JP7351535B2 - 癌の転移抑制および治療用組成物 - Google Patents
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Description
1-1.細胞生存率の確認
1-1-1.単独投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン(chlorphenensin、OC-201と命名)、クロロキン(chloroquine、OC-202と命名)と、クロロピラジン(chloropyrazine、OC-203と命名)、それぞれの単独投与が大腸癌細胞の生存率に及ぼす影響を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega、Ltd.)により、大腸癌細胞株CT26、HCT116およびSW480細胞株に対する細胞の生存率を評価した。それぞれの大腸癌細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種し、クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)を、それぞれOμM(対照群DMSO処理)、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM および1mMで24h、48hまたは72hの間、前処理した細胞を4時間5mg/mL MTTと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液および中断溶液を追加した後、30℃で4時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、下記式を用いて、細胞生存率を計算した。
(数1)
細胞生存率=実験群吸光度(570nm)/対照群吸光度(570nm)×100(%)
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)の組み合わせによる併用処理による大腸癌細胞の生存率を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega 、Ltd.)により、大腸癌細胞株CT26、HCT116およびSW480細胞株に対する細胞生存率を評価した。それぞれの大腸癌細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種し、対照群(DMSO処理)、クロルフェネシン5μM、クロルフェネシンとクロロキン(5μM+500nM、5μM+1μM、5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μMと5μM+50μM)、またはクロルフェネシンとクロロピラジン(5μM+1μM、5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM、5μM+50μMおよび5μM+100μM)をそれぞれ24h、48hまたは72hの間、処理した細胞を4時間5mg/mLのMTTと一緒にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液および中断溶液を追加した後、30℃で4時間の間、インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、前記(式1)を用いて細胞生存率を計算した。
1-2-1.移動解析(migration assay)
1-2-1-1.クロルフェネシン単独投与
癌細胞の転移は、細胞の運動性が前提とされるべき関係にあるので、クロルフェネシン(OC-201)の処理濃度による大腸癌細胞株SW480、HCT116およびCT26細胞株の移動を移動解析方法を使用して確認した。具体的には、大腸癌細胞株CT26、HCT116およびSW480細胞株を無血清RPMIに懸濁した後、ポリカーボネート膜(8.0μMpore size、Costar)を有する24ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーにウェル当たり1x105細胞で添加した。ラミニン(10μg/ml)を下部ウェルに位置させ、それぞれの細胞にクロルフェネシン(OC-201)OμM(対照群DMSO処理)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1mMおよび2mMでそれぞれ処理した。細胞は、37℃のCO2インキュベーター内で18時間培養し、移動するようにした。その後、細胞を30分間PBS内で70%メチルアルコールで固定し、PBSで3回洗浄した。細胞をヘマトキシリン(Sigma)で10分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Gel Mount(Biomeda、Foster City、CA)で固定させた。移動した細胞(膜の下面に付着した細胞)を高出力長(x20)からランダムに選択されたスコープで計数した。
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)をそれぞれ単独処理した場合と、クロルフェネシンとクロロキン、またはクロロピラジンを併用処理した場合、大腸癌細胞株CT26、HCT116およびSW480の移動程度を確認した。
1-2-2-1.クロルフェネシン単独投与
癌細胞の転移は、細胞の運動性が前提とされるべき関係であるので、クロルフェネシン(OC-201)を単独処理した場合、大腸癌細胞株HCT116の移動程度を、創傷治癒アッセイで確認した。具体的には、大腸癌細胞株HCT116を、10%FBSが補充されたRPMIに添加し、24時間後、単層で70~80%コンフルエンスに達したときの濃度で24ウェル組織培養プレートに接種した。ウェルの中央を横切って、新しい200μLイエローピペットチップで断層に慎重にゆっくりとスクラッチを出した。結果として生成されたギャップ距離をチップの端の外径と同じにした。スクラッチを出した後、ディッシュを培地に慎重に2回洗浄して分離された細胞を除去した。その後、クロルフェネシン0μM(DMSO)、5μM、10μM、25μM、50μM、250μM、500μMまたは1mMを処理し、インキュベーション0時間、8時間、および24時間後、顕微鏡で確認をし、グラフ化した。
クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)をそれぞれ単独処理した場合と クロルフェネシン(OC-201)をこれらとそれぞれ併用処理した場合、大腸癌細胞株HCT116の移動程度を確認した。具体的には、大腸癌細胞株HCT116を、10%FBSが補充されたRPMIに添加し、24時間後、単層で70~80%コンフルエンスに達したときの濃度で24ウェル組織培養プレートに接種した。ウェルの中央を横切って、新しい200μLイエローピペットチップで断層に慎重にゆっくりとスクラッチを出した。結果として生成されたギャップ距離をチップの端の外径と同じにした。スクラッチを出した後、ディッシュを培地に慎重に2回洗浄して分離された細胞を除去した。その後、クロロキン単独処理(5、10、または25μM)、クロロピラジン単独処理(25または50μM)、クロルフェネシンとクロロキン併用処理(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、およびクロルフェネシンとクロロピラジン併用処理(5μM+ 25μM、5μM+50μM)した後、0時間、8時間、または24時間後の細胞の移動程度を前記実施例1-2-2-1と同様の方法で確認した。
1-3-1.クロルフェネシン単独投与
非付着増殖能(Anchorage independent growth)は、正常細胞と癌細胞を区分する重要な形質であって、正常細胞が増殖する際に付着(anchorage)を必要とするが、癌細胞は、付着せずに生存し、増殖することができる。すなわち、正常細胞は、細胞が培養プレートに付着していない場合は、増殖することができないが、癌細胞は軟寒天(soft agar)のように、細胞接着がない浮遊状態で増殖可能な特性を利用して、軟寒天コロニー形成アッセイを通じて非付着増殖能を確認した。まず、クロルフェネシン単独投与による大腸癌細胞株の非付着増殖能を確認するために、コロニー形成アッセイ(colony formation assay)を行った。具体的には、大腸癌細胞株HCT116 3千個を軟寒天と混ぜて6ウェルプレートに分注した後、クロルフェネシン0μM(DMSO)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1mMまたは2mMで処理した。その後、細胞培地を交換するたびにクロルフェネシンも一緒に補充し、細胞分周3週間後に観察した。
クロルフェネシンとクロロキン(OC-202)またはクロロピラジン(OC-203)を併用処理した場合、大腸癌細胞株の非付着増殖能が単独処理に比べて抑制するのかを確認するために、大腸癌細胞株HCT116およびCT26にそれぞれクロルフェネシン5μM、クロロキン10または25μM、クロロピラジン10μM、クロルフェネシンとクロロキン(5μM+10μMまたは5μM+25μM)、クロルフェネシンとクロロピラジン(5μM+10μM、5μM+25μMまたは5μM+50μM)を処理してコロニー形成アッセイを行った。
2-1.細胞生存率の確認
2-1-1.単独投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)のそれぞれの単独投与が膵臓癌細胞の生存率に及ぼす影響を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega、 Ltd.)により、膵臓癌細胞株Aspc-1、MIAPaCA2およびPanc-1に対する細胞生存率を評価した。それぞれの膵臓癌細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種し、クロルフェネシン(OC-201)をOμM(対照群DMSO処理)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μMおよび1mM(1000μM)で、クロロキン(OC-202)をOμM(対照群DMSO処理)、0.5μM、1μM、5μM、10μM、25μM、50μMおよび100μM、およびクロロピラジン(OC-203)をOμM(対照群DMSO処理)、1μM、5μM、10μM、25μM、50μMおよび100μMで、それぞれ24h 、48hまたは72hの間、前処理した細胞を4時間5mg/mL MTTと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、30℃で4時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、前記(式1)を用いて、細胞生存率を計算した。
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)の組み合わせによる併用処理による膵臓癌細胞の生存率を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega、 Ltd.)により、膵臓癌細胞株Aspc-1、MIAPaCA2およびPanc-1の細胞生存率を評価した。それぞれの膵臓癌細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種し、対照群(DMSO処理)、クロルフェネシン5μM、クロルフェネシンとクロロキン(クロルフェネシン5μMおよびクロロキン1、5、10、25、または50μMの併用処理、クロロキン0.5μMおよびクロルフェネシン1、5、10、25、または50μMの併用処理、クロロキン1μMおよびクロルフェネシン1、5、10、25または50μMの併用処理、またはクロロキン5μMとクロルフェネシン1、5、10、25、または50μMの併用処理)、またはクロルフェネシンとクロロピラジン(クロルフェネシン5μMおよびクロロピラジン1、5、10、25または50μMの併用処理)を処理した後、それぞれ24h、48hまたは72h後、細胞を4時間5mg/mL MTTと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、30℃で4時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、前記(式1)を用いて細胞生存率を計算した。
2-2-1.単独と併用処理との比較
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)をそれぞれ単独処理した場合と、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した場合、膵臓癌細胞株Panc-1およびAspc- 1の移動程度を、前記実施例1-2-1と同様の方法で確認した。具体的には、膵臓癌細胞株Panc-1およびAspc-1に対照群(DMSO)、クロルフェネシン(5μM)、クロロキン(5μM、10μMまたは25μM)、クロロピラジン(25μMまたは50μM)、クロルフェネシンおおびクロロキン(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、およびクロルフェネシンとクロロピラジン(5μM+25μM、5μM+50μM)で処理した後、細胞の移動程度を前記実施例1-2-1と同様の方法で確認した。また、併用処理時、上昇作用(synergistic effect)をCompusyn softwareを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数(Combination Index、CI)を通じて計算した。
本発明のクロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)が、細胞の組織を取り囲んでいる薄い膜に穴を開けたり、細胞の間々を満たしている細胞外基質を分解しながら、他の部位に浸潤して転移する癌細胞の特性を阻害していることを確認するためには、細胞外基質を模写したマトリゲル(matrigel)を使用した浸潤解析(invasion assay)を行った。具体的には、膵臓癌細胞株Panc-1およびMIACaPa2を無血清RPMIに懸濁した後、ポリカーボネート膜(8.0μMpore size、 Costar)を有する24ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーにウェル当たり1x105細胞に添加した。マトリゲル(10μg/ml)を下部ウェルに位置させ、それぞれの細胞に対照群(DMSO)、クロルフェネシン(5μM)、クロロキン(5μM、10μMまたは25μM)、クロロピラジン(25μMまたは50μM)、クロルフェネシンとクロロキン(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、およびクロルフェネシンとクロロピラジン(5μM+25μM、5μM+50μM)で処理した。その後、細胞を37℃のCO2インキュベーター内で18時間培養した。その後、細胞を30分間PBS内で70%メチルアルコールで固定し、PBSで3回洗浄した。細胞をヘマトキシリン(Sigma)で10分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Gel Mount(Biomeda、Foster City、CA)で固定させた。移動した細胞(膜の下面に付着した細胞)を高出力長(x20)からランダムに選択されたスコープで計数した。また、併用処理時、上昇作用(synergistic effect)をCompusyn softwareを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数(Combination Index、CI)を通じて計算した。
3-1.細胞生存率の確認
3-1-1.単独投与による細胞生存率の確認
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)それぞれの単独投与が胆道癌細胞の生存率に及ぼす影響を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega 、Ltd.)により、胆道癌細胞株SNU1079およびSNU308の細胞生存率を評価した。それぞれの胆道癌細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種し、クロルフェネシン(OC-201)をOμM(対照群DMSO処理)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μMと1mM(1000μM)であり、およびクロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)を、それぞれOμM(対照群DMSO処理)、1μM、5μM、10μM、25μM、50μMおよび100μMでそれぞれ24h、48hまたは72hの間に前処理した細胞を4時間、5mg/mL MTTと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液および中断溶液を追加した後、30℃で4時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、前記(式1)を用いて細胞生存率を計算した。
クロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)およびクロロピラジン(OC-203)の組み合わせによる併用処理による胆道癌細胞の生存率を確認するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega 、Ltd.)により、胆道癌細胞株SNU1079およびSNU308に対する細胞生存率を評価した。それぞれの胆道癌細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種し、対照群(DMSO処理)、クロルフェネシン(OC-201)5μMの処理、クロルフェネシンとクロロキン(OC-202 )併用処理(クロルフェネシン5μM+クロロキン1、5、10、25、または50μM併用処理)、またはクロルフェネシンとクロロピラジン(OC-203)併用処理(クロルフェネシン5μM+クロロピラジン1、5、10、25、50、または100μM併用処理)した後、それぞれ24h、48hまたは72h後、細胞を4時間5mg/mL MTTと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、30℃で4時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、前記(式1)を用いて、細胞生存率を計算した。
3-2-1.クロルフェネシン単独投与
クロルフェネシン(OC-201)の処理濃度による胆道癌細胞株SNU1079の移動性を移動解析方法を通じて確認した。具体的には、胆道癌細胞株SNU1079を無血清RPMIに懸濁した後、ポリカーボネート膜(8.0μMpore size、Costar)を有する24ウェルトランスウェルチャンバーの上部チャンバーにウェル当たり1x105細胞に添加した。ラミニン(10μg/ml)を下部ウェルに位置し、クロルフェネシン5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1mMまたは2mMを処理した。細胞は、37℃のCO2インキュベーター内で18時間培養して移動するようにした。その後、細胞を30分間、PBS内で70%メチルアルコールで固定し、PBSで3回洗浄した。細胞をヘマトキシリン(Sigma)で10分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜の上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Gel Mount(Biomeda、Foster City、CA)で固定させた。移動した細胞(膜の下面に付着した細胞)を高出力長(x20)からランダムに選択されたスコープで計数した。
クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンを併用処理した場合、胆道癌細胞株SNU1079の移動性を移動解析方法を通じて確認した。具体的には、胆道癌細胞株SNU1079に対照群(DMSO)、クロルフェネシン(5μM)、クロロキン(5μM、10μMまたは25μM)、クロロピラジン(25μMまたは50μM)、クロルフェネシンとクロロキン(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、およびクロルフェネシンとクロロピラジン(5μM+25μM、5μM+50μM)を処理した後、細胞の移動程度を前記実施例3-2-1と同様の方法で確認した。また、併用処理時、上昇作用(synergistic effect)を、Compusyn softwareを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数(Combination Index、CI)を通じて計算した。
本発明のクロルフェネシン(OC-201)、クロロキン(OC-202)とクロロピラジン(OC-203)が単独または併用処理時、他の部位に浸潤して転移する癌細胞の特性を阻害していることを確認するため、胆道癌細胞株SNU1079に対照群(DMSO)、クロルフェネシン(5μM)、クロロキン(5μM、10μMまたは25μM)、クロロピラジン(25μMまたは50μM)、クロルフェネシンとクロロキン(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、およびクロルフェネシンとクロロピラジン(5μM+25μM、5μM+50μM)を処理して、前記実施例2-3に記載された方法で浸潤解析(invasion assay)を行った。また、併用処理時、上昇作用(synergistic effect)を、Compusyn softwareを利用して、クロルフェネシンとクロロキンまたはクロロピラジンの併用処理濃度による併用係数(Combination Index、CI)を通じて計算した。
4-1.クロルフェネシン大腸癌の転移抑制効果の確認
4-1-1.細胞毒性のない低濃度の決定
細胞毒性のないクロルフェネシン濃度を決定するために、製造業者のプロトコルに従って、MTT assay(Promega、Ltd.)により、細胞生存率を評価した。CT26細胞株およびHCT-116細胞株をウェル当たり5×103細胞の密度で96ウェルプレートに接種した。クロルフェネシン(100ppm、1μM、10μM、100μM、1mMおよび10mM)を前処理する、または前処理せずに、それから細胞を4時間5mg/mL MTTと共にインキュベーションした。その後、培地を除去し、150μLの可溶化溶液と中断溶液を追加した後、30℃で4時間インキュベーションした。反応溶液の吸光度を570nmで測定した。細胞生存率は、前記(式1)で計算した。図57から見られるように、CT26細胞およびHCT-116細胞いずれも1μM~1mMの濃度範囲で細胞毒性がないことを確認した。
4-1-1-1.移動解析
ポリカーボネート膜(8.0μMpore size、Costar)を有する24ウェルトランスウェルチャンバーを使用して、細胞の移動を評価した。CT26とHCT116大腸癌細胞を無血清RPMIに懸濁した後、ウェル当たり1x105細胞で上部チャンバーに添加した。ラミニン(10μg/ml)を下部ウェルに位置させ、細胞が37℃のCO2インキュベーター内で8時間移動するようにした。細胞を30分間、PBS内で70%メチルアルコールで固定し、PBSで3回洗浄した。細胞をヘマトキシリン(Sigma)で10分間染色し、蒸留水で洗浄した。移動していない細胞を綿棒で膜の上面から除去した。膜をチャンバから切除し、Gel Mount(Biomeda、Foster City、CA)で固定させた。移動した細胞(膜の下面に付着した細胞)を高出力長(x20)からランダムに選択されたスコープで計数した。
細胞の運動性を測定するために創傷治癒アッセイを実施した。まず、CT26大腸癌細胞株を、10%FBSが補充されたRPMIに添加し、24時間後、単層で70~80%コンフルエンスに達したときの濃度で、24ウェル組織培養プレートに接種した。ウェルの中央を横切って、新しい200μLイエローピペットチップで断層に慎重にゆっくりとスクラッチを出した。結果として生成されたギャップ距離をチップの端の外径と同じにした。スクラッチを出した後、ディッシュを培地に慎重に2回洗浄して分離された細胞を除去した。クロルフェネシン(1μM)の存在または不在下で細胞を24時間インキュベーションした後、顕微鏡で染色された断層の写真を撮影した。
クロルフェネシンによる腫瘍増殖抑制効果を動物実験で確認した。具体的には、60匹Balb/c miceに100μLのCT26細胞懸濁液(1x107 cells/mL)を1回皮下接種し、腫瘍を誘発させて異種移植動物モデル(Xenograft animal model)を製造した。癌細胞接種後、3日後から5週間の間、抗癌剤であるフルオロウラシル(5’FU)と併用して、または単独でクロルフェネシンを投与した。まず、フルオロウラシルとの併用投与実験群として、11匹の動物モデルに5週間25mg/kgのフルオロウラシル(週5回投与)と、10mg/kgのクロルフェネシン(週3回投与)を腹腔内に併用投与した。クロルフェネシン単独投与実験群としては、10匹の動物モデルに5週間、10mg/kgのクロルフェネシンを週3回腹腔投与したり、14匹の動物モデルに5週間、20mg/kgのクロルフェネシンを週5回経口投与した。陰性対照群として14匹の動物モデルにクロルフェネシンと同容量のPBSを投与し、陽性対照群として14匹の動物モデルに抗癌剤である、25mg/kgのフルオロウラシルを単独で週5回投与した。動物モデルの体重を週1回測定し、腫瘍の大きさを薬物投与日から週1回測定した。6週間後に、動物モデルをエーテルで麻酔した後、腫瘍と肺を収集した。
Claims (6)
- クロルフェネシン(chlorphenesin)または薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物(但し、クロルフェネシン及びクロロピラジンを有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学組成物を除く)であって、前記癌は大腸癌または胆道癌である、癌の予防または治療用薬学組成物。
- クロルフェネシンは、下記化1で表される、請求項1に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
- クロルフェネシンまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、癌の増殖および転移抑制用薬学的組成物(但し、クロルフェネシン及びクロロピラジンを有効成分として含む、癌の増殖および転移抑制用薬学的組成物を除く)であって、前記癌は大腸癌または胆道癌である、癌の増殖および転移抑制用薬学的組成物。
- クロルフェネシンまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、抗癌サプリメント(但し、クロルフェネシン及びクロロピラジンを有効成分として含む、抗癌サプリメントを除く)であって、前記癌は大腸癌または胆道癌である、抗癌サプリメント。
- クロルフェネシンを含む、癌の予防または改善用食品組成物(但し、クロルフェネシン及びクロロピラジンを有効成分として含む、癌の予防または改善用食品組成物を除く)であって、前記癌は大腸癌または胆道癌である、癌の予防または改善用食品組成物。
- 癌の予防および治療用薬学的組成物の製造に使用するための、クロルフェネシンまたは薬学的に許容可能なその塩の使用(但し、クロルフェネシン及びクロロピラジンの使用を除く)であって、前記癌は大腸癌または胆道癌である、使用。
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