JP7353500B2 - アクリル酸トリプトリド、その調製方法および用途 - Google Patents

Description

本発明は、医薬技術分野に属し、具体的には、トリプトリドの誘導体、その調製方法および医薬用途に関する。

トリプトリド（Ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）は、トリプトニド（Ｔｒｉｐｔｏｎｉｄｅ）とも呼ばれ、ニシキギ科植物であるＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ Ｗｉｌｆｏｒｄｉｉの根、葉、花および実から抽出されるエポキシジテルペンラクトン化合物であり、ウィルホルジン（ｗｉｌｆｏｒｔｉｎｅ）、ウィルフォリン（Ｗｉｌｆｏｒｉｎｅ）、ウィルホルギン（Ｗｉｌｆｏｒｇｉｎｅ）、ウィルホルトリン（ｗｉｌｆｏｒｔｒｉｎｅ）、ｗｉｌｆｏｚｉｎｅやｅｕｏｎｉｎｅなどのアルカロイドとともにライコウトウ抽出物の主な有効成分を構成し、水に不溶で、メタノール、ジメチルスルホキシド、無水エタノール、酢酸エチル、クロロホルムなどに容易に溶ける。従来の研究によると、トリプトリドは抗酸化作用、抗リウマチ作用、抗アルツハイマー作用、抗ガン作用があることが示される。また、現代の研究によると、それは、抗リウマチ作用だけでなく、抗アルツハイマー作用や抗癌作用もあることが示される。

しかし、トリプトリドは活性が強い一方で、毒性も強く、臨床試験では消化器系、泌尿器系、心血管系、血液系、アレルギー反応、神経系、生殖器系などに強い毒性副作用を示すことが分かる。一定の活性を確保した上でその毒性を低減させることは、トリプトリド誘導体の研究において重要な方向である。研究によると、トリプトリドの毒性は、その１２，１３位のエポキシド環に関連し、その基が様々なタンパク質に容易に結合して様々な生物学的作用をもたらすことが示される。

本発明の１つの目的は、上記技術的課題の少なくとも１つを解決するために、トリプトリドの誘導体を提供することである。さらに、本発明の別の目的は、上記化合物の調製方法およびその医薬用途を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、上記技術的課題の少なくとも１つを解決するために、トリプトリドの誘導体の調製方法を提供することである。

本発明によるトリプトリドの誘導体は、具体的にアクリル酸トリプトリドおよびその薬学的に許容される塩であり、その構造式は式Ｉに示される。

本発明のアクリル酸トリプトリドの合成経路は、以下のとおりである。

トリプトリドをアシル化試薬（塩化アクリロイル、臭化アクリロイル、アクリル酸グリコシド、アクリル酸またはその等価物の３－クロロプロピオニルクロリド）とともに、有機溶媒（無水ジクロロメタン、トリクロロメタン、テトラヒドロフラン、エーテル）に添加し、酸結合剤としてトリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＴＥＡ）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン（ＤＢＵ）、２，６－ジメチルピリジン、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの有機塩基を使用し、触媒として４－ジメチルアミノピリジン、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡＴ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）等を使用し、室温で１－４ｈ（具体的には、２ｈであってもよい）撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチ反応を行い、ジクロロメタン（または水との相溶性が悪い他の有機極性溶媒）で抽出し、水層はジクロロメタン（または水との相溶性が悪い他の有機極性溶媒）でさらに２回抽出してもよく、ジクロロメタン（または水との相溶性が悪い他の有機極性溶媒）の抽出液を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄して抽出液における水の大部分を除去し、さらに乾燥剤（無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム、無水塩化カルシウムなどの１つ以上の吸収剤）で乾燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して式Iの化合物を得る。

本発明に係るアクリル酸トリプトリドおよびその薬学的に許容される塩は、抗癌活性を有し、動物のｉｎ ｖｉｖｏ実験において腫瘍の成長を効果的に阻害することができる。複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、ｐ５３のタンパク質表現の量を有意に増加させ、腫瘍細胞のアポトーシスを促進し、腫瘍細胞の成長を効果的に阻害することができ、癌細胞の転移を阻害する効果を有することが実証されている。さらに重要なのは、正常細胞に対する毒性がトリプトリドよりも低いということである。

本発明では、標的タンパク質に優先的に結合する特異的な選択性を有する官能基をトリプトリドのＣ１４－水酸基に導入することにより、その選択性が高まり、毒性が低減される。同時に、導入された官能基が適度な大きさを有する回転可能な柔性基であるため、１２，１３位のエポキシ環に対する一定の立体障害効果が生じ、その選択性を高め、毒性を低減することができる。

アクリル酸トリプトリドの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。 アクリル酸トリプトリドの^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルである。 アクリル酸トリプトリドのＤＥＰＴ１３５スペクトルである。 ヌードマウス腫瘍の蛍光シグナルを示す図である。 ヌードマウスの皮膚表面で観察された皮下移植腫瘍を示す図である。 ヌードマウスを死なせてから剥がした腫瘍組織を示す図である。 アポトーシスに関連する重要なタンパク質の表現に対するアクリル酸トリプトリドの影響を示す図である。 ＬＯ２細胞に対する異なる濃度の薬剤の毒性作用を示す図である。 肝臓癌細胞の増殖率に対する異なる濃度の薬剤の影響を示す図である。 アクリル酸トリプトリドの濃度による肝臓癌細胞のアポトーシス誘導作用を示す図である。 アクリル酸トリプトリドによる肝臓癌細胞の遊走阻害作用を示す図である。

以下、具体的な実施例および添付図面を合わせて本発明をさらに詳細に説明する。

１０３．４ｍｇ（０．２８７ｍｍｏｌ）のトリプトリドおよび１．７５ｍｇ（０．０１４３５ｍｍｏｌ）の４－ジメチルアミノピリジンを５ｍＬの無水ジクロロメタンに溶かし、３１９．５ｍｇ（３．１５７ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加し、氷浴で約０℃にし、２５９．７ｍｇ（２．８７ｍｍｏｌ）の塩化アクリロイルを滴下し、滴下後、徐々に室温に戻し、２ｈ撹拌反応させ、ＴＬＣで反応の完了を検出すると、撹拌を停止し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチ反応を行い、ジクロロメタンで抽出し、水層はジクロロメタンでさらに２回抽出し、ジクロロメタンの抽出液を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄してジクロロメタン抽出液における水の大部分を除去し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させ、薄層シリカゲルプレートの調製により分離を行い、展開剤として石油エーテル－酢酸エチル（２：１－１：１）を使用した後、無色透明な油状物３２．１ｍｇを収率約２７．０％で得た。検出の結果、当該化合物の構造式は、式Iに示すように、アクリル酸トリプトリドである。

図１－３に示すように、式Iの化合物は、分子式Ｃ_２３Ｈ_２６Ｏ_７、ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ：４１４．１６７９［Ｍ＋Ｈ］^＋（理論値）である。

^１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．５４（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｓ，１Ｈ），４．７７－４．６１（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝３０．８，４．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７０（ｄ，Ｊ＝１３．３Ｈｚ，１Ｈ），２．３２（ｄ，Ｊ＝１８．３Ｈｚ，１Ｈ），２．１８（ｄ，Ｊ＝２６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｄ，Ｊ＝３９．２Ｈｚ，２Ｈ），１．５９（ｄｄ，Ｊ＝４．８，１６．０Ｈｚ，１Ｈ），１．２４（ｍ，１Ｈ），１．０６（ｓ，３Ｈ），０．９７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）．
^１３Ｃ ＮＭＲ（１５１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７３．２４，１６５．５２，１５９．９８，１３２．４６（ＣＨ_２），１２７．７８，１２５．６３，７１．１３，６９．９８（ＣＨ_２），６３．６４，６３．４０，６１．１１，５９．７８，５５．３６，５５．０９，４０．４０，３５．７１，２９．８６（ＣＨ_２），２８．３３，２３．４７（ＣＨ_２），１７．５８，１７．０８（ＣＨ_２），１６．７６，１３．７４．

一、アクリル酸トリプトリドによるヌードマウスＨｅｐＧ２皮下移植腫瘍の阻害試験

１ 実験材料

１．１ 実験動物：ヌードマウス、メス、４－６週、体重約１８－２０ｇ、当該マウスは北京バイタルリバー実験動物技術有限公司（証明書番号：１１４００７００２７０６７５）から購入した。

１．２ 細胞：ＨｅｐＧ２細胞系；薬剤：上記実施例で合成されたアクリル酸トリプトリド。

１．３ その他の実験用試薬および消耗品：
滅菌生理食塩水、手術用はさみ、鉗子、読み取り用ノギス（広州威佳科技有限公司）、１ｍＬのシリンジ、綿棒。ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＤＭＥＭ培地（Ｇｂｉｃｏ、ＵＳＡ）；牛胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、北米）；ペニシリン（二重抗体）、０．２５％トリプシン（ＥＤＴＡ含有）；細胞アポトーシスキット、細胞周期キット（杭州聯科生物技術有限公司）；細胞培養フラスコ、細胞培養皿（Ｃｏｒｉｎｇ、ニューヨーク・米国）；２ｍＬクライオチューブ（Ｃｏｒｉｎｇ、ロサンゼルス・米国）；９６ウェル細胞培養プレート、６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｉｎｇ、ロサンゼルス・米国）。ＲＩＰＡライセート（強）、ＰＭＳＦプロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼタンパク質複合体阻害剤（広州鼎国生物技術公司）；Ｔｗｅｅｎ ２０（ＳＴ８２５、碧雲天、広州威佳科技有限公司）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルキット（碧雲天、広州威佳科技有限公司）、５×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（碧雲天、広州威佳科技有限公司）；Ｐｒｉｓｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ、米国）；ＥＣＬ化学発光液（Ｐ００１８Ａ、碧雲天、広州威佳科技有限公司）；ＰＶＤＦ膜（碧雲天、広州威佳科技有限公司）；薄型ろ紙、スポンジ、１．５μｍのシート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）；メタノール（シノファーム化学試薬有限公司）；グリシン（青島生工生物科技有限公司）、ＳＤＳ（北京バイオディー生物技術有限公司）、Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ（上海百研生物科技有限公司）、ＴＢＳ粉末（碧雲天、広州威佳科技有限公司）；脱脂粉乳（ＢＤ、ＵＫ）。

１．４ 実験装置・機器
最小表示０．１ｍｇの天びん（北京雷多利斯科学儀器有限公司）、炭酸ガスインキュベーター（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｂｏｘｕｎ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ＆Ｃｏｍｍｅｒｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；セルクリーンベンチ（芸思高科技有限公司、シンガポール）；低速ベンチトップ遠心分離機（ＤＴ５－３、北京時代北利遠心機有限公司）；マイクロプレートリーダーＶＩＣＴＯＲＸ５型（米国、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）；液体窒素タンク（Ｌｏｃａｔｏｒ ＰＬＵＳ、米国）。多機能凍結遠心機（５４３０Ｒ、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、中国ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ有限公司）、電気泳動、膜移動装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）、速度制御発振器（ＨＳ２６０、ＩＫＡ上海聖科儀器設備有限公司）、恒温金属浴槽（Ｑ８７２）、ゲル撮影装置（ＸＲ＋）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、上海Ｌａｂａｒａｔｏｒｉｅｓ有限公司）、振盪機（ＳＫ－Ｌ３３０－Ｐｒｏ）。

２ 実験過程

２．１ 動物モデルの確立
ルシフェラーゼを安定的に発現するＨｅｐＧ２－Ｌｕｃ細胞株の確立：対数増殖期のＨｅｐＧ２細胞を１×１０^５／ウェルで２４ウェルプレートに撒き、細胞を壁に十分に付着させるように一晩培養した。元の培地を６μｇ／ｍＬ ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを含む新鮮な培地２ｍＬに置き換え、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を安定的に発現する組換えレンチウイルス粒子を約１×１０^５トランスフェクション単位加え、３７℃で４ｈインキュベートした後、新鮮な培地を２ｍＬ加えてｐｏｌｙｂｒｅｎｅを希釈した。引き続き培養し、ウイルスを含む培地を新鮮な培地と交換した。引き続き培養し、耐性スクリーニングのためにピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）を含む培地を交換し、耐性のあるものを選択してクローンし、２週間スクリーニングし続け、最終的にルシフェラーゼを安定的に発現できる細胞株ＨｅｐＧ２－Ｌｕｃを得た。

ＨｅｐＧ２－Ｌｕｃ細胞株を用いた担癌マウスの構築：凍結保存したＨｅｐＧ２－Ｌｕｃ細胞を１００ｃｍ^２の培養フラスコに蘇生させ、対数増殖期までｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、ＥＤＴＡを含む０．２５％トリプシンで消化し、細胞を回収し、１０００ｒｐｍ、室温で３ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、無血清ＤＭＥＭ培地で細胞を洗い、トリパンブルー排除アッセイにより細胞の生存率を測定した（生存細胞の割合が９５％を超える場合だけ実験条件を満たす）。無血清ＤＭＥＭ培地を少量加えて細胞を再懸濁させ、細胞を数えた。ヌードマウスの背部皮膚を７５％アルコールで消毒し、１×１０^７細胞を含む懸濁液を約２００μＬ、ヌードマウスの右前腋窩に接種し、続いて無菌状態で飼育し、裸眼で見える皮下移植腫瘍の有無を観察した。

小動物生体イメージングシステムを用いた腫瘍成長の検出：各ヌードマウスに１５０μＬ ３０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内注射して１５ｍｉｎ観察し、誘導ボックスにおいてヌードマウスをエーテルにより５ｍｉｎ麻酔した後、すぐ麻醉したヌードマウスを観察ボックスに移し、ヌードマウスの頭部を円錐形の鼻栓に合わせて固定し、パラメータを設定して蛍光イメージングを行い（腫瘍の成長があれば、対応する場所で強度の異なる蛍光シグナルが検出できる）、イメージング後、ヌードマウスを誘導ボックスに再移動し、酸素バルブを開いてヌードマウスを蘇生させた。

２．２ 動物の群分けと投与量
群分け：１週間後に全てのヌードマウスで皮下腫瘍が観察され、かつ小動物生体イメージング技術により腫瘍の成長が確認されたため、体重に応じてヌードマウスをソートして番号を付け、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて１８個の乱数を生成し、乱数とヌードマウス番号を１対１に対応させ、ヌードマウスを乱数の大きさに従ってモデル群、低用量群（１００μｇ／ｋｇ）、中用量群（２００μｇ／ｋｇ）および高用量群（４００μｇ／ｋｇ）に均等に分割した。ランダムに群分けした後、ヌードマウスの体重および腫瘍体積を測定し、群間におけるヌードマウス体重と腫瘍体積の差異を統計学的に検証し、群間に差異がなく、バランスが良い場合は、群分けが正確になされていることが示される。

投与方法：使い捨て滅菌シリンジを用いてアクリル酸トリプトリド溶液を腹腔内注射した。モデル群のヌードマウスには生理食塩水を、投与群には指定された用量でアクリル酸トリプトリド溶液を投与した。日に１回、１３日間投与した。

２．３ 観察と記録
投与後、ヌードマウスに対して、毎日精神状態、活動性、食事、皮膚の色、糞便の性状などを日常的に観察し、ヌードマウスの体重を週に２回測定・記録して移植腫瘍の大きさを測定し、インビボイメージングを週に１回行って腫瘍の成長および遠隔転移状況をモニタリングし、投与終了まで３週間連続した。

２．４ 取材
投与終了後、動物を麻酔し、頚椎離断により死なせ、腫瘍体を完全に剥がし、腫瘍組織の大きさを測定して記録した。

２．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ
腫瘍組織を氷上で解凍した後、組織ホモジナイズチューブに５０ｍｇ入れ、かつプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む組織ライセートを５００μＬ（Ｒｏｃｈｅブランドのタブレットの場合、１タブレット／１０ｍＬで）加えた。高速ホモジナイズ処理後、１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心し、上清を取り、ＢＣＡ法により試料のタンパク質濃度を測定し、各試料の濃度を同じように調整した後、タンパク質ローディングバッファー５ｘ Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で１０ｍｉｎ変性させ、－８０℃で保存した。

適切なブランドの１０％プレミックスポリアクリルアミドゲル調製液を選択し、使用説明書に従って実験に使用するゲルを配合し（セパレーターゲルとスタッキングゲルを含み、約２ｈかかる）、ゲル固化の過程ではＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動液を予め配合しておき、配合したゲルを電気泳動槽に入れ、続いて電気泳動液を加え、試料添加槽の各ウェルに１０－３０μＬの試料を添加し、８０Ｖの低電圧で試料をスタッキングゲルに流し、次に電圧を１００Ｖに調整して試料をゲル全体に流し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動操作を完了させ、続いて、膜（ＰＶＤＦ膜、メタノールで５ｍｉｎ予備湿潤したもの）の転写を３００ｍＡで１２０－１５０ｍｉｎ行い（分子量１００ｋＤａを分割線として転写時間を選択し、分子量１００ｋＤａ未満の場合１２０ｍｉｎ、分子量１００ｋＤａ以上の場合１５０ｍｉｎ転写する）、転写終了後、５％脱脂乳で２ｈブロッキングした後、対応するストリップに応じて４℃の冷蔵庫で一次抗体を一晩インキュベートし、翌日、結合しなかった一次抗体をＴＢＳＴ洗浄液で除去し（１回に５ｍｉｎ、５回洗浄した）、二次抗体を３７℃で２ｈインキュベートし、結合しなかった二次抗体をＴＢＳＴ洗浄液で除去し（１回に５ｍｉｎ、５回洗浄した）、ＥＣＬ発光液を基質として目標ストリップを露出させ、分析・記録して結果を統計した。

３ 結果と分析

３．１ 本実験では、ルシフェラーゼを安定的に発現できる肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２－Ｌｕｃを確立し、当該細胞を用いてヌードマウス皮下肝癌移植腫瘍モデルを構築した。

実験では、ヌードマウスをモデル群（Ｍｏｄｅｌ）、低用量群（ＴＰＯ－Ｌ）、中用量群（ＴＰＯ－Ｍ）および高用量群（ＴＰＯ－Ｈ）の４群にランダムに分け、１３日間の連続投与後にヌードマウスを死なせて移植腫瘍組織および組織標本を得た。実験では、小動物生体イメージング技術を用いて腫瘍の成長を観察し、図４に示すように、各用量投与群のヌードマウスの腫瘍における蛍光シグナルは、モデル群と比較して有意に低減され、かつ用量依存的であり、また、高用量群ではより有意に低減され、アクリル酸トリプトリド（式I化合物）が腫瘍内の肝臓癌細胞の増殖を有意に阻害できることが示唆された。図５に示すように、ヌードマウスの皮下移植腫瘍と皮膚表面から、投与群（特に高用量群）の腫瘍体積がモデル群に比べ有意に小さく、かつ用量依存的であることが分かった。同様に、図６に示すように、ヌードマウスを死なせた後剥がした腫瘍組織は、投与群の腫瘍体積がモデル群より小さく、アクリル酸トリプトリドのｉｎ ｖｉｖｏでの抗肝臓癌効果がさらに検証された。

３．２ 本実験では、アポトーシスに関連する重要なタンパク質表現に対するアクリル酸トリプトリドの影響も観察された。

ｐ５３は、遺伝子の修復、細胞周期進行の制御、細胞アポトーシスの誘導など様々な生物学的機能を有する非常に重要な癌抑制遺伝子であり、セリン部位でのリン酸化は細胞アポトーシスを促進する役割を果たす。Ｃａｓｐａｓｅ－８およびｃａｓｐａｓｅ－３は、ｃａｓｐａｓｅカスケード反応でそれぞれイニシエーターとエクゼキューターとして重要な役割を果たし、細胞アポトーシス発生のための重要なステップであり、全てのアポトーシスシグナルに共通の経路でもある。図７に示すように、高用量群ではｐ５３のタンパク質表現量が有意に増加したが、低中用量群および中用量群では有意な変化が見られなかった。中用量群ではｃａｓｐａｓｅ－８のタンパク質表現量が有意に増加したが、低用量群および高用量群ではその表現量が減少した。ｃａｓｐａｓｅ－３のタンパク質表現量は、中用量群および高用量群で有意に増加し、低用量群で減少した。

二、肝臓癌細胞の増殖およびアポトーシスに対するアクリル酸トリプトリドの作用

１ 実験材料

１．１ 細胞株および薬剤
本実験で使用されたＬＯ２、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２細胞は全てＡＴＣＣから購入した。細胞は、１０％牛胎児血清、１×１０^５Ｕ・Ｌ－１ペニシリン、１００ｍｇ・Ｌ－１ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ完全培地を用いて、５％ ＣＯ_２、３７℃および飽和湿度にて培養した。

１．２ 試薬
牛胎児血清、ＤＭＥＭ培地、ペニシリン、ストレプトマイシン二重抗体（米国 Ｇｉｂｃｏ公司）；ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キット、ＥＣＬ検出キット（Ｋｅｙｇｅｎ生物）；ＭＭＴキット、ＢＣＡタンパク質濃度測定キット、ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ローディングバッファー、ＰＭＳＦ、ＮＰ４０ライセート（碧雲天）；β－ａｃｔｉｎ、Ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃｌｅａｖｅｄ－Ｃａｓｐａｓｅ－３、ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ－ＰＡＲＰ抗体および二次抗体（米国ＣＳＴ公司）。

１．３ 装置 Ｈｅａｌ Ｆｏｒｃｅ バイオセーフティキャビネット、ＮＥＷ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ炭酸ガスインキュベーター、Ｒｏｃｈｅ生化学分析装置、倒立顕微鏡、ＢＤフローサイトメーター、Ｂｉｏ－ｒａｄタンパク質電気泳動システム、ＢｉｏＴｅｋ Ｅｐｏｃｈマイクロプレートリーダーなど。

２ 実験方法

２．１ 細胞毒性実験
対数成長したＬＯ２細胞を採取し、９６ウェルプレートに１×１０^４個／ウェルで接種した。最終濃度０、１０、５０、１００ｎＭの薬剤で細胞をそれぞれ処理し、２４時間後に培養上清を回収し、Ｒｏｃｈｅ生化学分析装置を用いて培養上清のＬＤＨ活性を検出した。

２．２ ＭＭＴ法による細胞増殖の検出
肝臓癌細胞が対数期まで成長した時、単一細胞懸濁液を９６ウェルプレートに１×１０^４個／ウェルで接種した。ブランク群は１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地、対照群は溶媒対照（ＤＭＳＯ）添加細胞群、実験群は異なる最終濃度（１０、２５、５０、１００ｎＭ）の薬剤で処理した細胞群である。２４時間処理後、培地上清を用心深く吸引して除去し、培地で希釈した最終濃度０．５ｍｇ・Ｌ^－１のＭＴＴ溶液１００μＬを各ウェルに加え、細胞を４時間培養した後、培地を捨て、各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯ溶液を加え、光を避けて振盪機に置いて低速で１０分間振り、結晶物を十分に溶解させた後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（Ａ）を４９０ｎｍで測定した。細胞増殖阻害率＝［（対照群Ａ_４５０－ブランク群Ａ_４５０）－（実験群Ａ_４５０－ブランク群Ａ_４５０）／（対照群Ａ_４５０－ブランク群Ａ_４５０）］×１００％。

２．３ フローサイトメトリーによる細胞アポトーシスの検出
対数増殖期の肝臓癌細胞を採取し、１２ウェルプレートに５×１０^５個／ウェルで接種した。最終濃度０、５０、１００ｎＭのアクリル酸トリプトリド（以下、ＴＰＯと略称）およびトリプトリドトリオール（以下、ＴＰ－３－ＯＨと略称）で細胞を処理した。２４時間処理後、０．２５％のＥＤＴＡフリートリプシンで細胞を消化して収集し、予め冷却したＰＢＳで２回洗浄し、かつ３００μＬ １×Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を再懸濁した。各チューブの細胞懸濁液に５μＬ ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖおよび５μＬ ＰＩを加え、光を避けて室温で５分間インキュベートし、１時間以内にフローサイトメトリーで検出した。

２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔによるアポトーシス関連タンパク質の検出
対数増殖期のＢＥＬ－７４０２細胞を採取し、１２ウェルプレートに５×１０^５個／ウェルで接種した。最終濃度０、５０、１００ｎＭのＴＰＯで細胞を処理した。２４時間処理後、細胞を収集してからライセートを加え、氷上で十分に分解した後全タンパク質を抽出した。ＢＣＡ法によりタンパク質濃度を測定した後、Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを加え、１００℃で１０分間煮沸させることにより、タンパク質を十分に変性させた。変性した試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動にかけ、かつＰＶＤＦ膜に電気転写した。転写したＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳＴで配合した５％ＢＳＡ溶液を用いて室温で１時間ブロッキングし、対応する一次抗体で４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳＴで洗浄し、二次抗体で室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで再度洗浄し、最後にＥＣＬ化学発光液を加えて膜ストリップを発光させ、且つ感光性フィルムでプレス、現像、定着を行って電気泳動の結果を得て、異なる処理群間のアポトーシス関連タンパク質の変化傾向を観察した。

２．５ スクラッチ実験
対数増殖期のＨｕｈ７細胞を採取し、２４ウェルプレートに５×１０^５個／ウェルで接種した。完全に増殖したら、滅菌したピペットチップで引っ掻き、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、引っ掻いた細胞を除去し、且つ５０ｎＭ ＴＰＯを含む無血清培地を加えて２４、４８時間培養し続け、写真を撮った。スクラッチの写真をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアで分析し、スクラッチの距離を計算し、スクラッチの治癒状況を評価した。

３ 結果の処理と分析

３．１ 統計学的分析
ＳＰＳＳ １６．０ソフトウェアで結果を分析した。統計データは、平均値±標準偏差（ｘ±ｓ）として表された。データは最初に正規性と等分散性の検定を行い、群間の比較は一元配置分散分析またはｔ検定で行い、Ｐ＜０．０５の場合は統計的に有意であると見なされた。

３．２ 正常肝細胞に対するＴＰＬ（トリプトリド）、ＴＰ－３－ＯＨ、ＴＰＯの毒性比較
図８の細胞毒性アッセイの結果、ＴＰＬで処理したＬＯ２細胞培養上清のＬＤＨ活性は有意に増加したが、ＴＰ－３－ＯＨ、ＴＰＯ処理群の上清のＬＤＨ活性はＴＰＬ処理群より有意に低く、肝細胞に対するＴＰ－３－ＯＨ、ＴＰＯの毒性がトリプトリドより明らかに低いことが示された。

３．３ 肝臓癌細胞の増殖に対するＴＰ－３－ＯＨ、ＴＰＯの阻害作用
図９のＭＴＴアッセイの結果、ＴＰＯはＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＭＭＣ－７７２１、ＢＥＬ－７４０２の４種類の肝臓癌細胞の増殖を有意に阻害し、かつ用量依存性を示し、ＴＰＯが肝臓癌細胞の増殖を阻害する作用を有することが示された。ＴＰ－３－ＯＨは肝臓癌細胞の増殖に対して有意な阻害作用を示さなかった。

３．４ ＴＰＯによる肝臓癌細胞のアポトーシスの誘導作用
図１０のフロー結果から、Ｈｅｐ３ＢおよびＢＥＬ－７４０２の２種類の肝臓癌細胞のＡｎｎｅｘｉｎ ＶとＰＩ陽性細胞の割合がＴＰＯ処理後に有意に増加したこと（Ａ）が示され、図１０のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果から、ＢＥＬ－７４０２細胞Ｃａｓｐａｓｅ－３およびＰＡＲＰのせん断がＴＰＯ処理後に有意に増加したこと（Ｂ）が示され、ＴＰＯには肝臓癌細胞のアポトーシス誘導効果があることが示唆された。ＴＰ－３－ＯＨによる肝臓癌細胞のアポトーシス誘導は有意ではなかった（結果は示さない）。

３．５ ＴＰＯによる肝臓癌細胞遊走の阻害作用
図１１のスクラッチ実験の結果、ＴＰＯはＨｕｈ７細胞の遊走を有意に阻害でき、かつその差は統計的に有意であったことから（Ｐ＜０．０５）、ＴＰＯには肝臓癌細胞の転移を阻害する作用がある可能性が示唆された。

上記は本発明のいくつかの実施形態に過ぎない。当業者であれば、本発明の創造的思想を逸脱することなく、多くの変形や改良が可能であり、これらは本発明の保護範囲に含まれる。

Claims (8)

1. 式Ｉで示される化合物である、ことを特徴とするアクリル酸トリプトリド。
   
2. （１）トリプトリド、アシル化試薬を有機溶媒に加え、４－ジメチルアミノピリジンを触媒とし、トリエチルアミンを酸結合剤とし、室温で１－４ｈ撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチ反応を行うステップと、
   （２）ジクロロメタンで抽出し、飽和塩化ナトリウム水溶液で抽出液を洗浄し、さらに乾燥剤で乾燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してアクリル酸トリプトリドを得るステップとを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のアクリル酸トリプトリドの調製方法。
3. ステップ（１）は、
   トリプトリド、４－ジメチルアミノピリジンを有機溶媒に溶かし、トリエチルアミンを添加し、氷浴で０℃にし、アシル化試薬を滴下し、滴下後徐々に室温に戻し、１－４ｈ撹拌し、ＴＬＣで反応の完了を検出すると、撹拌を停止し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でクエンチ反応を行うステップであり得る、ことを特徴とする請求項２に記載のアクリル酸トリプトリドの調製方法。
4. ステップ（２）は、
   ジクロロメタンで抽出し、水層はジクロロメタンでさらに２回抽出し、３回で得たジクロロメタン抽出液を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、さらに乾燥剤で乾燥し、減圧下で蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してアクリル酸トリプトリドを得るステップであり得る、ことを特徴とする請求項２に記載のアクリル酸トリプトリドの調製方法。
5. 前記アシル化試薬は、塩化アクリロイル、臭化アクリロイル、アクリル酸無水物、アクリル酸の１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする請求項２－４のいずれか一項に記載のアクリル酸トリプトリドの調製方法。
6. 前記有機溶媒は、無水ジクロロメタン、トリクロロメタン、テトラヒドロフランまたはエーテルである、ことを特徴とする請求項５に記載のアクリル酸トリプトリドの調製方法。
7. 前記乾燥剤は、無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウムおよび無水塩化カルシウムの１つまたは２つ以上である、ことを特徴とする請求項６に記載のアクリル酸トリプトリドの調製方法。
8. 抗癌剤の調製における請求項１に記載のアクリル酸トリプトリドの使用。