CN117398385A - 用于抑制癌症转移及治疗的组合物 - Google Patents

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CN117398385A CN202210853488.7A CN202210853488A CN117398385A CN 117398385 A CN117398385 A CN 117398385A CN 202210853488 A CN202210853488 A CN 202210853488A CN 117398385 A CN117398385 A CN 117398385A
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Abstract

本发明涉及一种用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，该组合物包含氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹，或其药学上可接受的盐作为有效成分，可以有效预防或治疗癌症转移。

Description

用于抑制癌症转移及治疗的组合物
技术领域
本发明涉及一种用于抑制癌症转移的组合物，涉及氯苯甘醚及羟氯喹的单独或联合处理对癌症转移及浸润的抑制效果。
背景技术
癌症(cancer)是在全球具有高死亡率的疾病之一。正常细胞会通过分裂、增殖及凋亡的一系列过程产生新的细胞，但在此过程中可能会出现问题，导致细胞异常分裂，不断增殖，并形成新的细胞群体。癌症是由异常细胞分裂及增殖引起的疾病，因此它可以在身体的任何组织中发病。
胰腺癌和大多数癌症一样，在早期没有特定的症状，当症状出现而被发现时，往往会因癌症已经进展而错过手术治疗时机，是早期诊断困难的肿瘤之一。通过手术进行切除是唯一的治疗方法，但确诊时能够接受手术的患者仅为5～20％左右。胰腺癌术后平均生存率为20％至30％左右，5年平均生存率不到5％，是一种预后极差的癌症。
在大多数情况下，恶性肿瘤在一个器官(肺、肝、肾、胃、大肠、直肠等)发生后，会从最初发生的原发部位即器官扩散到其他组织，这种从原发部位扩散到其他组织的情况被称为转移(metastasis)。转移是伴随着恶性肿瘤的进展出现的现象，随着恶性肿瘤细胞的增殖和癌症的进展，在获得转移所需的新遗传特征后，会浸润到血管和淋巴腺中，通过血液和淋巴循环定居在其他组织后进行增殖。
目前，为了治疗癌症，使用手术疗法、放射疗法及化学疗法等。其中，化学疗法是指使用抗癌剂来治疗癌症的方法。如今，已有约60多种不同的抗癌剂投入使用，而且近年来随着人们对癌症的发病及癌细胞特性的诸多了解，对研发新型抗癌剂的研究也在积极进行。并且，目前的治疗方法侧重于癌细胞的凋亡或去除，而对于直接影响癌症患者生存率的抑制癌细胞增殖和转移的药物研究则比较缺乏。尤其，癌细胞从原发肿瘤部位向其他部位的转移是癌症患者的重要死亡原因，也是治疗的最大难题。因此，为了治疗癌症并提高患者的生存率，迫切需要开发一种对癌细胞的增殖和转移具有抑制效果的药物。
因此，本发明人确认到氯苯甘醚或羟氯喹对癌细胞的增殖和转移具有抑制效果，并且确认到它们的组合具有协同作用，从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：韩国公开专利第10-2018-0014306号。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于抑制癌症转移或浸润的组合物。
为了实现上述目的，
本发明提供一种用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其包含选自由氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯苯氨酸甘油酯(chlorphenesin carbamate)及羟氯喹(hydroxychloroquine)组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分。
并且，本发明提供一种抗癌助剂，其包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分。
进而，本发明提供一种用于抑制癌症转移或浸润的食品组合物，其包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其食品学上可接受的盐作为有效成分。
进而，本发明提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含上述用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物。
本发明涉及一种用于抑制癌细胞转移及浸润的组合物，通过单独给予羟氯喹或与氯苯甘醚组合来联合给药，可以显着有效地抑制癌症转移及浸润。
附图说明
图1为示出胰腺癌细胞株PANC-1、MIApaca-2及ASPC-1对于氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的细胞存活率的图表。
图2为示出胰腺癌细胞株PANC-1、MIApaca-2及ASPC-1分别对于氯喹(OC-202)及羟氯喹(HCQ)的细胞存活率的图表。
图3为示出胰腺癌细胞株PANC-1、MIApaca-2及ASPC-1根据氯苯氨酸甘油酯(OC-201)与氯喹(OC-202)或与羟氯喹(HCQ)联合处理浓度的细胞存活率的图表。
图4为确认ASPC-1细胞根据氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的处理浓度的迁移程度的图。
图5为确认氯苯氨酸甘油酯(OC-201)对MIApaca-2癌细胞迁移的抑制效果的图。
图6为确认ASPC-1细胞根据氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的处理浓度的浸润分析结果的图。
图7为确认氯苯氨酸甘油酯(OC-201)对MIApaca-2癌细胞浸润的抑制效果的图。
图8为确认ASPC-1细胞根据氯喹(OC-202)及氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的处理浓度的迁移程度的图。
图9为确认氯喹(OC-202)及羟氯喹(HCQ)对MIApaca-2癌细胞迁移的抑制效果的图。
图10为确认ASPC-1细胞根据氯喹(OC-202)及氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的处理浓度的迁移分析结果的图。
图11为确认氯喹(OC-202)及羟氯喹(HCQ)对MIApaca-2癌细胞浸润的抑制效果的图。
图12为确认ASPC-1细胞根据氯苯氨酸甘油酯(OC-201)与氯喹(OC-202)或与羟氯喹(HCQ)的联合处理浓度的迁移程度的图。
图13为确认氯苯氨酸甘油酯(OC-201)与氯喹(OC-202)或与羟氯喹(HCQ)的联合处理对MIApaca-2癌细胞迁移的抑制效果的图。
图14为确认ASPC-1细胞根据氯苯氨酸甘油酯(OC-201)与氯喹(OC-202)或与羟氯喹(HCQ)的联合处理浓度的浸润分析结果的图。
图15为确认氯苯氨酸甘油酯(OC-201)与氯喹(OC-202)或与羟氯喹(HCQ)的联合处理对MIApaca-2癌细胞浸润的抑制效果的图。
图16为确认氯苯氨酸甘油酯(OC-201)、氯喹(OC-202)和/或羟氯喹(HCQ)对癌症转移的抑制机制的图。
图17为使用MIAPaCa-2诱导的肝转移模型来确认药物的肝转移效果的实验设计的示意图。
图18为通过拍摄在MIAPaCa-2诱导的肝转移模型中，根据氯苯甘醚、羟氯喹或它们的联合处理(co-treatment)的肝(liver)组织的照片而获得的图像。
图19为对在MIAPaCa-2诱导的肝转移模型中，根据氯苯甘醚、羟氯喹或它们的联合处理而在肝组织中产生的结节(nodule)的数量进行量化的图表。
具体实施方式
以下，将参照附图，通过本发明的实例来对本发明进行详细说明。但是，以下实例作为本发明的例示而提出，如果判断出对本领域技术人员已知的技术或结构的具体说明有可能不必要地混淆本发明的主旨，则可以省略对此的详细说明，且本发明不因此而受限制。可以在所附发明要求保护范围的记载及由此解释的等同范围内对本发明进行多种变形及应用。
并且，本说明书中使用的术语(terminology)是用于适当地表述本发明优选实施例的术语，其可以根据使用人员、操作者的意图或本发明所属领域的惯例等而改变。因此，对这些术语的定义应基于本说明书的全部内容而定。在整个说明书中，当提到某一部分“包括”某个结构要素时，除非另有相反的表述，否则意味着可以进一步包括其他结构要素，而不是排除其他结构要素。
在一实施方式中，本发明涉及一种用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其包含选自由氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯苯氨酸甘油酯(chlorphenesin carbamate)及羟氯喹(hydroxychloroquine)组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分。
在一实例中，氯苯甘醚可以由以下化学式1表示；氯苯氨酸甘油酯可以由以下化学式2表示；羟氯喹可以由以下化学式3表示：
化学式1
化学式2
化学式3
上述氯苯氨酸甘油酯(C10H12ClNO4，分子量245.66g/mol)(表示为OC-201)是可以用作氯苯甘醚的前药的一种药物，是苯氧基与氯及1,2-丙二醇相连的物质。氯苯氨酸甘油酯(OC-201)被用作治疗肌肉酸痛及痉挛的肌肉松弛剂。而且可以有效地防止细菌和霉菌，因此还被用作一种化妆品防腐剂。
羟氯喹(Hydroxychloroquine)(表示为HCQ)是一种降低了氯喹的毒性的药物，是以硫酸羟基氯喹片(Plaquenil)的商品名销售的一种预防和治疗疟疾的药物。它还用于治疗类风湿性关节炎、狼疮及慢性皮肤卟啉症等。目前正被作为新型冠状病毒肺炎的实验性治疗剂在研究当中。
氯喹(Chloroquine)(C18H26CIN3，分子量319.87g/mol)(表示为OC-202)是一种4-氨基喹啉衍生物，用作治疗疟疾、类风湿性关节炎和狼疮的药物。它还用于治疗卟啉症、日光性荨麻疹及皮肤血管炎。已知它通过与DNA及RNA聚合酶结合来干扰原虫的新陈代谢和血红蛋白的使用。并且已知它具有肌肉疾病、食欲不振、腹泻和皮疹等副作用，还具有对视力产生问题、肌肉损伤和癫痫等副作用。上述氯喹可以由以下化学式4表示：
化学式4
在一实例中，本发明的药物组合物可以包含选自由氯苯甘醚或氯苯氨酸甘油酯以及羟氯喹组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分；优选地，可以包含单独的羟氯喹；或氯苯甘醚及羟氯喹；或氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹作为有效成分，当包含氯苯甘醚或氯苯氨酸甘油酯以及羟氯喹时，具有协同的癌症转移及浸润抑制效果，因此更为优选。
在一实例中，本发明的药物组合物可以分别包含500nM至500μM的氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹。优选地，可以包含500nM至20μM的氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)、500nM至20μM的羟氯喹；在同时包含氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)与羟氯喹的情况下，可以包含5μM或10μM的氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)及500nM至20μM的羟氯喹。在本发明一实施例的细胞实验中，本发明的氯苯甘醚及羟氯喹在上述浓度范围内抑制了癌细胞的迁移及浸润而没有严重的细胞毒性。
在本发明的一实施例中，确认到本发明的羟氯喹对癌症转移及浸润具有与在现有研究中已确认具有癌症转移抑制效果的氯喹相似或稍低的抑制效果，但在联合组合氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)与羟氯喹时，与在联用氯苯甘醚与氯喹时相比，对抑制癌症转移及浸润具有更优异的协同效应。
在一实例中，上述癌症可以为实体癌，例如，可以为选自由脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛周癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病(Hodgkin's disease)、食管癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆道癌(胆囊及胆管癌)、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤及垂体腺瘤组成的组中的一种以上，更优选地，可以为结肠癌、胰腺癌或胆道癌，特别优选地，可以为胰腺癌。
在本发明一实施例中，确认到氯苯甘醚及羟氯喹分别对于人胰腺癌(ancreaticcarcinoma)细胞株Panc-1，人胰腺癌细胞株Aspc-1及人胰腺癌细胞株MIAPaCA2的癌细胞转移及浸润的抑制效果，以及根据它们的组合的联合处理对癌细胞转移及浸润的抑制效果。
本发明不仅包括由化学式1至化学式3表示的氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹，还包括它们的药学上可接受的盐，以及可以由它们制备的溶剂化物、水合物、外消旋体、立体异构体及前药(prodrug)。
由化学式1及化学式3表示的本发明的氯苯甘醚及羟氯喹能够以药学上可接受的盐的形式使用，作为盐，有用的是由药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐。酸加成盐从如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸或亚磷酸等的无机酸类以及如脂肪族单羧酸盐及二羧酸盐、苯基取代的链烷酸盐、羟基链烷酸盐及链烷酸盐、芳族酸、脂肪族及芳香族磺酸类等的无毒有机酸获得。这种药学上无毒的盐类包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、氯化焦磷酸盐、溴化物、碘化物、氟化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己烷-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、苯甲酸甲酯、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、羟基丁酸盐、乙醇酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐或扁桃酸盐。
本发明的酸加成盐可以通过常规方法制备，例如，可以将由化学式1及化学式3表示的氯苯甘醚及羟氯喹溶解在过量的酸水溶液中，通过使用如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈等水混溶性有机溶剂对上述盐进行沉淀来制备。而且，也可通过从上述混合物中蒸发溶剂或过量酸来干燥，或通过吸入过滤析出的盐来制备。
并且，也可以使用碱来制备药学上可接受的金属盐。例如，碱金属或碱土金属盐可以通过将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中，过滤未溶解的化合物盐，并蒸发干燥滤液而得。在此情况下，作为金属盐，药学上合适的是制备钠盐、钾盐或钙盐。而且，与之相应的银盐通过使碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(如硝酸银)反应而得。
在一实例中，羟氯喹能够以由以下化学式5表示的硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine sulfate)(C18H26ClN3O·H2SO4，分子量433.95g/mol)的前药的形式使用。
化学式5
本发明的药物组合物除了氯苯甘醚及羟氯喹以外，还可以包含其他已知的癌症转移抑制剂作为有效成分，也可以与其他已知的治疗这些疾病的疗法联合使用。其他疗法包括化学疗法、放射疗法(例如，照射X射线及γ射线等)、激素疗法、骨髓移植、干细胞替代疗法、其他生物疗法、免疫疗法等，但不限于此。
在本发明中，与有效成分结合使用的术语“治疗有效量”是指用于预防或治疗目标疾病的有效量，本发明的组合物的治疗有效量可以根据如给药方法、目标部位、患者状况等多种因素而变化。因此，当用于人体时，应同时考虑安全性及有效性来确定适当的剂量。还可以根据通过动物实验确定的有效量来估计对人体的用量。例如，《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础》(Hardman and Limbird，eds.，Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics，10th ed.(2001)，Pergamon Press)；以及《雷明顿药物科学》(E.W.Martin ed.，Remington's Pharmaceutical Sciences，18th ed.(1990)，Mack Publishing Co.)中记载了在确定有效量时需要考虑的上述事项。
本发明的药物组合物按药学有效量给药。本发明所使用的术语“药学有效量”是指在可适用于医学治疗的合理受益/风险比率下，足以治疗疾病且不引起副作用的剂量，有效剂量水平可根据患者的健康状况、癌症种类、严重程度、药物活性、对药物的敏感度、给药方法、给药时间、给药途径及排泄率、治疗周期、配方及同时使用的药物等因素以及其他医学领域熟知的因素来确定。本发明的组合物可以作为单独治疗剂或与其他治疗剂联合给药，也可以与现有治疗剂依次或同时使用，且可以单次或多次给药。重要的是在考虑到所有上述因素且在没有副作用的情况下用最少的量来获得最大效果，这可以由本领域技术人员容易地确定。
本发明的药物组合物可以包括生物制剂中常用的载体、稀释剂、赋形剂或它们的两种以上的组合。本发明所使用的术语“药学上可接受”是指对暴露于上述组合物的细胞或人无毒的特性。上述载体只要是适于在体内传递组合物的就不作特别限制，例如，可以混合使用《默克索引》(Merck Index，13th ed.，Merck&Co.Inc.)中记载的化合物、生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及这些成分中的一种以上，也可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等其他常规添加剂。并且，还可以额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂及润滑剂配制成水溶液、悬浮液、乳浊液等可注射剂型、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。并且，还可使用本领域的适当方法或《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton PA，18th，1990)中公开的方法，根据不同的疾病或成分适当地进行配制。
在一实例中，上述药物组合物可以为选自由口服剂型、外用剂、栓剂、无菌注射液及喷雾剂组成的组中的一种以上的剂型，更优选地，可以为口服或注射剂型。
本发明的组合物还可以包含生物制剂中常用的载体、稀释剂、赋形剂或它们的两种以上的组合。药学上可接受的载体只要是适于在体内传递组合物的就不作特别限制，例如，可以混合使用《默克索引》中记载的化合物、生理盐水、无菌水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及这些成分中的一种以上，也可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂等其他常规添加剂。并且，还可以额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂等来配制成水溶液、悬浮液、乳浊液等可注射剂型、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。进而，还可使用本领域的适当方法或《雷明顿药物科学》中公开的方法，根据不同的疾病或成分适当地进行配制。
本发明所使用的术语“给药”是指通过任意合适的方式向个体或患者提供规定物质，可以根据所需方法进行非口服给药(例如，作为注射剂型应用于静脉内、皮下、腹膜内或局部)或口服给药，剂量范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、膳食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度等而不同。用于口服给药的本发明的组合物的液体制剂有悬浮剂、内服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了作为常用的简单稀释剂的水、液体石蜡以外，还可以包括多种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、香料、保鲜剂等。用于非口服给药的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。本发明的药物组合物也可以通过能够将活性物质输送至靶细胞的任意装置给药。优选的给药方式及制剂为静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉内注射剂、滴注剂等。注射剂可以使用如生理盐水溶液、林格氏溶液等水性溶剂或如植物油、高级脂肪酸酯(例如，油酸乙酯等)、醇类(例如，乙醇、苯甲醇、丙二醇、甘油等)等水性溶剂进行制备，并且可以包括用于防止变质的稳定剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、BHA、生育酚、EDTA等)、乳化剂、用于调节pH的缓冲剂、用于抑制微生物生长的保鲜剂(例如，硝酸苯汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)等药物载体。
本发明所使用的术语“个体”是指患有或可能患上癌症的包括人、猴、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔和豚鼠在内的所有动物，通过向个体注射本发明的药物组合物可以有效地预防或治疗上述疾病。本发明的药物组合物也可以与现有的治疗剂平行给药。
本发明的组合物还可以包含一种以上具有相同或相似功能的有效成分。相对于组合物总重量，本发明的组合物包含0.0001重量百分比至10重量百分比的蛋白质，优选地，包含0.001重量百分比至1重量百分比的蛋白质。
本发明的药物组合物还可以包含药剂学上可接受的添加剂，在此情况下，药剂学上可接受的添加剂可以使用淀粉、凝胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、糖浆、阿拉伯胶、预胶化淀粉、玉米淀粉、粉状纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、羟基乙酸淀粉钠、巴西棕榈、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇及滑石等。优选地，本发明的药剂学上可接受的添加剂含量可以为相对于上述组合物的0.1重量份至90重量份，但不限于此。
本发明的组合物可以根据所需方法进行非口服给药(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部应用)或口服给药，剂量范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、膳食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度等而不同。本发明的组合物的日剂量为0.0001mg/ml至50mg/ml，优选为0.0001mg/ml至30mg/ml，更优选每日一次至数次分次给药。
在一实施方式中，本发明涉及一种抗癌助剂，其包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分。
在一实例中，本发明的抗癌助剂可以包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分；优选地，可以包含单独的羟氯喹；或氯苯甘醚及羟氯喹；或氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹作为有效成分，当包含氯苯甘醚或氯苯氨酸甘油酯以及羟氯喹时，具有协同的癌症转移及浸润抑制效果，因此更为优选。
在一实例中，本发明的抗癌助剂可以分别包含500nM至500μM的氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹。优选地，可以包含500nM至20μM的氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)、500nM至20μM的羟氯喹；当同时包含氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)和羟氯喹时，可以包含5μM或10μM的氯苯甘醚(或氯苯氨酸甘油酯)及500nM至20μM的羟氯喹。
本发明的药物组合物或抗癌助剂除了氯苯甘醚及羟氯喹以外，还可以包含其他已知的抗癌剂作为有效成分，也可以与其他已知的治疗这些疾病的疗法联用。其他疗法包括化学疗法、放射疗法、激素疗法、骨髓移植、干细胞替代疗法、其他生物疗法、免疫疗法等，但不限于此。
在一实例中，本发明的药物组合物或抗癌助剂可以与抗癌剂联合给药。
在一实例中，本发明的药物组合物或抗癌助剂可以与抗癌剂同时(simultaneous)、单独(separate)或依次(sequential)给药。
在一实例中，上述抗癌剂的示例包括：甲乙胺(mechloethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙氨酸(phenylalanine)、芥末(mustard)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine：BCNU)、洛莫司汀(lomustine：CCNU)、链脲佐菌素(streptozotocin)、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)等DNA烷化剂(DNA alkylatingagents)；放线菌素(dactinomycin：actinomycin D)、多柔比星(doxorubicin：adriamycin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普利霉素(plicamycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)及博来霉素(bleomycin)等抗癌抗生素(anti-cancer antibiotics)；长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康(topotecan)及伊立替康(iridotecan)等植物生物碱(plantalkaloids)；以及达克替尼(dacomitinib)、奥希替尼(osimertinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、吡罗替尼(Pyrotinib)、埃克替尼(Lcotinib)、帕尼单抗(Panitumumab)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、奈拉替尼(Neratinib)、凡德他尼(Vandetanib)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)或阿法替尼(afatinib)等，但不限于此。
本发明的术语“抗癌助剂”是指能够改善、提高或增强抗癌剂的抗癌效果的制剂，其本身不具有抗癌活性，但在与抗癌剂一起使用时，可以改善、提高或增强上述抗癌剂的抗癌效果。并且，当将具有浓度依赖性抗癌活性的制剂以其本身不具有抗癌活性的水平与抗癌剂一起使用时，可以改善、提高或增强上述抗癌剂的抗癌效果。
只要能够使抗癌助剂到达靶组织，就可以通过任何常规途径给药。本发明的抗癌助剂可以根据需要进行腹腔内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、口服、鼻内给药、肺内给药和直肠内给药，但不限于此。并且，上述抗癌助剂可以通过能够将活性物质输送至靶细胞的任意装置给药。
在一实施方式中，本发明涉及一种用于抑制癌症转移或浸润的食品组合物，其包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其食品学上可接受的盐作为有效成分。
在一实例中，本发明的食品组合物可以包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其食品学上可接受的盐作为有效成分，优选地，可以包含单独的羟氯喹；或氯苯甘醚及羟氯喹；或氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹作为有效成分，当包含氯苯甘醚或氯苯氨酸甘油酯以及羟氯喹时，具有协同的癌症转移及浸润抑制效果，因此更为优选。
在一实例中，上述癌症可以为选自由脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛周癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌种、霍奇金病、食管癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆道癌(胆囊及胆管癌)、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤及垂体腺瘤组成的组中的一种以上，更优选地，可以为结肠癌、胰腺癌或胆道癌，特别优选胰腺癌。
当将本发明的组合物作为食品组合物使用时，可以直接添加氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹或与其他食品或食品成分一起使用，并且可以按照常规方法适当使用。除了有效成分以外，上述组合物还可以包含食品学上可接受的食品辅助添加剂，有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、保健或治疗)来适当决定。
本发明所使用的术语“食品辅助添加剂”是指可以辅助添加到食品中的组分，是在制备各种剂型的保健功能食品时添加的物质，可由本领域的技术人员适当地选择并使用。食品辅助添加剂的示例包括多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成调味剂及天然调味剂等调味剂、着色剂及填充剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂等，但本发明的食品辅助添加剂的种类不限于上述示例。
本发明的食品组合物可以包括保健功能食品。本发明所使用的术语“保健功能食品”是指使用对人体有用的功能性原料或成分来制备及加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体状、丸状等形态的食品。这里的“功能性”是指具有对人体结构及功能产生如调节营养物质或生理作用等保健用途的有用的效果。本发明的保健功能食品可以采用本技术领域中常用的方法制备，在上述制备过程中可以添加本技术领域中常用的原料及成分来制备。而且，上述保健功能食品的剂型只要是公认为保健功能食品的剂型就可以不受限制地制备。本发明的食品用组合物可以制备成多种形态的剂型，与一般的药物不同，由于以食品为原料，因此具有不存在长期服用药物时可能产生的副作用等的优点，并且便于携带，因此本发明的保健食品可以作为增强抗癌剂效果的助剂来食用。
而且，可以使用本发明的组合物的保健食品的种类没有任何限制。同时，本发明的包含氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯或羟氯喹作为有效成分的组合物可以根据本领域技术人员的选择，将保健功能食品中可能含有的其他辅助成分与已知的添加剂混合来制备。可添加的食品的示例包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、快餐类、饼干类、比萨、方便面、其他面条类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳制品、各种调料、饮料、茶、口服液、酒精饮料及维生素复合剂等，也可以将本发明的提取物作为主要成分添加到汁、茶、果冻和果汁中来制备。
在一实施方式中，本发明涉及一种包含用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物的用于预防或治疗癌症的药物组合物，上述用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分。
在本发明中，术语“预防”是指通过给予本发明的药物组合物来抑制或延缓癌症的发生、扩散及复发的所有行为，术语“治疗”是指通过给予选自由本发明的氯苯甘醚及羟氯喹中的一种以上，或其药学上可接受的盐，或包含其的组合物来使癌细胞凋亡或改善或有益地改变癌症症状的所有行为。本发明所属技术领域的普通技术人员可以通过参照韩国大韩医学协会等提供的资料了解本申请的组合物能够起到效果的疾病的准确标准，并判断其改善、提高及治疗的程度。
在一实例中，本发明的药物组合物可以为用于预防或治疗转移性癌症或癌症转移的药物组合物。
在一实例中，本发明的药物组合物可以包含选自由氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹组成的组中的一种以上或其食品学上可接受的盐作为有效成分，优选地，可以包含单独的羟氯喹；或氯苯甘醚及羟氯喹；或氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹作为有效成分，当包含氯苯甘醚或氯苯氨酸甘油酯以及羟氯喹时，具有协同的癌症转移及浸润抑制效果，因此更为优选。
在一实例中，上述癌症可以为选自由脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛周癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌种、霍奇金病、食管癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆道癌(胆囊及胆管癌)、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤及垂体腺瘤组成的组中的一种以上，更优选地，可以为结肠癌、胰腺癌或胆道癌，特别优选胰腺癌。
本发明的药物组合物除了氯苯甘醚、氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹以外，还可以包含其他已知的抗癌剂作为有效成分，也可以与其他已知的治疗这些疾病的疗法联用。其他疗法包括化学疗法、放射疗法、激素疗法、骨髓移植、干细胞替代疗法、其他生物疗法、免疫疗法等，但不限于此。
本发明的药物组合物可以包含的抗癌剂的示例包括：甲乙胺(mechloethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、苯丙氨酸(phenylalanine)、芥末(mustard)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine：BCNU)、洛莫司汀(lomustine：CCNU)、链脲佐菌素(streptozotocin)、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)等DNA烷化剂(DNA alkylatingagents)；放线菌素(dactinomycin：actinomycin D)、多柔比星(doxorubicin：adriamycin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普利霉素(plicamycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)及博来霉素(bleomycin)等抗癌抗生素(anti-cancer antibiotics)；长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(iridotecan)等植物生物碱(plant alkaloids)；以及达克替尼(dacomitinib)、奥希替尼(osimertinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、吡罗替尼(Pyrotinib)、埃克替尼(Lcotinib)、帕尼单抗(Panitumumab)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、奈拉替尼(Neratinib)、凡德他尼(Vandetanib)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)或阿法替尼(afatinib)等，但不限于此。
下面将通过以下实施例更详细地说明本发明。但是，以下实施例仅用于具体化本发明的内容，本发明不限于此。
实施例1.确认细胞毒性
1-1.氯苯甘醚的细胞毒性
为了确认氯苯甘醚的单独给药对胰腺癌细胞存活率的影响，作为等同于氯苯甘醚的有效成分，使用可在体内具有等同的药理作用并发挥等同效果的改善稳定性的前药药物氯苯氨酸甘油酯(OC-201)来代替氯苯甘醚，根据制造商的方案，通过MTT测定法(Promega公司)评估胰腺癌细胞株PANC-1、MIApaca-2及ASPC-1的细胞存活率。
将每个胰腺癌细胞株以每孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中，并将分别用0μM(对照组用DMSO处理)、500nM、1μM、5μM、10μM及2μM的氯苯氨酸甘油酯(OC-201)预处理72小时的细胞与5mg/mL的MTT一起孵育4小时。之后，去除培养基，加入150μL的增溶液及终止液，在30℃下孵育4小时。在570nm处测量反应溶液的吸光度。利用以下数学式1计算细胞存活率。
数学式1
细胞存活率＝实验组吸光度(570nm)/对照组吸光度(570nm)×100(％)
结果，在三种胰腺癌细胞株中，即使在用氯苯氨酸甘油酯处理并过了72小时后，在20μM的高浓度下也未观察到因氯苯氨酸甘油酯(OC-201)而引发的毒性(图1)。
1-2.氯喹及羟氯喹的细胞毒性
为了确认氯喹(OC-202)及羟氯喹(HCQ)的单独给药对胰腺癌细胞存活率的影响，根据制造商的方案，通过MTT测定法(Promega公司)评估胰腺癌细胞株PANC-1、MIApaca-2及ASPC-1的细胞存活率。
将每个胰腺癌细胞株以每孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中，并将分别用0μM(对照组用DMSO处理)、500nM、1μM、5μM、10μM及2μM的氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)预处理72小时的细胞与5mg/mL的MTT一起孵育4小时。之后，去除培养基，加入150μL的增溶液及终止液，在30℃下孵育4小时。在570nm处测量反应溶液的吸光度。利用上述数学式1计算细胞存活率。
通过在用500nM至20μM的氯喹和羟氯喹处理三种胰腺癌细胞株72小时后测量细胞存活率，确认到即使在20μM的高浓度下，两种药物均未表现出显着的毒性(图2)。
1-3.联合处理时的细胞毒性
为了确认在用氯苯氨酸甘油酯(OC-201)和氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)联合处理时是否对胰腺癌细胞产生毒性，根据制造商的方案，通过MTT测定法(Promega公司)评估胰腺癌细胞株PANC-1、MIApaca-2及ASPC-1的细胞存活率。
将每个胰腺癌细胞株以每孔5×103个细胞的密度接种在96孔板中，并将用5μM或10μM的氯苯氨酸甘油酯(OC-201)及氯喹(OC-202)或分别用0μM(对照组用DMSO处理)、500nM、1μM、5μM、10μM或2μM的羟氯喹(HCQ)预处理72小时的细胞与5mg/mL的MTT一起孵育4小时。之后，去除培养基，加入150μL的增溶液及终止液，在30℃下孵育4小时。在570nm处测量反应溶液的吸光度。利用上述数学式1计算细胞存活率。
测量结果，即使在将两种药物联合给药时，在20uM的高浓度下也未表现出显着的毒性(图3)。
实施例2.氯苯甘醚的癌症转移抑制效果
2-1.氯苯甘醚的癌细胞迁移抑制效果
由于癌细胞转移是以细胞的运动性为前提的关系，因此使用迁移分析方法(migration assay)评估氯苯甘醚处理对癌症转移中重要的细胞迁移性的变化的影响。为了确认氯苯甘醚的效果，通过迁移分析方法确认胰腺癌细胞株ASPC-1根据氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的处理浓度的迁移性。
具体地，将胰腺癌细胞株ASPC-1细胞株悬浮在无血清RPMI中，然后将以每孔1×105个细胞的密度添加到具有聚碳酸酯膜(孔径(pore size)8.0μM，Costar公司)的24孔Transwell小室的上室中。将层粘连蛋白(10μg/ml)置于下孔中，分别用0μM(对照组用DMSO处理)、5μM及10μM的氯苯氨酸甘油酯(OC-201)处理每个细胞。在37℃的CO2培养箱中培养18小时使细胞迁移。之后，在PBS中用70％甲醇将细胞固定30分钟，并用PBS洗涤3次。用苏木精(Sigma公司)染色细胞10分钟，并用蒸馏水洗涤。使用棉签从膜的上表面去除未迁移的细胞。从小室中切除膜，并用封片剂(Gel Mount(Biomeda公司，Foster City，CA))固定。在高倍视野(×20)中随机选择的范围内对迁移的细胞(附着在膜下表面的细胞)进行计数。
结果，确认到当用氯苯氨酸甘油酯(OC-201)处理ASPC-1细胞株时，胰腺癌细胞株的迁移性受到抑制(图4)。
并且，为了评估对于胰腺癌细胞株MIApaca-2的细胞迁移性，使用了孔径为8um的Transwell板，在其插入膜(insert membrane)中以2×105/每孔的密度接种用0μM(对照组用DMSO处理)、5μM及10μM的上述氯苯氨酸甘油酯(OC-201)处理的细胞，在37℃的CO2培养箱中培养18小时。培养后用PBS洗涤插入膜，用3.7％甲醛固定10分钟。固定后再次用PBS洗涤，用100％甲醇反应20分钟。用PBS洗涤，并用0.05％结晶紫(Crystal violet)染色1小时。染色结束后，用PBS进行洗涤，使用棉签去除未通过膜芯(membrane core)的细胞。去除细胞后，在常温下干燥水分并通过显微镜进行分析。
结果，确认到通过氯苯氨酸甘油酯(OC-201)的处理，胰腺癌细胞迁移性以浓度依赖性方式受到抑制(图5)。
2-2.氯苯甘醚的癌细胞浸润抑制效果
为了确认本发明的氯苯甘醚是否对通过穿透包围细胞组织的薄膜或分解填充在细胞之间的细胞外基质来浸润和转移到其他部位的癌细胞的特性具有抑制作用，使用模拟细胞外基质的基质胶(matrigel)对氯苯氨酸甘油酯(OC-201)进行浸润分析来分析侵袭性。
具体地，将胰腺癌细胞株ASPC-1悬浮在无血清RPMI中，然后将以每孔1×105个细胞的密度添加到具有聚碳酸酯膜(孔径8.0μM，Costar公司)的24孔Transwell小室的上室中。将基质胶(10μg/ml)置于下孔中，分别用氯苯氨酸甘油酯(OC-201，5μM或10μM)处理每个细胞。之后，在37℃的CO2培养箱中培养细胞18小时。之后，在PBS中用70％甲醇固定30分钟，并用PBS洗涤3次。用苏木精(Sigma公司)染色细胞10分钟，并用蒸馏水洗涤。使用棉签从膜的上表面去除未迁移的细胞。从小室中切除膜，并用封片剂(Biomeda公司，Foster City，CA)固定。在高倍视野(×20)中随机选择的范围内对迁移的细胞(附着在膜下表面的细胞)进行计数。
结果，如图6所示，确认到ASPC-1细胞株的浸润受到氯苯甘醚单独给药组的抑制。
并且，为了确认对胰腺癌细胞株MIApaca-2的浸润抑制效果，使用Boyden小室(boyden-chamber)，并用基质胶涂布在膜(membrane)上。在插入膜中以1×104个细胞/每孔的密度接种单独或联合处理的细胞，在37℃的CO2培养箱中培养18小时。培养后用蒸馏水洗涤3次，并用固定液固定10分钟。固定之后，再次用蒸馏水洗涤，用染色剂染色5分钟后进行洗涤。将染色的插入膜粘附在载玻片(slide-glass)上，除去未通过膜芯的细胞，在常温下干燥水分并通过显微镜进行分析。
结果，确认到用氯苯氨酸甘油酯(OC-201)处理的组中胰腺癌细胞的侵袭(浸润)减少(图7)。
由此，确认到氯苯甘醚(氯苯氨酸甘油酯，OC-201)对细胞没有毒性，能够通过抑制癌细胞转移中重要的细胞迁移和侵袭性来抑制癌细胞的转移。
实施例3.氯喹及羟氯喹的癌症转移抑制效果
3-1.氯喹及羟氯喹单独给药时的癌细胞迁移抑制效果
通过迁移测定法确认氯喹(OC-202)和羟氯喹(HCQ)是否诱导抑制胰腺癌细胞株ASPC-1的迁移。
具体地，将胰腺癌细胞株ASPC-1细胞株悬浮在无血清RPMI中，然后将以每孔1×105个细胞的密度添加到具有聚碳酸酯膜(孔径8.0μM，Costar公司)的24孔Transwell小室的上室中。将层粘连蛋白(10μg/ml)置于下孔中，分别用0μM(对照组用DMSO处理)、5μM及10μM的氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)处理每个细胞。在37℃的CO2培养箱中培养18小时使细胞迁移。之后，在PBS中用70％甲醇将细胞固定30分钟，并用PBS洗涤3次。用苏木精(Sigma公司)染色细胞10分钟，并用蒸馏水洗涤。使用棉签从膜的上表面去除未迁移的细胞。从小室中切除膜，并用封片剂(Biomeda公司，Foster City，CA)固定。在高倍视野(×20)中随机选择的范围内对迁移的细胞(附着在膜下表面的细胞)进行计数。
通过比较用氯喹(OC-202)和羟氯喹(HCQ)处理的组与未处理的组的ASPC-1细胞株的迁移性，确认到用药物处理的组的细胞迁移性受到抑制(图8)。
并且，用5μM或10μM的氯喹(OC-202)及羟氯喹(HCQ)分别处理胰腺癌细胞株MIApaca-2，并采用上述实施例2-1的方法进行评估。
结果，确认到在用氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)处理的组中，胰腺癌细胞MIApaca-2的迁移性以浓度依赖性方式受到抑制(图9)。
3-2.氯喹及羟氯喹的单独给药对癌细胞浸润的抑制效果
在确认到胰腺癌细胞株的迁移性受氯喹(OC-202)和羟氯喹(HCQ)的抑制后，进行浸润分析(invasion assay)来分析胰腺癌细胞的侵袭性。
具体地，将胰腺癌细胞株ASPC-1悬浮在无血清RPMI中，然后将以每孔1×105个细胞的密度添加到具有聚碳酸酯膜(孔径8.0μM，Costar公司)的24孔Transwell小室的上室中。将基质胶(10μg/ml)置于下孔中，分别用氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)(分别用5μM或10μM)处理每个细胞。之后，在37℃的CO2培养箱中培养细胞18小时。之后，在PBS中用70％甲醇将细胞固定30分钟，并用PBS洗涤3次。用苏木精(Sigma公司)染色细胞10分钟，并用蒸馏水洗涤。使用棉签从膜的上表面去除未迁移的细胞。从小室中切除膜，并用封片剂(Biomeda公司，Foster City，CA)固定。在高倍视野(×20)中随机选择的范围内对迁移的细胞(附着在膜下表面的细胞)进行计数。
结果，确认到这两种药物诱导抑制胰腺癌细胞株ASPC-1的侵袭性(图10)。
并且，用5μM或10μM的氯喹(OC-202)及羟氯喹(HCQ)分别处理胰腺癌细胞株MIApaca-2，并采用上述实施例2-2的方法确认侵袭性。结果，确认到用氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)处理的组中，胰腺癌细胞的浸润以浓度依赖性方式显着增加(图11)。
实施例4.复合剂的癌症转移抑制效果
4-1.联合给药对癌细胞迁移的抑制效果
通过迁移测定法评估氯苯甘醚与氯喹(OC-202)或与羟氯喹(HCQ)的联合处理对癌症转移中重要的细胞迁移性和侵袭性的变化的影响。
具体地，将胰腺癌细胞株ASPC-1细胞株悬浮在无血清RPMI中，然后将以每孔1×105个细胞的密度添加到具有聚碳酸酯膜(孔径8.0μM，Costar公司)的24孔Transwell小室的上室中。将层粘连蛋白(10μg/ml)置于下孔中，分别用5μM或10μM的氯苯氨酸甘油酯(OC-201)及氯喹(OC-202)或用0μM(对照组用DMSO处理)、5μM或10μM的羟氯喹(HCQ)处理每个细胞。在37℃的CO2培养箱中培养18小时使细胞迁移。之后，在PBS中用70％甲醇将细胞固定30分钟，并用PBS洗涤3次。用苏木精(Sigma公司)染色细胞10分钟，并用蒸馏水洗涤。使用棉签从膜的上表面去除未迁移的细胞。从小室中切除膜，并用封片剂(Biomeda公司，FosterCity，CA)固定。在高倍视野(×20)中随机选择的范围内对迁移的细胞(附着在膜下表面的细胞)进行计数。
确认到氯喹和羟氯喹在与氯苯甘醚联合处理时，细胞的迁移性受到抑制，尤其，在用氯苯氨酸甘油酯与羟氯喹联合处理时，表现出对迁移性的抑制显着地协同增加(协同效应)(图12)。
并且，用氯苯氨酸甘油酯(5μM或10μM)+氯喹(5μM或10μM)或氯苯氨酸甘油酯(5μM或10μM)+羟氯喹(5μM或10μM)分别联合处理胰腺癌细胞株MIApaca-2，采用上述实施例2-1的方法评估癌细胞迁移性。
结果，在用氯苯氨酸甘油酯和氯喹或羟氯喹联合处理时，表现出以浓度依赖性方式协同抑制癌细胞的迁移性，尤其，在用氯苯氨酸甘油酯和羟氯喹联合处理时，表现出对迁移性的抑制显着地协同增加(图13)。
4-2.联合给药对癌细胞浸润的抑制效果
确认到在用氯苯甘醚和氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)联合处理时胰腺癌细胞株的迁移性受到抑制后，进行浸润分析来确认胰腺癌细胞的侵袭性。
具体地，将胰腺癌细胞株ASPC-1悬浮在无血清RPMI中，然后将以每孔1×105个细胞的密度添加到具有聚碳酸酯膜(孔径8.0μM，Costar公司)的24孔Transwell小室的上室中。将基质胶(10μg/ml)置于下孔中，分别用对照组(DMSO)、5μM或10μM的氯苯氨酸甘油酯(OC-201)以及5μM或10μM的氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)处理每个细胞。之后，在37℃的CO2培养箱中培养细胞18小时。之后，在PBS中用70％甲醇浆细胞固定30分钟，并用PBS洗涤3次。用苏木精(Sigma公司)染色细胞10分钟，并用蒸馏水洗涤。使用棉签从膜的上表面去除未迁移的细胞。从小室中切除膜，并用封片剂(Biomeda公司，Foster City，CA)固定。在高倍视野(×20)中随机选择的范围内对迁移的细胞(附着在膜下表面的细胞)进行计数。
结果，确认到在用氯喹和羟氯喹与氯苯甘醚联合处理时，胰腺癌细胞株的浸润受到抑制，尤其，氯苯甘醚和羟氯喹的联合处理对侵袭性的抑制表现出协同效应(图14)。
并且，用氯苯氨酸甘油酯(5μM或10μM)+氯喹(5μM或10μM)或氯苯氨酸甘油酯(5μM或10μM)+羟氯喹(5μM或10μM)分别联合处理胰腺癌细胞株MIApaca-2，采用上述实施例2-2的方法评估癌细胞的浸润程度。
结果，在用氯苯氨酸甘油酯和氯喹或羟氯喹联合处理时，表现出胰腺癌细胞株的侵袭性以浓度依赖性方式受到协同抑制，尤其，在用氯苯氨酸甘油酯与羟氯喹联合处理时对侵袭性抑制具有协同效应(图15)。
实施例5.确认复合剂的癌症转移抑制机制
由于从原发肿瘤中分离出来的癌细胞具有间充质细胞的特性，通过血管在身体其他部位定居来完成转移过程，已知上皮间质转化(epithelial to mesenchymaltransition，EMT)是癌症转移的重要信号传递通道，因此为了确认氯苯甘醚、氯喹或羟氯喹的单独或联合处理是否会改变癌细胞上皮间充质细胞特异性标志物的表达，用氯苯氨酸甘油酯(OC-201)、氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)单独或联合处理胰腺癌细胞株(Miapaca-2、Panc-1及ASPC-1)后，通过蛋白质印迹分析确认上皮细胞标志物ZO-1、间充质细胞标志物ZEB1、Snail及N-钙粘蛋白(N-cadherin)的表达。并且，还同时确认了调节这种上皮间质转化的AKT的表达。
结果，ZO-1的表达表现出因氯苯氨酸甘油酯(OC-201)、氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)的单独或联合处理而增加，ZEB1、Snail及N-钙粘蛋白的表达表现出因氯苯氨酸甘油酯(OC-201)、氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)的单独或联合处理而减少，并且，AKT的表达也表现出因氯苯氨酸甘油酯(OC-201)、氯喹(OC-202)或羟氯喹(HCQ)的单独或联合处理而减少(图16)，从而可以确认到OC-201、OC-202和/或HCQ通过抑制AKT的信号传达机制来调节上皮间充质细胞转化。
实施例6.确认对动物的癌症转移的效果
2-1.实验设计
为了确认羟氯喹与氯苯甘醚联合处理的转移抑制(anti-metastatic)效果，建立了体内癌症转移模型(in-vivo cancer metastasis model)，并由此评估相应药物的单独或联合处理对癌症转移的影响。具体地，使用胰腺癌细胞株MIAPaCa-2建立MIAPaCa-2诱导的肝转移模型(MIAPaCa-2induced hepatic metastasis model)，并给予相应药物来验证是否具有抗转移(anti-metastatic)效果。
对于氯苯甘醚和羟氯喹，用电子天平(Sartorius公司，Cat no.TE214S)分别称量所需量的试验物质并放入制备容器中，加入适量PBS后用涡旋混合器(vortex mixer)搅拌至溶解，加入PBS配制成设定浓度(3mg/ml)。在-20℃下储存稀释的药物，且在给药前制备。
本实施例的动物试验获得了韩国庆熙大学动物实验伦理委员会的批准(批准号：KHUASP(SE)-18-001)，并按照《动物保护法》(第16977号法案，2020年2月11日部分修订)及《关于实验动物的法律》(第15944号法案，2018年12月11日部分修订)的动物伦理进行实验。实验中使用的所有动物均在12小时光照周期(12h light cycle)中饲养，并允许自由地接触水和饲料。
具体地，在经过1周稳定期的8周龄雄性BALB/c裸鼠(Nara Biotech公司，18-24g，32只)的脾脏(spleen)中，将每只1×105个MIA PaCa-2细胞溶解在100ul无血清杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)中并使用26G注射器(韩国疫苗公司，目录号27-00024-01)进行注射。之后，经过1周的稳定期后给药。每种药物的给药剂量是在考虑药物的药动学参数、毒性剂量及无害剂量(NOAEL)等现有数据的基础上设定，并且为了确认和比较药物的复合给药效果，设定了低剂量和高剂量的复合给药剂量。为了快速达到血药浓度及准确的给药剂量，选择腹腔内给药，在1周的稳定期内每天(每周5次)进行称重并在此基础上设定药物剂量，在上述细胞给药7天后将氯苯甘醚(Chlorphenesin，OC-201)和羟氯喹(Hydroxychloroquine，OC-202)在腹膜内单独或联合注射4周。胰腺癌细胞株脾注射肝转移模型实验示意图见图17，各试验组及给药剂量在下表1中示出。
实验期间每天观察一次一般症状，并检查有无垂死或死亡动物。在分组日和给药日测量每个个体的体重。给药4周后，在组织提取日，通过吸入异氟醚(isoflurane)将所有动物麻醉，然后通过颈椎脱臼法实施安乐死并处死(sacrifice)，获得肝脏(liver)及脾脏(spleen)组织。提取的组织用PBS清洗2次，用10％的PFA溶液固定，进行脱水及石蜡化后，在室温或低温(4℃)下保存。进行石蜡化(paraffinization)及分节(section)后通过进行苏木精-伊红染色(H&E staining)来观察肝内结节(nodule)数量，由此评估该药物的转移抑制效果。对各实验组及对照组进行等方差检验后，通过独立样本T检验分析各组间的均值差异，以p值(p value)表示组间的均值差异的可信度。
表1：
通过观察根据氯苯甘醚和羟氯喹的单独或联合处理的肝组织中的结节数量，与对照组相比，单独或联合处理时观察到结节数量的统计学显着减少，确认到其具有减少癌症向肝脏转移的效果。尤其，在联合处理的组中表现出结节数量更少的倾向，并且在用氯苯甘醚和羟氯喹联合处理的情况下表现出协同效应，由此可以确认相对于单独给药具有更优异的治疗效果(图18及图19)。

Claims (9)

1.一种用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其特征在于，包含氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹，或其药学上可接受的盐作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其特征在于，所述氯苯氨酸甘油酯由以下化学式2表示：
化学式2：
3.根据权利要求1所述的用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其特征在于，所述羟氯喹由以下化学式3表示：
化学式3：
4.根据权利要求1所述的用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其特征在于，所述癌症为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。
5.根据权利要求1所述的用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物，其特征在于，所述羟氯喹能够以硫酸羟基氯喹的形式使用。
6.一种抗癌助剂，其特征在于，包含氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹或其药学上可接受的盐作为有效成分。
7.根据权利要求6所述的抗癌助剂，其特征在于，包含氯苯氨酸甘油酯及羟氯喹作为有效成分。
8.根据权利要求6所述的抗癌助剂，其特征在于，所述癌症为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。
9.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的用于抑制癌症转移或浸润的药物组合物。
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