CN110290787B - 用于抑制癌的转移及治疗癌的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的抗癌及癌转移抑制效果，氯苯甘醚、氯喹或氯吡嗪具有同时抑制癌细胞的凋亡和增殖及转移的效果，尤其，确认到它们的组合具有协同作用，因此，可通过单独给药或以多种组合联合给药氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪来有效预防或治疗癌。

Description

用于抑制癌的转移及治疗癌的组合物
技术领域
本发明涉及用于治疗癌及抑制癌转移的组合物，且涉及基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的抗癌及癌转移抑制效果。
背景技术
构成人类身体的最小单位被称为细胞(cell)，正常细胞通过细胞内调节功能分裂并成长，且会死亡并消失，以此维持细胞数量的均衡。在细胞因某种原因受损的情况下，通过接受治疗来使细胞起到正常作用或者在无法恢复的情况下使其凋亡。但是，因多种原因，若在细胞的基因发生变化，则细胞将变得不成长，从而不完全成长，且无法调节细胞周期，从而继续进行细胞分裂，将这种现象称为癌症(cancer)。并且，癌症不仅侵入周围组织及脏器，而且还对其进行破坏并向其他脏器蔓延。在韩国，基于癌症的死亡率为死亡原因的第一位，且其数量逐年增加。特定癌症的医学治疗进步了很多，在过去20年间，对于所有癌症的整体5年生存率得到了10％左右的改善。癌症或恶性肿瘤以无法控制的方式迅速转移及成长，因此，很难按时检测癌症或恶性肿瘤并对其进行治疗。
大肠为从小肠的末端连接至肛门的长管型的消化器官，将在上述部位发生的癌症称为大肠癌。根据发生的部位，大肠癌大致分为结肠癌和直肠癌。大肠癌患者一般呈现出排便习惯的变化、血便或粘液便、细的便、体重减轻、腹部不适、疲劳、食欲不振等症状。大肠癌主要向肝、肺转移，约为50％以上的大肠癌患者发生癌症转移(cancer metastasis)。以往大肠癌治疗主要进行外科手术和抗癌化疗，代表性的标的治疗法使用“Cetuximab(Erbitux)注射剂”。Cetuximab是将上皮成长因子受容体(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)作为标的的单一克隆抗体，与大肠癌细胞表面的上皮成长因子受容体特异结合，在引发癌细胞增殖的信号传递过程中，通过抑制特定部分来抑制癌细胞的整体增殖。
胰腺癌是最为致命形态的癌症中的一种。在美国，每年4万人以上被诊断出胰腺癌，其中，不到5％的人被诊断出胰腺癌之后生存5年以上。这种低的生存率主要是因为大部分的胰腺癌无法被诊断到的进行阶段。胰腺癌通常在初期阶段没有症状，在后期阶段中的症状非特异且多样，从而早起诊断变得艰难。对于胰腺癌的治疗选项有限。手术及放射线治疗法可适用于初期阶段的胰腺癌，对进行性或再发性胰腺癌并无效果。氟胞苷的每周一次静脉内给药呈现出效果，且这在1998年被美国FDA承认了对于胰腺癌的效果。为了胰腺癌治疗，作为最多使用的氟胞苷(gemcitabine)与草酸盐(oxalate)或5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)等的其他药物一同使用，但是，对胰腺癌患者的生存率的增加并未呈现出很大的影响。用于常规化疗的标准疗法为单独疗法或与作为EGF受体酪氨酸激酶抑制剂的埃罗替尼并用的氟胞苷。大致选项为5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康及奥沙利铂的并用(也可以是FOLFIRINOX协议)或氟胞苷和白蛋白结合型紫杉醇的并用，在MPACT研究中，与氟胞苷单独疗法相比，后者呈现出卓越的效果(Von Hoff et al.，2013；S3-LeitlinieExokrines Pankreaskarzinom，2013)。美国FDA承认了对过去未接受化疗的进行阶段的胰腺癌患者并用氟胞苷的激酶抑制剂埃罗替尼。但是，从埃罗替尼诱导的整体生存中间值(median overall survival)的利益小于4周(Moore et al.，J.Clin.Oncol.，25(15)：1960-6(2007))。
胆管为将在肝形成的胆汁向十二指肠移送的管，如树枝朝向一个枝聚集，胆管在肝内缓慢的聚集并变粗，当从肝出来时，左右的胆管大部分合成一个。胆管分为在肝内经过的肝内胆管和从肝脱离并连接至十二指肠的外胆管。在肝外胆管中，将暂时储存胆汁并进行浓缩的口袋称为胆囊，将这些肝内的胆管和胆囊统称为胆道。胆管为在肝中排除胆汁的通路，如树枝般逐渐变粗并向十二指肠开口。而且，一次性潜流胆汁的位置的胆囊。将胆管癌和胆囊癌统称为胆道癌，胆道癌为在包围胆囊内部的上皮细胞中发生的癌症。在诊断当时，胆道癌的70％～80％为进行癌症，手术仅可以完成30％～40％，5年生存率仅为7％左右，是很难治疗的癌症之一。至今，即使开发了对于多种癌症的抗癌剂，仅通过抗癌剂治疗的癌症仅为少数，这是因为当利用抗癌剂治疗癌症时，癌细胞并不与抗癌剂发生反应，或者在初期有效地减少重量，但是，在治疗过程中或治疗之后，形成对于抗癌剂的耐性。因此，为了有效的抗癌治疗，需要克服对于抗癌剂的癌细胞的耐性等对于抗癌剂的阻抗性。在胆道癌的情况下，早起频频发生抗癌剂耐性，抗癌剂反应率仅为15％，在手术之后，再发率达到85％，不存在为了手术前和后的辅助抗癌药物治疗可以利用的有效抗癌药剂。
在大部分情况下，恶性肿瘤在一个脏器(肺、肝、肾脏、胃、大肠、直肠等)发生之后，从第一次发生的脏器向其他组织蔓延，将从原发部位向其他组织蔓延的现象称为转移(metastasis)。转移为与恶性肿瘤的蔓延伴随的现象，随着恶性肿瘤细胞增殖并引发癌症，获取用于转移的新的遗传物质之后，向血管和淋巴结浸润并随着血液和淋巴循环并附着在其他组织之后进行增殖。
当前，为了癌症的治疗，使用手术方法、放射线治疗法及化疗等。其中，化疗是指利用抗癌剂来治疗癌症的方法。如今，使用约60多种的抗癌剂，最近，随着与癌症发生及癌细胞的特性有关的知识得到普及，积极进行有关于新的抗癌剂开发的研究。并且，当前的治疗法着重于癌细胞的凋亡或去除，从而，缺乏用于直接对癌症患者的生存率产生影响的癌细胞的增殖及转移的药物的研究。因此，为了提高癌症治疗和患者的生存率，确切需要同时具有抗癌活性和癌细胞的增殖及转移抑制效果的新概念的药物开发。
发明内容
技术问题
本发明的发明人确认到氯苯甘醚、氯喹或氯吡嗪具有抗癌效果以及抑制癌细胞的增殖和转移的效果，且它们的组合具有协同作用，由此完成了本发明。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供包含选自氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗癌的药学组合物。
并且，本发明提供包含选自由氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于抑制癌增殖及转移的药学组合物。
并且，本发明提供包含选自由氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的抗癌助剂。
同时，本发明提供包含选自由氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或改善癌的食品组合物。
有益效果
本发明涉及以同时抑制癌细胞增殖及转移为目的的抗癌组合物，可通过单独给药或以多种组合联合给药氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪来有效抑制癌细胞增殖及转移。
附图说明
图1为示出与氯苯甘醚(OC-201)有关的大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480的细胞存活率的曲线图。
图2为示出与氯喹(OC-202)有关的大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480的细胞存活率的曲线图。
图3为示出与氯吡嗪(OC-203)有关的大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480的细胞存活率的曲线图。
图4为示出基于联用处理氯苯甘醚及氯喹的大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480的细胞存活率的曲线图。
图5为示出基于联用处理氯苯甘醚及氯吡嗪的大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480的细胞存活率的曲线图。
图6为确认根据氯苯甘醚浓度的SW480细胞的迁移程度的图。
图7为示出根据氯苯甘醚浓度的SW480细胞的迁移程度的曲线图。
图8为确认根据氯苯甘醚浓度的HCT116细胞的迁移程度的图。
图9为示出根据氯苯甘醚浓度的HCT116细胞的迁移程度的曲线图。
图10为确认根据氯苯甘醚浓度的CT26细胞的迁移程度的图。
图11为示出根据氯苯甘醚浓度的CT26细胞的迁移程度的曲线图。
图12为确认基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的SW480细胞的迁移程度的图。
图13为示出基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的SW480细胞的迁移程度的曲线图。
图14为确认基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的HCT116细胞的迁移程度的图。
图15为示出基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的HCT116细胞的迁移程度的曲线图。
图16为确认基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的CT26细胞的迁移程度的图。
图17为示出基于单独处理或联用处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的CT26细胞的迁移程度的曲线图。
图18为确认根据氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的对SW480细胞的迁移阻碍的协同作用(synergistic effect)的图。
图19为确认根据氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的对HCT116细胞的迁移阻碍的协同作用的图。
图20为确认根据氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的对CT26细胞的迁移阻碍的协同作用的图。
图21为通过伤口治疗分析方法确认基于单独处理氯苯甘醚的HCT116细胞的迁移抑制效果的图。
图22为通过伤口治疗分析方法确认基于单独处理氯苯甘醚的HCT116细胞的迁移抑制效果的图。
图23为示出基于单独处理氯苯甘醚的HCT116的伤口治疗分析结果的曲线图。
图24为通过伤口治疗分析方法确认基于分别单独处理氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的HCT116细胞的迁移抑制效果的图。
图25为通过伤口治疗分析方法确认基于联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的HCT116细胞的迁移抑制效果的图。
图26为示出基于单独处理氯喹或氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的HCT116细胞的伤口治疗分析结果的曲线图。
图27为示出根据氯苯甘醚处理浓度的HCT116细胞的菌落形成分析结果的图。
图28为示出根据单独处理氯苯甘醚、氯喹或氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的浓度的HCT116细胞的菌落形成分析结果的图。
图29为示出根据单独处理氯苯甘醚、氯喹或氯吡嗪或者氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的浓度的CT26细胞的菌落形成分析结果的图。
图30为示出根据氯苯甘醚处理浓度的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图31示出根据氯喹处理浓度的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图32为示出根据氯吡嗪处理浓度的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图33为示出在5μM的氯苯甘醚联用处理1μM至50μM的氯喹的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图34为示出在0.5μM的氯喹联用处理1μM至50μM的氯苯甘醚的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图35为示出在1μM的氯喹联用处理1μM至50μM的氯苯甘醚的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图36为示出在5μM的氯喹联用处理氯苯甘醚1μM至50μM的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图37为示出在5μM的氯苯甘醚联用处理1μM至25μM的氯吡嗪的胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率的曲线图。
图38为示出分别单独处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株Panc-1的迁移程度的图。
图39为确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株Panc-1中根据并用浓度的对细胞的迁移阻碍的协同作用的图。
图40为示出分别单独处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株Aspc-1的迁移程度的图。
图41为确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株Aspc-1中根据并用浓度的对细胞的迁移阻碍的协同作用的图。
图42为示出分别单独处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株Panc-1的浸润分析结果的图。
图43为确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株Panc-1中根据并用浓度的对细胞的浸润抑制的协同作用的图。
图44为示出分别单独处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株MIACaPa2的浸润分析结果的图。
图45为确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胰腺癌细胞株MIACaPa2中根据并用浓度的对细胞的浸润抑制的协同作用的图。
图46为示出根据胆道癌细胞SNU1079及SNU308的氯苯甘醚的浓度的细胞存活率的曲线图。
图47为示出根据胆道癌细胞SNU1079及SNU308的氯喹的浓度的细胞存活率的曲线图。
图48为示出根据胆道癌细胞SNU1079及SNU308的氯吡嗪的浓度的细胞存活率的曲线图。
图49为示出根据氯苯甘醚及氯喹的并用浓度的胆道癌细胞SNU1079及SNU308的细胞存活率的曲线图。
图50为示出根据氯苯甘醚及氯吡嗪的并用浓度的胆道癌细胞SNU1079及SNU308的细胞存活率的曲线图。
图51为确认根据氯苯甘醚浓度的胆道癌细胞SNU1079的迁移阻碍程度的图。
图52为确认根据氯苯甘醚浓度的胆道癌细胞SNU1079的迁移阻碍程度的曲线图。
图53为确认分别单独处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胆道癌细胞SNU1079的迁移阻碍程度的图。
图54为确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胆道癌细胞株SNU1079中根据并用浓度的对细胞的迁移阻碍的协同作用的图。
图55为示出分别单独处理氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪或者联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胆道癌细胞SNU1079的浸润抑制效果的图。
图56为确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的胆道癌细胞株SNU1079中根据并用浓度的对细胞的浸润抑制的协同作用的图。
图57为示出氯苯甘醚的细胞毒性评价结果的曲线图。
图58为处理或未处理氯苯甘醚的CT26细胞及HCR116细胞的染色照片。
图59为处理或未处理氯苯甘醚的CT26细胞的单层染色照片。
图60为示出从癌转迁移物模型中收集的肺的照片及在肺中产生的结节(nodule)的数的曲线图。
图61为示出癌转迁移物模型的体重及肿瘤大小测定结果的曲线图。
最优实施方式
以下，参照附图，通过本发明的实例详细说明本发明。只是，上述实例仅作为对于本发明的例示揭示，在判断为对于本发明所属技术领域的普通技术人员的知名技术或结构的具体说明使本发明的主旨不清楚的情况下，将省略对其的详细说明，本发明并不局限于此。本发明可以在从后述的发明要求保护范围的记载及以此解释的等同范畴内进行多种变形及应用。
并且，在本说明书中所使用的术语(terminology)为了适当表现本发明的优选实施例而使用，这可以根据使用人员、运用人员的意图或本发明所属技术领域的惯例等而改变。因此，对于本术语的定义需要通过本说明书整体内容来定义。在整个说明书中，当一个部分“包括”其他结构要素时，只要没有特殊相反的记载，则意味着还可以包括其他结构要素，而并非意味着排除其他结构要素。
在一实施方式中，本发明涉及包含选自氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于预防或治疗癌的药学组合物。
在一实例中，氯苯甘醚可由下述化学式1表示，氯喹可由下述化学式2表示，氯吡嗪可由下述化学式3表示：
化学式1：
Figure GDA0003737324580000081
化学式2：
Figure GDA0003737324580000082
以及
化学式3：
Figure GDA0003737324580000091
在一实例中，氯苯甘醚可以为由下述化学式4表示的氯苯甘油氨酯(chlorphenesin carbamate)：
化学式4：
Figure GDA0003737324580000092
本发明的氯苯甘油氨酯主要用作肌肉松驰剂，被公知为具有镇定、缓解不安等效果及抗真菌、抗细菌效果。
在一实例中，本发明的药学组合物可包含氯苯甘醚及氯喹、氯苯甘醚及氯吡嗪、氯喹及氯吡嗪或者氯苯甘醚、氯喹及氯苯甘醚或其药学上可接受的盐作为有效成分，包含氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪时具有协同性抗癌效果，因此更优选。
在一实例中，本发明的药学组合物可包含5μM至500μM的氯苯甘醚、0.5μM至25μM的氯喹或1μM至100μM的氯吡嗪，在同时包含氯苯甘醚和氯喹的情况下，可包含5μM(固定浓度)的氯苯甘醚及0.5μM至25μM的氯喹，在同时包含氯苯甘醚和氯吡嗪的情况下，可包含5μM(固定浓度)的氯苯甘醚及25μM至50μM的氯吡嗪。在本发明的一实施例中，本发明的氯苯甘醚、氯喹和/或氯吡嗪在细胞实验中在上述浓度范围内没有过多的细胞毒性的情况下抑制癌细胞的迁移及浸润。
在一实例中，上述癌可以为选自由脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门周围癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴门癌、霍奇金病(Hodgkin's disease)、食道癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆道癌(胆囊及胆管癌)、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾脏骨盆癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓瘤、脑干神经胶质瘤及垂体腺瘤组成的组中的一种以上，更优选地，上述癌为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。在本发明的一实施例中，确认了对来源于小鼠的结肠癌(colon carcinoma)细胞株CT26、来源于人类的大肠癌(colorectal carcinoma)细胞株HCT116、来源于人类的结肠癌(colon carcinoma)细胞株SW480、来源于人类的胰腺癌(pancreatic carcinoma)细胞株Panc-1、来源于人类的胰腺癌细胞株Aspc-1、来源于人类的胰腺癌细胞株MIAPaCA2、来源于人类的胆囊癌(Gallbladder carcinoma)细胞株SNU308以及来源于人类的胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma)细胞株SNU1079的氯苯甘醚、氯喹及氯苯甘醚各个的抗癌效果和基于它们的组合的联用处理的抗癌效果。
本发明不仅包含由化学式1至化学式3表示的氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)，而且还包含其药学上可接受的盐、可利用其制备的溶剂化物、水合物、消旋体或立体异构体。
本发明的由化学式1至化学式3表示的氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)能够以药学上可接受的盐的形态使用，作为盐，通过药学上可接受的游离酸形成的酸加成盐为有用。酸加成盐从如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚硝酸或亚磷酸等无机酸类和如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的链烷酸酯、羟基链烷酸酯及链烷二酸酯、芳香族酸类、脂肪族及芳香族磺酸类等无毒性有机酸。作为这种药学上无毒的盐类、包括硫酸盐、焦硫酸盐、二硫酸盐、亚硫酸盐、重亚硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、单氢磷酸盐、二碘磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐氯化物、溴化物、碘化物、氟化物、醋酸盐、丙酸盐、癸酸盐(Decanoate)、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、癸酸盐(Caprate)、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、suberate、癸二酸盐、富马酸盐、苹果酸盐、丁烷-1，4-二酸酯、己烷-1，6-二酸酯、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、丙酸苯酯、丁酸苯酯、柠檬酸盐、乳酸盐、羟基丁酸盐、乙醇酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙烷磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐或扁桃酸盐。
本发明的酸加成盐可通过常规的方法制备，例如，将由化学式1至化学式3表示的氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)溶解于过量的酸水溶液中，可通过使其盐使用如甲醇、乙醇、丙酮或乙腈来沉淀而制备。并且，也可通过在其混合物中蒸发溶剂或过量的酸来进行干燥或通过吸入并过滤析出的盐来制备。
并且，可使用碱来制备药学上可接受的金属盐。例如，将化合物溶解于过量的碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物溶液中并过滤非溶解化合物盐，蒸发并干燥滤液来获得碱金属或碱土金属盐。此时，在制药方面上，作为金属盐，制备钠盐、钾盐或钙盐为适合。并且，与其对应的银盐通过将碱金属或碱土金属盐与适当的银盐(例如，硝酸银)反应来获得。
本发明的药学组合物还可包含除了氯苯甘醚、氯喹及氯苯甘醚之外的公知的抗癌剂，为了治疗这些疾病，可与其他公知的治疗联合。在其他治疗中，包括化学疗法、放射线治疗、激素治疗、骨髓移植、干细胞代替治疗、其他生物学治疗、免疫治疗等，但并不限定于此。
在本发明中，术语“预防”是指通过给药本发明的药学组合物来抑制或延迟癌的发生、扩散及复发的所有行为，“治疗”是指通过给药本发明的选自氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)中的一种以上或其药学上可接受的盐或者包含其的组合物来使癌细胞的凋亡或癌的症状好转或有利变更的所有行为。只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，可参照在韩国医学协会等揭示的材料来获知本申请的组合物产生效果的疾病的正确的基准，并可判断改善、提高及治疗的程度。
在本发明中，与有效成分结合使用的术语“治疗学有效剂量”是指预防或治疗对象患者的有效剂量，本发明的组合物的治疗有效剂量可根据如给药方法、目的部位、患者的状态等而不同。因此，同时考虑到安全性及效率性应将在人体中所使用的给药量决定为适量。也可以通过动物实验来从决定的有效剂量推定在人类中所使用的量。例如，当决定药效剂量时，需要考虑的这些事项记载在Hardman and Limbird，eds.，Goodman and Gilman'sThePharmacological Basis of Therapeutics，10th ed.(2001)，Pergamon Press；及E.W.Martin ed.，Remington's Pharmaceutical Sciences，18th ed.(1990)，MackPublishing Co.中。
本发明的药学组合物以药学有效剂量给药。本发明中所使用的术语“药学有效剂量”是指充分按可适用于医学治疗的合理的收益/危险比例来治疗疾病且不产生副作用的程度的量，有效剂量水平可根据包括患者的健康状态、癌的种类、重症度、药物的活性、对药物的敏感度、给药方法、给药时间、给药路径及排出比率、治疗时间、配合或同时使用的药物的要素及其他医学领域中悉知的要素决定。本发明的组合物可作为单独的治疗剂给药或者与其他治疗剂联用来给药，可与以往的治疗剂依次或同时给药，可单独给药或多重给药。考虑到上述的全部要素，重要的是给药可在没有副作用的情况下以最小的量获得最大的效果的量，而这可通过普通技术人员容易决定。
本发明的药学组合物可包含可通常使用于生物学制剂的载体、稀释剂、赋形剂或两种以上的它们的组合。本发明中所使用的术语“药学上可接受的”是指对暴露于上述组合物的细胞或人类不呈现毒性的特性。对于上述载体，只要是适合将组合物向生物体内传递，没有特别限制，例如，可混合Merck Index，13th ed.，Merck&Co.Inc.中记载的化合物、食盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲食盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及这些成分中的一种成分以上来利用，根据需要，可添加抗氧化剂、缓冲剂、静菌剂等其他常规的添加剂。并且，还添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来制剂化成如水溶液、悬浮液、乳浊液等注入用剂型、如丸剂、胶囊、颗粒或片剂。进一步地，优选地，可利用本领域中的适当的方法或在Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company，EastonPA，18th，1990)中所揭示的方法并根据各疾病或成分来进行制剂化。
在一实例中，上述药学组合物可以为选自由口服用剂型、外用剂、栓剂、灭菌注射溶液及喷雾剂组成的组中的一种以上的剂型，更优选地，上述药学组合物为口服用或注射剂型。
本发明中所述使用的术语“给药”是指以任意适当的方法向个体或患者提供规定的物质，根据所需方法可进行非口服给药(例如，适用于静脉内、皮下、腹腔内或局部注射剂型)或口服给药，给药量的范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的重症度等具有多种。作为本发明的组合物的用于口服给药的液相制剂，包括悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，而且除了作为通常所使用的单纯稀释剂的水、液体石油蜡之外，还可以包括如湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等多种赋形剂。用于非口服给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干基、栓剂等。本发明的药学组合物可通过能够使活性物质移动至目标细胞的任意装置来给药。优选的给药方式及制剂为静脉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、肌肉注射剂、静脉输液注射剂等。注射剂可利用如生理食盐液、输液等水性溶剂、如食物油、高级脂肪酸酯(例如，油酸乙酯等)、醇类(例如，乙醇、苄醇、丙二醇、甘油等)等非水性溶剂等来制备，并可包括用于防止变质的稳定剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦磷酸钠、BHA、生育酚、EDTA等)、乳化剂、用于调节pH的缓冲剂、用于阻止微生物发育的保鲜剂(例如，硝酸苯汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苄醇等)等药学载体。
本发明所使用的术语“个体”是指包括上述癌已发病或可能发病的人类在内的猴、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、鼠、兔或豚鼠的所有动物，可通过向个体给药本发明的药学组合物来有效预防或治疗上述多种疾病。本发明的药学组合物可与以往的治疗剂联合给药。
本发明的药学组合物还可包含药剂学上可接受的添加剂，此时，作为药剂学上可接受的添加剂，可使用淀粉、明胶化淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚维酮、胶体二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、饴糖、阿拉伯树胶、预糊化淀粉、玉米淀粉、粉状纤维素、羟丙基纤维素、欧巴代、淀粉乙醇酸钠、巴西棕榈蜡、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、白糖、葡萄糖、山梨糖醇及滑石等。优选地，相对于上述组合物，包含0.1重量份至90重量份的本发明的药剂学上可接受的载体，但并不限定于此。
在一实施方式中，本发明涉及包含选自氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的用于抑制癌增殖及转移的药学组合物。
在一实例中，氯苯甘醚可由下述化学式1表示，氯喹可由下述化学式2表示，氯吡嗪可由下述化学式3表示：
化学式1：
Figure GDA0003737324580000141
化学式2：
Figure GDA0003737324580000142
以及
化学式3：
Figure GDA0003737324580000143
在一实例中，氯苯甘醚可以为由下述化学式4表示的氯苯甘油氨酯(chlorphenesin carbamate)：
化学式4：
Figure GDA0003737324580000144
在一实例中，本发明的药学组合物可包含氯苯甘醚及氯喹、氯苯甘醚及氯吡嗪、氯喹及氯吡嗪或者氯苯甘醚、氯喹及氯苯甘醚作为有效成分，包含氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪时具有协同性转移及浸润抑制效果，因此更优选。
在一实例中，本发明的药学组合物可包含5μM至500μM的氯苯甘醚、0.5μM至25μM的氯喹或1μM至100μM的氯吡嗪，在同时包含氯苯甘醚和氯喹的情况下，可包含5μM(固定浓度)的氯苯甘醚及0.5μM至25μM的氯喹，在同时包含氯苯甘醚和氯吡嗪的情况下，可包含5μM(固定浓度)的氯苯甘醚及25μM至50μM的氯吡嗪。在本发明的一实施例中，在上述浓度范围内没有过多的细胞毒性的情况下抑制癌细胞的迁移及浸润。
本发明的氯苯甘醚在作为低浓度的0.1μM～10mM中仅可抑制癌细胞的增殖及转移，而无法抑制癌细胞的凋亡。例如，本发明的组合物可包含1μM～1mM范围的低浓度的氯苯甘醚。在氯苯甘醚的浓度小于1μM的情况下，癌增殖及转移抑制效果相比于浓度为1μM时减少，在浓度大于1mM，尤其在10mM以上的浓度中，可呈现细胞毒性。
在一实例中，上述癌可以为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。在本发明的一实施例中，确认了对来源于小鼠的结肠癌(colon carcinoma)细胞株CT26、来源于人类的大肠癌(colorectal carcinoma)细胞株HCT116、来源于人类的结肠癌(colon carcinoma)细胞株SW480、来源于人类的胰腺癌(pancreatic carcinoma)细胞株Panc-1、来源于人类的胰腺癌细胞株Aspc-1、来源于人类的胰腺癌细胞株MIAPaCA2、来源于人类的胆囊癌(Gallbladdercarcinoma)细胞株SNU308及来源于人类的胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma)细胞株SNU1079的氯苯甘醚、氯喹及氯苯甘醚各个的癌细胞转移及浸润抑制效果和基于它们的组合的联用处理的癌细胞转移及浸润抑制效果。
在一实施方式中，本发明涉及包含选自氯苯甘醚(chlorphenesin)、氯喹(chloroquine)及氯吡嗪(chloropyrazine)中的一种以上或其药学上可接受的盐作为有效成分的抗癌助剂。
在一实例中，本发明的氯苯甘醚在低浓度中仅可抑制癌细胞的增殖及转移，而无法抑制癌细胞的凋亡，因此，当与已具有细胞毒性的抗癌剂联合给药时，可最小化细胞毒性。例如，本发明的组合物可包含1μM～1mM范围的低浓度的氯苯甘醚。在氯苯甘醚的浓度小于1μM的情况下，没有癌增殖及转移抑制效果，在浓度大于1mM，尤其在10mM以上的浓度中，可呈现细胞毒性。
在一实例中，可包含氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪作为有效成分。在本发明的一实施例中，经确认，通过联用处理氯苯甘醚与抗癌剂，明显抑制在小鼠中以来源于小鼠的结肠癌(colon carcinoma)细胞株CT26诱导的肿瘤的大小及转移。
作为本发明的药学组合物中可包含的抗癌剂的例，包括作为DNA烷基化剂(DNAalkylating agents)的氮芥(mechloethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、笨丙氨酸(phenylalanine)、芥末酱(mustard)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、亚硝脲氮芥(carmustine：BCNU)、洛莫司汀(lomustine：CCNU)、链脲佐菌素(streptozotocin)、白消安(busulfan)、塞替派(thiotepa)、顺铂(cisplatin)及卡铂(carboplatin)；作为抗癌抗生素(anti-cancer antibiotics)的放线菌素(dactinomycin：actinomycin D)、亚德里亚霉素(doxorubicin：adriamycin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、米托葸醌(mitoxantrone)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)及博来霉素(bleomycin)；以及作为植物生物碱(plant alkaloids)的长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、紫杉醇；(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊甙(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)及伊立替康(iridotecan)等，但并不限定于此。
在一实施方式中，本发明涉及包含选自氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪中的一种以上的用于预防或改善癌的食品组合物。
在将本发明的组合物用作食品组合物的情况下，可单独添加上述氯苯甘醚、氯喹或氯苯甘醚或者与其他食品或食品成分一起添加来使用，根据常规的方法来适当地使用。上述组合物除了包含有效成分之外，还可以包含食品学上可接受的食品辅助添加剂，有效成分的混合量可根据使用目的(预防、健康或治疗性处置)来适当地决定。
本发明中所使用的术语“食品辅助添加剂”是指可辅助性地添加到食品中的结构要素，将其在制备各剂型的健康功能食品时添加，普通技术人员可适当地选择来使用。作为食品辅助添加剂的例，包括各种营养剂、维生素、矿物(电解质)、如合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中所使用的碳酸化剂等，但本发明的食品辅助添加剂的种类并不限定于上述例。
本发明的食品组合物可包括健康功能食品。本发明中所使用的术语“健康功能食品”是指使用具有对人体有用的功能性的原料或成分来制备成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液相及丸剂等形态制备及加工的食品。其中，“功能性”是指获得对如对人体的结构及功能调节营养素或生理学作用等保健用途有用的效果。本发明的健康功能食品可通过常规的技术领域的中通常使用的方法来制备，当进行上述制备时，通过添加常规的技术领域中通常添加的原料及成分来制备。并且，只要是被认可为上述健康功能食品的剂型或健康功能食品的剂型，可无限制地制备。本发明的食品用组合物能够以多种形态的剂型制备，与普通的药品不同地，当以食品为原料来长期服用药品时，具有不会产生副作用的优点，且具有优秀的携带性，因此，本发明的健康功能食品可用作用于增进抗癌剂的效果的辅助剂来摄取。
并且，对可使用本发明的组合物的健康食品的种类没有限制。同时，本发明的包含氯苯甘醚、氯喹或氯苯甘醚作为活性成分的组合物可通过将根据普通技术人员的选择而可包含在健康功能食品中的适当的其他辅助成分与公知的添加剂混合来制备。作为可添加的食品的例，包括肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、小食类、饼干类、披萨、拉面、其他面类、口香糖类、包括冰淇淋类在内的乳农产品、各种汤、饮料、茶、清凉剂、酒精饮料及维生素复合剂等，可通过添加到以本发明的提取物作为主要成分来制备的汁、茶、果冻及果汁等来制备。
在一实施方式中，本发明涉及包括将药学有效剂量的选自由氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪组成的组中的一种以上或其药学上可接受的盐给药到患有癌的个体的步骤的癌的治疗方法。
在一实例中，可给药氯苯甘醚及氯喹、氯苯甘醚及氯吡嗪、氯喹及氯吡嗪或氯苯甘醚、氯喹及氯苯甘醚或者它们的药学上可接受的盐，若同时给药氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪，则具有协同性抗癌效果，因此更优选。
在一实例中，本发明的药学组合物可包含5μM至500μM的氯苯甘醚、0.5μM至25μM的氯喹或1μM至100μM的氯吡嗪，在同时包含氯苯甘醚和氯喹的情况下，可包含5μM(固定浓度)的氯苯甘醚及0.5μM至25μM的氯喹，在同时包含氯苯甘醚和氯吡嗪的情况下，可包含5μM(固定浓度)的氯苯甘醚及25μM至50μM的氯吡嗪。在本发明的一实施例中，在上述浓度范围内没有过多的细胞毒性的情况下抑制癌细胞的迁移及浸润。
在一实例中，上述癌可以为选自由脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、宫颈癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门周围癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴门癌、霍奇金病(Hodgkin's disease)、食道癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆道癌(胆囊及胆管癌)、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞淋巴瘤、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾脏骨盆癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓瘤、脑干神经胶质瘤及垂体腺瘤组成的组中的一种以上，更优选地，上述癌为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。
在一实施方式中，本发明涉及用于制备癌症预防及治疗用药学组合物的选自由氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪组成的组中的一种以上或其药学可接受的盐的用途。
本发明的实施方式
通过以下实施例，更详细地说明本发明。但是，以下实施例仅用于将本发明的内容具体化，本发明并不局限于此。
实施例1.确认对大肠癌的抗癌及转移抑制效果
1-1.确认细胞存活率
1-1-1.确认基于单独给药的细胞存活率
为了确认分别单独给药氯苯甘醚(chlorphenensin，命名为OC-201)，氯喹(chloroquine，命名为OC-202)及氯吡嗪(chloropyrazine，命名为OC-203)时对大肠癌细胞的存活率产生的影响，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价对大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480细胞株的细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种各个大肠癌细胞株，将氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)分别以OμM(对照组DMSO处理)、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM及1mM的浓度预处理24h、48h或72h的细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用下述数学式来计算细胞存活率。
数学式1：细胞存活率＝实验组吸光度(570nm)/对照组吸光度(570nm)×100(％)
其结果，从图1至图3可知，OC-201在大于500μM时呈现出毒性，OC-202在大于10uM时呈现出毒性，OC-203在为100uM以下没有毒性。
1-1-2.确认基于联合给药的细胞存活率
为了确认基于联用处理氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的组合的大肠癌细胞的存活率，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价对大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480细胞株的细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种各个大肠癌细胞株，将对照组(DMSO处理)、5μM的氯苯甘醚、氯苯甘醚及氯喹(5μM+500nM、5μM+1μM、5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM及5μM+50μM)或者氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+1μM、5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM、5μM+50μM及5μM+100μM)分别处理24h、48h或72h的细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用上述数学式1来计算细胞存活率。
其结果，在5μM的氯苯甘醚中联用处理25μM以上的氯喹的情况下，大肠癌中呈现出毒性(图4)，在5μM的氯苯甘醚中联用处理100μM以下的氯吡嗪的情况下，大肠癌中没有呈现出毒性(图5)。
1-2.确认细胞迁移
1-2-1.迁移分析(migration assay)
1-2-1-1.单独给药氯苯甘醚
癌细胞的转移是需要以细胞的迁移性作为前提，因此，通过迁移分析方法来确认基于氯苯甘醚(OC-201)的处理浓度的大肠癌细胞株SW480、HCT116及CT26细胞株的迁移性。具体地，将大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480细胞株悬浮于无血清RPMI后以每孔1×105细胞添加到在具有聚碳酸酯膜(8.0μm pore size，Costar)的24孔Transwell小室的上部小室中。将层黏连蛋白(10μg/ml)位于下部孔，对各个细胞分别处理OμM(对照组DMSO处理)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1mM及2mM的氯苯甘醚(OC-201)。使细胞在37℃的CO2培养箱内培养18小时来迁移。然后，在PBS中用70％的甲醇固定细胞30分钟并用PBS清洗3次。用苏木素(Sigma)染色细胞10分钟并用蒸馏水清洗。用棉棒从膜的上表面移除未迁移的细胞。从小室切除膜并用Gel Mount(Biomeda，Foster City，CA)固定。在高功率场(×20)随机选择的镜下对迁移的细胞(附着于膜下面的细胞)进行计数。
其结果，在处理25μM以上的氯苯甘醚(OC-201)的情况下，SW480细胞株中的细胞的迁移明显减少(图6及图7)。并且，在处理氯苯甘醚(OC-201)的情况下，HCT116细胞株中的细胞的迁移减少，尤其，在处理250μM以上的情况下，显著减少(图8及图9)。同时，在处理氯苯甘醚(OC-201)的情况下，CT26细胞株中的细胞迁移也减少，尤其，在处理250μM以上的情况下，显著减少(图10及图11)。
1-2-1-2.联合给药
确认在分别单独处理氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的情况和在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的情况下的大肠癌细胞株CT26、HCT116及SW480的迁移程度。具体地，用对照组(DMSO处理)、氯苯甘醚(5μM)、氯喹(5μM、10μM或25μM)、氯吡嗪(25μM或50μM)、氯苯甘醚及氯喹(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)及氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+25μM、5μM+50μM)处理大肠癌细胞株CT26、HCT116或SW480后,以与上述实施例相同的方法确认细胞的迁移程度。并且，当进行联用处理时，利用Compusyn software并通过基于氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的组合指数(Combination Index，CI)来计算协同作用(synergistic effect)。
其结果，相比于分别单独处理氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)，当联用处理氯苯甘醚和氯喹或者氯苯甘醚和氯吡嗪时，大肠癌细胞株CT26，HCT116及SW480的迁移全部减少(图12至图17)。并且，在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡的情况下，呈现出协同作用，尤其，在联用处理氯苯甘醚和氯喹的情况下，所有细胞中呈现出协同作用(图18至图20)。
1-2-2.伤口治疗分析(wound healing assay)
1-2-2-1.单独给药氯苯甘醚
癌细胞的转移是需要以细胞的迁移性作为前提，因此，在单独处理氯苯甘醚(OC-201)的情况下，通过伤口恢复分析来确认大肠癌细胞株HCT116的迁移程度。具体地，将大肠癌细胞株HCT116添加到补充了10％的FBS的RPMI中并经过24小时之后以单层达到70～80％的汇集处时的浓度接种于24孔组织培养板。横穿孔的中央并用新的200μL的黄色吸管来小心地在单层上缓慢地刮出刮痕。结果，使所生成的间隔与吸管末端的外部直径相同。刮出刮痕后，去除将培养皿用培养基小心地清洗两次来分离的细胞。然后，处理0μM(DMSO)、5μM、10μM、25μM、50μM、250μM、500μM或1mM的氯苯甘醚并培养0小时、8小时及24小时后，用显微镜确认并进行图表化。
其结果，在处理25μM以上的氯苯甘醚情况下，大肠癌细胞的迁移减少(图21至图23)。
1-2-2-2.联合给药
确认在分别单独处理氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的情况和在将氯苯甘醚(OC-201)分别与它们联用处理的情况下的大肠癌细胞株HCT116的迁移程度。具体地，将大肠癌细胞株HCT116添加到补充了10％的FBS的RPMI中并经过24小时之后以单层达到70～80％的汇集处时的浓度接种于24孔组织培养板。横穿孔的中央并用新的200μL的黄色吸管来小心地在单层上缓慢地刮出刮痕。结果，使所生成的间隔与吸管末端的外部直径相同。刮出刮痕后，去除将培养皿用培养基小心地清洗两次来分离的细胞。然后，单独处理氯喹(5μM、10μM或25μM)、单独处理氯吡嗪(25μM或50μM)、联用处理氯苯甘醚及氯喹(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)以及联用处理(5μM+25μM、5μM+50μM)后，以与上述实施例1-2-2-1相同的方法确认经过0小时、8小时及24小时后的细胞迁移程度。
其结果，相比于分别单独处理氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的情况，在一同处理氯苯甘醚的情况下，大肠癌细胞的迁移减少(图24至图26)。
1-3.非锚定依赖性生长分析
1-3-1.单独给药氯苯甘醚
非锚定依赖性生长能力(Anchorage independent growth)为区分正常细胞和癌细胞的重要的形态特征，当正常细胞增殖时，无需锚定(anchorage)，但癌细胞可以在不进行锚定的情况下也可以生存并增殖。即，利用正常细胞在细胞不锚定在培养板的情况下无法增殖而癌细胞在如软琼脂(soft agar)等没有细胞粘结的悬浮状态下可增殖的特性并通过软琼脂集落形成分析来确认非锚定依赖性生长能力。首先，为了基于单独给药氯苯甘醚的大肠癌细胞株的非锚定依赖性生长能力，进行了集落形成分析(colony formationassay)。具体地，将3000个肠癌细胞株HCT116与软琼脂混合并分离到6孔板后，处理0μM(DMSO)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1mM或2mM的氯苯甘醚。然后，当每次更换细胞培养基时一同补充氯苯甘醚，分离细胞3周后进行了观察。
其结果，如图27所示，在处理250μM以上的氯苯甘醚的情况下，集落形成能力减少。
1-3-2.联合给药
为了确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹(OC-202)或氯吡嗪(OC-203)的情况下的大肠癌细胞株的非锚定依赖性生长能力相比于单独处理的情况下是否得到抑制，分别对大肠癌细胞株HCT116及CT26处理5μM的氯苯甘醚、10μM或25μM的氯喹、10μM的氯吡嗪、氯苯甘醚及氯喹(5μM+10μM或5μM+25μM)、氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+10μM、5μM+25μM或5μM+50μM)来进行集落形成分析。
其结果，相比于分别单独处理氯喹或氯吡嗪，在联用处理氯苯甘醚和氯喹的情况下，集落形成减少(图28至图29).
实施例2.确认对胰腺癌的效果
2-1.确认细胞存活率
2-1-1.确认基于单独给药的细胞存活率
为了确认分别单独给药氯苯甘醚(OC-201)，氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)时对胰腺癌细胞的存活率产生的影响，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价对胰腺癌细胞株Aspc-1、MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种各个胰腺癌细胞株，将氯苯甘醚(OC-201)分别以OμM(对照组DMSO处理)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM及1mM(1000μM)的浓度，将氯喹(OC-202)分别以OμM(对照组DMSO处理)、0.5μM、1μM、5μM、10μM、25μM、50μM及100μM的浓度，以及将氯吡嗪(OC-203)分别以OμM(对照组DMSO处理)、1μM、5μM、10μM、25μM、50μM及100μM的浓度分别预处理24h、48h或72h的细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用上述数学式1来计算细胞存活率。
其结果，如图30至图32所示，在单独处理氯苯甘醚和氯吡嗪的组的情况下，在高剂量中也没有细胞毒性，但处理氯喹的情况下，在50μM以上的浓度呈现出细胞毒性。
2-1-2.确认基于联合给药的细胞存活率
为了确认基于联用处理氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的组合的胰腺癌细胞的存活率，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价对胰腺癌细胞株Aspc-1，MIAPaCA2及Panc-1的细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种各个胰腺癌细胞株，处理对照组(DMSO处理)、5μM的氯苯甘醚、氯苯甘醚及氯喹(联用处理5μM的氯苯甘醚及1μM、5μM、10μM、25μM或50μM的氯喹，联用处理0.5μM的氯喹及1μM、5μM、10μM、25μM或50μM的氯苯甘醚，联用处理1μM的氯喹及1μM、5μM、10μM、25μM或50μM的氯苯甘醚，或者联用处理5μM的氯喹及1μM、5μM、10μM、25μM或50μM的氯苯甘醚)或者氯苯甘醚及氯吡嗪(联用处理5μM的氯苯甘醚及1μM、5μM、10μM、25μM或50μM的氯吡嗪)后，分别在24h、48h或72h后将细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用上述数学式1来计算细胞存活率。
其结果，在5μM的氯苯甘醚中联用处理1μM至50μM的氯喹的情况(图33)、在0.5μM的氯喹联用处理1μM至50μM的氯苯甘醚的情况(图34)、在1μM的氯喹联用处理1μM至50μM的氯苯甘醚的情况(图35)、在5μM的氯喹联用处理1μM至50μM的氯苯甘醚的情况(图36)下，在胰腺癌细胞株没有呈现出过多的细胞毒性，直到经过72小时，在5μM的氯苯甘联用处理1μM至25μM的氯吡嗪的情况(图37)下，在胰腺癌细胞株没有呈现出过多的细胞毒性，直到经过24小时。
2-2.细胞迁移分析(migration assay)
2-2-1.单独处理及联用处理比较
以与上述实施例1-2-1相同的方法确认在分别单独给药氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的情况和联用给药氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的情况下的胰腺癌细胞株Panc-1及Aspc-1的迁移程度。具体地，对胰腺癌细胞株Panc-1及Aspc-1处理对照组(DMSO)、氯苯甘醚(5μM)、氯喹(5μM，10μM或25μM)、氯吡嗪(25μM或50μM)、氯苯甘醚及氯喹(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、以及氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+25μM、5μM+50μM)后,以与上述实施例1-2-1相同的方法确认细胞的迁移程度。并且，当进行联用处理时，利用Compusynsoftware并通过基于氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的组合指数(CombinationIndex，CI)来计算协同作用(synergistic effect)。
其结果，在单独给药氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的组中，Panc-1的细胞的迁移减少(图38及图39)，在联用处理5μM的氯苯甘醚和10μM的氯喹的组以及联用处理5μM的氯苯甘醚和25μM以上的氯吡嗪的组中，呈现出协同作用(图39)。并且，在单独给药氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的组中，在Aspc-1细胞株中的细胞的迁移也减少(图40及图41)，在联用处理甘醚和氯喹或氯吡嗪的所有组中，对细胞迁移的减少呈现出协同作用(图41)。
2-3.浸润分析
为了确认本发明的氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)是否阻碍分解贯穿包围细胞组织的薄膜或填充细胞之间的细胞外基质并向其他部位浸润且转移的癌细胞的特性，进行使用临摹细胞外基质的基质胶(matrigel)的浸润分析(invasionassay)。将胰腺癌细胞株Panc-1及MIACaPa2悬浮于无血清RPMI后以每孔1×105细胞添加到在具有聚碳酸酯膜(8.0μmpore size，Costar)的24孔Transwell小室的上部小室中。将基质胶(10μg/ml)位于下部孔，对各个细胞分别处理对照组(DMSO)、氯苯甘醚(5μM)、氯喹(5μM、10μM或25μM)、氯吡嗪(25μM或50μM)、氯苯甘醚及氯喹(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、以及及氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+25μM、5μM+50μM)。然后，使细胞在37℃的CO2培养箱内培养18小时。之后，在PBS中用70％的甲醇固定细胞30分钟并用PBS清洗3次。用苏木素(Sigma)染色细胞10分钟并用蒸馏水清洗。用棉棒从膜的上表面移除未迁移的细胞。从小室切除膜并用GelMount(Biomeda，Foster City，CA)固定。在高功率场(×20)随机选择的镜下对迁移的细胞(附着于膜下面的细胞)进行计数。并且，当进行联用处理时，利用Compusyn software并通过基于氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的组合指数(Combination Index，CI)来计算协同作用(synergistic effect)。
其结果，如图42及图44所示，在单独给药氯苯甘醚、氯喹及氯吡嗪的组中，确认到抑制了Panc-1及MIACaPa2的浸润，在两个胰腺癌细胞株中，都呈现出基于联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的协同作用(图43及图45)。
实施例3.确认对胆道癌的效果
3-1.确认细胞存活率
3-1-1.确认基于单独给药的细胞存活率
为了确认分别单独给药氯苯甘醚(OC-201)，氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)时对胆道癌细胞的存活率产生的影响，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价对胆道癌细胞株SNU1079及SNU308的细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种各个胆道癌细胞株，将氯苯甘醚(OC-201)分别以OμM(对照组DMSO处理)、5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM及1mM(1000μM)的浓度，以及将氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)分别以OμM(对照组DMSO处理)、1μM、5μM、10μM、25μM、50μM及100μM的浓度分别预处理24h、48h或72h的细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用上述数学式1来计算细胞存活率。
其结果，如图46至图48所示，在处理1mM以上的氯苯甘醚的情况下，在48小时之后，呈现出明显的细胞毒性，在处理氯喹的情况下，在SNU1079细胞中，在24小时在50μM以上的浓度，在48小时之后在25μM以上的浓度中，呈现出细胞毒性，在SNU308细胞株的情况下，在48小时之后在50μM以上的浓度中，呈现出细胞毒性，在单独处理氯吡嗪的组中，在高剂量中也没有细胞毒性。
3-1-2.确认基于联合给药的细胞存活率
为了确认基于联用处理氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)的组合的胆道癌细胞的存活率，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价对胆道癌细胞株SNU1079及SNU308的细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种各个胆道癌细胞株，处理对照组(DMSO处理)、5μM的氯苯甘醚(OC-201)、联用处理氯苯甘醚及氯喹(OC-202)(联用处理5μM的氯苯甘醚+1μM、5μM、10μM、25μM或50μM的氯喹)或者联用处理氯苯甘醚及氯吡嗪(OC-203)(联用处理5μM的氯苯甘醚+1μM、5μM、10μM、25μM、50μM或100μM的氯吡嗪)后，分别在24h、48h或72h后将细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用上述数学式1来计算细胞存活率。
其结果，在联用处理5μM的氯苯甘醚和50μM以上的氯喹的情况(图49)及在联用处理5μM的氯苯甘醚和100μM的氯吡嗪情况(图50)下，在胆道癌细胞株呈现出细胞毒性。
3-2.确认细胞迁移
3-2-1.单独给药氯苯甘醚
通过迁移分析方法确认基于氯苯甘醚(OC-201)的处理浓度的胆道癌细胞株SNU1079的迁移性。具体地，将胆道癌细胞株SNU1079悬浮于无血清RPMI后以每孔1×105细胞添加到在具有聚碳酸酯膜(8.0μm pore size，Costar)的24孔Transwell小室的上部小室中。将层黏连蛋白(10μg/ml)位于下部孔，处理5μM、10μM、25μM、50μM、100μM、250μM、500μM、1mM或2mM的的氯苯甘醚。使细胞在37℃的CO2培养箱内培养18小时来迁移。然后，在PBS中用70％的甲醇固定细胞30分钟并用PBS清洗3次。用苏木素(Sigma)染色细胞10分钟并用蒸馏水清洗。用棉棒从膜的上表面移除未迁移的细胞。从小室切除膜并用Gel Mount(Biomeda，Foster City，CA)固定。在高功率场(×20)随机选择的镜下对迁移的细胞(附着于膜下面的细胞)进行计数。
其结果，在处理25μM以上的氯苯甘醚的胆道癌细胞的迁移减少，尤其，在100μM以上的浓度中细胞迁移明显减少(图51及图52)。
3-2-2.联合给药
通过迁移分析方法来确认在联用处理氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的情况下的胆道癌细胞株SNU1079的迁移性。具体地，对胆道癌细胞株SNU1079处理对照组(DMSO)、氯苯甘醚(5μM)、氯喹(5μM、10μM或25μM)、氯吡嗪(25μM或50μM)、氯苯甘醚及氯喹(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、以及氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+25μM、5μM+50μM)后，以与上述实施例3-2-1相同的方法确认。并且，当进行联用处理时，利用Compusyn software并通过基于氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的组合指数(Combination Index，CI)来计算协同作用(synergistic effect)。
其结果，在5μM的氯苯甘醚联用处理5μM或10μM的氯喹的情况下，胆道癌细胞的迁移阻碍协同性地增加(协同作用)(图53及图54)。
3-3.浸润分析
为了确认单独或联用处理本发明的氯苯甘醚(OC-201)、氯喹(OC-202)及氯吡嗪(OC-203)时否阻碍向其他部位浸润且转移的癌细胞的特性，对胆道癌细胞株SNU1079处理对照组(DMSO)、氯苯甘醚(5μM)、氯喹(5μM、10μM或25μM)、氯吡嗪(25μM或50μM)、氯苯甘醚及氯喹(5μM+5μM、5μM+10μM、5μM+25μM)、以及氯苯甘醚及氯吡嗪(5μM+25μM、5μM+50μM)来以在上述实施例2-3中记载的方法进行浸润分析(invasion assay)。并且，当进行联用处理时，利用Compusyn software并通过基于氯苯甘醚和氯喹或氯吡嗪的并用浓度的组合指数(Combination Index，CI)来计算协同作用(synergistic effect)。
其结果，如图55所示，可确认到胆道癌细胞的浸润得到抑制，尤其，在联用处理氯苯甘醚和氯喹的情况下，呈现出协同作用(图56)。
实施例4.确认在低浓度中的癌转移抑制效果
4-1.确认氯苯甘醚的大肠癌转移抑制效果
4-1-1.确定没有细胞毒性的低浓度
为了确定没有毒性的氯苯甘醚的浓度，根据制造商的协议并利用MTT assay(Promega，Ltd.)来评价细胞存活率。在96孔板中以每孔5×103的细胞密度接种CT26细胞株及HCT-116细胞株。处理或未处理氯苯甘醚(100ppm，1μM、10μM、100μM、1mM及10mM)后，将细胞与5mg/mL的MTT一同培养4小时。然后，去除培养基并加入150μL的增溶溶液及终止溶液后，在30℃的温度下培养4小时。在570nm的条件下测定反应溶液的吸光度。利用上述数学式1来计算细胞存活率。如图57所示，CT26细胞及HCT-116细胞均在1μM至1mM的浓度范围中没有细胞毒性。
1μM的氯苯甘醚浓度既是呈现肌肉松弛效力的浓度以下，也是没有细胞毒性的浓度，因此，以用于评价没有抗癌活性的低浓度的氯苯甘醚是否具有癌细胞转移抑制效果的浓度来进行后续实验。
4-1-1.确认细胞迁移阻碍
4-1-1-1.迁移分析
使用具有聚碳酸酯膜(8.0μm pore size，Costar)的24孔Transwell小室来评价细胞迁移。将CT26及HCT116大肠癌细胞悬浮于无血清RPMI后以每孔1×105细胞添加到上部小室中。将层黏连蛋白(10μg/ml)位于下部孔，并使细胞在37℃的CO2培养箱内培养8小时来迁移。然后，在PBS中用70％的甲醇固定细胞30分钟并用PBS清洗3次。用苏木素(Sigma)染色细胞10分钟并用蒸馏水清洗。用棉棒从膜的上表面移除未迁移的细胞。从小室切除膜并用GelMount(Biomeda，Foster City，CA)固定。在高功率场(×20)随机选择的镜下对迁移的细胞(附着于膜下面的细胞)进行计数。
其结果，如图58所示，在以低浓度(1μM)处理氯苯甘醚的情况下，可确认细胞的渗透能力及迁移能力相比于对照组明显减少。
4-1-1-2.伤口治疗分析
为了测定细胞的迁移性而进行伤口治疗分析。首先，将CT26大肠癌细胞株添加到补充了10％的FBS的RPMI中并经过24小时之后以单层达到70～80％的汇集处时的浓度接种于24孔组织培养板。横穿孔的中央并用新的200μL的黄色吸管来小心地在单层上缓慢地刮出刮痕。结果，使所生成的间隔与吸管末端的外部直径相同。刮出刮痕后，去除将培养皿用培养基小心地清洗两次来分离的细胞。在氯苯甘醚(1μM)的存在或不存在的条件下，培养细胞24小时后，在显微镜上拍摄染色的单层的照片。
其结果，如图59所示，可确认CT26细胞株的迁移性随着氯苯甘醚(1μM)的处理而减少，这是证明不能凋亡癌细胞的程度的低浓度中也可对癌细胞的转移抑制产生影响的结果。
4-1-2.确认生物体内(in vivo)癌细胞抑制
通过动物实验确认基于氯苯甘醚的肿瘤增殖抑制效果。具体地，向60只Balb/cmice皮下接种100μL的CT26细胞悬浮液(1×107cells/mL)一次来诱发肿瘤，从而制备异种移植动物模型Xenograft animal model)。自接种癌细胞后3天后开始与作为抗癌剂的氟尿嘧啶(5’FU)联合给药或单独给药氯苯甘醚5周。首先，作为与氟尿嘧啶联合给药的实验组，向11只动物模型以腹腔给药方式联合给药25mg/kg的氟尿嘧啶(给药每周5次)和10mg/kg的氯苯甘醚(给药每周3次)5周。作为单独给药氯苯甘醚的实验组，向10只动物模型以腹腔给药方式给药10mg/kg的氯苯甘醚5周，且每周给药3次，或者向14只动物模型以口服给药方式给药20mg/kg的氯苯甘醚5周，且每周给药5次。作为阴性对照组，向14只动物模型给药与氯苯甘醚相同剂量的PBS，作为阳性对照组，向14只动物模型单独给药作为抗癌剂的25mg/kg的氟尿嘧啶每周5次。测量动物模型的体重每周一次，自给药日起测量肿瘤大小每周一次。6周后，用乙醚麻醉动物模型后收集肿瘤和肺。
其结果，如图60所示，可确认，相比于对照组，在处理氯苯甘醚的组中，癌没有向肺转移。并且，如图61所示，相比于对照组，在处理氯苯甘醚的组中，在处理20mg/kg的氯苯甘醚的动物中，也可以确认肿瘤大小也变小的现象。因此，可知氯苯甘醚阴性调节肿瘤的增长和转移能力。

Claims (7)

1.一种药学组合物在制备治疗癌的药物中的应用，其特征在于，所述药学组合物包含氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪作为有效成分，
其中，癌为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，氯苯甘醚由下述化学式1表示：
化学式1：
Figure FDA0003799568490000011
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，氯喹由下述化学式2表示：
化学式2：
Figure FDA0003799568490000012
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，氯吡嗪由下述化学式3表示：
化学式3：
Figure FDA0003799568490000013
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，氯苯甘醚可替换为由下述化学式4表示的氯苯甘油氨酯：
化学式4：
Figure FDA0003799568490000021
6.一种药学组合物在制备抑制癌增殖及转移的药物中的应用，其特征在于，所述药学组合物包含氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪作为有效成分，
其中，癌为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。
7.一种组合物在制备抗癌助剂中的应用，其特征在于，所述组合物包含氯苯甘醚及氯喹或者氯苯甘醚及氯吡嗪作为有效成分，
其中，癌为大肠癌、胰腺癌或胆道癌。
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