナーから得られたT細胞の非同種反応性細胞への形質転換を可能にする限り、本発明は、同種免疫療法に特に適切である。これは、標準的なプロトコールの下で行われ得、必要に応じて何回も再現され得る。得られた改変T細胞をプールし、1人または複数の患者に投与し得るので、「既製」治療製品として利用可能である。
開示される方法と共に使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記処置は、癌、ウイルス感染、自己免疫障害または移植片対宿主病(GvHD)と診断された患者を処置するために使用され得る。処置され得る癌としては、血管新生していないかまたはまだ実質的に血管新生していない腫瘍、および血管新生した腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍(例えば、血液学的腫瘍、例えば白血病およびリンパ腫など)を含み得るか、または固形腫瘍を含み得る。本発明の多重鎖CARで処置すべき癌の種類としては、限定されないが、癌腫、芽細胞腫、肉腫および特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性および悪性の腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えば肉腫、癌腫および黒色腫が挙げられる。成人の腫瘍/癌および小児の腫瘍/癌も挙げられる。
前記処置は、寛解的、治癒的または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己は、患者を処置するために使用される細胞、細胞株または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原(HLA)適合性ドナーに起因することを意味する。同種は、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、前記患者ではなく、ドナーに起因することを意味する。
開示される方法で使用され得る細胞は、先のセクションに記載されている。前記予防的または治療的処置は、CD123発現細胞、特に過剰なCD123発現細胞を特徴とする前悪性または悪性癌症状と診断された患者を処置するために使用され得る。このような症状は、血液学的癌、例えば白血病または悪性リンパ増殖性障害で見られる。
それは、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される1つ以上の抗癌療法と組み合わせた処置であり得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化のため、少なくとも1つの免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に依拠する。この態様では、免疫抑制処置は、患者における本発明のT細胞の選択および増大を支援するべきである。本発明の細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込みまたは移植を含む、任意の便利な様式で実施され得る。本明細書に記載される組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射によって投与される。
細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む、体重1kg当たり10〜10個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10〜10個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、単回投与される。別の実施形態では、前記有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーなどの任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量は、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。
別の実施形態では、前記有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内への注射によって直接行われ得る。
本発明の特定の実施形態では、細胞は、限定されないが、抗ウイルス治療、シドホビルおよびインターロイキン2、シタラビン(ARA−Cとしても公知)などの薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ(natalizimab)処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ(efaliztimab)処置、またはPML患者のための他の処置を含む多数の関連する処置モダリティと共に(例えば、前に、同時にまたは後に)患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸およびFK506などの免疫抑制剤、抗体またはCAM PATH、抗CD3抗体、もしくは他の抗体治療などの他の免疫除去剤、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか(シクロスポリンおよびFK506)、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Liu et al.,Cell 66:807−815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316−321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin.mm n. 5:763−773, 93)。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療(XRT)、シクロホスファミドなどの化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に(例えば、前に、同時にまたは後に)患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。特定の実施形態では、移植の後、被験体は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。本明細書に記載される方法のいずれか1つによって得られる前記改変細胞は、宿主対移植片(HvG)拒絶反応および移植片対宿主病(GvHD)に対して、それを必要とする患者を処置するために、本発明の特定の態様において使用され得る;したがって、宿主対移植片(HvG)拒絶反応および移植片対宿主病(GvHD)に対して、それを必要とする患者を処置する方法であって、不活性化TCRアルファおよび/またはTCRベータ遺伝子を含む有効量の改変(人工)細胞を前記患者に投与することによって、前記患者を処置することを含む方法は、本発明の範囲内である。
本出願では、患者または被験体は、非ヒト霊長類またはヒトを意味する。
ドナーは、健常個体または疾患を患っている個体を意味する。
「再発性」という用語は、治療後に癌が寛解した被験体が再び癌細胞を有する状況を指す。
「難治性または抵抗性」という用語は、被験体または哺乳動物が、集中処置後であっても体内に残存癌細胞を有する状況を指す。
「薬剤耐性」という用語は、疾患が1つまたは複数の薬物の処置に応答しない状態を指す。薬剤耐性は、内因性(または一次耐性)(これは、疾患が1つまたは複数の薬物に決して応答しないことを意味する)であり得るか、またはそれは、獲得性(これは、疾患が、その疾患が以前に応答した1つまたは複数の薬物に応答しないことを意味する)(二次耐性)であり得る。特定の実施形態では、薬剤耐性は、内因性である。特定の実施形態では、薬剤耐性は、獲得性である。
「血液悪性腫瘍」または「血液癌」という用語は、体の血液骨髄および/またはリンパ組織の癌を指す。血液悪性腫瘍の例としては、例えば、骨髄異形成、白血病、リンパ腫、例えば皮膚リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病(ホジキンリンパ腫とも称される)、および骨髄腫、例えば急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性前骨髄球性白血病(APL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性好中球性白血病(CNL)、急性未分化白血病(AUL)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、前リンパ球性白血病(PML)、若年性骨髄単球性白血病(JMML)、成人T細胞ALL、三血球系骨髄異形成を伴うAML(AML/TMDS)、混合系統白血病(MLL)、骨髄異形成症候群(MDS)、骨髄増殖性障害(MPD)および多発性骨髄腫(MM)が挙げられる。
「白血病」という用語は、限定されないが、慢性リンパ球性白血病または慢性リンパ性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄系白血病または急性骨髄性白血病(AML)および急性骨髄芽球性白血病を含む血液形成組織の悪性新生物を指す。
本発明の抗CD123多重鎖CAR発現細胞を使用して処置され得るAMLまたはAMLサブタイプは、特に、CD123陽性悪性細胞(CD123−positive malignat cells)の関与にかかわらず、急性骨髄芽球性白血病、最小分化急性骨髄芽球性白血病、未成熟急性骨髄芽球性白血病、顆粒球成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病(APL)、急性骨髄単球性白血病、骨髄好酸球増加症を伴う骨髄単球性、急性単芽球性白血病(M5a)または急性単球性白血病(M5b)、急性赤白血病(赤白血病を含む)(M6a)および非常に珍しい純粋な赤白血病(M6b)、急性巨核芽球性白血病、急性好塩基球性白血病、骨髄線維症を伴う急性汎骨髄症であり得る。
AMLサブタイプはまた、有毛細胞白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病を含む。
本発明の抗CD123多重鎖CAR発現細胞を使用して処置され得るAMLまたはAMLサブタイプは、特定の遺伝子異常を伴うAMLであり得る。分類は、導入療法に対する応答、再発リスク、生存を予測する核型の能力に基づいている。
したがって、本発明の抗CD123多重鎖CAR発現細胞を使用して処置され得るAMLは、第8染色体と第21染色体との間の転座を伴うAML、第16染色体における転座または逆位を伴うAML、第9染色体と第11染色体との間の転座を伴うAML、第15染色体と第17染色体との間の転座を伴うAPL(M3)、第6染色体と第9染色体との間の転座を伴うAML、第3染色体における転座または逆位を伴うAML、第1染色体と第22染色体との間の転座を伴うAML(巨核芽球性)であり得る。
本発明は、これらの特定の細胞遺伝学的マーカーに関連するAMLの処置のために特に有用である。
本発明はまた、AMLの特定の細胞遺伝学的サブセットを有する患者(例えば、オールトランス型レチノイン酸(ATRA)16−19を使用して同定されたt(15;17)(q22;q21)を有する患者)の処置のための、および高用量のシタラビンの反復投与を使用して同定されたt(8;21)(q22;q22)またはinv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)を有する患者の処置のための抗CD123多重鎖CAR発現細胞を提供する。
好ましくは、本発明は、異常性(例えば、−5/del(5q),−7、3qの異常または複合核型)を有するAML罹患患者であって、完全寛解率および生存率が低いことが示されている者の処置のための抗CD123多重鎖CAR発現細胞を提供する。
特定の実施形態では、「含む」は、「〜中に存在する」を意味する。
一般的方法
国際特許出願第PCT/EP2015/055848号の文献に開示されているすべての方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
−初代T細胞培養
フィコール密度勾配媒質(Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences)を使用して、EFS(Etablissement Francais du Sang,Paris,France)によって提供されるバフィーコートサンプルから、T細胞を精製した。PBMC層を回収し、市販のT細胞濃縮キット(Stem Cell Technologies)を使用して、T細胞を精製した。20ng/mLヒトIL−2(Miltenyi Biotech)、5%ヒト血清(Sera Laboratories)およびDynabeadsヒトT活性化剤CD3/CD28を補充したX−Vivo(商標)−15培地(Lonza)中、1:1のビーズ:細胞比(Life Technologies)で、精製T細胞を活性化した。活性化後に、細胞を成長させ、20ng/mLヒトIL−2(Miltenyi Biotec)および5%ヒト血清(Sera Laboratories)を補充したX−Vivo(商標)−15培地(Lonza)中で維持した。
−AMLおよびクロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性AMLのモデル
最初、MOLM13細胞株は、初期骨髄異形成症候群(MDS、過剰な芽球を伴う不応性貧血、RAEB)後の1995年に再発した急性骨髄性白血病AML FAB M5aを有する20歳の男性の末梢血から樹立された。MOLM13−Luc細胞株およびdckノックアウトMOLM13−Luc細胞株(クロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性MOLM13−Luc細胞株)を樹立するために、デオキシシチジンキナーゼ活性(dcK−EC2.7.1.74)を有する酵素を発現する遺伝子(すなわち、ヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子(NCBI Gene ID:1633))を特異的にターゲティングする低頻度切断エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列で、ならびにGFPおよびホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルス(amsbio LVP438−PBS)で、MOLM13細胞(DSMZ ACC 554)をトランスフェクトした。
−ネオマイシン(ref 10131−027,Gibco,Life Technologies,Saint−Aubin,France)を用いて、GFP陽性細胞を選択した。cdk KO MOLM13−Luc細胞のクロファラビン、フルダラビンまたはシタラビン耐性を、クロファラビン、フルダラビンまたはシタラビンの存在下で試験した。
−T細胞の形質導入およびCARの検出
組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を、T細胞の精製/活性化の3日後に行った。Vectalys SA(Toulouse,France)によって、HEK−293細胞におけるゲノムおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションによって、レンチウイルスベクターを生産した。形質導入当たり10個の細胞を使用して5の感染多重度で、形質導入を行った。ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインとマウスIgG1 Fc断片(LakePharma製)との融合物からなる組換えタンパク質を使用して、T細胞の表面におけるCAR検出を行った。該タンパク質のマウスFc部分をターゲティングするPE結合二次抗体(Jackson Immunoresearch)を用いて、CAR分子に対するこのタンパク質の結合を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。
−脱顆粒アッセイ(CD107aの動員)
96ウェルプレート(細胞40,000個/ウェル)において、T細胞を、等量のCD123タンパク質発現または非発現細胞と共にインキュベートした。最終容量100μlのX−Vivo(商標)−15培地(Lonza)中で、共培養物を5%CO、37℃で6時間維持した。細胞刺激の間、共培養の開始時に、1μg/mlの抗CD49d(BD Pharmingen)、1μg/mlの抗CD28(Miltenyi Biotec)および1×Monensin溶液(eBioscience)と共に、蛍光抗CD107a抗体(APC結合、Miltenyi Biotec製)を追加することによって、CD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素(eFluor780、eBioscience製)および蛍光色素結合抗CD8(PE結合、Miltenyi Biotec)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
CD8+細胞の中のCD107a染色の平均蛍光シグナル強度(MFI)を決定することによって、CD8+/CD107a+細胞の%として、脱顆粒活性を決定した。mcCARまたはscCARによるT細胞の形質導入の8〜10日後に、脱顆粒アッセイを行った。
−細胞傷害性アッセイ
96ウェルプレート(細胞100,000個/ウェル)において、T細胞を、10,000個の(様々なレベルのCD123を発現する)標的細胞および10,000個のコントロール(CD123neg)細胞と共に同じウェルにおいてインキュベートした。CAR+T細胞(mcCAR+T細胞またはscCAR+T細胞)と共に共培養する前に、標的細胞およびコントロール細胞を蛍光細胞内色素(CFSEまたはCell Trace Violet、Life Technologies製)で標識した。共培養物を5%CO、37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間後に、細胞を、固定可能な生存色素(eFluor780、eBioscience製)で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団(標的細胞またはCD123negコントロール細胞)の生存を決定し、特異的細胞溶解の%を計算した。mRNAトランスフェクションの48時間後に、細胞傷害性アッセイを行った。
−抗腫瘍マウスモデル
−動物飼育および実験手順は、実験動物の管理および使用に関するフランスおよび欧州の規制およびNRCガイドにしたがって、Oncodesign(Dijon,France;http://www.oncodesign.com/)が行った。
−免疫欠損雌性NOG(NOG)マウス(NOD.Cg−PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicTac)マウス(NODは、非肥満糖尿病を表す)(6〜8週齢)は、Taconic(Ry,Danemark)から入手した。
−実験の一方の治療群では、クロファラビンまたはフルダラビンをマウスに投与した。
−それぞれAMLおよびクロファラビン耐性AMLマウスモデルとして、MOLM13−ルシフェラーゼ細胞またはクロファラビン耐性MOLM13−ルシフェラーゼ細胞をマウスに静脈内(iv)注射した。
次いで、(腫瘍細胞株の注射の7日後に)異なる用量のmcCAR+T細胞もしくはscCAR+T細胞(10〜5×10)を、またはCARレンチウイルスベクターで形質導入しなかったT細胞をマウスに静脈内(iv)注射した。
異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、T細胞の注射の前日(D−1)に、ならびにT細胞の注射後7日目および14日目に、生物発光シグナルを決定した。結果は、図4に示されているように、mcCAR+T細胞で処置したマウスにおける腫瘍進行の用量依存的な変化を示している。
本出願で使用した抗CD123 scCARの配列は、以下の通りであった:
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVKLVESGGGLVQPGGSLSLSCAASGFTFTDYYMSWVRQPPGKALEWLALIRSKADGYTTEYSASVKGRFTLSRDDSQSILYLQMNALRPEDSATYYCARDAAYYSYYSPEGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSMADYKDIVMTQSHKFMSTSVGDRVNITCKASQNVDSAVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGRGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSTPWTFGGGTKLEIKRTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(配列番号:25)
臨床エッセイ
条件の例:
新たにAMLと診断されたと患者。
再発性もしくは難治性AML患者、または集中処置対象外のAML患者。
CD123特異的多重鎖CARの実施例
A.多重鎖CARの設計(図2、図3、図4)
CD123抗原をターゲティングする多重鎖CARを、IgEに対する高親和性受容体(FcεRI)に基づいて設計した。肥満細胞および好塩基球上において発現されるFcεRI(図1)は、アレルギー反応をトリガーする。それは、単一のαサブユニット、単一のβサブユニットおよび2つのジスルフィド結合γサブユニットから構成される四量体複合体である。αサブユニットは、IgE結合ドメインを含有する。βおよびγサブユニットは、シグナル伝達を媒介するITAMを含有する。あらゆる多重鎖CARにおいて、FcRα鎖の細胞外ドメインを削除し、それぞれ表5においてμと称される各scFvで置換し、FcRβ鎖および/またはFcRγ鎖のCD8αヒンジ(配列番号:2)およびITAMを削除した。得られた構造は、表6に詳述されている構造を有していた。
B.T細胞における一過性発現(図5、図6)
ポリシストロン性mRNAのエレクトロポレーション後に、ヒトT細胞において、多重鎖CARを発現させ得る。
mMESSAGEmMACHINEキットおよび線状化プラスミド(テンプレートとして)を使用して生産したキャップ化およびポリアデニル化ポリシストロン性mRNAをT細胞にエレクトロポレーションした。テンプレートとして使用したプラスミドは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターと、続いて、異なるCAR変異体をコードするポリシストロン性DNA配列を含有していた。
以下のプロトコールにしたがって、CytoLVT−Sデバイス(Cellectis)を使用して、ヒトT細胞へのポリシストロン性mRNAのエレクトロポレーションを行った:抗CD3/CD28コーティングビーズで数日間(3〜5)予備活性化した5×10個のT細胞およびIL2をCytoporation緩衝液Tに再懸濁し、0.4cmキュベットにおいて、PBMC3 program Table14を使用して、45μgのmRNAをエレクトロポレーションした。
エレクトロポレーションの24時間後に、多重鎖CARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作したヒトT細胞を、固定可能な生存色素eFluor−780およびPE結合特異的ヤギ抗マウスIgG F(ab’)2断片で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。
ポリシストロン性mRNAを使用して操作した生T細胞は、それらの表面において多重鎖CARを発現した。
図5および図6の結果は、MOI 5で形質導入した8日後に評価した各mcCARの発現レベルを示す。ヒトCD123タンパク質の細胞外ドメインがマウスIgG1由来のFc断片と融合したものを含有する組換えタンパク質を使用して、CAR検出を行った。PE結合抗Fc抗体を用いてCAR/CD123−Fc複合体を検出し、フローサイトメトリーによって分析した。NTDは、非形質導入細胞を表す。コントロールと比較して、図5は、89.9%のmc123−CD28発現細胞を示し、図6は、87.9%のmc123−41BB発現細胞を示す。
C.多重鎖CARを一過性発現するヒトT細胞は、標的細胞との共培養後に脱顆粒する(図7)。
エレクトロポレーションの24時間後に、多重鎖CARをコードするかまたは一本鎖CARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作したヒトT細胞を、国際特許出願第PCT/EP2015/055848号に記載されているように調製した。次いで、細胞を、標的(ダウディ)、(異なるレベルのCD123を発現する)KG1、MOLM13もしくはRPMI8226(KG1a<MOLM13<RPMI8226)またはコントロール(K562)細胞と共に6時間共培養した。
次いで、フローサイトメトリーによってCD8+T細胞を分析して、それらの表面における脱顆粒マーカーCD107aの発現を検出した。データは、CD123多重鎖CARを発現するヒトCD8+T細胞が、コントロール細胞との共培養ではなくCD123発現標的細胞との共培養後に、脱顆粒することを示している。
共培養と同じ条件において単独で培養したT細胞、および陽性コントロール(PMA/イオノマイシンで活性化した細胞)の脱顆粒活性も図7に示されている。フローサイトメトリーによって、(CD8+細胞の中の)CD107a+細胞の%を測定することによって、脱顆粒活性を決定した。少なくとも3つの別個のドナーにおいて、実験を行った。
D.標的細胞との共培養後の、多重鎖CARを一過性発現するヒトT細胞におけるサイトカインの分泌
エレクトロポレーションの24時間後に、多重鎖CARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作したヒトT細胞を、標的(ダウディ)またはコントロール(K562)細胞と共に24時間共培養した。次いで、上清を回収し、TH1/TH2サイトカインサイトメトリービーズアレイキットを使用して分析して、T細胞によって産生されたサイトカインを定量した。アッセイにより、多重鎖CARを発現するヒトT細胞は、コントロール細胞との共培養ではなくCD123発現標的細胞との共培養後に、IFNγ、IL8およびIL5を産生することが示された。
興味深いことに、同じ用量で使用した場合、抗CD123 mc CAR−T細胞は、抗CD123 scCAR−T細胞よりも低レベルのサイトカイン放出を誘導し、より少ない二次効果が観察され、T細胞はより耐性が高く、したがってより低毒性であると考えられる。
E.多重鎖CARを一過性発現するヒトT細胞は、標的細胞を溶解する(図8)
エレクトロポレーションの24時間後に、多重鎖CARをコードするポリシストロン性mRNAを使用して操作したヒトT細胞を、標的(ダウディ)またはコントロール(K562)細胞と共に4時間共培養した。次いで、フローサイトメトリーによって標的細胞を分析して、それらの生存を分析したところ、CD123多重鎖CARを発現する異なる細胞が、コントロール細胞ではなくCD123発現標的細胞を溶解することが示された。
図8の結果は、CAR−T細胞の特異的細胞溶解活性を示す。T細胞を、ダウディ+KG1a、ダウディ+MOLM13またはダウディ+RPMI−8226細胞と共に4時間共培養した。共培養の終了時に各細胞株の細胞生存率を決定し、各条件について、特異的細胞溶解率を計算した。
図8の結果は、CD123をターゲティングする両mcCARが、CD123+標的細胞に対して同程度の細胞溶解活性を有することを示している。
F−多重鎖CARを一過性発現するヒトT細胞は、抗腫瘍活性を有する
また、2つのCARを使用して、腫瘍樹立マウスモデルにおける抗腫瘍インビボ実験を行った。非形質導入ヒトT細胞の静脈内(iv)注射の7日前に(cdk wtまたはcdk KO)MOLM13−ルシフェラーゼ細胞を、または異なる用量の抗CD123 mcCAR+T細胞(10〜5×10個)(TCR KO薬剤耐性人工細胞)を免疫欠損マウスに静脈内(iv)注射した。結果は、マウスにおける抗CD123 mcCAR+T細胞の用量依存的な抗腫瘍活性を示している。
G−GVHDに関する臨床データ
得られたデータは、TCR KO CD123 CAR T細胞の抗腫瘍活性が、TCR KO CD123 CAR T細胞のものと類似することを示している。これらの細胞で処置した個体では、細胞と比較して、KO CD123 CAR T細胞の寛容性の劇的な改善(TCR発現細胞と比較してGVHDが約50%〜80%減少)が測定されている。

Claims (28)

  1. −細胞外CD123リガンド結合ドメインに融合された高親和性IgE受容体(FcεRI)のアルファ鎖由来の膜貫通ポリペプチド
    を含む、CD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)。
  2. −シグナル伝達ドメインに融合されたFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第2の膜貫通ポリペプチド
    をさらに含む、請求項1に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)。
  3. −共刺激ドメインを含むFcεRIのガンマまたはベータ鎖由来の第3の膜貫通ポリペプチド
    をさらに含む、請求項2に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体(mc CAR)。
  4. FcεRIの前記アルファ鎖に融合された前記CD123リガンド結合ドメインが、CD123に対する特異性を付与する重鎖(V)および軽鎖(V)を含む一本鎖可変断片(scFv)である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  5. 前記Vが、配列番号:13、15、17、19、21および23から選択される1つと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項4に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  6. 前記Vが、配列番号:14、16、18、20、22および24から選択される1つと少なくとも90%の同一性を示すポリペプチドを含む、請求項1に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  7. FcεRIの前記アルファ鎖が、CD8α、IgG1またはFcRIIIαタンパク質由来のヒンジによって、前記細胞外リガンド結合ドメインに融合されている、請求項1に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  8. 前記ヒンジが、配列番号:2と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項1に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  9. FcεRIのガンマまたはベータ鎖に融合された前記シグナル伝達ドメインが、TCRゼータ鎖、FCεRβ鎖、FcεRIγ鎖に由来し、または免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含む、請求項2〜8のいずれか一項に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  10. 前記シグナル伝達ドメインがCD3ゼータに由来する、請求項9に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  11. 前記シグナル伝達ドメインが、配列番号:10と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項10に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  12. 前記第2または第3のポリペプチドが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7−H3、CD83に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組み合わせから選択される共刺激分子の細胞質ドメイン由来の共刺激ドメインを含む、請求項3〜11のいずれか一項に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  13. 前記共刺激ドメインが4−1BBに由来し、配列番号:6と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項12に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  14. 前記共刺激ドメインがCD28に由来し、配列番号:7と少なくとも90%の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項12に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体。
  15. 請求項1に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードするポリペプチドであって、表6において抗CD123 7G3、抗CD123 Old4、抗CD123 26292、抗CD123 32716、抗CD123 Klon43、抗CD123 12F1と称される全長アミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を示すポリペプチド配列を含む、ポリペプチド。
  16. 請求項1〜15のいずれか一項に記載のCD123特異的多重鎖キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  17. 請求項16に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  18. 免疫細胞を操作する方法であって、
    (a)免疫細胞を提供すること;
    (b)前記細胞の表面において、少なくとも1つの請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を発現させること
    を含む、方法。
  19. (a)免疫細胞を提供すること;
    (b)少なくとも1つの請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること;
    (c)前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
    を含む、請求項18に記載の免疫細胞操作方法。
  20. (a)免疫細胞を提供すること;
    (b)前記細胞の表面において、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を発現させること
    を含む、請求項18に記載の免疫細胞操作方法。
  21. (a)免疫細胞を提供すること;
    (b)各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体の集団を構成するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記細胞に導入すること;
    (c)前記ポリヌクレオチドを前記細胞に発現させること
    を含む、請求項18に記載の免疫細胞操作方法。
  22. 請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法から得られる、単離された免疫細胞。
  23. 少なくとも1つの請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重鎖キメラ抗原受容体を含む、単離された免疫細胞。
  24. 医薬として使用するための、請求項22または23に記載の単離された免疫細胞。
  25. NK細胞、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球またはヘルパーTリンパ球に由来する、請求項22〜23のいずれか一項に記載の単離された細胞。
  26. それを必要とする患者を処置するための方法であって、
    a)請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法によって得られる免疫細胞を提供すること;
    b)前記T細胞を前記患者に投与すること
    を含む、方法。
  27. 前記免疫細胞が、ドナーから回収されるものである、請求項26に記載の患者処置方法。
  28. 前記免疫細胞が、患者から回収されるものである、請求項26に記載の患者処置方法。
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