JP7250950B2 - 所定の構成の複数の発現カセットを標的指向組込みすることによってＦｃＲｎ発現細胞を作製するための方法 - Google Patents

所定の構成の複数の発現カセットを標的指向組込みすることによってＦｃＲｎ発現細胞を作製するための方法 Download PDF

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Description

本発明は、細胞株作製およびポリペプチド生産の分野に関する。より正確には、哺乳動物細胞のゲノムへの特定の発現カセット配列の組込みをもたらす二重リコンビナーゼ媒介カセット交換反応によって得られた組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告される。前記細胞は、ＦｃＲｎを生産するための方法において使用することができる。
例えば抗体などの、分泌されグリコシル化されるポリペプチドは、通常、安定発現または一過性発現のいずれかとして真核細胞において組換え発現されることにより生産される。
目的の外因性ポリペプチドを発現する組換え細胞を作製するための１つの戦略は、該目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダムな組込みとそれに続く分泌工程および単離工程を含む。しかし、この手法にはいくつかの不都合な点がある。第一に、細胞それ自体のゲノム中へのヌクレオチド配列の機能的組込みは、珍しい事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列が組み込まれる場所についてのランダム性を考慮に入れると、これらの珍しい事象の結果、遺伝子発現および細胞増殖に様々な表現型が生じる。「位置効果変異」として公知のこのような変異は、真核細胞ゲノムに存在する複雑な遺伝子制御ネットワークならびに組込みおよび遺伝子発現のための特定のゲノム遺伝子座に対する接近容易性に、少なくともある程度は起因する。第二に、一般に、ランダム組込み戦略は、細胞のゲノム中に組み込まれるヌクレオチド配列コピーの数をコントロールしない。実際に、遺伝子増幅法は、高生産細胞を実現するために使用されることが多い。しかし、このような遺伝子増幅は、例えば不安定な細胞増殖および／または生産物発現などの望ましくない細胞表現型を招く可能性もある。第三に、ランダム組込みプロセスにつきものの組込み遺伝子座不均一性が原因となって、目的のポリペプチドについて望ましい発現レベルを示している組換え細胞を単離するためにトランスフェクション後に何千個もの細胞をスクリーニングすることには、時間がかかり、大きな労働力を要する。そのような細胞を単離した後でさえ、目的のポリペプチドの安定な発現は保証されておらず、安定な市販用生産細胞を得るには、さらなるスクリーニングが必要とされる場合がある。第四に、ランダム組込みによって得られた細胞から生産されるポリペプチドは、高度の配列差異を示し、これは、高レベルのポリペプチド発現を選択するために使用される選択剤の変異原性にいくらか起因する可能性がある。最後に、生産しようとするポリペプチドの複雑性が高いほど、すなわち、目的のポリペプチドを細胞内で形成するのに必要とされる種々のポリペプチドまたはポリペプチド鎖の数が多いほど、互いに異なるポリペプチドまたはポリペプチド鎖の発現比率をコントロールすることが、より重要になる。発現比率のコントロールは、目的のポリペプチドの効率的な発現、正確な組立て、および高い発現収率での成功裡な分泌を可能にするために必要とされる。
リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）による標的指向組込みは、真核生物宿主ゲノムのあらかじめ定められた部位に特異的かつ効率的に外来ＤＮＡを導くための方法である（Ｔｕｒａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３～２２１（非特許文献１））。
ＷＯ２００６／００７８５０（特許文献１）では、抗ＲｈＤ組換えポリクローナル抗体および個々の宿主細胞のゲノム中への部位特異的組込みを用いる製造方法が開示されている。
Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｙ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９（２０１３）１３０７～１３１５（非特許文献２））は、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ技術とＣＲＥ－Ｌｏｘ技術を組み合わせて用いて、標的指向型細胞株開発のために信頼のおける宿主を限定的なゲノムスクリーニングによって迅速に同定したことを報告した。
ＷＯ２０１３／００６１４２（特許文献２）では、そのゲノム中にドナーカセットを安定的に組み入れた、遺伝的に変更された真核細胞のほぼ均質な集団を開示しており、該ドナーカセットは、ターゲティング核酸部位および選択マーカータンパク質コード配列を含む単離された核酸断片に動作可能に連結された強力なポリアデニル化部位を含み、該単離された核酸断片は、第１の組換え部位および第２の異なる組換え部位に挟まれている。
ＷＯ２０１３／１２０９２９（特許文献３）では、抗体または少なくとも１つのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを分離するための正の直線ｐＨ勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての、固定化された、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）とβ－２－ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有結合性複合体の使用が開示されている。
ＷＯ２０１８／１６２５１７（特許文献４）では、ｉ）発現カセット配列およびｉｉ）様々な発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質に大きな差異が認められたことが開示されている。
ＷＯ２０１９／１２６６３４（特許文献５）では、組換えタンパク質の発現に適した標的指向組込み（ＴＩ）宿主細胞、ならびに該ＴＩ宿主細胞を生産および使用する方法が開示された。
Ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３７５（２０１２）２０～２９（非特許文献３））は、ＥＢＮＡ－１を安定に発現し、かつＦｃＲｎαおよびβ２ｍ共発現（ｉ）ビオチンリガーゼ酵素（ＬｓＢｉｒＡ）および（ｉｉ）レポーター遺伝子としての高感度緑色蛍光性タンパク質（ＥＧＦＰ）のためのデュアルプロモーターベクターを一過性にトランスフェクトされたＰＥＡＫ細胞を用いてビオチン化ＦｃＲｎを生産するための方法を報告した。Ｎｉ－ＮＴＡ精製および固定化後、彼らが得たｈＦｃＲｎおよびｍＦｃＲｎは、細胞培養上清１リットル当たり、それぞれわずか４ｍｇ／Ｌおよび１．２ｍｇ／Ｌであった。
Ｆａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ，Ａ．は、血清アルブミンおよび新生児Ｆｃ受容体とのその相互作用―アルブミン／ＦｃＲｎ結合機序の特徴づけ（Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０１３（非特許文献４））を報告した。この研究では、バイシストロン性Ｌｏｎｚａ ｐＥＥ６．４ 発現ベクターを用いて可溶型ヒトＦｃＲｎが作製された。Ｌｏｎｚａ発現系を用いて可溶型マウスＦｃＲｎを生産することは不可能であった。収率は開示されていない。
ＷＯ２００６／００７８５０ ＷＯ２０１３／００６１４２ ＷＯ２０１３／１２０９２９ ＷＯ２０１８／１６２５１７ ＷＯ２０１９／１２６６３４
Ｔｕｒａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３～２２１ Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９（２０１３）１３０７～１３１５ Ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３７５（２０１２）２０～２９ Ｆａｒｂｅｒ－Ｓｃｈｗａｒｚ，Ａ．、Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２０１３
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を発現する組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告される。ＦｃＲｎは、前記哺乳動物細胞によって天然には発現されないヘテロ多量体ポリペプチドである。より具体的には、ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド、すなわちクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）およびβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎの発現を実現するために、特定かつ所定の配列中に複数の異なる発現カセットを含む組換え核酸が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれた。
ＦｃＲｎを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法および該組換え哺乳動物細胞を用いてＦｃＲｎを生産するための方法も、本明細書において報告される。
本発明は、ヘテロ二量体ＦｃＲｎの発現に必要とされる異なる発現カセットの配列、すなわち発現カセット構成が、哺乳動物細胞のゲノム中に組み込まれた際に、ＦｃＲｎの発現収率に影響を与えるという知見に、少なくともある程度は基づいている。
本発明は、特定の発現カセット構成を有する、ヘテロ二量体ＦｃＲｎをコードする核酸を、哺乳動物細胞のゲノム中に組み込むことによって、ＦｃＲｎの効率的な組換え発現および生産を実現できるという知見に、少なくともある程度は基づいている。
二重リコンビナーゼ媒介カセット交換反応によって、所定の発現カセット配列を哺乳動物細胞のゲノム中に有利に組み込めることが、判明している。
本発明の１つの態様は、Ｃ末端がビオチン化されたＦｃＲｎを生産するための方法であって、
ａ）ＦｃＲｎおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞をビオチン含有培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地から、Ｃ末端がビオチン化されたＦｃＲｎを回収する工程と、
を含み、ＦｃＲｎおよび大腸菌ＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ５’から３’の方向に
－ Ｃ末端にＨｉｓＡｖｉタグを含むクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ β２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ Ｃ末端にＨｉｓＡｖｉタグを含むクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ β２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ 大腸菌ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む、方法である。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎおよび大腸菌ＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、
－ 第１の発現カセットの５’側に位置する第１の組換え認識配列、
－ 第５の発現カセットの３’側に位置する第２の組換え認識配列、および
－ 第２の発現カセットと第３の発現カセットの間に位置する第３の組換え認識配列
をさらに含み、組換え認識配列はすべて異なっている。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードする別の発現カセットを含み、選択マーカーをコードする該発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部分が、３’側に一部分が位置しており、該発現カセットの、該５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含み、該開始コドンは該コード配列に動作可能に連結されている。
１つの実施形態において、各発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、コード配列、およびポリアデニル化シグナル配列、場合によっては、それに続くターミネーター配列を含む。１つの実施形態において、プロモーターがＳＶ４０プロモーターでありポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位でありターミネーター配列が存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
１つの実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎはヒトＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）はヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）はヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎはマウスＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）はマウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）はマウスβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎはカニクイザルＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）はカニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）はカニクイザルβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である。
本発明による１つの態様は、本発明によるビオチン化ＦｃＲｎである。
本発明による１つの態様は、本発明によるビオチン化ＦｃＲｎの、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用である。
[本発明1001]
Ｃ末端がビオチン化されたＦｃＲｎを生産するための方法であって、
ａ）ＦｃＲｎおよびビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞をビオチン含有培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地から、Ｃ末端がビオチン化されたＦｃＲｎを回収する工程と
を含み、
ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ5’から3’の方向に
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含むクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第1の発現カセット、
－ β2－ミクログロブリン（β2ｍ）をコードする第2の発現カセット、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含むクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第3の発現カセット、
－ β2－ミクログロブリン（β2ｍ）をコードする第4の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第5の発現カセット
を含む、方法。
[本発明1002]
ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸が、
－ 第1の発現カセットの5’側に位置する第1の組換え認識配列、
－ 第5の発現カセットの3’側に位置する第2の組換え認識配列、および
－ 第2の発現カセットと第3の発現カセットの間に位置する第3の組換え認識配列
をさらに含み、組換え認識配列はすべて異なっている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードする別の発現カセットを含み、選択マーカーをコードする該発現カセットは、一部分が第3の組換え認識配列の5’側に、一部分が第3の組換え認識配列の3’側に位置しており、該発現カセットの、該5’側に位置する部分が、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該3’側に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
各発現カセットが、5’から3’の方向に、プロモーター、コード配列、およびポリアデニル化シグナル配列、場合によっては、それに続くターミネーター配列を含む、本発明1001から1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
プロモーターがＳＶ40プロモーターでありポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ40ポリＡ部位でありターミネーター配列が存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターが、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列が、ｈＧＴターミネーターである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、本発明1001から1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
ＦｃＲｎがヒトＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）がヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β2－ミクログロブリン（β2ｍ）がヒトβ2－ミクログロブリン（β2ｍ）である、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
ＦｃＲｎがマウスＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）がマウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β2－ミクログロブリン（β2ｍ）がマウスβ2－ミクログロブリン（β2ｍ）である、本発明1001から1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
ＦｃＲｎがカニクイザルＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）がカニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β2－ミクログロブリン（β2ｍ）がカニクイザルβ2－ミクログロブリン（β2ｍ）である、本発明1001から1006のいずれかの方法。
本発明の態様の詳細な説明
本発明は、異なるポリペプチドを含む複合分子、すなわちヘテロ多量体である新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の発現のために、所定かつ特定の発現カセット構成を使用すると、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞においてＦｃＲｎの効率的な発現および生産がもたらされるという知見に、少なくともある程度は基づいている。
本発明は、組換えＣＨＯ細胞などの組換え哺乳動物細胞を生産するために二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を使用することができ、その際、所定かつ特定の発現カセット配列がゲノム中に組み込まれ、その結果として、ＦｃＲｎの効率的な発現および生産がもたらされるという知見に、少なくともある程度は基づいている。この組込みは、標的指向組込みによって哺乳動物細胞のゲノムの特定の部位に引き起こされる。それによって、ヘテロ多量体ＦｃＲｎの互いに異なるポリペプチドの、互いに対する発現比率をコントロールすることが可能である。その結果として、正確に折り畳まれ組み立てられたＦｃＲｎの効率的な発現、正確な組立て、および高い発現収率での成功裡な分泌が実現される。
Ｉ．定義
本発明を実施するために有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．、およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（１９８５）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（編）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第二版、ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．編、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第二版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第二版、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失、または挿入によって、単一またはいくつかのヌクレオチド位置において修飾され得る。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて実施することができる。このような修飾は、当業者は容易に実施することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照されたい）。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において特に明白な規定がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞、および当業者に公知であるその等価物を含み、他も同様である。同様に、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つまたは複数の」、および「少なくとも１つの」も、本明細書において同義的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が同義的に使用され得ることにも留意すべきである。
用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。１つの実施形態において、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。１つの実施形態において、用語「約」は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、そのような細胞の子孫を含めて、１つまたは複数の外因性核酸が導入され、かつその後の遺伝子修飾のための開始点になることが目的とされる細胞を、包含する。したがって、用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を包含し、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する、少なくとも１つの第１の組換え認識配列および少なくとも１つの第２の組換え認識配列（これらのリコンビナーゼ認識配列は異なる）を含む。１つの実施形態において、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なっている。
本明細書において使用される場合、用語「組換え細胞」は、最終的な遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的のポリペプチドを発現し、該目的のポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できる細胞を意味する。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。この細胞は、さらにＲＭＣＥ反応を行うことが依然としてできるが、そうすることは目的ではない。
「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」および「組換え細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。子孫の核酸内容は親細胞と完全に同一でなくてもよく、例えば突然変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有している変異子孫は、包含される。
「単離された」組成物とは、その天然環境の成分から分離された組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換ＨＰＬＣもしくは逆相ＨＰＬＣ）によって測定した場合に９５％または９９％を超える純度まで精製される。例えば抗体純度を評価するための方法に関する概要については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ ８４８（２００７）７９～８７を参照されたい。
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を意味する。単離された核酸は、その核酸分子を普通は含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に存在するか、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「単離された」ポリペプチドまたは抗体とは、その天然環境の成分から分離されたポリペプチド分子または抗体分子を意味する。
用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施形態において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施形態において、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施形態において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。
用語「ベクター」または「プラスミド」は、同義的に用いることができ、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を意味する。この用語は、自己複製する核酸構造体としてのベクター、ならびに導入された先の宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。ある種のベクターは、それらが作動的に連結されている核酸の発現を導くことができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
用語「に結合する」は、ある結合部位のその標的への結合、例えば、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位などの、各抗原への結合を意味する。この結合は、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて測定することができる。すなわち、用語「（抗原に）結合する」は、インビトロアッセイでの、抗体のその抗原への結合を意味する。１つの実施形態において、結合は、抗体を表面に結合し、その抗体への抗原の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定する結合アッセイにおいて、測定される。結合とは、例えば、１０－８Ｍ以下、いくつかの実施形態において１０－１３～１０－８Ｍ、いくつかの実施形態において１０－１３～１０－９Ｍの結合親和性（ＫＤ）を意味する。用語「結合する」は、用語「特異的に結合する」も含む。
例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施形態において、抗原が表面に結合され、抗体、すなわちその結合部位の結合が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合親和性は、用語ｋａ（結合定数：複合体を形成する結合についての速度定数）、ｋｄ（解離定数；複合体の解離についての速度定数）、およびＫＤ（ｋｄ／ｋａ）に基づいて定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照物の応答シグナルと直接比較することもできる。
用語「結合部位」は、標的に対して結合特異性を示す任意のタンパク質性実体を意味する。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであり得る。したがって、本明細書において使用される用語「結合部位」は、第２のポリペプチドに特異的に結合できるか、または第２のポリペプチドが特異的に結合できる、ポリペプチドを意味する。
本明細書において使用される場合、用語「選択マーカー」は、その遺伝子を有する細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブまたはネガティブに特異的に選択されることを可能にする遺伝子を意味する。例えば、限定するわけではないが、選択マーカーにより、その選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、各選択剤の存在下（選択的培養条件下）で、ポジティブに選択されることが可能になり得る；形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖することも生存することもできないと考えられる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であってよい。ポジティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞の選択が可能になり得るのに対し、ネガティブ選択マーカーにより、マーカーを有する細胞を選択的に排除することが可能になり得る。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、または代謝もしくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。その他のマーカー遺伝子が、ＷＯ９２／０８７９６およびＷＯ９４／２８１４３で説明されている。
対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出または不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。
本明細書において使用される場合、用語「動作可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の近接した配置を意味する。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーターおよび／またはエンハンサーはコード配列に動作可能に連結されている。特定の実施形態において、「動作可能に連結されて」いるＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態において、例えば、１つの分泌リーダーおよび１つのポリペプチドなど２つのタンパク質のコード化領域をつなげる必要がある場合、これらの配列は近接し、隣り合い、かつ同じ読み枠に存在する。特定の実施形態において、動作可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、かつコード配列の隣に存在してよい。特定の実施形態において、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、動作可能に連結されてよい。エンハンサーがコード配列の転写を増大させる場合、エンハンサーはコード配列に動作可能に連結されている。動作可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置してよく、かつコード配列のプロモーターからかなり離れて位置してよい。動作可能な連結は、当該技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ方法を用いて、かつ／または好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の手法に従って使用することができる。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、５’末端に非依存的にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の内部位置で翻訳を開始することを可能にする場合、ＯＲＦに動作可能に連結されている。
用語「ＦｃＲｎ」は、新生児Ｆｃ受容体を意味する。ＦｃＲｎは、リソソーム分解経路からＩｇＧを救助する機能を果たし、その結果、クリアランスを減らし、半減期を長くする。ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド、すなわちクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）およびβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２－ＣＨ３部分に高い親和性で結合する。ＩｇＧとＦｃＲｎの相互作用は、ｐＨに厳密に依存しており、１：２の化学量論比で起こり、１つのＩｇＧが２本の重鎖を介して２つのＦｃＲｎ分子に結合する（Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０（１９９３）１０７７～１０８３）。ＦｃＲｎ結合は酸性ｐＨ（ｐＨ＜６．５）のエンドソーム中で起こり、中性の細胞表面（ｐＨ約７．４）でＩｇＧは遊離する。相互作用がｐＨ感受性の性質を持つため、エンドソームの酸性環境内での受容体への結合によって、細胞中へ飲作用されるＩｇＧを細胞内分解からＦｃＲｎを介して保護することが容易になる。次いで、ＦｃＲｎは、細胞表面へのＩｇＧの再循環およびそれに続く、ＦｃＲｎ－ＩｇＧ複合体が細胞外の中性ｐＨ環境に曝露された際の血流中への遊離を促進する。
用語「Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合部分」は、おおよそＥＵ位置２４３番からＥＵ位置２６１番、ならびにおおよそＥＵ位置２７５番からＥＵ位置２９３番、ならびにおおよそＥＵ位置３０２番からＥＵ位置３１９番、ならびにおおよそＥＵ位置３３６番からＥＵ位置３４８番、ならびにおおよそＥＵ位置３６７番からＥＵ位置３９３番およびＥＵ位置４０８番、ならびにおおよそＥＵ位置４２４番からＥＵ位置４４０番まで伸びる、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。１つの実施形態において、ＫａｂａｔのＥＵ番号付与による以下のアミノ酸残基：Ｆ２４３、Ｐ２４４、Ｐ２４５Ｐ、Ｋ２４６、Ｐ２４７、Ｋ２４８、Ｄ２４９、Ｔ２５０、Ｌ２５１、Ｍ２５２、Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｒ２５５、Ｔ２５６、Ｐ２５７、Ｅ２５８、Ｖ２５９、Ｔ２６０、Ｃ２６１、Ｆ２７５、Ｎ２７６、Ｗ２７７、Ｙ２７８、Ｖ２７９、Ｄ２８０、Ｖ２８２、Ｅ２８３、Ｖ２８４、Ｈ２８５、Ｎ２８６、Ａ２８７、Ｋ２８８、Ｔ２８９、Ｋ２９０、Ｐ２９１、Ｒ２９２、Ｅ２９３、Ｖ３０２、Ｖ３０３、Ｓ３０４、Ｖ３０５、Ｌ３０６、Ｔ３０７、Ｖ３０８、Ｌ３０９、Ｈ３１０、Ｑ３１１、Ｄ３１２、Ｗ３１３、Ｌ３１４、Ｎ３１５、Ｇ３１６、Ｋ３１７、Ｅ３１８、Ｙ３１９、Ｉ３３６、Ｓ３３７、Ｋ３３８、Ａ３３９、Ｋ３４０、Ｇ３４１、Ｑ３４２、Ｐ３４３、Ｒ３４４、Ｅ３４５、Ｐ３４６、Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｃ３６７、Ｖ３６９、Ｆ３７２、Ｙ３７３、Ｐ３７４、Ｓ３７５、Ｄ３７６、Ｉ３７７、Ａ３７８、Ｖ３７９、Ｅ３８０、Ｗ３８１、Ｅ３８２、Ｓ３８３、Ｎ３８４、Ｇ３８５、Ｑ３８６、Ｐ３８７、Ｅ３８８、Ｎ３８９、Ｙ３９１、Ｔ３９３、Ｓ４０８、Ｓ４２４、Ｃ４２５、Ｓ４２６、Ｖ４２７、Ｍ４２８、Ｈ４２９、Ｅ４３０、Ａ４３１、Ｌ４３２、Ｈ４３３、Ｎ４３４、Ｈ４３５、Ｙ４３６、Ｔ４３７、Ｑ４３８、Ｋ４３９、およびＳ４４０のうちの１つまたは複数が変更される。
本明細書において使用される場合、用語「隣接する」は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端のいずれか、または両末端に位置していることを意味する。隣接ヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の隣に存在するか、またはそれから所定の距離の位置にあってよい。隣接ヌクレオチド配列の長さには特に制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対または数千塩基対であってよい。
用語「正の直線ｐＨ勾配」は、低い（すなわち、酸性の強い）ｐＨ値から始まって、高い（すなわち、酸性が弱い、中性、またはアルカリ性の）ｐＨ値で終わるｐＨ勾配を意味する。１つの実施形態において、正の直線ｐＨ勾配は、約５．５のｐＨ値から始まり、約８．８のｐＨ値で終わる。
デオキシリボ核酸は、コード鎖および非コード鎖を含む。用語「５’」および「３’」は、本明細書において使用される場合、コード鎖上の位置を指す。
本明細書において使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって該細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である）から、または配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失もしくは核酸塩基の突然変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。
ＩＩ． 組成物および方法
通常、例えば治療用ポリペプチドのような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、該ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」または「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞などの適切な宿主細胞に、前記目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。
ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は単純な情報であり、その発現には追加の制御エレメントが必要とされる。したがって、普通は、構造遺伝子は発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、および構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、該哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、およびポリアデニル化シグナル配列は、動作可能に連結された形態で並べられる。
目的のポリペプチドが、互いに異なる（単量体）ポリペプチドから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドであるならば、１つの発現カセットだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれについて少なくとも１つの発現カセットが必要とされる。例えば、完全長抗体は、軽鎖の２個のコピーおよび重鎖の２個のコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、完全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、完全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１個および重鎖のための１個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である、すなわち該抗体が、２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、軽鎖同士も互いに異なり、重鎖同士も互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、４つの異なるポリペプチドから構成され、４つの発現カセットが必要とされる。
目的のポリペプチドのための発現カセットは、いわゆる「発現ベクター」に順に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で該ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。
以前のパラグラフで概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作および処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それによって、発現カセットを、該発現カセットの一部のみをそれぞれ含む異なる発現ベクター間で分け合うことができる。
従来の細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的のポリペプチド（ＳＯＩ）のための発現カセットを有するベクターのランダム組込み（ＲＩ）に依拠している。一般に、ランダム手法によってベクターがトランスフェクトされる場合、いくつかのベクターまたはその断片が細胞ゲノム中に組み込まれる。したがって、ＲＩに基づくトランスフェクションプロセスは、予測不可能である。
このようにして、異なる発現ベクター間で発現カセットを分け合うことでサイズの問題に対処することにより、新たな問題―組み込まれる発現カセットの不揃いな数およびその空間的分布―が生じる。
通常、構造遺伝子の発現用の発現カセットが細胞ゲノム中により多く組み込まれるほど、発現される各ポリペプチドの量は多くなる。組み込まれる発現カセットの数のほかに、組込みの部位および遺伝子座も発現収率に影響を与える。例えば、発現カセットが、細胞ゲノム中の転写活性が低い部位に組み込まれる場合、コードされたポリペプチドはごく少量しか発現されない。しかし、同じ発現カセットが、細胞ゲノム中の転写活性が高い部位に組み込まれる場合、コードされたポリペプチドは多量に発現される。
ヘテロ多量体ポリペプチドの互いに異なるポリペプチドのための発現カセットが、同じ頻度で、かつ同程度の転写活性を有する遺伝子座にすべて組み込まれる限り、この発現の違いが問題を引き起こしてはいない。このような状況下では、多量体ポリペプチドに含まれるすべてのポリペプチドが同量で発現され、多量体ポリペプチドが正確に組み立てられる。
しかし、このシナリオが起こる可能性は非常に低く、２つより多いポリペプチドで構成される分子に対してこのシナリオを保証することはできない。例えば、ＷＯ２０１８／１６２５１７では、ｉ）発現カセット配列およびｉｉ）異なる発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質の大きな差異がＲＩによって観察されたことが開示されている。この理論に縛られるわけではないが、この観察結果は、異なる発現ベクターに由来する異なる発現カセットが、細胞中で異なる頻度で異なる遺伝子座に組み込まれ、その結果、ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる様々なポリペプチドが差次的に、すなわち適切ではない様々な比率で発現されるという事実に起因する。その結果、単量体ポリペプチドの一部が、相対的に多い量で存在し、それ以外が相対的に少ない量で存在する。ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる単量体がこのように不均衡であることが原因で、不完全な組立て、間違った組立て、および分泌速度の低下が起こる。前述のどれも、正確に折り畳まれたヘテロ多量体ポリペプチドの発現収率の低下、および生産物に関係する副産物の割合の上昇を招く。
従来のＲＩ ＣＬＤとは違って、標的指向組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、細胞ゲノム中のあらかじめ定められた「ホットスポット」に、様々な発現カセットを含む導入遺伝子を導入する。また、この導入は、所定の比率の発現カセットを用いる。その結果、この理論に縛られるわけではないが、ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる様々なポリペプチドのすべてが、同じ（または少なくとも同程度であり、少ししか違わない）速度かつ適切な比率で発現される。その結果、正確に組み立てられたヘテロ多量体ポリペプチドの量は増加するはずであり、生産物に関係する副産物の割合は低下するはずである。
また、所定のコピー数および所定の組込み部位が与えられたとすると、ＴＩによって得られる組換え細胞は、ＲＩによって得られる細胞と比べて、優れた安定性を有しているはずである。さらに、選択マーカーは、適切なＴＩを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を示す細胞を選択するためには使用されないことから、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）のような選択剤の突然変異誘発性が原因の一部である配列変異体（ＳＶ）が生じる可能性を最小限にするために、突然変異誘発性の低いマーカーを適用してよい。
しかし、ＴＩで使用される導入遺伝子中の発現カセットの配列、すなわち発現カセット構成が、ＦｃＲｎ発現に強い影響を持っていることが、現在では判明している。
本発明は、個々の発現カセットを所定の数および配列で有する特定の発現カセット構成を使用する。これにより、哺乳動物細胞において発現されるＦｃＲｎの発現収率が高くなり、生産物の質が良くなる。
本発明による発現カセット配列を有する導入遺伝子の所定の組込みのために、ＴＩ方法が使用される。本発明は、２プラスミドリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）反応を用いて、ＦｃＲｎを発現する組換え哺乳動物細胞を作製する新規の方法を提供する。改良点は、特に、所定の配列中の同じ遺伝子座における所定の組込み、ならびにそれによるＦｃＲｎの高発現および生産物に関係する副産物の形成の減少である。
本発明で開示される主題は、ＦｃＲｎの安定な大量生産のために組換え哺乳動物細胞を生産するための方法だけでなく、有利な副産物プロファイルを有するＦｃＲｎの生産力が高い組換え哺乳動物細胞もまた、提供する。
本明細書において使用される２プラスミドＲＭＣＥ戦略は、同じＴＩ遺伝子座に複数の発現カセットを挿入することを可能にする。
ＩＩ．ａ 本発明による導入遺伝子および方法
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を発現する組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告される。ＦｃＲｎは、前記哺乳動物細胞によって天然には発現されないヘテロ多量体ポリペプチドである。より具体的には、ＦｃＲｎは、２つのポリペプチド、すなわちクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）およびβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）からなるヘテロ二量体タンパク質である。ＦｃＲｎの発現を実現するために、特定かつ所定の配列中に複数の異なる発現カセットを含む組換え核酸が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれた。
ＦｃＲｎを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法および該組換え哺乳動物細胞を用いてＦｃＲｎを生産するための方法も、本明細書において報告される。
本発明は、ヘテロ二量体ＦｃＲｎの発現に必要とされる異なる発現カセットの配列、すなわち発現カセット構成が、哺乳動物細胞のゲノム中に組み込まれた際に、ＦｃＲｎの発現収率に影響を与えるという知見に、少なくともある程度は基づいている。
本発明は、組換えＣＨＯ細胞などの組換え哺乳動物細胞を生産するために二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を使用することができ、その際、所定かつ特定の発現カセット配列がゲノム中に組み込まれ、その結果として、ＦｃＲｎの効率的な発現および生産がもたらされるという知見に、少なくともある程度は基づいている。この組込みは、標的指向組込みによって哺乳動物細胞のゲノムの特定の部位に引き起こされる。それによって、ヘテロ多量体ＦｃＲｎの互いに異なるポリペプチドの、互いに対する発現比率をコントロールすることが可能である。その結果として、正確に折り畳まれ組み立てられたＦｃＲｎの効率的な発現、正確な組立て、および高い発現収率での成功裡な分泌が実現される。
ＦｃＲｎは、次の少なくとも２つの発現カセットがその発現のために必要とされるヘテロ二量体である：クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）の発現のための第１の発現カセットおよびβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）の発現のための第２の発現カセット。さらに、ポジティブ選択マーカーのための第３の発現カセットも含まれてよい。
２種の異なるポリペプチドのみからなるこの単純なヘテロ二量体分子を用いる場合でさえ、様々な発現カセット構成を実現することができる。その一部の例を、下記に示す（５’から３’の方向）：
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ－α－ＦｃＲｎ
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ－β２ｍ
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ－α－ＦｃＲｎ－β２ｍ
など。
最初は、単量体のための追加の発現カセットの存在が発現収率に影響を与えるかということが検証されていた。したがって、一過性のスクリーニング発現が行われていた。このような一過性スクリーニングを例えばＨＥＫ細胞において行って、安定な細胞株の順位付けを前もって明らかにできることが、当該技術分野では公知である。一過性の手法の方が、時間がかからないため、これは有利である（例えば、Ｄｉｅｐｅｎｂｒｕｃｋ，Ｃ．ら Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５４（２０１３）４９７～５０３を参照されたい）。
ヒトＦｃＲｎの発現のための一過性スクリーニングにおいて使用される発現カセット構成は、以下のとおりであった（５’から３’の方向に示す。選択マーカーは示していないが、第２の発現カセットの後に常に位置した）：
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ－β２ｍ
α－ＦｃＲｎ－β２ｍ－α－ＦｃＲｎ－β２ｍ。
両方の発現カセットについて２つのコピーが存在すると、予想どおりに収率が二倍になったことが判明している（ＮｉＮＴＡおよびＳＥＣ精製後、２０ｍｇ／ｍＬおよび４０ｍｇ／ｍＬ）。予想とは違って、β２ｍのための第２の発現カセットのみを追加した場合、４発現カセット構成の場合の２倍より多い発現収率が得られた（ＮｉＮＴＡおよびＳＥＣ精製後、９０ｍｇ／ｍＬおよび４０ｍｇ／ｍＬ）。これらの結果を下記の表１にまとめて示す。
Ｍａｇｉｓｔｒｅｌｌｉら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３７５（２０１２）２０～２９）は、ＥＢＮＡ－１を安定に発現し、かつＦｃＲｎαおよびβ２ｍ共発現（ｉ）ビオチンリガーゼ酵素（ＬｓＢｉｒＡ）および（ｉｉ）レポーター遺伝子としての高感度緑色蛍光性タンパク質（ＥＧＦＰ）のためのデュアルプロモーターベクターを一過性にトランスフェクトされたＰＥＡＫ細胞を用いてビオチン化ＦｃＲｎを生産するための方法を報告した。Ｎｉ－ＮＴＡ精製および固定化後、彼らが得たｈＦｃＲｎおよびｍＦｃＲｎは、細胞培養上清１リットル当たり、それぞれわずか４ｍｇ／Ｌおよび１．２ｍｇ／Ｌであった。
（表1）HEK293細胞における一過性発現の結果。発現カセット構成を5'から3'の方向に示す。選択マーカー発現カセットは複雑性を軽減するために示していないが、第2の発現カセットの後に常に位置した;n.d.=未測定。
Figure 0007250950000001
*:6ウェルマイクロタイタープレートの使用体積
**:Ni-NTAおよびアフィニティー吸着後
一過性発現において最良であると判定された発現カセット構成を、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎを発現する安定な組換えＣＨＯ細胞をＴＩによって作製するために使用した。一過性発現において２番目に良い発現収率をもたらした４発現カセット構成も、使用した。これらの結果を下記の表２に提示する。
（表2）CHO-K1細胞における安定発現の結果。発現カセット構成を5'から3'の方向に示す。選択マーカーは複雑性を軽減するために示していないが、第2の発現カセットの後に常に位置した;hu=ヒト;cy=カニクイザル;mu=マウス。
Figure 0007250950000002
マウスＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎの安定発現の場合にも、一過性発現の場合と同じ発現カセット構成が最も優れた収率をもたらしたことが、認識できる。
ヒトＦｃＲｎの安定発現の場合、予想外に、一過性発現では収率が低かったにもかかわらず、４発現カセット構成が、より優れた収率をもたらした。
したがって、ヒトＦｃＲｎおよびマウス／カニクイザルＦｃＲｎのそれぞれ、すなわち種が異なるＦｃＲｎを組換え生産する場合、最も優れた発現収率をもたらす発現カセット構成は異なっている。
本発明による組換え細胞を用いて生産されたＦｃＲｎの１つの用途は、アフィニティークロマトグラフィーリガンドである。アビジンまたはストレプトアビジンで誘導体化したマトリックスの表面にモノビオチン化ＦｃＲｎを固定化することにより、安定なＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムを得られることが、当該技術分野において公知である（例えばＷＯ２０１３／１２０９２９を参照されたい）。
したがって、このような使用のために、本発明による組換え細胞を用いるかまたは本発明による方法において生産されたＦｃＲｎを、モノビオチン化しなければならない。このようなモノビオチン化は、ビオチン化されていないＦｃＲｎの発現および単離の後にインビトロの方法によって、またはＦｃＲｎを発現する組換え細胞の培養により直接的にインビボで、実現することができる。
どちらの方法も、適用可能である。
どちらの手法の場合も、α－ＦｃＲｎのアミノ酸配列のＣ末端に、大腸菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡによって認識されるＡｖｉタグを付けて伸ばすことにより、α－ＦｃＲｎを修飾する。
インビトロ手法の場合、前記Ａｖｉタグを含むＦｃＲｎを、ビオチンの存在下でＢｉｒＡと共にインキュベートする。これにより、ビオチンがα－ＦｃＲｎのＡｖｉタグ部位に結合する。インビトロビオチン化を用いて得られた結果を以下の表３に示している。
（表3）CHO-K1細胞における安定発現によって生産されたFcRnのインビトロビオチン化の結果。発現カセット構成を5'から3'の方向に示す。選択マーカーは複雑性を軽減するために示していないが、第2の発現カセットの後に常に位置した;hu=ヒト;cy=カニクイザル;mu=マウス。
Figure 0007250950000003
インビボ手法の場合、ＢｉｒＡを同じ組換え細胞において発現させる。したがって、この場合、ＢｉｒＡを発現させるための別の発現カセットが必要とされ、標的指向組込みによって導入される導入遺伝子中に組み込まれなければならない。
ＦｃＲｎ発現カセットの構成の場合と同様に、ＢｉｒＡ発現カセットは、様々な位置に配置することができる。各結果を下記の表４に示している。
（表4）CHO-K1細胞においてBirAとの安定な共発現によって生産されたFcRnのインビボビオチン化の結果。発現カセット構成を5'から3'の方向に示す。選択マーカーは複雑性を軽減するために示していないが、BirAが一番3'側に位置している発現カセットである場合には第2の発現カセットの後、またはBirA発現カセットが第3の発現カセットとして位置している場合はBirA発現カセットの後のどちらかに、位置した。hu=ヒト;cy=カニクイザル;mu=マウス;BirA=大腸菌ビオチンリガーゼ。
Figure 0007250950000004
予想外に、導入遺伝子中の最後の最も３’末端側の発現カセットとしてＢｉｒＡ発現カセットが位置すると、最も有効性の高い力価が得られた。同じく予想外に、ＢｉｒＡ発現カセットが２つの場合よりも、ＢｉｒＡ発現カセットが１つの場合の方が、有効性の高い力価が得られている。この結果は、ＦｃＲｎの種とは無関係である。
本発明を以下に要約する。
１ ヒトＦｃＲｎ
本発明による１つの態様は、ヒトＦｃＲｎを生産するための方法であって、
ａ）ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
ｂ）細胞または培養培地からヒトＦｃＲｎを回収する工程と、
を含み、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ５’から３’の方向に
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、および
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット
を含む、方法である。
１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ｈｉｓタグ、Ａｖｉタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
本発明による１つの態様は、Ｃ末端がビオチン化されたヒトＦｃＲｎを生産するための方法であって、
ａ）ヒトＦｃＲｎおよびビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞をビオチン含有培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地から、Ｃ末端がビオチン化されたヒトＦｃＲｎを回収する工程と、を含み、ヒトＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ５’から３’の方向に
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含むヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含むヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む、方法である。
１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、ＢｉｒＡは大腸菌に由来する。
本発明の１つの態様は、５’から３’の方向に
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、および
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット
を含む、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸である。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、もしくはＨｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセットをさらに含む。
１つの実施形態において、ＢｉｒＡは大腸菌に由来する。
本発明の１つの態様は、哺乳動物細胞においてヒトＦｃＲｎを発現させるための、５’から３’の方向に
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、および
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット
を含むデオキシリボ核酸の使用である。
使用の１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に組み込まれる。
使用の１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、前記使用は、Ｃ末端がビオチン化されたヒトＦｃＲｎの発現のためであり、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、第４の発現カセットの後に、ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードする第５の発現カセットをさらに含み、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ｃ末端にＡｖｉタグをさらに含む。
１つの実施形態において、ＢｉｒＡは大腸菌に由来する。
本発明の１つの態様は、細胞のゲノム中に組み込まれた、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含む、組換え哺乳動物細胞であって、
ヒトＦｃＲｎをコードする該デオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、および
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット
を含む、組換え哺乳動物細胞である。
１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、第４の発現カセットの後に、ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードする第５の発現カセットをさらに含み、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ｃ末端にＡｖｉタグをさらに含む。
１つの実施形態において、ＢｉｒＡは大腸菌に由来する。
これまでのすべての態様の１つの実施形態において、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、
－ 第１の（最も５’側の）発現カセットの５’側に位置する第１の組換え認識配列、
－ 第４の発現カセット、または存在するならば、第５（最も３’側）の発現カセットの３’側に位置する第２の組換え認識配列、および
－
－ 第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間、かつ
－ 発現カセットのうちの２つの間、
に位置する第３の組換え認識配列
をさらに含み、組換え認識配列はすべて異なっている。
１つの実施形態において、第３の組換え認識配列は、第２の発現カセットと第３の発現カセットの間に位置する。
本発明の１つの態様は、３つの異なる組換え認識配列および４つの発現カセットを順に含む、２つのデオキシリボ核酸を含む組成物であり、
－ 第１のデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ 第１のリコンビナーゼ認識配列、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、および
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー
を含み、
－ 第２のデオキシリボ核酸は５’から３’の方向に
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、および
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ 第２の組換え認識配列
を含む。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、第２のデオキシリボ核酸は、第４の発現カセットの後かつ第２のリコンビナーゼ認識配列の前に位置するビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードする第５の発現カセットをさらに含み、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、ＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、ＢｉｒＡは大腸菌に由来する。
これまでのすべての態様の１つの実施形態において、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードする別の発現カセットを含む。
１つの実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットは、
第３の組換え認識配列の
ｉ）５’側もしくは
ｉｉ）３’側または
ｉｉｉ）一部分が５’側、一部分が３’側に、位置している。
１つの実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部分が、３’側に一部分が位置しており、該発現カセットの、該５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含む。
１つの実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットの、５’側に位置する部分は、開始コドンに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、該プロモーター配列は、上流に第２の発現カセットが隣接し（すなわち、第２の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流に第３の組換え認識配列が隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）；かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの、３’側に位置する部分は、ポリアデニル化配列に動作可能に連結された、開始コドンを欠く、選択マーカーをコードする核酸を含み、上流には第３の組換え認識配列が隣接し、下流には第３の発現カセットが隣接している。
１つの実施形態において、開始コドンは転写開始コドンである。１つの実施形態において、開始コドンはＡＴＧである。
本発明の１つの態様は、細胞のゲノム中に組み込まれた、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含む、組換え哺乳動物細胞であり、
ヒトＦｃＲｎをコードする該デオキシリボ核酸は、以下のエレメント：
第１の組換え認識配列、第２の組換え認識配列、および第３の組換え認識配列、
第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカー、ならびに
第１～第４の発現カセット、
を含み、５’から３’の方向に、前記エレメントの配列は、
ＲＲＳ１－第１のＥＣ－第２のＥＣ－ＲＲＳ３－ＳＭ１－第３のＥＣ－第４のＥＣ－ＲＲＳ２－ＳＭ２
であり、
ＲＲＳ＝組換え認識配列、
ＥＣ＝発現カセット、
ＳＭ＝選択マーカー
である。
本発明の１つの態様は、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含みヒトＦｃＲｎを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、該外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列および５つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第１のリコンビナーゼ認識配列、
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、および
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー
を含み、
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ 前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分
－ ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、および
－ ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、ならびに
－ 第２の組換え認識配列
を含み、第１および第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列は、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前述の１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を細胞に導入する工程；
ｃ）
ｉ）ｂ）の第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に；または
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つまたは複数のリコンビナーゼが、第１および第２のデオキシリボ核酸ならびに外因性ヌクレオチド配列の組換え認識配列を認識し；（かつ、場合によっては、１つまたは複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程
ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現しヒトＦｃＲｎを分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それによって、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含みヒトＦｃＲｎを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産する、方法。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、方法は、ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含み、Ｃ末端がビオチン化されたヒトＦｃＲｎを分泌する、組換え哺乳動物細胞を生産するためのものであり、２つのデオキシリボ核酸は、３つの異なる組換え認識配列および６つの発現カセットを含み、第２のデオキシリボ核酸は、第４の発現カセットの後かつ第２のリコンビナーゼ認識配列の前に位置する、大腸菌ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセットをさらに含み、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、ＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部分が、３’側に一部分が位置しており、該発現カセットの、該５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該３’側に位置する部分は、開始コドンのない、前述の１つの第２の選択マーカーのコード配列、およびポリアデニル化シグナル配列を含む。
１つの実施形態において、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分は、開始コドンに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、該プロモーター配列は、上流に第２の発現カセットが隣接し（すなわち、第２の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流に第３の組換え認識配列が隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）；かつ、前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分は、ポリアデニル化シグナル配列に動作可能に連結された、開始コドンを欠く、前述の１つの第２の選択マーカーのコード配列を含み、上流には第３の組換え認識配列が隣接し、下流には第３の発現カセットが隣接している。
１つの実施形態において、開始コドンは転写開始コドンである。１つの実施形態において、開始コドンはＡＴＧである。
１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、第１のデオキシリボ核酸は第１のベクターに組み込まれ、第２のデオキシリボ核酸は第２のベクターに組み込まれる。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、各発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、コード配列、およびポリアデニル化シグナル配列、場合によっては、それに続くターミネーター配列を含み、これらはすべて互いに動作可能に連結されている。
１つの実施形態において、
ｉ）第１の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含み、かつ／または
ｉｉ）第２の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含み、かつ／または
ｉｉｉ）第３の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含み、かつ／または
ｉｖ）第４の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含み、かつ／または
ｖ）選択マーカーをコードする発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含む。
１つの実施形態において、第５の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、大腸菌ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含む。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、プロモーターがＳＶ４０プロモーターでありポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位でありターミネーター配列が存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ヒトＦｃＲｎは、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）とヒトβ２－ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有結合性複合体である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ヒトＦｃＲｎはモノビオチン化される。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。１つの実施形態において、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、配列番号０３のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、配列番号０４のアミノ酸配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、リコンビナーゼ認識配列は、Ｌ３、２Ｌ、およびＬｏｘＦａｓである。１つの実施形態において、Ｌ３は配列番号２２の配列を有し、２Ｌは配列番号２３の配列を有し、ＬｏｘＦａｓは配列番号２４の配列を有する。１つの実施形態において、第１のリコンビナーゼ認識配列はＬ３であり、第２のリコンビナーゼ認識配列は２Ｌであり、第３のリコンビナーゼ認識配列はＬｏｘＦａｓである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）は、配列番号０７のアミノ酸配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、大腸菌ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号２５の配列を有する。１つの実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号２７の配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ｂＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２９である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ｈＧＴターミネーターは、配列番号３０の配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ＳＶ４０プロモーターは、配列番号３１の配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２８である。
２ 非ヒトＦｃＲｎ
本発明による１つの態様は、非ヒトＦｃＲｎを生産するための方法であって、
ａ）非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を培養する工程、および
ｂ）細胞または培養培地から非ヒトＦｃＲｎを回収する工程と、
を含み、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ５’から３’の方向に
－ 非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、および
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第３の発現カセット
を含む、方法である。
１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
本発明による１つの態様は、Ｃ末端がビオチン化された非ヒトＦｃＲｎを組換えによって生産するための方法であって、
ａ）非ヒトＦｃＲｎおよびビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞をビオチン含有培地中で培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地から、Ｃ末端がビオチン化された非ヒトＦｃＲｎを回収する工程と、
を含み、非ヒトＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ５’から３’の方向に
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む、方法である。
１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
本発明の１つの態様は、５’から３’の方向に
－ 非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、および
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第３の発現カセット
を含む、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸である。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
本発明の１つの態様は、哺乳動物細胞において非ヒトＦｃＲｎを発現させるための、５’から３’の方向に
－ 非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、および
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第３の発現カセット
を含むデオキシリボ核酸の使用である。
使用の１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に組み込まれる。
使用の１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、使用は、Ｃ末端がビオチン化された非ヒトＦｃＲｎの発現のためであり、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む。
本発明の１つの態様は、細胞のゲノム中に組み込まれた、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含む、組換え哺乳動物細胞であり、
非ヒトＦｃＲｎをコードする該デオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ 非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、および
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第３の発現カセット
を含む。
１つの実施形態において、デオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノムの単一の部位または遺伝子座に安定に組み込まれる。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
すべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ＢｉｒＡは、大腸菌に由来する。
これまでのすべての態様の１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、
－ 第１の（最も５’側の）発現カセットの５’側に位置する第１の組換え認識配列、
－ 第３の発現カセット、または存在するならば、第５（最も３’側）の発現カセットの３’側に位置する第２の組換え認識配列、および
－
－ 第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間、かつ
－ 発現カセットのうちの２つの間
に位置する第３の組換え認識配列
をさらに含み、組換え認識配列はすべて異なっている。
１つの実施形態において、第３の組換え認識配列は、第２の発現カセットと第３の発現カセットの間に位置する。
本発明の１つの態様は、３つの異なる組換え認識配列および３つの発現カセットを順に含む、２つのデオキシリボ核酸を含む組成物であり、
－ 第１のデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向
－ 第１のリコンビナーゼ認識配列、
－ 非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、および
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー
を含み、
－ 第２のデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第３の発現カセット、および
－ 第２の組換え認識配列
を含む。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、第２のデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ 第３のリコンビナーゼ認識配列の第２のコピー、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット、および
－ 第２のリコンビナーゼ認識配列
を含む。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
これまでのすべての態様の１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードする別の発現カセットを含む。
１つの実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットは、
第３の組換え認識配列の
ｉ）５’側もしくは
ｉｉ）３’側または
ｉｉｉ）一部分が５’側、一部分が３’側に、位置している。
１つの実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部分が、３’側に一部分が位置しており、該発現カセットの、該５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含む。
１つの実施形態において、選択マーカーをコードする発現カセットの、５’側に位置する部分は、開始コドンに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、該プロモーター配列は、上流に第２の発現カセットが隣接し（すなわち、第２の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流に第３の組換え認識配列が隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）；かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの、３’側に位置する部分は、ポリアデニル化シグナル配列に動作可能に連結された、開始コドンを欠く、選択マーカーをコードする核酸を含み、上流には第３の組換え認識配列が隣接し、下流には第３の発現カセットが隣接している。
１つの実施形態において、開始コドンは転写開始コドンである。１つの実施形態において、開始コドンはＡＴＧである。
本発明の１つの態様は、細胞のゲノム中に組み込まれた、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含む、組換え哺乳動物細胞であり、
非ヒトＦｃＲｎをコードする該デオキシリボ核酸は、以下のエレメント：
第１の組換え認識配列、第２の組換え認識配列、および第３の組換え認識配列、
第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカー、ならびに
第１～第３の発現カセット、
を含み、５’から３’の方向に、前記エレメントの配列は、
ＲＲＳ１－第１のＥＣ－第２のＥＣ－ＲＲＳ３－ＳＭ１－第３のＥＣ－ＲＲＳ２－ＳＭ２
であり、
ＲＲＳ＝組換え認識配列、
ＥＣ＝発現カセット、
ＳＭ＝選択マーカー
である。
本発明の１つの態様は、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含み非ヒトＦｃＲｎを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、該外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列および５つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第１のリコンビナーゼ認識配列、
－ 非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
－ １つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分、および
－ 第３の組換え認識配列の第１のコピー、
を含み、
第２のデオキシリボ核酸が５’から３’の方向に
－ 第３の組換え認識配列の第２のコピー
－ 前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第３の発現カセット、および
－ 第２の組換え認識配列
を含み、第１および第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列は、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前述の１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、
２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を細胞に導入する工程；
ｃ）
ｉ）ｂ）の第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に；または
ｉｉ）その後に逐次的に、
１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程であって、
１つまたは複数のリコンビナーゼが、第１および第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識し；（かつ、場合によっては、１つまたは複数のリコンビナーゼが、２リコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、
１つまたは複数のリコンビナーゼを導入する工程
ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現し非ヒトＦｃＲｎを分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それによって、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含み非ヒトＦｃＲｎを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産する、方法。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、Ａｖｉタグ、Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓＡｖｉタグをＣ末端にさらに含む。
１つの実施形態において、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。
１つの実施形態において、方法は、非ヒトＦｃＲｎをコードするデオキシリボ核酸を含み、Ｃ末端がビオチン化された非ヒトＦｃＲｎを分泌する、組換え哺乳動物細胞を生産するためのものであり、２つのデオキシリボ核酸は、３つの異なる組換え認識配列および６つの発現カセットを含み、第２のデオキシリボ核酸は、５’から３’の方向に
－ 第３のリコンビナーゼ認識配列の第２のコピー、
－ Ｃ末端にＡｖｉタグを含む非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
－ 非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
－ ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
を含む。
１つの実施形態において、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部分が、３’側に一部分が位置しており、該発現カセットの、該５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該３’側に位置する部分は、開始コドンのない、前述の１つの第２の選択マーカーのコード配列、およびポリＡシグナルを含む。
１つの実施形態において、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分は、開始コドンに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、該プロモーター配列は、上流に第２の発現カセットが隣接し（すなわち、第２の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流に第３の組換え認識配列が隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）；かつ、前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分は、ポリアデニル化シグナル配列に動作可能に連結された、開始コドンを欠く、前述の１つの第２の選択マーカーのコード配列を含み、上流には第３の組換え認識配列が隣接し、下流には第３の発現カセットが隣接している。
１つの実施形態において、開始コドンは転写開始コドンである。１つの実施形態において、開始コドンはＡＴＧである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、第１のデオキシリボ核酸は第１のベクターに組み込まれ、第２のデオキシリボ核酸は第２のベクターに組み込まれる。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、各発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、コード配列、およびポリアデニル化シグナル配列、場合によっては、それに続くターミネーター配列を含む。
１つの実施形態において、
ｉｉ）第１および／または第３の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含み、
ｉｉ）第２および／または第４の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含み、かつ
ｉｉｉ）選択マーカーをコードする発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、ピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含む。
１つの実施形態において、第５の発現カセットは、５’から３’の方向に、プロモーター、大腸菌ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする核酸、およびポリアデニル化シグナル配列、ならびに場合によっては、ターミネーター配列を含む。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、プロモーターがＳＶ４０プロモーターでありポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位でありターミネーター配列が存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎは、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）と非ヒトβ２－ミクログロブリン（ｂ２ｍ）との非共有結合性複合体である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎはモノビオチン化される。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。１つの実施形態において、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、リコンビナーゼ認識配列は、Ｌ３、２Ｌ、およびＬｏｘＦａｓである。１つの実施形態において、Ｌ３は配列番号２２の配列を有し、２Ｌは配列番号２３の配列を有し、ＬｏｘＦａｓは配列番号２４の配列を有する。１つの実施形態において、第１のリコンビナーゼ認識配列はＬ３であり、第２のリコンビナーゼ認識配列は２Ｌであり、第３のリコンビナーゼ認識配列はＬｏｘＦａｓである。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、大腸菌ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼは、配列番号２１のアミノ酸配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号２５の配列を有する。１つの実施形態において、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号２７の配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ｂＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２９である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ｈＧＴターミネーターは、配列番号３０の配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ＳＶ４０プロモーターは、配列番号３１の配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号２８である。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎはカニクイザルＦｃＲｎであり、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）はカニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）はカニクイザルβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である。１つの実施形態において、カニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。１つの実施形態において、カニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、配列番号０９のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、カニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、カニクイザルβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）は、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。
これまでのすべての態様および実施形態のうちの１つの実施形態において、非ヒトＦｃＲｎはマウスＦｃＲｎであり、非ヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）はマウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、非ヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）はマウスβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である。１つの実施形態において、マウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、その細胞外ドメインである。１つの実施形態において、マウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、マウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）は、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、マウスβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
ＩＩ．ｂ リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）
標的指向組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施形態において、標的指向組込みは、１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態において、標的指向組込みは、相同組換えによって媒介される。
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組換え事象のために必要かつ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳを用いて、組換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めることができる。
特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。
特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ部位またはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ部位またはφＣ３１ａｔｔＢ部位である特定の実施形態において、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて細胞中に導入することができる。
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する、３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリー部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組換えと分子間組換えの両方を媒介する。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域から構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰの媒介による組換えは、高効率で起こり、いかなる他の宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上に同じ向きで配置されている場合、Ｃｒｅの媒介による組換えは、それら２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列を、共有結合的に閉じた環として切除する。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上に逆向きの位置で配置されている場合、Ｃｒｅの媒介による組換えは、それら２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを逆にする。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上に存在する場合、かつ一方のＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅの媒介による組換えの結果、環状ＤＮＡ配列が組み込まれる。
特定の実施形態において、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、ＬｏｘＰ配列は、変異ＬｏｘＰ配列である。変異ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅの媒介による組込みまたは置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態において、変異ＬｏｘＰ配列は、Ｌｏｘ ＰＬ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、およびＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列は、左の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列は、右の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。野生型ＬｏｘＰ配列も変異ＬｏｘＰ配列も、Ｃｒｅに依存した組換えを媒介することができる。
用語「一致ＲＲＳ」とは、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは、同じである。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、どちらのＲＲＳも、変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、２つの一致ＲＲＳは、互いに異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、第１の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
ＩＩ．ｃ ＴＩに適した例示的哺乳動物細胞
前述したような、外因性核酸（「ランディング部位」）を含む、ＴＩに適した任意の公知または今後得られる哺乳動物細胞を、本発明において使用することができる。
これまでのセクションに基づく、外因性核酸（ランディング部位）を含むＣＨＯ細胞を用いて、本発明を例示する。これは、単に本発明を例示するために提示され、決して限定として解釈すべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲において設定される。
１つの好ましい実施形態において、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
本発明において使用するために適している、そのゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む例示的哺乳動物細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼの媒介によるＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含むランディング部位（＝哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列）を内部に持つ、ＣＨＯ細胞である。これらの異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、および２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８～９０８；Ｗｏｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照されたい）、その際、Ｌ３および２Ｌはランディング部位の５’末端および３’末端にそれぞれ隣接しており、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光性ＧＦＰタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化することならびにトランスフェクションおよびＣｒｅ組換え後に該部位が存在しないものを選択すること（ネガティブ選択）を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）は、ＲＭＣＥ反応をモニターするのに役立つ。
先のパラグラフで概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、いわゆる、Ｌ３部位およびＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクターならびにＬｏｘＦａｓ部位および２Ｌ部位を内部に持つバックベクターを同時に組み込むことが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配されている：プロモーターおよび開始コドンはフロントベクター上に位置しているのに対し、コード化領域およびポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する前記核酸がＣｒｅを媒介として正確に組み込まれた場合にのみ、各選択剤に対する耐性が誘導される。
通常、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の１つの部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞であって、該外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なっている、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞である。前記外因性ヌクレオチド配列は、「ランディング部位」と呼ばれる。
本発明で開示される主題では、外因性ヌクレオチド配列のＴＩに適した哺乳動物細胞を使用する。特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の組込み部位に組み込まれる外因性ヌクレオチド配列を含む。ＴＩに適したこのような哺乳動物細胞は、ＴＩ宿主細胞と表記することもできる。
特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、ハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯ Ｋ１Ｓ細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞である。
特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、該外因性ヌクレオチド配列は、１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、かつ第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は第２の選択マーカーもさらに含み、かつ第１の選択マーカーと第２の選択マーカーは互いに異なる。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、第３の選択マーカーおよび配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もさらに含み、該ＩＲＥＳは該第３の選択マーカーに動作可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１の選択マーカーとも第２の選択マーカーとも異なってよい。
選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光性タンパク質であってもよい。
特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。
外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態において、外因性ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれる。
特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、該ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＳＳは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の好ましい実施形態において、３つのＲＳＳはすべて、互いに異なる。特定の実施形態において、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から、相互に独立して、選択される。
特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’側（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’側（下流）に位置している。特定の実施形態において、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’末端の隣に存在し、かつ第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端の隣に存在する。
特定の実施形態において、選択マーカーは第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置しており、かつこれら２つの隣接ＲＲＳは互いに異なる。特定の好ましい実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態において、ＬｏｘＰ Ｌ３配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）は選択マーカーの５’側に位置しており、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は選択マーカーの３’側に位置している。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接ＲＲＳは変異ＦＲＴ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、第１の隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置づけられている。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、両方が順方向または逆方向である。特定の実施形態において、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置づけられている。
特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＳＳが隣接する、第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーを含み、該第１の選択マーカーは該第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態において、２つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態において、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施形態において、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光性タンパク質である。特定の実施形態において、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、互いに異なる。
特定の実施形態において、選択マーカーは、プロモーター配列に動作可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに動作可能に連結されている。特定の実施形態において、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに動作可能に連結されている。
特定の実施形態において、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。特定の実施形態において、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置している。特定の実施形態において、第１のＲＲＳおよび第２のＲＲＳは同じであり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳとも第２のＲＲＳとも異なる。特定の好ましい実施形態において、３つのＲＳＳはすべて、互いに異なる。
ＩＩ．ｄ 本発明を実施するために適した例示的ベクター
上記に概説した「単一ベクターＲＭＣＥ」のほかに、２つの核酸を同時に標的指向組込みするために、新規な「２ベクターＲＭＣＥ」を実施することができる。
「２ベクターＲＭＣＥ」戦略は、本発明によるベクター組合せを用いる本発明による方法において実施される。例えば、限定されるわけではないが、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在する並びを含むことができ、第１のベクターは、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれる外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳおよび第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。２ベクターＲＭＣＥ戦略の例を図１に例示している。このような２ベクターＲＭＣＥ戦略により、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムにおけるＴＩ後に本発明による発現カセット構成が得られるように、各配列の各ＲＲＳペアの間に適切な数のＳＯＩを組み入れることによって複数のＳＯＩを導入することが可能になる。
２プラスミドＲＭＣＥ戦略は、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実施するために３つのＲＲＳ部位を使用することを含む（図１）。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いるＴＩに適した哺乳動物細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対しても交差活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的とされる２つの発現プラスミドは、効率的な標的化のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方の発現プラスミド（フロント）にはＲＲＳ１およびＲＲＳ３が隣接し、他方（バック）にはＲＲＳ３およびＲＲＳ２が隣接している。また、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットが、２つの部分に分割されている。フロントプラスミドは、プロモーターとそれに続く開始コドンおよびＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード化領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち動作可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。図１は、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を示す概略図である。
単一ベクターＲＭＣＥと２ベクターＲＭＣＥのどちらも、ドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡ配列と組込み部位が存在する哺乳動物細胞ゲノム中のＤＮＡ配列とを正確に交換することにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に１つまたは複数のドナーＤＮＡ分子を一方向性に組み込むことを可能にする。これらのＤＮＡ配列は、ｉ）少なくとも１つの選択マーカー、もしくはある種の２ベクターＲＭＣＥの場合のような「分割された選択マーカー」、および／またはｉｉ）少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、に隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。
ＲＭＣＥは、二重組換え乗換え事象を伴い、この事象は、リコンビナーゼによって触媒され、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間で起こる。ＲＭＣＥは、フロントベクターおよびバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ただ１回の乗換え事象を伴う組換えとは違って、ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫または防御機構の望まれない誘発を減らし、かつ／または防ぐように、実行することができる。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。
特定の実施形態において、標的指向組込みは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、標的指向組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列がすべて、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施形態において、選択マーカーは、一部分が第１のベクターにおいてコードされ、一部分が第２のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。このような系の例を図１に示している。
特定の実施形態において、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的指向組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つまたは複数のあらかじめ定められた組込み部位に、選択マーカーおよび／または多量体ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。
ＩＩ．ｅ 本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎの使用
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、例えば、ヒト、マウス、またはカニクイザルに由来するものは、ＩｇＧ異化作用において重要な役割を果たしている。ＩｇＧのインビトロでのＦｃＲｎ結合性質／特性は、インビボでのその薬物動態学的性質を示している。このようなインビトロ方法は、度重なるインビボ研究を回避することができる（動物実験、時間、およびコストの低減）ため、抗体を開発する間、大変貴重である。このような解析は、プラズモン表面共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（Ｗａｎｇ，Ｗ．ら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．３９（２０１１）１４６９～１４７７；Ｄａｔｔａ－Ｍａｎｎａｎ，Ａ．ら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．４０（２０１２）１５４５～１５５５；Ｖａｕｇｈｎ，Ｄ．Ｅ．およびＢｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６（１９９７）９３７４～９３８０；Ｒａｇｈａｖａｎ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２（１９９５）１１２００～１１２０４；Ｍａｒｔｉｎ，Ｗ．Ｌ．およびＢｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（１９９９）１２６３９～１２６４７）；熱量測定方法および非対称流フィールドフロー分画法（Ｈｕｂｅｒ，Ａ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０（１９９３）１０７７～１０８３；Ｐｏｌｌａｓｔｒｉｎｉ，Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１４（２０１１）８８～９８）；およびＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー（ＷＯ２０１３／１２０９２９）を用いて実施することができる。圧倒的に最も簡便な方法は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーである。他の方法を組み合わせることによって、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーの結果に匹敵する解析結果を得ることができると思われるが、複雑さおよび労力の増大という犠牲を払う。
さらに、ｐＨに依存しない方法は、エンドソーム結合のためには酸性ｐＨを要するが、細胞表面でのＩｇＧ遊離には中性ｐＨを要する、ＦｃＲｎ結合特性についての生理的ｐＨ依存性を適切に反映しない。また、ｐＨ環境は、ＦｃＲｎ分子の自己会合性質に影響を与える。１種類のｐＨにおいて標準的条件下で機能し、したがって、複雑なＦｃＲｎ－ＩｇＧ相互作用のスナップショットのみを検出するには、ＦｃＲｎ結合の全体的なｐＨ依存性を集約するための複数回の測定が必要となる。ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーでは、１回の測定でこれを行うことができる。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーによって、１：２、１：１、および２：２の化学量論比を含む混ざった化学量論比において２：１の化学量論比を主に用い、かつ試料において認められる様々なピークの分離を微調整するために調整することができるｐＨ勾配を用いて、適切な生理的条件下で、試料を解析することが可能になる。様々なピークは、個々の曲線下面積に基づいて定量することができ、各ピークに対応する溶出液は、例えば、官能性の決定のための二次的解析、再クロマトグラフィー、または質量分析解析に適用することができる。
さらに、現在公知の様々な疾患およびまた今後明らかになるであろう疾患を治療するための治療レジメンを提供するために、目的に合わせて作製された抗体ならびにＦｃ領域を含む融合ポリペプチドが必要とされている。
抗体またはＦｃ領域を含む融合ポリペプチドのＦｃＲｎ結合特性を目的に合わせるために、Ｆｃ領域を介したエフェクター機能に関与する残基を修飾し、結果として生じる修飾された抗体および融合ポリペプチドを試験する。必要とされる特性を実現していない場合、同じ方法を再び実施する。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、単純なクロマトグラフィー方法に基づいて修飾抗体の特徴的な性質の変化を予測し、修飾抗体の特性の変化を解析するのにインビボ研究を必要としない方法が提供される。
いくつかの場合において、半減期が延長された抗体が望まれる。例えば、治療を必要とする患者の血液循環中での半減期が延長された薬物は、必要とする投薬回数が減るか、または必要とする投薬期間が長くなる。また、このような抗体は、疾患部位、例えば腫瘍への曝露が増大するという利点も有している。
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、インビボでのＩｇＧ抗体の代謝運命にとって重要である。
本発明による（ビオチン化）ＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産された（ビオチン化）ＦｃＲｎは、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用することができる。
したがって、本発明の１つの態様は、抗体または少なくとも１つのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを分離するための正の直線ｐＨ勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての、本発明による固定化されたＦｃＲｎの使用であって、
ＦｃＲｎが固体相に結合されており、
ＦｃＲｎがモノビオチン化され、かつ固体相がストレプトアビジンで誘導体化されており、
ｐＨ勾配が、第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までであり、第１のｐＨ値はｐＨ３．５～ｐＨ６．４であり、第２のｐＨ値はｐＨ７．４～ｐＨ９．５である、
本発明による固定化されたＦｃＲｎの使用である。
したがって、本発明の別の１つの態様は、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー方法であって、
－ 第１のｐＨ値を有し、抗体または少なくとも１つのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを含む溶液を、本発明によるＦｃＲｎを含むＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー材料に添加する工程、
－ 第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までのｐＨ勾配を有する溶液を、前の工程のアフィニティークロマトグラフィー材料に添加する工程、および
－ 抗体または融合ポリペプチドの溶出を測定する工程
を含み、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー材料は、固体相に結合された本発明によるＦｃＲｎを含み、ＦｃＲｎはモノビオチン化され、かつ固体相はストレプトアビジンで誘導体化されており、かつ
第１のｐＨ値はｐＨ３．５～ｐＨ６．４であり、第２のｐＨ値はｐＨ７．４～ｐＨ９．５である、方法である。
本明細書において報告される方法／使用を用いると、密接に関連した、すなわち、ＦｃＲｎ結合に影響を与える単一または限定された数のアミノ酸残基が異なる抗体種を分離し、単離し、かつインビボでの性質に関して特徴を明らかにすることが可能である。
したがって、本明細書において報告されるクロマトグラフィー方法を用いて、ＦｃＲｎに関連し半減期に影響を与えるアミノ酸位置について特徴を明らかにする／同定することができる。
したがって、本明細書において報告される方法を用いると、１つの親抗体の様々な変異体を分離すること、およびこれらの変異体間の特定の比率を求めることが可能である。これは、ｉ）組換えによって生産したＦｃＲｎをクロマトグラフィー担体上に固定化することとｉｉ）直線ｐＨ勾配とを組み合わせることによって、実現することができる。
ＦｃＲｎ結合を低減した修飾Ｆｃ領域を有する抗体の保持時間は短いのに対し、ＦｃＲｎ結合を増強した修飾Ｆｃ領域を有する抗体の保持時間は、野生型Ｆｃ領域を有する抗体よりも長い。
１つの実施形態において、ＦｃＲｎは固体相に結合される。１つの実施形態において、固体相はクロマトグラフィー材料である。１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）およびβ－２－ミクログロブリン（ｂ２ｍ）の非共有結合性複合体であり、ビオチン化され、固体相はストレプトアビジンで誘導体化されている。
１つの実施形態において、β－２－ミクログロブリンは、ＦｃＲｎと同じ種に由来する。
１つの実施形態において、抗体は、単一特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片である。
本明細書において報告される例示的方法は、あらかじめ定められたインビボ半減期を有する抗体を選択するための方法であって、クロマトグラフィーが実施され、保持時間が野生型ＩｇＧ１と比べて所与の保持時間ウィンドウ内である抗体が選択される、抗体を選択するための方法である。
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーでは、ピーク面積および保持時間のプロファイルに基づいてＩｇＧ試料を区別することができる。これにより、インビトロでＦｃＲｎとＩｇＧとの相互作用を解析することが可能になり、インビボでの薬物動態に関する治療的ＩｇＧの構造的および機能的な完全性に対する見識を与えることができる。
したがって、変異ＩｇＧおよび野生型ＩｇＧのＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーは、インビボでの薬物動態の半定量的予測として使用することができる。さらに、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを用いて、例えば、ＩｇＧバッチの特徴づけまたは類似性の研究のためにＦｃＲｎ－ＩｇＧ相互作用をモニターすることもできる。
標準化されたｐＨ勾配のＦｃＲｎアフィニティー液体クロマトグラフィー方法は、インビボのＩｇＧとＦｃＲｎの相互作用の機序によく似ている条件を用いて行われている。例えば、ヒトＦｃＲｎが親和性リガンドとしてカラムに固定化され、例えばｐＨ５．５から８．８への直線ｐＨ勾配が適用された。
例えば、解析的ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーにより、ピークパターンおよび保持時間のプロファイルに基づいてＩｇＧ試料および変異体の同定および特徴づけをすることが可能になる。この方法により、１）Ｆａｂ断片が異なる同じＩｇＧ、２）酸化ＩｇＧ型と非酸化ＩｇＧ型、３）凝集物と単量体、および４）Ｆｃ領域に変異を有する抗体を区別することができる。
野生型ＩｇＧと比べた変異体ＩｇＧ（Ｆｃ領域変異体）のＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィープロファイルの変化は、インビボでの薬物動態プロファイルの予測に役立つことが判明している。これらの結果から、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーが、ＦｃＲｎ－ＩｇＧ相互作用、ＩｇＧ完全性、およびせいぜいＩｇＧそれ自体を特徴づけするための有用な新しい方法であることが実証される。
本明細書において報告される１つの態様は、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎの、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用である。
例示的アフィニティークロマトグラフィーカラムは、マトリックスに結合されたクロマトグラフィー用の官能基が本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎを含むことを特徴とする、マトリックスおよびマトリックスに結合されたクロマトグラフィー用の官能基を含む。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の例示的使用は、抗体と参照抗体の保持時間の比を求めることによって、抗体のインビボ半減期を決定するためのものである。参照抗体は、完全長ヒトＩｇＧ１抗体であってよい。
参照抗体と比較して抗体のインビボ半減期を決定するための例示的方法は、ＦｃＲｎアフィニティーカラムを用いて測定した抗体および参照抗体の保持時間の比を求めることによる。
本発明の１つの態様は、抗体または少なくとも１つのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドの分離のための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
また、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗体または少なくとも１つのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを分離するための方法も、本明細書において報告される。
１つの実施形態において、分離は、精製、生産、および解析から選択される。
例示的使用は、ＩｇＧ１サブクラスの抗体をＩｇＧ３サブクラスの抗体から分離するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
例示的使用は、抗体のメチオニン酸化を測定するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
例示的方法は、本明細書において報告されるアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて、抗体のＦｃ領域中の酸化メチオニン残基がＦｃＲｎ結合に与える影響を測定するための方法である。
例示的使用は、抗体のオリゴマー化レベルを測定するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
例示的方法は、本明細書において報告されるアフィニティークロマトグラフィー方法を用いて、抗体のオリゴマー化レベルを測定するための方法である。
例示的使用は、親抗体または親融合ポリペプチドと比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が変化している修飾抗体または修飾融合ポリペプチドを求めて、親抗体またはＦｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
例示的方法は、親抗体または親融合ポリペプチドと比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が変化している修飾抗体または修飾融合ポリペプチドを求めて、親抗体またはＦｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）本明細書において報告されるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムに、ライブラリーの個々のメンバーおよび親抗体または親融合ポリペプチドを添加する工程；
（ｂ）正の直線ｐＨ勾配を用いてライブラリーの個々のメンバーを回収し、個々の保持時間を測定する工程；ならびに
（ｃ）親抗体または親融合ポリペプチドと比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が変化している抗体または融合ポリペプチドを選択する工程
を含む方法である。
抗体またはＦｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む融合ポリペプチドを、ポリペプチドの混合物から精製するための方法が本明細書において報告され、該方法は、本明細書において報告されるＦｃＲｎアフィニティーカラムに混合物を添加すること、および抗体またはＦｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む融合ポリペプチドを正の直線ｐＨ勾配を用いて溶出させ、それによって、抗体または融合ポリペプチドを精製することを含む。１つの実施形態において、Ｆｃ領域のＦｃＲｎ部分は、ヒトＦｃ領域、またはマウスＦｃ領域、もしくはカニクイザルＦｃ領域のものである。
１つの実施形態において、反応／生産混合物またはクルードもしくはある程度精製した培養上清が、第１のｐＨ値でＦｃＲｎアフィニティーカラムに添加され、抗体または融合ポリペプチドが、第２のｐＨ値でＦｃＲｎアフィニティーカラムから回収される。
例示的使用は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の変化を示している、抗体またはＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１などの免疫グロブリンの定常ドメイン）の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む融合ポリペプチドを同定するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
例示的方法は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合の変化を示している、抗体またはＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ１などの免疫グロブリンの定常ドメイン）の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む融合ポリペプチドを同定するための方法である。
このような修飾された抗体または融合ポリペプチドは、親抗体もしくは親融合ポリペプチドと比べるか、または参照抗体もしくは参照融合タンパク質と比べた場合、ＦｃＲｎに対する結合の増大または減少のいずれかを示し、したがって、それぞれ、血清中半減期が延長されるか、または短縮されている。
ＦｃＲｎに対する親和性が増大しているＦｃ領域変異体（すなわち、親抗体または参照抗体と比べて、本明細書において報告されるようにＦｃＲｎカラムにおける保持時間が長くなっているが、それでもなお、ｐＨ７．４のｐＨ値より前に溶出する）は、ＦｃＲｎに対する親和性が低下しているものと比べて、より長い血清半減期を有することが予測される。ＦｃＲｎに対する親和性が増大しているＦｃ領域変異体は、慢性の疾患または障害の治療などにおいて投与される抗体または融合ポリペプチドの半減期が長いことが望まれる場合、哺乳動物、特にヒトを治療する方法に応用される。ＦｃＲｎに対する親和性が低下しているＦｃ領域変異体は、インビボの画像診断などにおいて投与される抗体または融合ポリペプチドの半減期が短いことが望まれる場合、哺乳動物、特にヒトを処置する方法に応用される。
ＦｃＲｎ結合親和性が低下しているＦｃ領域変異体は、胎盤を通過することができ、したがって、妊婦における、特に生まれる前の子供の疾患または障害の治療に使用できる可能性が非常に高い。さらに、ＦｃＲｎ結合親和性の低下は、脳、腎臓、および／または肝臓への適用／輸送を目的とする薬物にとって望ましい場合がある。
例示的使用は、血管系からの腎糸球体上皮を通過する輸送の減少を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
本明細書において報告される修飾Ｆｃ領域を含む抗体または融合ポリペプチドは、血管系からの腎糸球体上皮を通過する輸送の減少を示す場合がある。
例示的使用は、脳から血管腔中への血液脳関門を通過する輸送の減少を示す抗体または融合ポリペプチドを同定するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
本明細書において報告されるヒト由来の修飾Ｆｃ領域を含む抗体または融合ポリペプチドは、脳から血管腔中への血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送の減少を示す場合がある。
本明細書において報告されるすべての態様の１つの実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分は、ヒト由来のＦｃ領域の少なくとも１つの部分である。本明細書において報告されるすべての態様の１つの実施形態において、ＦｃＲｎは、ヒトＦｃＲｎ、カニクイザルＦｃＲｎ、およびマウスＦｃＲｎから選択される。
本明細書において報告されるすべての態様の１つの実施形態において、β－２－ミクログロブリンは、α－ＦｃＲｎと同じ種に由来する。
本明細書において報告されるすべての態様の１つの実施形態において、β－２－ミクログロブリンは、α－ＦｃＲｎとは異なる種に由来する。
１つの実施形態において、Ｆｃ領域またはＦｃ領域のＦｃＲｎ結合部分は、任意のアイソタイプの重鎖に由来する。
１つの実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分は、ヒト由来のＣＨ２ドメインの少なくともアミノ酸残基２８２～３４０を含む（Ｋａｂａｔによる番号付与）。１つの実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分は、ＣＨ２ドメイン全体（ＫａｂａｔのＥＵ番号付与によれば、ヒト由来の抗体重鎖ポリペプチドＦｃ領域のアミノ酸残基２３１～３４０あたり）を含む。１つの実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分は、少なくとも１つのＣＨ２ドメイン、およびヒンジ領域（ＥＵ番号付与によれば、ヒト由来の抗体重鎖ポリペプチドＦｃ領域のアミノ酸残基２１６～２３０あたり）またはＣＨ３ドメイン（ＥＵ番号付与によれば、ヒト由来の抗体重鎖ポリペプチドＦｃ領域のアミノ酸残基３４１～４４６あたり）のうちの少なくとも１つを含む。１つの実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分は、ヒト由来の抗体重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。１つの実施形態において、Ｆｃ領域の少なくとも１つの部分は、ヒト由来の抗体重鎖Ｆｃ領域のヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。ヒト由来のＦｃ領域またはヒト由来部分のＦｃ領域のＦｃＲｎ結合部分は、任意のアイソタイプの重鎖に由来してよい。１つの実施形態において、ヒトアイソタイプはＩｇＧ１である。
標的に特異的に結合する抗体は、適切な抗原（例えば、精製された抗原、そのような抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物、またはそのような抗原をコードするＤＮＡ）および場合によってはアジュバントを皮下または腹腔内に複数回注射することによって、哺乳動物において産生させることができる。
１つの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。
一般に、結合ドメインは、Ｆｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分のＣ末端またはＮ末端に融合される。
例示的使用は、インビボで（同時）ターゲティングするために、ｐＨ７．４のｐＨ値でＦｃＲｎに結合する抗体を選択するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。同時ターゲティングは、内部移行であってよい。
本明細書において報告されるすべての態様の１つの実施形態において、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎは、固体相に結合される。
「固体相」は、非流動性物質を意味し、ポリマー、金属（常磁性粒子、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックなどの材料から作製された粒子（微小粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどのゲル物質；ポリマー、金属、ガラス、および／またはセラミック製であり得るキャピラリー；ゼオライトおよび他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；ソリッドストリップ；ならびにキュベット、チューブ、または他の分光計用試料容器が含まれる。「固体支持体」が、ある分子と化学的に相互作用することが目的とされる少なくとも１つの部分をその表面に含むという点で、アッセイの固体相成分は、不活性な固体表面と区別される。固体相は、チップ、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートなどの静止成分であってもよく、またはビーズおよび微小粒子などの非静止成分であってもよい。微小粒子は、均一系アッセイ形式のための固体支持体として使用することもできる。タンパク質および他の物質の非共有結合または共有結合の両方を可能にする様々な微小粒子が、使用されてよい。このような粒子には、ポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリレート）などのポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドなどの金粒子；ならびにシリカ、ガラス、および金属酸化物粒子などのセラミック粒子が含まれる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｎｅｗｓ＆Ｆｅａｔｕｒｅｓ、５月１日（１９９８）３２２Ａ～３２７Ａを参照されたい。１つの実施形態において、固体支持体はセファロースである。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎは、特異的結合対を介して固体相にコンジュゲートしている。本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎはビオチンにコンジュゲートしており、固体支持体に固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、固体支持体への固定化が行われる。
本明細書において報告される使用および方法における、本明細書において報告されるＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合した抗体の回収は、直線勾配溶離による。この直線勾配は、ｐＨ勾配である。
原理的には、本明細書において報告される方法において、任意の緩衝物質を使用することができる。
マウスＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に決定的に重要なＦｃ残基は、部位特異的突然変異誘発によって同定されている（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１～５１８０を参照されたい）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、およびＨ４３５（ＫａｂａｔによるＥＵ番号付与）が、相互作用に関与している（Ｍｅｄｅｓａｎ，Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、およびＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に決定的に重要であることが判明した（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。タンパク質間の相互作用研究によってＦｃＲｎ結合を改良するために、残基Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６ＥがＤａｌｌ’Ａｃｑｕａらによって説明されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．ら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４～２３５２４）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、およびＹ４３６が相互作用に決定的に重要であることが示された（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１～６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７～７６７１）において、残基２４８～２５９番および３０１～３１７番および３７６～３８２番および４２４～４３７番の様々な突然変異体が報告され調査されている。
１つの実施形態において、例えば、リン酸またはその塩、酢酸またはその塩、クエン酸またはその塩、モルホリン、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）またはその塩、ヒスチジンまたはその塩、グリシンまたはその塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）またはその塩、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）またはその塩などの薬学的に許容される緩衝物質が、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーの工程または方法において使用される。
１つの実施形態において、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、または酢酸もしくはその塩、またはクエン酸もしくはその塩、またはヒスチジンもしくはその塩から選択される。
１つの実施形態において、緩衝物質の濃度は、１０ｍＭ～５００ｍＭである。１つの実施形態において、緩衝物質の濃度は、１０ｍＭ～３００ｍＭである。１つの実施形態において、緩衝物質の濃度は、１０ｍＭ～２５０ｍＭである。１つの実施形態において、緩衝物質の濃度は、１０ｍＭ～１００ｍＭである。１つの実施形態において、緩衝物質の濃度は、１５ｍＭ～５０ｍＭである。１つの実施形態において、緩衝物質の濃度は、約２０ｍＭである。
１つの実施形態において、第１のｐＨ値を有する溶液中の緩衝物質および第２のｐＨ値を有する溶液中の緩衝物質は、同じ緩衝物質である。
１つの実施形態において、第１のｐＨ値を有する溶液中の緩衝物質および第２のｐＨ値を有する溶液中の緩衝物質は、互いに異なる緩衝物質である。
第１のｐＨ値を有する例示的溶液は、２０ｍＭ ＭＥＳおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、ｐＨ５．５に調整されている。
第２のｐＨ値を有する例示的溶液は、２０ｍＭ ＴＲＩＳおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌを含み、ｐＨ８．８に調整されている。
第２のｐＨ値を有する例示的溶液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含み、ｐＨ８．６に調整されている。
第２のｐＨ値を有する例示的溶液は、２０ｍＭ ＴＲＩＳを含み、ｐＨ８．２に調整されている。
１つの実施形態において、緩衝液は、追加の塩を含む。１つの実施形態において、追加の塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、またはクエン酸カリウムから選択される。１つの実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭ～１０００ｍＭの追加の塩を含む。１つの実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭ～７５０ｍＭの追加の塩を含む。１つの実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭ～５００ｍＭの追加の塩を含む。１つの実施形態において、緩衝液は、５０ｍＭ～７５０ｍＭの追加の塩を含む。１つの実施形態において、緩衝液は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭの追加の塩を含む。
１つの実施形態において、第１のｐＨ値を有する溶液および／または第２のｐＨ値を有する溶液は、塩化ナトリウムを含む。１つの実施形態において、第１のｐＨ値を有する溶液および／または第２のｐＨ値を有する溶液は、約５０ｍＭ～約３００ｍＭｍＭの塩化ナトリウムを含む。
したがって、例示的使用は、ＦＡＢ修飾を検出するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。１つの実施形態において、修飾は、グリコシル化または電荷分布である。
通常、本明細書において報告される方法および使用における保持時間は、ｐＨ勾配の険しさおよび使用される塩濃度に依存している。野生型抗体が参照として使用され、弱い結合は、短い保持時間（＝早い溶出）によって示され、一方、強い結合は、長い保持時間（＝遅い溶出）によって示され、ただし、それでもなお、ｐＨ７．４のｐＨ値より前である。
ＩｇＧのＦｃ部分について互いに異なる突然変異体は、ＦｃＲｎカラム上での挙動が異なり、変化した保持時間を示すことが判明している。
本明細書において報告されるＦｃＲｎカラムを用いて、ＦｃＲｎ結合に関連するアミノ酸を同定すること、および修飾されていない野生型抗体と比較して突然変異体を格付けすることが可能であることが判明している。
例示的使用は、ＦｃＲｎ結合に関連するアミノ酸を同定するため、および修飾されていない野生型抗体と比較して突然変異体を格付けするための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
ＦｃＲｎカラムからの遅い溶出を示した、すなわち、ＦｃＲｎカラムにおける保持時間がより長かった抗体の方が、インビボでの半減期が長かったことが判明している。
例示的使用は、抗体のインビボ半減期を測定するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
ＩｇＧ調製物中の半抗体の解析および除去は、本明細書において報告されるＦｃＲｎカラムを用いて実現できることが判明している。
例示的使用は、ＩｇＧ調製物から半抗体を除去するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
オリゴマーおよび凝集物は、本明細書において報告されるＦｃＲｎクロマトグラフィーによって分離できることが判明している。
例示的使用は、ＩｇＧ調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するための、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料の使用である。
保持時間は、被分析物分子中に含まれるＦｃ部分の数の影響を受けることが判明している。
酸化が、ＦｃＲｎ結合に影響を与えたこと、およびＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムにおいて保持時間の差に基づいて酸化を測定できることが判明している。
抗体の形態はＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムへの結合に影響を与えなかったことが示されている。したがって、ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィーカラムは、新しい抗体形態の評価に使用され得る。
本発明による何らかのＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産された何らかのＦｃＲｎは、モノビオチン化される。
本明細書において報告される、本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、抗体断片の単離／分離のために使用することができ、したがって、従来のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの代替手段を提供する。さらに、本明細書において報告されるクロマトグラフィー材料を用いることによって、従来のプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーと比べて、より生理的な条件、例えばｐＨ値で分離を引き起こすことができる。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、修飾、例えば、酸化、電荷変異体、グリコシル化、および脱アミドなどを含む抗体種の測定／分離／濃縮のために使用することができる。本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、特定の抗体種を濃縮するために、選択されたｐＨ勾配（開始／終了ｐＨ値）に応じて使用することができる。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、分子量の差異／差に基づいた抗体種の単離／濃縮のために使用することができる。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、分子中のＦｃＲｎ結合部位の数に基づいた抗体の単離／濃縮のために使用することができる。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、アミノ酸修飾物の単離のために使用することができる。本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎをリガンドとして含むクロマトグラフィー材料は、ホール－ホールダイマーおよび半抗体などの二重特異性抗体誤対合物の単離／分離のために使用することができる。
本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎの使用についての例示的な実施形態は、以下のとおりである：
１ 固定化された、本発明によるＦｃＲまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎの、正の直線ｐＨ勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおけるアフィニティークロマトグラフィーリガンドとしての使用。
２ 抗体または少なくとも１つのＦｃ領域を含む融合ポリペプチドを分離するための正の直線ｐＨ勾配を用いるアフィニティークロマトグラフィーにおけるものである、項目１に記載の使用。
３ α－ＦｃＲｎおよびβ２ｍが、相互に独立して、ヒト由来、またはマウス由来、もしくはカニクイザル由来である、項目１または２に記載の使用。
４ β２ｍがα－ＦｃＲｎと同じ種に由来する、項目１から３のいずれか１つに記載の使用。
５ α－ＦｃＲｎおよびβ２ｍが、それぞれ相互に独立して、０～１０個のアミノ酸残基修飾を有する、ヒト野生型α－ＦｃＲｎおよびヒト野生型β２ｍである、項目１から４のいずれか１つに記載の使用。
６ 本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎが固体相に結合される、項目１から５のいずれか１つに記載の使用。
７ 固体相がクロマトグラフィー材料である、項目６に記載の使用。
８ 本発明によるＦｃＲｎまたは本発明による方法を用いて生産されたＦｃＲｎがビオチン化され、固体相がストレプトアビジンで誘導体化される、項目６または７に記載の使用。
９ ｐＨ勾配が第１のｐＨ値から第２のｐＨ値までであり、第１のｐＨ値が約ｐＨ３．５～約ｐＨ７．５であり、第２のｐＨ値が約ｐＨ６．０～約ｐＨ９．５である、項目１から８のいずれか１つに記載の使用。
１０ 第１のｐＨ値がｐＨ約５．５であり第２のｐＨ値がｐＨ約８．８である、項目１から９のいずれか１つに記載の使用。
１１ 抗体と参照抗体の保持時間の比を求めることによって、抗体のインビボ半減期を決定するためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１２ 抗体のメチオニン酸化を測定するためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１３ 抗体のオリゴマー化レベルを測定するためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１４ 親抗体または親融合ポリペプチドと比べてＦｃＲｎに対する結合親和性が変化している修飾抗体または修飾融合ポリペプチドを求めて、親抗体またはＦｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む親融合ポリペプチドの修飾抗体または修飾融合ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１５ 新生児Ｆｃ受容体に対する結合の変化を示す、抗体またはＦｃ領域の少なくとも１つのＦｃＲｎ結合部分を含む融合ポリペプチドを同定するためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１６ ＩｇＧ調製物から半抗体を除去するためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１７ ＩｇＧ調製物から抗体凝集物および抗体オリゴマーを除去するためのものである、項目１から１０のいずれか１つに記載の使用。
１８ 抗体が、単一特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または二重特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または三重特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片、または四重特異性の、抗体もしくは融合ポリペプチドの抗体断片である、項目１から１７のいずれか１つに記載の使用。
１９ ＩｇＧ１サブクラスの抗体をＩｇＧ３サブクラスの抗体から分離するためのものである、項目１から１８のいずれか１つに記載の使用。
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲において説明される。本発明の精神から逸脱することなく、説明される手順に修正を加えてよいことが理解される。
２つの独立したＲＭＣＥを同時に実施するために３つのＲＲＳ部位の使用を含む、２プラスミドＲＭＣＥ戦略のスキーム。
配列の説明
配列番号０１：Ａｖｉタグ
配列番号０２：ＨｉｓＡｖｉタグ
配列番号０３：タグなし、リーダーペプチドなしのヒトα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号０４：タグあり、リーダーペプチドなしのヒトα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号０５：タグなし、リーダーペプチドありのヒトα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号０６：タグあり、リーダーペプチドありのヒトα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号０７：リーダーペプチドなしのヒトβ２ｍ
配列番号０８：リーダーペプチドありのヒトβ２ｍ
配列番号０９：タグなし、リーダーペプチドなしのカニクイザルα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１０：タグあり、リーダーペプチドなしのカニクイザルα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１１：タグなし、リーダーペプチドありのカニクイザルα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１２：タグあり、リーダーペプチドありのカニクイザルα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１３：リーダーペプチドなしのカニクイザルβ２ｍ
配列番号１４：リーダーペプチドありのカニクイザルβ２ｍ
配列番号１５：タグなし、リーダーペプチドなしのマウスα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１６：タグあり、リーダーペプチドなしのマウスα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１７：タグなし、リーダーペプチドありのマウスα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１８：タグあり、リーダーペプチドありのマウスα－ＦｃＲｎ細胞外ドメイン
配列番号１９：リーダーペプチドなしのマウスβ２ｍ
配列番号２０：リーダーペプチドありのマウスβ２ｍ
配列番号２１：大腸菌ＢｉｒＡの例示的配列
配列番号２２：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号２３：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号２４：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号２５～２７：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的変異体
配列番号２８：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号２９：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号３０：例示的なｈＧＴターミネーター配列
配列番号３１：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号３２：例示的なＧＦＰ核酸配列
実施例１
一般的な技術
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ、（１９８９）に記載されているように、標準的方法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。
ＤＮＡ配列の決定
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施された。
ＤＮＡおよびタンパク質の配列解析および配列データの管理
ＥＭＢＯＳＳ（欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート）ソフトウェアパッケージおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、アノテーション、および図示のために使用した。
実施例２
標的指向組込みベクターのクローニング
可溶型のヒトＦｃＲｎ、マウスＦｃＲｎ、およびカニクイザルＦｃＲｎを生産するための安定なＣＨＯ ＴＩプールを作製するために、プラスミドを設計しクローニングしなければならない。ＴＩベクターのクローニングは、２つのクローニング工程で実施した。第１の工程において、ＦｃＲｎ α鎖およびβ２－ミクログロブリンの遺伝子合成物を、ｈＣＭＶプロモーターのコントロール下のプレベクターにクローニングした。発現カセットは両方とも、ポリアデニル化シグナル型ウシ成長ホルモン（ＢＧＨポリ（Ａ））で終了する。
第２のクローニング工程において、前もってクローニングしたプレベクターの発現カセットを最終ＴＩベクターにクローニングした。最終ＴＩベクターは、Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ付きのＦｃＲｎ α鎖の発現カセットおよびβ２－ミクログロブリンの発現カセットを含む。
マウスＦｃＲｎおよびカニクイザルＦｃＲｎのためのＴＩプラスミドも、ヒトＦｃＲｎの場合と同様にクローニングした。
３種すべてについて、Ｈｉｓ－Ａｖｉタグ付きのＦｃＲｎ α鎖の細胞外ドメインおよびβ２ｍをコードするｃＤＮＡは、遺伝子合成によって作製された（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）。３７℃で１時間、遺伝子合成物およびバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦおよびＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入断片およびバックボーンのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコールに従って迅速ライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、３：１の挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーン断片をライゲーションした。次いで、４２℃で３０秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
翌日、クローンを採取し、ミニプレップまたはマキシプレップのために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、またはそれぞれＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ ＸｔｒａマキシＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、いかなる不適切な突然変異も存在しないように徹底した（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ）。
第２のクローニング工程において、第１のクローニングの場合と同じ条件を用いて、あらかじめクローニングしたベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦおよびＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。ＴＩバックボーンベクターをＫｐｎＩ－ＨＦおよびＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離および抽出を、前述したようにして実施した。製造業者のプロトコールに従ってＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、１：１：１の挿入断片／挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーンのライゲーションを４℃で一晩実施し、６５℃で１０分間、不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。
クローニングされたプラスミドを、ＴＩトランスフェクションおよびプール作製のために使用した。
実施例３
ＢｉｒＡ増幅およびクローニング
インビボビオチン化のために、ビオチン化を触媒するＢｉｒＡ遺伝子をＦｃＲｎ α鎖およびβ２ｍに加えて含むベクターを設計しクローニングした。最終ＴＩベクターも、２つの工程でクローニングした。第１の工程において、ＢｉｒＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、実施例２で説明したようにして、ＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ／ＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、バックボーンベクターにクローニングした。
第２の工程において、α－ＦｃＲｎ、β２ｍ、およびＢｉｒＡリガーゼのためのプラスミドを制限酵素で消化し、各ＴＩベクターにクローニングした（実施例２を参照されたい）。次いで、最終的なプラスミドをＴＩトランスフェクションおよびプール作製のために使用した。
実施例４
ＴＩトランスフェクションおよびプール作製
ＭａｘＣｙｔｅ’ｓ Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）技術を用いて、ＣＨＯ宿主細胞株のトランスフェクションを実施した。したがって、各アプローチについて３×１０Ｅ７個の細胞を遠心分離し、上清は一致しなかった（ｄｉｓｃｏｒｄｅｄ）。合計３０μｇのＤＮＡ（２５μｇのプラスミドおよび５μｇのリコンビナーゼプラスミド）を細胞に添加し、すべてをエレクトロローディングバッファー（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＭａｘＣｙｔｅ）と混合した。トランスフェクションは、ＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクション後に細胞を振盪フラスコに移し、３７℃で３０分間、静置してインキュベートした。３０ｍＬの回収培地を添加し、培養物を短時間、円を描くように揺すった。１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２、および８５％湿度で、細胞をインキュベートした。トランスフェクション後２日目に、トランスフェクション効率ＦＡＣＳを実施し、６５ｍＬ回収培地中で細胞を増殖させた。
５日目に、培地交換によって選択を開始した。したがって、６×１０Ｅ５細胞／ｍｌを遠心分離し、選択培地Ｉ（化学限定培地、選択マーカー１および２）８０ｍｌに再懸濁した。分割せずに、この日以降、３７℃、１５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２、および８５％湿度で、細胞をインキュベートした。
細胞の回収を促進するために、生存率が４０％より高く、かつ生細胞濃度（ＶＣＤ）が０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬより高い場合は選択圧を下げた。したがって、４×１０Ｅ５細胞／ｍｌを遠心分離し、選択培地ＩＩ（化学限定培地、１／２選択マーカー１および２）４０ｍｌに再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。
生存率が８０％を超えると、ＲＭＣＥ効率ＦＡＣＳを実施し、３～４日ごとに４０ｍＬ中４×１０Ｅ５細胞／ｍｌに分割することにより、細胞を継代培養した。生存率が９５％を超えたら、振盪フラスコ生産を始めた。
ＣＥＤＥＸアナライザーによって、このプロセスの全体を通じて生存率および生細胞濃度（ＶＣＤ）を調べた。
実施例５
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率およびトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬ ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。
実施例６
フェドバッチ振盪フラスコ生産
フェドバッチ生産は、振盪フラスコ中で行った。したがって、限定培地（フェドバッチ培地Ｉ）４０ｍＬ中に１×１０Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で細胞を播種した。３日目、７日目、および１０日目に細胞を供給した。ＣＥＤＥＸアナライザーを用いて、生存率およびＶＣＤの測定を実施した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。
第２のフェドバッチのために、第２の限定化学培地（フェドバッチ培地ＩＩ）を使用した。したがって、培地３０ｍＬ中に２×１０Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で細胞を播種した。３日目以降に、細胞を供給した。３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目、および１４日目にグルコース濃度を測定し、濃度が７ｇ／Ｌ未満である場合は、濃度１０ｇ／Ｌになるまで補充した。さらに、ビオチン不足を回避するために、グルコース濃度と同じ日にビオチン濃度も測定した。ＣＥＤＥＸアナライザーを用いて、生存率およびＶＣＤの測定を実施した。フェドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。
実施例７
ＨＥＫ２９３ＦにおけるヒトＦｃＲｎの一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞におけるヒトＦｃＲｎの一過性トランスフェクションを実施した。トランスフェクション実施日に、２．６×１０Ｅ６細胞／ｍＬの濃度でＨＥＫ２９３Ｆ細胞を播種した。ＤＮＡ ２０μｇをＯｐｔｉ－Ｍｅｍ（４０ｍｌの場合）１．６ｍＬと混合し、５分間インキュベートした。ＰＥＩｐｒｏ ５０μｌをＤＮＡ／培地混合物に添加し、さらに８分間インキュベートした。ＤＮＡ／培地／ＰＥＩｐｒｏ混合物をゆっくりと細胞に添加し、それらを３７℃、１２０ｒｐｍ、７％ＣＯ２、および８０％湿度でインキュベートした。トランスフェクション後５時間目に、バルプロ酸を添加した。トランスフェクション後２４時間目に、細胞にグルコースおよびフィードを供給した。７日目に、遠心分離（１０００ｒｐｍで５分、４０００ｒｐｍで２０分）によって細胞を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。
実施例８
ＦｃＲｎの精製
ＨｉｓＡｖｉタグで、３種すべてのＦｃＲｎにタグを付けた。このタグを用いてＦｃＲｎを精製した。第１の精製工程において、フェドバッチ由来の清澄化した上清をＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｎｉセファロース、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。５００ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（バッファーＡ）を用いる２回の洗浄工程、すなわちイミダゾールを含まない１回目の洗浄および２０ｍＭイミダゾールを含む２回目の洗浄の後に、３００ｍＭイミダゾールを含む同じバッファーを用いて３ｍｌ／分の流速でタンパク質を溶離した。４％、６０％、および１００％のイミダゾール濃度を用いる段階的溶離によって、溶離を行った。バッファーＡを用いて、各溶離後にカラムを再生した。
画分を集め、体積が９ｍｌ未満になるまで濃縮（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １５ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）した後、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってさらに精製した。流速３ｍｌ／分で試料を注入し、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＫＣｌバッファー、ｐＨ５．５において同じ流速で溶離した。
クロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔクロマトグラフィー系を用いて実施し、ＵＮＩＣＯＲＮ ７．３ソフトウェアを用いて記録、コントロール、および評価した。
精製したタンパク質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量し、各精製工程後に、解析的ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ならびに非還元条件下および還元条件下でのＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）によって解析した。
解析的ＳＥＣは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において５０μｇの試料を用いて実施し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７．２ソフトウェアによって解析した。
ＣＥ－ＳＤＳについては、試料を、対応する試料バッファー混合物（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合し（試料５μＬ、試料バッファー３５μｌ）、還元条件の場合は、ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μＬを試料バッファー３０μＬに添加し、同様に試料５μＬと混合した。次いで、試料を７０℃で１０分間加熱し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水７０μｌを添加した。Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ系を用いて試料を測定した。
実施例９
精製ＦｃＲｎのビオチン化
ＦｃＲｎをストレプトアビジンセファロースビーズに結合するために、Ａｖｉｄｉｔｙ社のビオチン化キットを製造業者の取扱い説明書に従って用いて、１５ｍｇの精製ＦｃＲｎをビオチン化した。この反応は、３０℃および３００ｒｐｍで一晩実施した。ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってビオチン化タンパク質を精製して、過剰なビオチンを除去した。したがって、流速２．５ｍｌ／分で試料を注入し、同じバッファーおよび３ｍｌ／分の流速で溶離した。画分を集め、濃縮した（Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ １５ｍｌ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ビオチン化タンパク質を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を用いて定量し、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｃａｌｉｐｅｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）および解析的ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって解析した。
ストレプトアビジン－ビオチン相互作用を用いて、これらのアプローチのビオチン化レベルを測定した。試料をストレプトアビジン（ＳＡ）と共に１：１で準備し（５０μｇの試料およびストレプトアビジン）、解析的ＳＥＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を実施した。ストレプトアビジンがビオチン化分子に結合することにより、分子量が約５２ｋＤａ増加する。これにより、ＳＥＣにおいて、ビオチン化されＳＡと相互作用する変換されたＦｃＲｎと、ビオチン化されていない未変換のＦｃＲｎとを区別することができる。ビオチン化レベルは、変換ＦｃＲｎと未変換ＦｃＲｎの比率から測定される。
実施例１０
ＦｃＲｎカラムの調製
精製しビオチン化したＦｃＲｎを、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用を利用してビーズに結合させた。したがって、１ｍＬのセファロースストレプトアビジンビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＨ２Ｏで洗浄し、次いで、２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５（バッファーＡ）中で緩衝化した。続いて、調製したセファロースストレプトアビジンビーズにビオチン化ＦｃＲｎを添加し、回転により、一晩、恒温放置した。ＦｃＲｎで誘導体化したビーズを４．６×５０ｍｍクロマトグラフィーカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ ５／５０カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に詰め、その後、バッファーＡで平衡化した。充填されたカラムの質を検査するために、標準物質をカラムに添加した。標準物質が典型的なクロマトグラムを示している場合、以降の測定のために、そのカラムを使用することができる。標準物質としては、酸化ｍＡｂを使用した。抗体は、暗所中、室温で１８時間、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２で酸化した。酸化の質を試験した後、ｍＡｂ－ｏｘを一晩透析した。
実施例１１
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー
ＦｃＲｎアフィニティーカラムをＨＰＬＣ系において使用した。カラムの温度は２５℃であった。０．３ｍｌ／分で２０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５（バッファーＡ）を用いてカラムを平衡化した。続いて、各試料３０μｇを１００μｌ Ｈｉｓ－Ｈｉｓ／ＨＣｌバッファー（ｐＨ５．５）の体積でＦｃＲｎカラムに注入し、これは別々に実施した。流速０．５ｍｌ／分で、１００％ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．８（バッファーＢ）への連続的な勾配を用いて、これらの試料を溶離した。ｐＨ６．０となるように各実施後にバッファーＡを用いて、カラムを再生した。標準物質は、一連のクロマトグラフィーの最初と最後に注入した。１０個より多い試料を流した場合、試料１０個を流し終わるごとに標準物質を注入する。２８０ｎｍにおける吸光度を連続的に測定することによって、溶出プロファイルを得た。さらに、溶離時のｐＨを記録して、試料が溶出した時点の正確なｐＨを測定した。

Claims (9)

  1. Ｃ末端がビオチン化されたＦｃＲｎを生産するための方法であって、
    ａ）ＦｃＲｎおよびビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼ（ＢｉｒＡ）をコードする安定に組み込まれているデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞をビオチン含有培地中で培養する工程と、
    ｂ）細胞または培養培地から、Ｃ末端がビオチン化されたＦｃＲｎを回収する工程と
    を含み、
    ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸は、哺乳動物細胞のゲノム中に安定に組み込まれ、かつ５’から３’の方向に
    － Ｃ末端にＡｖｉタグを含むクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第１の発現カセット、
    － β２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第２の発現カセット、
    － Ｃ末端にＡｖｉタグを含むクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）をコードする第３の発現カセット、
    － β２－ミクログロブリン（β２ｍ）をコードする第４の発現カセット、および
    － ビオチン－［アセチル－ＣｏＡ－カルボキシラーゼ］リガーゼをコードする第５の発現カセット
    を含む、方法。
  2. ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸が、
    － 第１の発現カセットの５’側に位置する第１の組換え認識配列、
    － 第５の発現カセットの３’側に位置する第２の組換え認識配列、および
    － 第２の発現カセットと第３の発現カセットの間に位置する第３の組換え認識配列
    をさらに含み、組換え認識配列はすべて異なっている、請求項１に記載の方法。
  3. ＦｃＲｎおよびＢｉｒＡをコードするデオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードする別の発現カセットを含み、選択マーカーをコードする該発現カセットは、一部分が第３の組換え認識配列の５’側に、一部分が第３の組換え認識配列の３’側に位置しており、該発現カセットの、該５’側に位置する部分が、プロモーターおよび開始コドンを含み、該発現カセットの、該３’側に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 各発現カセットが、５’から３’の方向に、プロモーター、コード配列、およびポリアデニル化シグナル配列、場合によっては、それに続くターミネーター配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. プロモーターがＳＶ４０プロモーターでありポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位でありターミネーター配列が存在しない、選択マーカーの発現カセットを除いて、プロモーターが、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列が、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列が、ｈＧＴターミネーターである、請求項４に記載の方法。
  6. 哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ＦｃＲｎがヒトＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）がヒトクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）がヒトβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ＦｃＲｎがマウスＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）がマウスクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）がマウスβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. ＦｃＲｎがカニクイザルＦｃＲｎであり、クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）がカニクイザルクラスＩ主要組織適合遺伝子複合体様タンパク質（α－ＦｃＲｎ）であり、β２－ミクログロブリン（β２ｍ）がカニクイザルβ２－ミクログロブリン（β２ｍ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007124452A2 (en) 2006-04-20 2007-11-01 The Regents Of The University Of California Methods for expressing multiple sirna and shrna from a single vector
WO2013120929A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
JP2016514477A (ja) 2013-03-30 2016-05-23 ウーシャ バイオテック リミテッド 哺乳動物細胞内で生物活性タンパク質を発現させるための方法および構築物
JP2017104107A (ja) 2015-12-09 2017-06-15 ンー， カ ルン アランＮＧ， Ｋａ Ｌｕｎ Ａｌａｎ 魚の成長を促進する手段及び方法
WO2018197533A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody selection method

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE159548T1 (de) 1990-11-13 1997-11-15 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
WO1994028143A1 (en) 1993-05-21 1994-12-08 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
AU2005263331B8 (en) 2004-07-20 2011-06-16 Symphogen A/S Anti-Rhesus D recombinant polyclonal antibody and methods of manufacture
US8293533B2 (en) * 2008-12-19 2012-10-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific integration and stacking of transgenes in soybean via DNA recombinase mediated cassette exchange
WO2013006142A1 (en) 2011-07-05 2013-01-10 Nanyang Technological University A novel process and reagent for rapid genetic alterations in eukaryotic cells
KR20180134894A (ko) * 2016-04-20 2018-12-19 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 발현 강화 유전자좌의 사용에 기초하여 항체를 만들기 위한 조성물 및 방법
CR20190397A (es) 2017-03-10 2019-09-27 Hoffmann La Roche Método para producir anticuerpos multiespecíficos
BR112020012591A2 (pt) 2017-12-22 2020-11-24 Genentech, Inc. células hospedeiras de integração direcionada (ti), células hospedeiras ti, métodos para preparar uma célula hospedeira ti, métodos para expressar um polipeptídeo de interesse e vetores

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007124452A2 (en) 2006-04-20 2007-11-01 The Regents Of The University Of California Methods for expressing multiple sirna and shrna from a single vector
WO2013120929A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
JP2016514477A (ja) 2013-03-30 2016-05-23 ウーシャ バイオテック リミテッド 哺乳動物細胞内で生物活性タンパク質を発現させるための方法および構築物
JP2017104107A (ja) 2015-12-09 2017-06-15 ンー， カ ルン アランＮＧ， Ｋａ Ｌｕｎ Ａｌａｎ 魚の成長を促進する手段及び方法
WO2018197533A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody selection method

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aline Farber-Schwarz，Serum Albumin and its Interaction with the Neonatal Fc Receptor (FcRn): Characterization of the Albumin/FcRn-binding Mechanism.，Retrieved from the Internet，2013年01月01日，https://elib.uni-stuttgart.de/bitstream/11682/2182/1/Dissertation_Aline_Faerber_Schwarz.pdf
Giovanni Magistrelli et al.，Robust recombinant FcRn production in mammalian cells enabling oriented immobilizarion for IgG binding studies.，J. Immunol. Methods，2012年01月31日，Vol.375, No.1-2，p.20-29，http://dx.doi.org/10.1016/j.jim.2011.09.002

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