CN113661173A - 通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生表达FcRn的细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本文报道了用于生产C末端生物素化FcRn的方法,其包括以下步骤:在含生物素的培养基中培养包含编码FcRn和大肠杆菌生物素‑[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及从细胞或培养基回收C末端生物素化FcRn,其中编码FcRn和大肠杆菌BirA的脱氧核糖核酸稳定整合到哺乳动物细胞的基因组中并在5’至3’方向上包含:编码在C末端包含HisAvi标签的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α‑FcRn)的第一表达盒;编码β2‑微球蛋白(β2m)的第二表达盒;编码在C末端包含HisAvi标签的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α‑FcRn)的第三表达盒;编码β2‑微球蛋白(β2m)的第四表达盒;和编码大肠杆菌生物素‑[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
Description
本发明属于细胞系产生和多肽生产领域。更准确地说,本文报道了重组哺乳动物细胞,其已通过双重组酶介导的盒式交换反应获得,导致特异性表达盒序列整合到哺乳动物细胞的基因组中。所述细胞可以用于生产FcRn的方法。
背景技术
分泌的和糖基化的多肽(诸如抗体)通常通过在真核细胞中重组表达(稳定表达或瞬时表达)而产生。
用于产生表达感兴趣的外源性多肽的重组细胞的一种策略涉及随机整合编码感兴趣多肽的核苷酸序列,随后是选择步骤和分离步骤。然而,这种方法具有若干缺点。第一,核苷酸序列照此功能性整合到细胞基因组中不仅是罕见的事件,而且考虑到核苷酸序列整合的随机性,这些罕见事件导致多种基因表达表型和细胞生长表型。此类变化称为“位置效应变化”,至少部分地源于真核细胞基因组中存在的复杂基因调控网络以及用于整合和基因表达的某些基因组基因座的可及性。第二,随机整合策略通常无法提供对整合到细胞基因组中的核苷酸序列拷贝数的控制。事实上,通常采用基因扩增方法来获得高产量细胞。然而,这种基因扩增还可能导致不需要的细胞表型,诸如不稳定的细胞生长和/或产物表达。第三,由于随机整合过程中固有的整合基因座异质性,在转染后筛选数千个细胞以分离那些表现出期望的感兴趣多肽表达水平的重组细胞既耗时又费力。即使在分离出此类细胞后,也不能保证感兴趣多肽的稳定表达,并且可能需要进一步筛选以获得稳定的商业化生产细胞。第四,由通过随机整合获得的细胞产生的多肽表现出高度的序列变异,这可能部分是由于用于选择高水平的多肽表达的选择剂的致突变性。最后,要生产的多肽的复杂性越高,即在细胞内形成感兴趣多肽所需的不同多肽或多肽链的数目越高,控制不同多肽或多肽链彼此的表达比就越重要。需要控制该表达比以使感兴趣多肽能够以高表达产量有效表达、正确组装和成功分泌。
通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)进行的靶向整合是将外来DNA特异性和有效地引导至真核宿主基因组中的预定位点的方法(Turan等人,J.Mol.Biol.407(2011)193-221)。
WO 2006/007850公开了抗恒河猴D重组多克隆抗体,以及使用位点特异性整合到单独的宿主细胞的基因组中的制造方法。
Crawford,Y.等人(Biotechnol.Prog.29(2013)1307-1315)报道了使用phiC31整合酶和CRE-Lox技术的组合从有限基因组筛选中快速鉴定用于靶细胞系发育的可靠宿主。
WO 2013/006142公开了几乎同质的遗传改变的真核细胞群,其基因组中稳定掺入了供体盒,该供体盒包含可操作地连接至分离的核酸片段的强多聚腺苷酸化位点,该分离的核酸片段包含靶向核酸位点和选择性标记蛋白质编码序列,其中该分离的核酸片段侧接第一重组位点和不同的第二重组位点。
WO 2013/120929公开了新生儿Fc受体(FcRn)和β2-微球蛋白(b2m)的固定化非共价复合物在具有正线性pH梯度的亲和层析中作为亲和层析配体用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽的用途。
WO 2018/162517公开了依赖于i)表达盒序列和ii)不同表达载体之间表达盒的分布,观察到表达产量和产物质量的高度变化。
WO 2019/126634公开了适用于表达重组蛋白质的靶向整合(TI)宿主细胞,以及产生和使用所述TI宿主细胞的方法。
Magistrelli等人(J.Immunol.Meth.375(2012)20-29)报道了使用PEAK细胞产生生物素化FcRn的方法,所述PEAK细胞稳定表达EBNA-1并且用共表达(i)生物素连接酶(LsBirA)和(ii)作为报告基因的增强绿色荧光蛋白质(EGFP)的FcRnα和β2m双启动子载体瞬时转染。在Ni-NTA纯化和固定之后,对于hFcRn和mFcRn,每升细胞培养上清液分别仅获得4mg/L和1.2mg/L。
Farber-Schwarz,A.报道了血清白蛋白及其与新生儿Fc受体的相互作用—Characterization of the albumin/FcRn-binding mechanism(Doctoral Thesis,Univesity of Stuttgart,Germany,2013)。在该工作中,使用双顺反子Lonza pEE 6.4表达载体产生可溶形式的人FcRn。使用Lonza表达系统不可能产生可溶性小鼠FcRn。产量未公开。
发明内容
本文报道了表达新生儿Fc受体(FcRn)的重组哺乳动物细胞。FcRn是不由所述哺乳动物细胞天然表达的异源多聚体多肽。更具体地讲,FcRn是由以下两种多肽组成的异二聚体蛋白质:I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和β2-微球蛋白(β2m)。为了实现FcRn的表达,已将在特异性和限定的序列中包含多个不同表达盒的重组核酸整合到哺乳动物细胞的基因组中。
本文还报道了用于产生表达FcRn的重组哺乳动物细胞的方法,以及使用所述重组哺乳动物细胞生产FcRn的方法。
本发明至少部分基于以下发现:异二聚体FcRn表达所需的不同表达盒的序列(即表达盒组织形式)在整合到哺乳动物细胞的基因组中时影响FcRn的表达产量。
本发明至少部分基于以下发现:通过将具有特异性表达盒组织形式的编码异二聚体FcRn的核酸整合到哺乳动物细胞的基因组中,可以实现FcRn的有效重组表达和产生。
已经发现,通过双重组酶介导的盒式交换反应,可以将限定的表达盒序列有利地整合到哺乳动物细胞的基因组中。
本发明的一个方面是用于生产C末端生物素化FcRn的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在含有生物素的培养基中培养包含编码FcRn和大肠杆菌(E.coli)生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及
b)从所述细胞或所述培养基中回收C末端生物素化FcRn,
其中所述编码FcRn和大肠杆菌BirA的脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含HisAvi标签的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含HisAvi标签的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码大肠杆菌生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,所述编码FcRn和大肠杆菌BirA的脱氧核糖核酸还包含
-位于所述第一表达盒的5’的第一重组识别序列,
-位于所述第五表达盒的3’的第二重组识别序列,以及
-位于所述第二表达盒与所述第三表达盒之间的第三重组识别序列,
并且
其中所有重组识别序列都不同。
在一个实施方案中,所述编码FcRn和BirA的脱氧核糖核酸包含编码选择性标记的另外的表达盒,并且所述编码所述选择性标记的表达盒部分地位于所述第三重组识别序列的5’并部分地位于所述第三重组识别序列的3’,其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子,并且所述表达盒的位于3’的部分包含没有起始密码子和多聚A信号的编码序列,其中所述起始密码子可操作地连接至所述编码序列。
在一个实施方案中,所述表达盒中的每一者在5’至3’方向上包含启动子、编码序列和多聚腺苷酸化信号序列,任选地随后是终止子序列。在一个实施方案中,所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子,所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点,并且所述终止子序列为除所述选择性标记的所述表达盒外的hGT终止子,其中所述启动子为SV40启动子,并且所述多聚腺苷酸化信号序列位点为SV40多聚A位点并且不存在终止子序列。
在一个实施方案中,所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
在一个实施方案中,所述FcRn为人FcRn,所述I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述β2-微球蛋白(β2m)为人β2-微球蛋白(β2m)。
在一个实施方案中,所述FcRn为鼠FcRn,所述I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为鼠I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述β2-微球蛋白(β2m)为鼠β2-微球蛋白(β2m)。
在一个实施方案中,所述FcRn为食蟹猴FcRn,所述I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为食蟹猴I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述β2-微球蛋白(β2m)为食蟹猴β2-微球蛋白(β2m)。
根据本发明的一个方面是根据本发明的生物素化FcRn。
根据本发明的一个方面是根据本发明的生物素化FcRn作为亲和层析配体的用途。
具体实施方式
本发明至少部分基于以下发现:为了表达新生儿Fc受体(FcRn)(包含不同多肽的复合分子,即异源多聚体),使用限定和特异性的表达盒组织形式导致FcRn在哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)中的有效表达和产生。
本发明至少部分基于以下发现:双重组酶介导的盒式交换(RMCE)可以用于产生重组哺乳动物细胞,诸如重组CHO细胞,其中已将限定和特异性的表达盒序列整合到基因组中,这进而导致FcRn的有效表达和产生。该整合通过靶向整合在哺乳动物细胞基因组中的特定位点处实现。因此,有可能控制异源多聚体FcRn的不同多肽相对于彼此的表达比。由此,进而以高表达产量实现了正确折叠和组装的FcRn的有效表达、正确组装和成功分泌。
I.定义
可用于实施本发明的方法和技术在例如以下文献中有所描述:Ausubel,F.M.(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,第I卷至第III卷(1997);Glover,N.D.和Hames,B.D.编辑,DNA Cloning:A Practical Approach,第I卷和第II卷(1985),OxfordUniversity Press;Freshney,R.I.(编辑),Animal Cell Culture–a practicalapproach,IRL Press Limited(1986);Watson,J.D.等人,Recombinant DNA,第二版,CHSLPress(1992);Winnacker,E.L.,From Genes to Clones;N.Y.,VCH Publishers(1987);Celis,J.编辑,Cell Biology,第二版,Academic Press(1998);Freshney,R.I.,Cultureof Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第二版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
使用重组DNA技术能够生成核酸的衍生物。此类衍生物可以例如在单个或几个核苷酸位置处通过取代、改变、交换、缺失或插入来加以修饰。修饰或衍生化可以例如借助定点诱变来进行。此类修饰可以由本领域技术人员容易地进行(参见例如,Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA;Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL Press,Oxford,England)。
必须注意的是,如本文和所附权利要求书中所用,单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代,除非上下文另外明确规定。因此,例如,提及“一个细胞”包括多个此类细胞和本领域技术人员已知的其等同物,诸如此类。同样,术语“一个/一种”、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意的是,术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20%范围。在一个实施方案中,术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10%范围。在一个实施方案中,术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5%范围。
术语“包括”还涵盖术语“由……组成”。
术语“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”涵盖以下细胞:已向其中引入一种或多种外源核酸(包括此类细胞的子代)并且其旨在形成进一步遗传修饰的起点。因此,术语“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”涵盖包含整合在哺乳动物细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的细胞,其中所述外源核苷酸序列至少包含侧接至少一个第一选择性标记的第一重组识别序列和第二重组识别序列(这些重组酶识别序列是不同的)。在一个实施方案中,包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞是包含整合在宿主细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的细胞,其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择性标记的第一重组识别序列和第二重组识别序列,以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列,并且所有重组识别序列都不同。
如本文所用,术语“重组细胞”表示最终遗传修饰后的细胞,诸如表达感兴趣多肽并且可以用于以任何规模生产所述感兴趣多肽的细胞。例如,已进行过重组酶介导的盒式交换(RMCE),由此感兴趣多肽的编码序列已被引入宿主细胞的基因组中的“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”为“重组细胞”。尽管该细胞仍能够进行进一步的RMCE反应,但并不希望这样做。
“包含外源核苷酸序列的哺乳动物细胞”和“重组细胞”都是“转化细胞”。该术语包括原代转化细胞以及由其衍生的子代,而不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致,而是可能例如含有突变。涵盖了具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体子代。
“分离的”组合物是已经与其天然环境的组分分离的组合物。在一些实施方案中,将组合物纯化至大于95%或99%的纯度,如通过例如电泳(例如,SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳、CE-SDS)或色谱(例如,尺寸排阻色谱或离子交换或反相HPLC)确定的。有关用于评估例如抗体纯度的方法的综述,参见例如,Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子:其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中,但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
“分离的”多肽或抗体是指已经与其天然环境的组分分离的多肽分子或抗体分子。
术语“整合位点”表示细胞基因组内的已向其中插入外源核苷酸序列的核酸序列。在某些实施方案中,整合位点在细胞基因组中的两个相邻核苷酸之间。在某些实施方案中,整合位点包括一段核苷酸序列。在某些实施方案中,整合位点位于哺乳动物细胞的基因组的特定基因座内。在某些实施方案中,整合位点在哺乳动物细胞的内源基因内。
如本文所用,术语“载体”或“质粒”(可以互换使用)是指能够载运与其相连的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体,以及掺入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“与……结合”表示结合位点与其靶标的结合,诸如,包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的抗体结合位点与相应抗原的结合。这种结合可以使用例如测定(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)来确定。即,术语“(与抗原)结合”表示抗体在体外测定中与其抗原结合。在一个实施方案中,结合在结合测定中确定,其中抗体与表面结合,并且抗原与抗体的结合通过表面等离子体共振(SPR)来测量。结合意味着例如结合亲和力(KD)为10-8M或更低,在一些实施方案中为10-13M至10-8M,在一些实施方案中为10- 13M至10-9M。术语“结合”还包括术语“特异性结合”。
例如,在测定的一个可能实施方案中,抗原与表面结合,并且通过表面等离子体共振(SPR)来测量抗体(即其结合位点)的结合。结合的亲和力由术语ka(缔合常数:缔合以形成复合物的速率常数)、kd(解离常数:复合物解离的速率常数)和KD(kd/ka)限定。替代性地,SPR传感图的结合信号可以直接与参考物的响应信号在共振信号高度和解离行为方面进行比较。
术语“结合位点”表示对靶标表现出结合特异性的任何蛋白质实体。这可以是例如受体、受体配体、抗运载蛋白、亲和体、抗体等。因此,如本文所用的术语“结合位点”表示可以与第二多肽特异性结合或可以被第二多肽特异性结合的多肽。
如本文所用,术语“选择性标记”表示这样的基因:其允许在相应的选择性试剂的存在下特异性选择或排除携带该基因的细胞。例如,但不作为限制,选择性标记可以允许在相应选择性试剂(选择性培养条件)的存在下正选择用该选择性标记基因转化的宿主细胞;未转化的宿主细胞将不能在该选择性培养条件下生长或存活。选择性标记可以是正的、负的或双功能的。正选择性标记可以允许选择携带该标记的细胞,而负选择性标记可以允许选择性地消除携带该标记的细胞。选择性标记可以赋予对药物的抗性,或者补偿宿主细胞中的代谢或分解代谢缺陷。在原核细胞中,可以使用赋予对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素的抗性的基因,以及其他基因。可用作真核细胞中的选择性标记的抗性基因包括但不限于针对氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如,潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)的基因,以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。另外的标记基因描述于WO 92/08796和WO 94/28143中。
除有助于在存在相应选择性试剂的情况下进行选择之外,选择性标记还可以替代性地为通常不存在于细胞中的分子,例如绿色荧光蛋白质(GFP)、增强的GFP(eGFP)、合成的GFP、黄色荧光蛋白质(YFP)、增强的YFP(eYFP)、青色荧光蛋白质(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。可以例如分别通过检测到编码的多肽所发出的荧光或不存在这种荧光,来将表达这种分子的细胞与不含该基因的细胞区分开来。
如本文所用,术语“可操作地连接”是指两种或更多种组分的并置,其中这些组分的关系允许它们以预期的方式发挥作用。例如,如果启动子和/或增强子用于调节编码序列的转录,则该启动子和/或增强子可操作地连接至编码序列。在某些实施方案中,“可操作地连接”的DNA序列在单个染色体上相连并且相邻。在某些实施方案中,例如,当必须接合两个蛋白质编码区(诸如分泌前导区和多肽)时,这些序列是相连、相邻的,并且在同一阅读框中。在某些实施方案中,可操作地连接的启动子位于编码序列上游并且可以与该编码序列相邻。在某些实施方案中,例如,关于调节编码序列表达的增强子序列,这两种组分能够可操作地连接,但并不相邻。如果增强子增加了编码序列的转录,则该增强子可操作地连接至编码序列。可操作地连接的增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游,并且可以位于与编码序列的启动子距离相当远的位置。可操作的连接可以通过本领域中已知的重组方法(例如使用PCR方法和/或通过在方便的限制性位点处连接)来完成。如果不存在方便的限制性位点,则可以根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。如果内部核糖体进入位点(IRES)允许在内部位置处以独立于5’端的方式启动ORF的翻译,则IRES可操作地连接至开放阅读框(ORF)。
术语“FcRn”表示新生儿Fc受体。FcRn的功能是从溶酶体降解途径中挽救IgG,从而引起清除率降低和半衰期延长。FcRn是由以下两种多肽组成的异二聚体蛋白质:I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和β2-微球蛋白(β2m)。FcRn以高亲和力与IgG的Fc区的CH2-CH3部分结合。IgG与FcRn之间的相互作用是严格pH依赖性的,并且以1:2的化学计量发生,其中一个IgG经由其两条重链与两个FcRn分子结合(Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083)。FcRn结合在酸性pH(pH<6.5)下发生在核内体中,并且IgG在中性细胞表面(pH为约7.4)处释放。该相互作用的pH敏感性通过在核内体的酸性环境内与受体结合,促进FcRn介导的对胞饮入细胞的IgG的保护,使其免于细胞内降解。FcRn然后促进IgG再循环到细胞表面,随后在FcRn-IgG复合物暴露于细胞外的中性pH环境时释放到血流中。
术语“Fc区的FcRn结合部分”表示抗体重链多肽的以下部分:大致从EU位置243延伸到EU位置261、大致从EU位置275延伸到EU位置293、大致从EU位置302延伸到EU位置319、大致从EU位置336延伸到EU位置348、大致从EU位置367延伸到EU位置393和EU位置408,以及大致从EU位置424延伸到EU位置440。在一个实施方案中,根据Kabat的EU编号,下列氨基酸残基中的一者或多者为改变的F243、P244、P245 P、K246、P247、K248、D249、T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、P257、E258、V259、T260、C261、F275、N276、W277、Y278、V279、D280、V282、E283、V284、H285、N286、A287、K288、T289、K290、P291、R292、E293、V302、V303、S304、V305、L306、T307、V308、L309、H310、Q311、D312、W313、L314、N315、G316、K317、E318、Y319、I336、S337、K338、A339、K340、G341、Q342、P343、R344、E345、P346、Q347、V348、C367、V369、F372、Y373、P374、S375、D376、I377、A378、V379、E380、W381、E382、S383、N384、G385、Q386、P387、E388、N389、Y391、T393、S408、S424、C425、S426、V427、M428、H429、E430、A431、L432、H433、N434、H435、Y436、T437、Q438、K439和S440。
如本文所用,术语“侧接”是指第一核苷酸序列位于第二核苷酸序列的5’端或3’端或这两端处。侧接核苷酸序列可以与第二核苷酸序列相邻或相距限定的距离。侧接核苷酸序列的长度无具体限制。例如,侧接序列可以具有几个碱基对或几千个碱基对。
术语“正线性pH梯度”表示以低(即,酸性较强)pH值开始并且以较高(即,酸性较弱、中性或碱性)pH值结束的pH梯度。在一个实施方案中,正线性pH梯度以约5.5的pH值开始并且以约8.8的pH值结束。
脱氧核糖核酸包含编码链和非编码链。术语“5’”和“3’”当在本文中使用时,是指编码链上的位置。
如本文所用,术语“外源”是指核苷酸序列并非来源于特异性细胞,而是通过DNA递送方法(例如,通过转染方法、电穿孔方法或转化方法)引入所述细胞中。因此,外源核苷酸序列是人工序列,其中人工性可以源自例如不同来源的子序列的组合(例如,具有SV40启动子的重组酶识别序列与绿色荧光蛋白质的编码序列的组合是人工核酸)或源自序列(例如仅编码膜结合受体的细胞外结构域或cDNA的序列)的部分的缺失,或者核碱基突变。术语“内源”是指来源于细胞的核苷酸序列。“外源”核苷酸序列可以具有碱基组成相同的“内源”对应物,但其中“外源”序列例如经由重组DNA技术被引入细胞中。
II.组合物和方法
一般来讲,对于感兴趣多肽(诸如治疗性多肽)的重组大规模生产,需要稳定地表达和分泌所述多肽的细胞。这种细胞被称为“重组细胞”或“重组生产细胞”,用于产生这种细胞的过程被称为“细胞系开发”。在细胞系开发过程的第一步中,合适的宿主细胞(诸如CHO细胞)用适于表达所述感兴趣多肽的核酸序列转染。在第二步中,基于已经用编码感兴趣多肽的核酸共转染的选择性标记的共表达,选择稳定表达感兴趣多肽的细胞。
编码多肽的核酸(即编码序列)称为结构基因。这种结构基因是简单的信息,并且其表达需要额外的调控元件。因此,结构基因通常整合在表达盒中。表达盒在哺乳动物细胞中起作用所需的最少调控元件是在所述哺乳动物细胞中起作用的启动子,其位于结构基因的上游,即5’,以及在所述哺乳动物细胞中起作用的多聚腺苷酸化信号序列,其位于结构基因的下游,即3’。启动子、结构基因和多聚腺苷酸化信号序列以可操作连接的形式排列。
在感兴趣多肽是由不同(单体)多肽构成的异源多聚体多肽的情况下,需要的不仅是单个表达盒,而是在所含结构基因上不同的多个表达盒,即,对于该异源多聚体多肽的不同(单体)多肽中的每一者需要至少一个表达盒。例如,全长抗体是包含轻链的两个拷贝以及重链的两个拷贝的异源多聚体多肽。因此,全长抗体由两种不同的多肽构成。因此,全长抗体的表达需要两个表达盒,一个用于轻链,另一个用于重链。例如,如果全长抗体是双特异性抗体,即抗体包含与两种不同抗原特异性结合的两个不同结合位点,则轻链和重链也彼此不同。因此,这种双特异性全长抗体由四种不同的多肽构成,并且需要四个表达盒。
感兴趣多肽的表达盒进而整合到所谓的“表达载体”中。“表达载体”是提供用于在细菌细胞中扩增所述载体以及在哺乳动物细胞中表达所包含的结构基因的所有必需元件的核酸。通常,表达载体包含原核质粒增殖单元,例如用于大肠杆菌的原核质粒增殖单元,其包含复制起点和原核选择性标记,以及真核选择性标记,以及表达感兴趣的结构基因所需的表达盒。“表达载体”是用于将表达盒引入哺乳动物细胞的转运工具。
如前面的段落中所概述,待表达的多肽越复杂,所需的不同表达盒的数量也越高。固有地随着表达盒的数量增加,整合到宿主细胞基因组中的核酸的大小也增加。表达载体的大小也随之增加。但是,载体大小的实际上限在约15kbp的范围内,超过该范围,处理和加工效率显著下降。该问题可以通过使用两个或更多个表达载体来解决。因此,表达盒可以在不同的表达载体之间拆分,每个表达载体仅包含其中一些表达盒。
常规细胞系开发(CLD)依赖于携带感兴趣多肽(SOI)表达盒的载体的随机整合(RI)。一般来讲,如果载体通过随机方法转染,则几种载体或其片段整合到细胞的基因组中。因此,基于RI的转染过程是不可预测的。
所以,通过解决在不同表达载体之间拆分表达盒时的大小问题,出现了新的问题,就是整合的表达盒的随机数量及其空间分布。
一般来讲,用于表达结构基因的表达盒被整合到细胞的基因组中的越多,相应表达的多肽的量就变得越高。除了整合的表达盒的数量之外,整合的位点和基因座也对表达产量产生影响。例如,如果表达盒整合在细胞基因组中具有低转录活性的位点处,则仅表达少量的编码多肽。但是,如果相同的表达盒整合在细胞基因组中具有高转录活性的位点处,则表达大量的编码多肽。
只要异源多聚体多肽的不同多肽的表达盒全部以相同的频率整合在具有相当转录活性的基因座处,这种表达差异就不会引起问题。在这种情况下,多聚体多肽的所有多肽均以相同的量表达,并且多聚体多肽将被正确地组装。
但是这种情况不太可能出现,并且对于由多于两种多肽构成的分子也不能保证。例如,在WO 2018/162517中已经公开,依赖于i)表达盒序列和ii)不同表达载体之间表达盒的分布,使用RI观察到表达产量和产物质量的高度变化。不受该理论的束缚,该观察是由于以下事实:来自不同表达载体的不同表达盒以不同频率在细胞中的不同基因座处整合,导致异源多聚体多肽的不同多肽的差异表达,即以不适当的不同比率表达。因此,一些单体多肽以较高的量存在,而另一些则以较低的量存在。异源多聚体多肽单体之间的这种不均衡导致不完全组装、错误组装以及分泌速率减慢。所有前述情况都将导致正确折叠的异源多聚体多肽的表达产量较低,以及产物相关副产物的比例较高。
与常规的RI CLD不同,靶向整合(TI)CLD在细胞基因组中的预定“热点”处引入包含不同表达盒的转基因。而且,该引入采用了表达盒的限定比率。因此,不受该理论的束缚,异源多聚体多肽的所有不同多肽都以相同(或至少相当且仅略有不同)的速率和适当的比率表达。由此,正确组装的异源多聚体多肽的量应当增加并且产物相关副产物的比例应当减少。
另外,考虑到限定的拷贝数和限定的整合位点,通过TI获得的重组细胞与通过RI获得的细胞相比应当具有更好的稳定性。此外,由于选择性标记仅用于选择具有适当TI的细胞,而不用于选择具有高水平转基因表达的细胞,所以可以应用诱变性较低的标记,以使产生序列变体(SV)的可能性最小化,这些序列变体的产生部分是由于甲氨蝶呤(MTX)或甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)等选择性试剂的致突变性。
但现在已发现,TI中所使用的转基因中的表达盒的序列(即表达盒组织形式)对FcRn表达具有深远的影响。
本发明使用具有限定的数量和序列的各个表达盒的特异性表达盒组织形式。这导致在哺乳动物细胞中表达的FcRn的高表达产量和良好的产物质量。
为了确定转基因与根据本发明的表达盒序列的整合,使用了TI方法。本发明提供了使用双质粒重组酶介导的盒式交换(RMCE)反应产生表达FcRn的重组哺乳动物细胞的新方法。改进尤其在于在限定的序列中的相同基因座处的限定整合,以及由此引起的FcRn的高表达和产物相关副产物的形成减少。
本发明所公开的主题不仅提供了用于生产重组哺乳动物细胞以便稳定地大规模生产FcRn的方法,而且还提供了具有FcRn高生产量且具有有利的副产物谱的重组哺乳动物细胞。
本文所使用的双质粒RMCE策略允许在同一TI基因座中插入多个表达盒。
II.a根据本发明的转基因和方法
本文报道了表达新生儿Fc受体(FcRn)的重组哺乳动物细胞。FcRn是不由所述哺乳动物细胞天然表达的异源多聚体多肽。更具体地讲,FcRn是由以下两种多肽组成的异二聚体蛋白质:I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和β2-微球蛋白(β2m)。为了实现FcRn的表达,已将在特异性和限定的序列中包含多个不同表达盒的重组核酸整合到哺乳动物细胞的基因组中。
本文还报道了用于产生表达FcRn的重组哺乳动物细胞的方法,以及使用所述重组哺乳动物细胞生产FcRn的方法。
本发明至少部分基于以下发现:异二聚体FcRn表达所需的不同表达盒的序列(即表达盒组织形式)在整合到哺乳动物细胞的基因组中时影响FcRn的表达产量。
本发明至少部分基于以下发现:双重组酶介导的盒式交换(RMCE)可以用于产生重组哺乳动物细胞,诸如重组CHO细胞,其中已将限定和特异性的表达盒序列整合到基因组中,这进而导致FcRn的有效表达和产生。该整合通过靶向整合在哺乳动物细胞基因组中的特定位点处实现。因此,有可能控制异源多聚体FcRn的不同多肽相对于彼此的表达比。由此,进而以高表达产量实现了正确折叠和组装的FcRn的有效表达、正确组装和成功分泌。
由于FcRn是异二聚体,所以其表达需要至少两个表达盒:第一个用于表达I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),第二个用于表达β2-微球蛋白(β2m)。此外,可以包括用于正选择性标记的第三表达盒。
即使使用仅由两种不同多肽组成的这种简单的异二聚体分子,也可以实现不同的表达盒组织形式。下面给出了一些示例(在5’至3’方向上):
α-FcRn-β2m
α-FcRn-β2m-α-FcRn
α-FcRn-β2m-β2m
α-FcRn-β2m-α-FcRn-β2m
等等。
首先,已经测试了单体的额外表达盒的存在是否对表达产量有影响。因此,进行了瞬时筛选表达。从本领域获知,这种瞬时筛选可以在例如HEK细胞中进行,以预先阐明稳定细胞系的排名。这是有利的,因为瞬时方法耗时较少(参见例如,Diepenbruck,C.等人,Mol.Biotechnol.54(2013)497-503)。
用于瞬时筛选人FcRn表达的表达盒组织形式为(以5’至3’方向给出,选择性标记未示出,但始终位于第二表达盒之后):
α-FcRn-β2m
α-FcRn-β2m-β2m
α-FcRn-β2m-α-FcRn-β2m
已经发现,两种表达盒的两个拷贝的存在使产量如预期那样翻倍(NiNTA之后和SEC纯化之后为20mg/mL对40mg/mL)。出乎意料的是,添加β2m的第二表达盒仅导致表达产量为四表达盒组织形式的表达产量的两倍多(NiNTA之后和SEC纯化之后为90mg/mL对40mg/mL)。结果汇总于下表1中。
Magistrelli等人(J.Immunol.Meth.375(2012)20-29)报道了使用PEAK细胞产生生物素化FcRn的方法,所述PEAK细胞稳定表达EBNA-1并且用共表达(i)生物素连接酶(LsBirA)和(ii)作为报告基因的增强绿色荧光蛋白质(EGFP)的FcRnα和β2m双启动子载体瞬时转染。在Ni-NTA纯化和固定之后,对于hFcRn和mFcRn,每升细胞培养上清液分别仅获得4mg/L和1.2mg/L。
表1:HEK293细胞中瞬时表达的结果。表达盒组织形式以5’至3’方向给出,为了降低复杂性,选择性标记表达盒未示出,但始终位于第二表达盒之后;n.d.=未测定。
*:6孔微量滴定板的工作体积
**:在Ni-NTA与亲和吸收之后
将确定在瞬时表达中表现最佳的表达盒组织形式用于通过TI产生表达人FcRn、食蟹猴FcRn和鼠FcRn的稳定重组CHO细胞。还使用了在瞬时表达中产生次佳表达产量的四表达盒组织形式。结果在下表2中呈现。
表2:CHO-K1细胞中稳定表达的结果。表达盒组织形式以5’至3’方向给出,为了降低复杂性,选择性标记未示出,但始终位于第二表达盒之后;hu=人;cy=食蟹猴;mu=鼠。
可以看出,对于鼠FcRn和食蟹猴FcRn的稳定表达,与瞬时表达中相同的表达盒组织形式提供了最佳产量。
对于人FcRn的稳定表达,出乎意料的是,尽管瞬时表达的产量较低,但四表达盒组织形式导致了更好的产量。
因此,对于分别重组生产人FcRn和鼠/食蟹猴FcRn,即在物种中有差别的FcRn,不同的表达盒组织形式导致了最佳的表达产量。
用根据本发明的重组细胞产生的FcRn的一种应用是作为亲和层析配体。从本领域获知,通过将单生物素化FcRn固定在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白衍生的基质上,可以获得稳定的FcRn亲和层析柱(参见例如,WO2013/120929)。
因此,对于这样的用途,用根据本发明的重组细胞或在根据本发明的方法中产生的FcRn必须是单生物素化的。这种单生物素化可以通过在表达和分离非生物素化FcRn之后的体外方法或者在体内直接培养表达FcRn的重组细胞的方法来实现。
两种方法都适用。
对于这两种方法,α-FcRn通过使用由大肠杆菌生物素连接酶BirA识别的Avi标签在C末端处延伸其氨基酸序列来修饰。
在体外方法中,在生物素存在下将包含所述Avi标签的FcRn与BirA一起温育。这导致生物素在Avi标签的位点处附接到α-FcRn。体外生物素化得到的结果在下表3中示出。
表3:通过CHO-K1细胞中的稳定表达产生的FcRn的体外生物素化的结果。表达盒组织形式以5’至3’方向给出,为了降低复杂性,选择性标记未示出,但始终位于第二表达盒之后;hu=人;cy=食蟹猴;mu=鼠。
物种 | 滴度批量[μg/mL] | 生物素化水平[%] | ||||
表达盒组织形式 | SEC之后 | |||||
α-FcRn-β2m-β2m | hu | 900 | 69.5 | |||
α-FcRn-β2m-α-FcRn-β2m | hu | 1300 | 85.5 | |||
α-FcRn-β2m-β2m | cy | 800 | 76.6 | |||
α-FcRn-β2m-α-FcRn-β2m | cy | 590 | 76.5 | |||
α-FcRn-β2m-β2m | mu | 1240 | 85.6 | |||
α-FcRn-β2m-α-FcRn-β2m | mu | 880 | 89.5 |
对于体内方法,BirA在相同的重组细胞中表达。因此,在这种情况下,需要用于表达BirA的另外的表达盒,并且必须将其整合到通过靶向整合引入的转基因中。
与FcRn表达盒的组织形式一样,BirA表达盒可以放置在不同的位置。相应的结果在下表4中示出。
表4:通过在CHO-K1细胞中与BirA稳定共表达产生的FcRn的体内生物素化的结果。表达盒组织形式以5’至3’方向给出,为了降低复杂性,选择性标记未示出,但是如果BirA是最靠近3’定位的表达盒,则选择性标记位于第二表达盒之后,或者如果BirA表达盒定位为第三表达盒,则选择性标记位于BirA表达盒之后;hu=人;cy=食蟹猴;mu=鼠;BirA=大肠杆菌生物素连接酶。
出乎意料的是,BirA表达盒作为转基因中最后一个最靠近3’末端的表达盒的位置导致了最高的有效滴度。同样出乎意料的是,单个BirA表达盒产生了比两个BirA表达盒更高的有效滴度。这与FcRn的物种无关。
本发明概述如下。
1.人FcRn
根据本发明的一个方面是用于生产人FcRn的方法,所述方法包括以下步骤:
a)培养包含编码人FcRn的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及
b)从所述细胞或所述培养基中回收人FcRn,
其中所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5’至3’方向上包含
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,以及
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒。
在一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含His标签、Avi标签或HisAvi标签。
根据本发明的一个方面是用于生产C末端生物素化人FcRn的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在含有生物素的培养基中培养包含编码人FcRn和生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及
b)从所述细胞或所述培养基中回收C末端生物素化人FcRn,
其中所述编码人FcRn和BirA的脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含Avi标签的人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含Avi标签的人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,BirA来自大肠杆菌。
本发明的一个方面是编码人FcRn的脱氧核糖核酸,其在5’至3’方向上包含
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,以及
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸还包含编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,BirA来自大肠杆菌。
本发明的一个方面是脱氧核糖核酸用于在哺乳动物细胞中表达人FcRn的用途,该脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,以及
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒。
在该用途的一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在该用途的一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,该用途用于表达C末端生物素化人FcRn,并且所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸在第四表达盒之后还包含编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的第五表达盒,并且所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签。
在一个实施方案中,BirA来自大肠杆菌。
本发明的一个方面是重组哺乳动物细胞,其包含整合在该细胞的基因组中的编码人FcRn的脱氧核糖核酸,
其中所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,以及
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒。
在一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸在第四表达盒之后还包含编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的第五表达盒,并且所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签。
在一个实施方案中,BirA来自大肠杆菌。
在所有前述方面的一个实施方案中,所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸还包含
-第一重组识别序列,其位于所述第一(最靠近5’的)表达盒的5’,
-第二重组识别序列,其位于第四表达盒或(如果存在的话)第五(最靠近3’的)表达盒的3’,以及
-第三重组识别序列,其位于
-第一重组识别序列与第二重组识别序列之间,以及
-所述表达盒中的两者之间,
并且
其中所有重组识别序列都不同。
在一个实施方案中,第三重组识别序列位于第二表达盒与第三表达盒之间。
本发明的一个方面是包含两种脱氧核糖核酸的组合物,这两种脱氧核糖核酸进而包含三种不同的重组识别序列和四种表达盒,其中
-所述第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第一重组酶识别序列,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,以及
-第三重组识别序列的第一拷贝,
并且
-所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组识别序列的第二拷贝,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,以及
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-第二重组识别序列。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,所述第二脱氧核糖核酸还包含位于第四表达盒之后和第二重组酶识别序列之前的编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的第五表达盒,并且所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签。
在一个实施方案中,BirA来自大肠杆菌。
在所有前述方面的一个实施方案中,所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸包含编码选择性标记的另外的表达盒。
在一个实施方案中,所述编码选择性标记的表达盒相对于第三重组识别序列
i)位于5’,或
ii)位于3’,或者
iii)部分地位于5’并且部分地位于3’。
在一个实施方案中,所述编码选择性标记的表达盒部分地位于第三重组识别序列的5’并部分地位于第三重组识别序列的3’,其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子,并且所述表达盒的位于3’的部分包含没有起始密码子和多聚A信号的编码序列。
在一个实施方案中,所述编码选择性标记的表达盒的位于5’的部分包含可操作地连接至起始密码子的启动子序列,由此启动子序列在上游侧接第二表达盒(即定位在第二表达盒的下游),并且起始密码子在下游侧接第三重组识别序列(即定位在第三重组识别序列的上游);并且所述编码选择性标记的表达盒的位于3’的部分包含编码选择性标记的核酸,该核酸缺乏可操作地连接至多聚腺苷酸化序列的起始密码子,并且在上游侧接第三重组识别序列,在下游侧接第三表达盒。
在一个实施方案中,所述起始密码子为转录起始密码子。在一个实施方案中,所述起始密码子为ATG。
本发明的一个方面是重组哺乳动物细胞,其包含整合在该细胞的基因组中的编码人FcRn的脱氧核糖核酸,
其中所述编码人FcRn的脱氧核糖核酸包含以下元件:
第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列,
第一选择性标记和第二选择性标记,以及
第一表达盒至第四表达盒,
其中所述元件在5’至3’方向上的序列为
RRS1-第1EC-第2EC-RRS3-SM1-第3EC-第4EC-RRS2-SM2
其中
RRS=重组识别序列,
EC=表达盒,
SM=选择性标记。
本发明的一个方面是用于生产包含编码人FcRn的脱氧核糖核酸并且分泌人FcRn的重组哺乳动物细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供包含整合在哺乳动物细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞,其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择性标记的第一重组识别序列和第二重组识别序列,以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列,并且所有重组识别序列都不同;
b)向a)所提供的细胞中引入两种脱氧核糖核酸的组合物,这两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和五种表达盒,其中
所述第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第一重组酶识别序列,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码一个第二选择性标记的表达盒的5’端部分,以及
-第三重组识别序列的第一拷贝,
并且
所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组识别序列的第二拷贝,
-编码这一个第二选择性标记的表达盒的3’端部分,
-编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,以及
-编码人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-第二重组识别序列,
其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的第一重组识别序列至第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第一重组识别序列至第三重组识别序列匹配,
其中编码这一个第二选择性标记的表达盒的5’端部分和3’端部分在合起来看时形成这一个第二选择性标记的功能性表达盒;
c)
i)与b)的第一脱氧核糖核酸和第二脱氧核糖核酸同时引入,或者
ii)随后依次引入
一种或多种重组酶,
其中所述一种或多种重组酶识别所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述重组识别序列,以及外源核苷酸序列;(并且任选地其中所述一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒式交换;)
以及
d)选择表达所述第二选择性标记并且分泌人FcRn的细胞,
从而产生包含编码人FcRn的脱氧核糖核酸并且分泌人FcRn的重组哺乳动物细胞。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,该方法用于生产包含编码人FcRn的脱氧核糖核酸并且分泌C末端生物素化人FcRn的重组哺乳动物细胞,其中所述两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和六种表达盒,并且所述第二脱氧核糖核酸还包含位于第四表达盒之后和第二重组酶识别序列之前的编码大肠杆菌生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒,并且所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签。
在一个实施方案中,所述编码这一个第二选择性标记的表达盒部分地位于第三重组识别序列的5’并部分地位于第三重组识别序列的3’,其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子,并且所述表达盒的位于3’的部分包含这一个第二选择性标记的没有起始密码子和多聚腺苷酸化信号序列的编码序列。
在一个实施方案中,所述编码这一个第二选择性标记的表达盒的5’端部分包含可操作地连接至起始密码子的启动子序列,由此启动子序列在上游侧接第二表达盒(即定位在第二表达盒的下游),并且起始密码子在下游侧接第三重组识别序列(即定位在第三重组识别序列的上游);并且所述编码这一个第二选择性标记的表达盒的3’端部分包含这一个第二选择性标记的编码序列,该编码序列缺乏可操作地连接至多聚腺苷酸化信号序列的起始密码子,并且在上游侧接第三重组识别序列,在下游侧接第三表达盒。
在一个实施方案中,所述起始密码子为转录起始密码子。在一个实施方案中,所述起始密码子为ATG。
在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,第一脱氧核糖核酸整合到第一载体中并且第二脱氧核糖核酸整合到第二载体中。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述表达盒中的每一者在5’至3’方向上包含启动子、编码序列和多聚腺苷酸化信号序列,任选地随后是终止子序列,它们都可操作地彼此连接。
在一个实施方案中
i)第一表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列,并且/或者
ii)第二表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码人β2-微球蛋白(β2m)的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列,并且/或者
iii)第三表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列,并且/或者
iv)第四表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码人β2-微球蛋白(β2m)的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列,并且/或者
v)编码选择性标记的表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列。
在一个实施方案中,第五表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码大肠杆菌生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子,所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点,并且所述终止子序列为hGT终止子。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子,所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点,并且所述终止子序列为除所述选择性标记的所述表达盒外的hGT终止子,其中所述启动子为SV40启动子,并且所述多聚腺苷酸化信号序列为SV40多聚A位点并且不存在终止子序列。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述人FcRn为人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和人β2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述人FcRn为单生物素化的。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述哺乳动物细胞为CHO细胞。在一个实施方案中,所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)具有氨基酸序列SEQ ID NO:03。在一个实施方案中,所述人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)具有氨基酸序列SEQ ID NO:04。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述重组酶识别序列为L3、2L和LoxFas。在一个实施方案中,L3具有序列SEQ ID NO:22,2L具有序列SEQ ID NO:23,并且LoxFas具有序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中,所述第一重组酶识别序列为L3,所述第二重组酶识别序列为2L,并且所述第三重组酶识别序列为LoxFas。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,人β2-微球蛋白(β2m)具有氨基酸序列SEQ ID NO:07。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述大肠杆菌生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶具有氨基酸序列SEQ ID NO:21。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,人CMV启动子具有序列SEQ IDNO:25。在一个实施方案中,人CMV启动子具有序列SEQ ID NO:27。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,bGH多聚腺苷酸化信号序列为SEQ ID NO:29。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,hGT终止子具有序列SEQ IDNO:30。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,SV40启动子具有序列SEQ IDNO:31。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,SV40多聚腺苷酸化信号序列为SEQ ID NO:28。
2.非人FcRn
根据本发明的一个方面是用于生产非人FcRn的方法,所述方法包括以下步骤:
a)培养包含编码非人FcRn的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及
b)从所述细胞或所述培养基中回收非人FcRn,
其中所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5’至3’方向上包含
-编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,以及
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第三表达盒。
在一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
根据本发明的一个方面是用于重组生产C末端生物素化非人FcRn的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在含有生物素的培养基中培养包含编码非人FcRn和生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及
b)从所述细胞或所述培养基中回收C末端生物素化非人FcRn,
其中所述编码非人FcRn和BirA的脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
本发明的一个方面是编码非人FcRn的脱氧核糖核酸,其在5’至3’方向上包含
-编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,以及
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第三表达盒。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
本发明的一个方面是脱氧核糖核酸用于在哺乳动物细胞中表达非人FcRn的用途,该脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,以及
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第三表达盒。
在该用途的一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在该用途的一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,该用途用于表达C末端生物素化非人FcRn,并且所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
本发明的一个方面是重组哺乳动物细胞,其包含整合在该细胞的基因组中的编码非人FcRn的脱氧核糖核酸,
其中所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,以及
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第三表达盒。
在一个实施方案中,所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在所有方面和实施方案中的一个实施方案中,BirA来自大肠杆菌。
在所有前述方面的一个实施方案中,所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸还包含
-第一重组识别序列,其位于所述第一(最靠近5’的)表达盒的5’,
-第二重组识别序列,其位于第三表达盒或(如果存在的话)第五(最靠近3’的)表达盒的3’,以及
-第三重组识别序列,其位于
-第一重组识别序列与第二重组识别序列之间,以及
-所述表达盒中的两者之间,
并且
其中所有重组识别序列都不同。
在一个实施方案中,第三重组识别序列位于第二表达盒与第三表达盒之间。
本发明的一个方面是包含两种脱氧核糖核酸的组合物,这两种脱氧核糖核酸进而包含三种不同的重组识别序列和三种表达盒,其中
-所述第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第一重组酶识别序列,
-编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,以及
-第三重组识别序列的第一拷贝,
并且
-所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组识别序列的第二拷贝,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第三表达盒,以及
-第二重组识别序列。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组酶识别序列的第二拷贝,
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒,以及
-第二重组酶识别序列。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在所有前述方面的一个实施方案中,所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸包含编码选择性标记的另外的表达盒。
在一个实施方案中,所述编码选择性标记的表达盒相对于第三重组识别序列
i)位于5’,或
ii)位于3’,或者
iii)部分地位于5’并且部分地位于3’。
在一个实施方案中,所述编码选择性标记的表达盒部分地位于第三重组识别序列的5’并部分地位于第三重组识别序列的3’,其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子,并且所述表达盒的位于3’的部分包含没有起始密码子和多聚A信号的编码序列。
在一个实施方案中,所述编码选择性标记的表达盒的位于5’的部分包含可操作地连接至起始密码子的启动子序列,由此启动子序列在上游侧接第二表达盒(即定位在第二表达盒的下游),并且起始密码子在下游侧接第三重组识别序列(即定位在第三重组识别序列的上游);并且所述编码选择性标记的表达盒的位于3’的部分包含编码选择性标记的核酸,该核酸缺乏可操作地连接至多聚腺苷酸化信号序列的起始密码子,并且在上游侧接第三重组识别序列,在下游侧接第三表达盒。
在一个实施方案中,所述起始密码子为转录起始密码子。在一个实施方案中,所述起始密码子为ATG。
本发明的一个方面是重组哺乳动物细胞,其包含整合在该细胞的基因组中的编码非人FcRn的脱氧核糖核酸,
其中所述编码非人FcRn的脱氧核糖核酸包含以下元件:
第一重组识别序列、第二重组识别序列和第三重组识别序列,
第一选择性标记和第二选择性标记,以及
第一表达盒至第三表达盒,
其中所述元件在5’至3’方向上的序列为
RRS1-第1EC-第2EC-RRS3-SM1-第3EC-RRS2-SM2
其中
RRS=重组识别序列,
EC=表达盒,
SM=选择性标记。
本发明的一个方面是用于生产包含编码非人FcRn的脱氧核糖核酸并且分泌非人FcRn的重组哺乳动物细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供包含整合在哺乳动物细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞,其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择性标记的第一重组识别序列和第二重组识别序列,以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列,并且所有重组识别序列都不同;
b)向a)所提供的细胞中引入两种脱氧核糖核酸的组合物,这两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和五种表达盒,其中
所述第一脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第一重组酶识别序列,
-编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码一个第二选择性标记的表达盒的5’端部分,以及
-第三重组识别序列的第一拷贝,
并且
所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组识别序列的第二拷贝,
-编码这一个第二选择性标记的表达盒的3’端部分,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第三表达盒,以及
-第二重组识别序列,
其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的第一重组识别序列至第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的第一重组识别序列至第三重组识别序列匹配,
其中编码这一个第二选择性标记的表达盒的5’端部分和3’端部分在合起来看时形成这一个第二选择性标记的功能性表达盒;
c)
i)与b)的第一脱氧核糖核酸和第二脱氧核糖核酸同时引入,或者
ii)随后依次引入
一种或多种重组酶,
其中所述一种或多种重组酶识别所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述重组识别序列;(并且任选地其中所述一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒式交换;)
以及
d)选择表达所述第二选择性标记并且分泌非人FcRn的细胞,
从而产生包含编码非人FcRn的脱氧核糖核酸并且分泌非人FcRn的重组哺乳动物细胞。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)在C末端还包含Avi标签、His标签或HisAvi标签。
在一个实施方案中,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。
在一个实施方案中,该方法用于生产包含编码非人FcRn的脱氧核糖核酸并且分泌C末端生物素化非人FcRn的重组哺乳动物细胞,其中所述两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和六种表达盒,并且所述第二脱氧核糖核酸在5’至3’方向上包含
-第三重组酶识别序列的第二拷贝,
-编码在C末端包含Avi标签的非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码非人β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
在一个实施方案中,所述编码这一个第二选择性标记的表达盒部分地位于第三重组识别序列的5’并部分地位于第三重组识别序列的3’,其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子,并且所述表达盒的位于3’的部分包含这一个第二选择性标记的没有起始密码子和多聚A信号的编码序列。
在一个实施方案中,所述编码这一个第二选择性标记的表达盒的5’端部分包含可操作地连接至起始密码子的启动子序列,由此启动子序列在上游侧接第二表达盒(即定位在第二表达盒的下游),并且起始密码子在下游侧接第三重组识别序列(即定位在第三重组识别序列的上游);并且所述编码这一个第二选择性标记的表达盒的3’端部分包含这一个第二选择性标记的编码序列,该编码序列缺乏可操作地连接至多聚腺苷酸化信号序列的起始密码子,并且在上游侧接第三重组识别序列,在下游侧接第三表达盒。
在一个实施方案中,所述起始密码子为转录起始密码子。在一个实施方案中,所述起始密码子为ATG。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,第一脱氧核糖核酸整合到第一载体中并且第二脱氧核糖核酸整合到第二载体中。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述表达盒中的每一者在5’至3’方向上包含启动子、编码序列和多聚腺苷酸化信号序列,任选地随后是终止子序列。
在一个实施方案中
i)第一表达盒和/或第三表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列,
ii)第二表达盒和/或第四表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码非人β2-微球蛋白(β2m)的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列,并且
iii)编码选择性标记的表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列。
在一个实施方案中,第五表达盒在5’至3’方向上包含启动子、编码大肠杆菌生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的核酸和多聚腺苷酸化信号序列,以及任选地终止子序列。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子,所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点,并且所述终止子序列为hGT终止子。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子,所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点,并且所述终止子序列为除所述选择性标记的所述表达盒外的hGT终止子,其中所述启动子为SV40启动子,并且所述多聚腺苷酸化信号序列为SV40多聚A位点并且不存在终止子序列。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述非人FcRn为非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和非人β2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述非人FcRn为单生物素化的。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述哺乳动物细胞为CHO细胞。在一个实施方案中,所述CHO细胞为CHO-K1细胞。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述重组酶识别序列为L3、2L和LoxFas。在一个实施方案中,L3具有序列SEQ ID NO:22,2L具有序列SEQ ID NO:23,并且LoxFas具有序列SEQ ID NO:24。在一个实施方案中,所述第一重组酶识别序列为L3,所述第二重组酶识别序列为2L,并且所述第三重组酶识别序列为LoxFas。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述大肠杆菌生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶具有氨基酸序列SEQ ID NO:21。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,人CMV启动子具有序列SEQ IDNO:25。在一个实施方案中,人CMV启动子具有序列SEQ ID NO:27。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,bGH多聚腺苷酸化信号序列为SEQ ID NO:29。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,hGT终止子具有序列SEQ IDNO:30。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,SV40启动子具有序列SEQ IDNO:31。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,SV40多聚腺苷酸化信号序列为SEQ ID NO:28。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述非人FcRn为食蟹猴FcRn,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为食蟹猴I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述非人β2-微球蛋白(β2m)为食蟹猴β2-微球蛋白(β2m)。在一个实施方案中,所述食蟹猴I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。在一个实施方案中,所述食蟹猴I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)具有氨基酸序列SEQ ID NO:09。在一个实施方案中,所述食蟹猴I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)具有氨基酸序列SEQ ID NO:10。在一个实施方案中,所述食蟹猴β2-微球蛋白(β2m)具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。
在所有前述方面和实施方案中的一个实施方案中,所述非人FcRn为鼠FcRn,所述非人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为鼠I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述非人β2-微球蛋白(β2m)为鼠β2-微球蛋白(β2m)。在一个实施方案中,所述鼠I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)是其细胞外结构域。在一个实施方案中,所述鼠I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)具有氨基酸序列SEQ ID NO:15。在一个实施方案中,所述鼠I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)具有氨基酸序列SEQID NO:16。在一个实施方案中,所述鼠β2-微球蛋白(β2m)具有氨基酸序列SEQ ID NO:19。
II.b重组酶介导的盒式交换(RMCE)
靶向整合允许将外源核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组的预定位点中。在某些实施方案中,靶向整合由识别一个或多个重组识别序列(RRS)的重组酶介导。在某些实施方案中,靶向整合由同源重组介导。
“重组识别序列”(RRS)是由重组酶识别的核苷酸序列,对于重组酶介导的重组事件是必需的并且足以引发此类重组事件。RRS可以用于限定核苷酸序列中将发生重组事件的位置。
在某些实施方案中,RRS选自由以下项组成的组:LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。如果必须存在多个RRS,则对这些序列中的每一者的选择取决于在选择不同RRS的限度内的另一个序列。
在某些实施方案中,当RRS为LoxP位点时,所述细胞需要Cre重组酶来执行重组。在某些实施方案中,当RRS为FRT位点时,所述细胞需要FLP重组酶来执行重组。在某些实施方案中,当RRS为Bxb1 attP或Bxb1 attB位点时,所述细胞需要Bxb1整合酶来执行重组。在某些实施方案中,当RRS为attP或位点时,所述细胞需要整合酶来执行重组。重组酶可以使用包含所述酶的编码序列的表达载体来引入细胞中。
Cre-LoxP位点特异性重组系统已广泛用于许多生物实验系统中。Cre为38kDa位点特异性DNA重组酶,其识别34bp LoxP序列。Cre来源于噬菌体P1并且属于酪氨酸家族位点特异性重组酶。Cre重组酶可以介导LoxP序列之间的分子内重组和分子间重组。LoxP序列由8bp非回文核心区及其侧接的两个13bp反向重复序列构成。Cre重组酶与13bp重复序列结合,从而介导8bp核心区内的重组。Cre-LoxP介导的重组以高效率发生,并且无需任何其他宿主因子。如果两个LoxP序列以相同的取向被置于同一核苷酸序列中,则Cre介导的重组将切除位于两个LoxP序列之间的DNA序列,成为共价闭环。如果两个LoxP序列以相反的位置被置于同一核苷酸序列中,则Cre介导的重组将反转位于这两个序列之间的DNA序列的取向。如果两个LoxP序列在两个不同的DNA分子上,并且如果一个DNA分子为环状分子,则Cre介导的重组将导致环状DNA序列的整合。
在某些实施方案中,LoxP序列为野生型LoxP序列。在某些实施方案中,LoxP序列为突变体LoxP序列。已开发突变体LoxP序列,用于提高Cre介导的整合或替换的效率。在某些实施方案中,突变体LoxP序列选自由以下项组成的组:LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列和Lox66序列。例如,Lox71序列在左侧的13bp重复序列中有5bp发生突变。Lox66序列在右侧的13bp重复序列中有5bp发生突变。野生型LoxP序列和突变体LoxP序列均可以介导Cre依赖性重组。
术语“匹配RRS”表示在两个RRS之间发生了重组。在某些实施方案中,两个匹配RRS是相同的。在某些实施方案中,两个RRS均为野生型LoxP序列。在某些实施方案中,两个RRS均为突变体LoxP序列。在某些实施方案中,两个RRS均为野生型FRT序列。在某些实施方案中,两个RRS均为突变体FRT序列。在某些实施方案中,两个匹配RRS为不同的序列,但是可以由同一重组酶识别。在某些实施方案中,第一匹配RRS为Bxb1 attP序列,并且第二匹配RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施方案中,第一匹配RRS为attB序列,并且第二匹配RRS为attB序列。
II.c适用于TI的示例性哺乳动物细胞
如上所述的包含外源核酸(“着陆位点”)的任何已知的或将来的适用于TI的哺乳动物细胞均可以用于本发明中。
本发明以根据前述部分的包含外源核酸(着陆位点)的CHO细胞为例。这仅仅是为了对本发明进行举例说明,而不应以任何方式解释为限制。本发明的真正范围在权利要求书中设定。
在一个优选的实施方案中,包含整合在哺乳动物细胞的基因组基因座内单个位点处的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞为CHO细胞。
适用于本发明的包含整合在其基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的示例性哺乳动物细胞为具有着陆位点(=整合在哺乳动物细胞的基因组基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列)的CHO细胞,其包含三个用于Cre重组酶介导的DNA重组的异种特异性loxP位点。这些异种特异性loxP位点为L3、LoxFas和2L(参见例如,Lanza等人,Biotechnol.J.7(2012)898-908;Wong等人,Nucleic Acids Res.33(2005)e147),由此L3和2L分别在5’端和3’端侧接着陆位点,并且LoxFas位于L3位点与2L位点之间。着陆位点还包含双顺反子单元,其经由IRES将选择性标记的表达与荧光GFP蛋白的表达联系起来,从而允许通过正选择稳定着陆位点,以及选择在转染和Cre重组后不存在该位点(负选择)。绿色荧光蛋白质(GFP)用于监测RMCE反应。
如前一段中所概述的着陆位点的这种配置允许同时整合两个载体,即具有L3和LoxFas位点的所谓前载体,以及包含LoxFas和2L位点的后载体。与着陆位点中存在的选择性标记基因不同的选择性标记基因的功能元件分布在两个载体之间:启动子和起始密码子位于前载体上,而编码区和多聚A信号位于后载体上。只有来自两个载体的所述核酸的正确的Cre介导整合才诱导针对相应选择性试剂的抗性。
一般来讲,适用于TI的哺乳动物细胞为包含整合在哺乳动物细胞基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列的哺乳动物细胞,其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择性标记的第一重组识别序列和第二重组识别序列,以及位于第一重组识别序列与第二重组识别序列之间的第三重组识别序列,并且所有重组识别序列都不同。所述外源核苷酸序列称为“着陆位点”。
本发明所公开的主题使用了适用于外源核苷酸序列的TI的哺乳动物细胞。在某些实施方案中,适用于TI的哺乳动物细胞包含整合在哺乳动物细胞基因组中的整合位点处的外源核苷酸序列。这种适用于TI的哺乳动物细胞也可以表示为TI宿主细胞。
在某些实施方案中,所述适用于TI的哺乳动物细胞为包含着陆位点的仓鼠细胞、人细胞、大鼠细胞或小鼠细胞。在某些实施方案中,所述适用于TI的哺乳动物细胞为包含着陆位点的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、CHO DG44细胞、CHO DUKXB-11细胞、CHO K1S细胞或CHO K1M细胞。
在某些实施方案中,适用于TI的哺乳动物细胞包含整合的外源核苷酸序列,其中所述外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS)。在某些实施方案中,所述外源核苷酸序列包含至少两个RRS。RRS可以由重组酶(例如,Cre重组酶、FLP重组酶、Bxb1整合酶或整合酶)识别。RRS可以选自由以下项组成的组:LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
在某些实施方案中,所述外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS,以及位于第一RRS与第二RRS之间的至少一个选择性标记,并且第三RRS不同于第一RRS和/或第二RRS。在某些实施方案中,所述外源核苷酸序列还包含第二选择性标记,并且第一选择性标记和第二选择性标记是不同的。在某些实施方案中,所述外源核苷酸序列还包含第三选择性标记和内部核糖体进入位点(IRES),其中IRES可操作地连接至第三选择性标记。第三选择性标记可以不同于第一选择性标记或第二选择性标记。
所述选择性标记可以选自由以下项组成的组:氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如,潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D),以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因。所述选择性标记也可以是选自由以下项组成的组的荧光蛋白质:绿色荧光蛋白质(GFP)、增强的GFP(eGFP)、合成的GFP、黄色荧光蛋白质(YFP)、增强的YFP(eYFP)、青色荧光蛋白质(CFP)、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald6、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire。
在某些实施方案中,所述外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS,以及位于第一RRS与第三RRS之间的至少一个选择性标记。
外源核苷酸序列是并非来源于特异性细胞,而是可以通过DNA递送方法(诸如,通过转染方法、电穿孔方法或转化方法)引入所述细胞中的核苷酸序列。在某些实施方案中,适用于TI的哺乳动物细胞包含整合在哺乳动物细胞基因组中的一个或多个整合位点处的至少一种外源核苷酸序列。在某些实施方案中,所述外源核苷酸序列整合在哺乳动物细胞基因组的特异性基因座内的一个或多个整合位点处。
在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含一个或多个重组识别序列(RRS),其中所述RRS可以由重组酶识别。在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含至少两个RRS。在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含三个RRS,其中第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施方案中,第一RRS与第二RRS相同,并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些优选的实施方案中,所有三个RRS都不同。在某些实施方案中,所述RRS彼此独立地选自由以下项组成的组:LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox511序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5171序列、Loxm2序列、Lox71序列、Lox66序列、FRT序列、Bxb1 attP序列、Bxb1 attB序列、attP序列和attB序列。
在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含至少一个选择性标记。在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含第一RRS、第二RRS和第三RRS,以及至少一个选择性标记。在某些实施方案中,选择性标记位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施方案中,两个RRS侧接至少一个选择性标记,即,第一RRS位于该选择性标记的5’(上游)并且第二RRS位于该选择性标记的3’(下游)。在某些实施方案中,第一RRS与该选择性标记的5’端相邻,并且第二RRS与该选择性标记的3’端相邻。
在某些实施方案中,选择性标记位于第一RRS与第二RRS之间,并且这两个侧接RRS是不同的。在某些优选的实施方案中,第一侧接RRS为LoxP L3序列,并且第二侧接RRS为LoxP 2L序列。在某些实施方案中,LoxP L3序列位于该选择性标记的5’,并且LoxP 2L序列位于该选择性标记的3’。在某些实施方案中,第一侧接RRS为野生型FRT序列,并且第二侧接RRS为突变体FRT序列。在某些实施方案中,第一侧接RRS为Bxb1 attP序列,并且第二侧接RRS为Bxb1 attB序列。在某些实施方案中,第一侧接RRS为attP序列,并且第二侧接RRS为attB序列。在某些实施方案中,这两个RRS以相同的取向定位。在某些实施方案中,这两个RRS均处于正向取向或反向取向。在某些实施方案中,这两个RRS以相反的取向定位。
在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含侧接两个RRS的第一选择性标记和第二选择性标记,其中第一选择性标记不同于第二选择性标记。在某些实施方案中,这两个选择性标记均彼此独立地选自由以下项组成的组:谷氨酰胺合成酶选择性标记、胸苷激酶选择性标记、HYG选择性标记和嘌呤霉素抗性选择性标记。在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含胸苷激酶选择性标记和HYG选择性标记。在某些实施方案中,第一选择性标记选自由以下项组成的组:氨基糖苷磷酸转移酶(APH)(例如,潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素和G418 APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D),以及编码对嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素、腐草霉素、氯霉素、Zeocin和霉酚酸的抗性的基因,并且第二选择性标记选自由以下项组成的组:GFP、eGFP、合成的GFP、YFP、eYFP、CFP、mPlum、mCherry、tdTomato、mStrawberry、J-red、DsRed单体、mOrange、mKO、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、CyPet、mCFPm、Cerulean和T-Sapphire荧光蛋白质。在某些实施方案中,第一选择性标记为谷氨酰胺合成酶选择性标记,并且第二选择性标记为GFP荧光蛋白质。在某些实施方案中,侧接两个选择性标记的两个RRS是不同的。
在某些实施方案中,选择性标记可操作地连接至启动子序列。在某些实施方案中,选择性标记可操作地连接至SV40启动子。在某些实施方案中,选择性标记可操作地连接至人巨细胞病毒(CMV)启动子。
在某些实施方案中,整合的外源核苷酸序列包含三个RRS。在某些实施方案中,第三RRS位于第一RRS与第二RRS之间。在某些实施方案中,第一RRS与第二RRS相同,并且第三RRS不同于第一RRS或第二RRS。在某些优选的实施方案中,所有三个RRS都不同。
II.d适用于实施本发明的示例性载体
除了上文所概述的“单载体RMCE”之外,还可以进行新的“双载体RMCE”以同时靶向整合两种核酸。
在根据本发明的使用根据本发明的载体组合的方法中采用了“双载体RMCE”策略。例如,但不作为限制,整合的外源核苷酸序列可以包含三个RRS,例如以下排列:其中第三RRS(“RRS3”)存在于第一RRS(“RRS1”)与第二RRS(“RRS2”)之间,而第一载体包含与该整合的外源核苷酸序列上的第一RRS和第三RRS相匹配的两个RRS,并且第二载体包含与该整合的外源核苷酸序列上的第三RRS和第二RRS相匹配的两个RRS。双载体RMCE策略的一个示例在图1中展示。此类双载体RMCE策略允许通过在每对RRS之间的相应序列中掺入适当数量的SOI来引入多个SOI,从而在适用于TI的哺乳动物细胞的基因组中的TI之后获得根据本发明的表达盒组织形式。
双质粒RMCE策略涉及使用三个RRS位点来同时实施两个独立的RMCE(图1)。因此,在适用于使用双质粒RMCE策略进行TI的哺乳动物细胞中的着陆位点包括第三RRS位点(RRS3),其与第一RRS位点(RRS1)或第二RRS位点(RRS2)没有交叉活性。这两个待靶向的表达质粒需要相同的侧接RRS位点才能有效靶向,其中一个表达质粒(前)侧接RRS1和RRS3,另一个表达质粒(后)侧接RRS3和RRS2。在该双质粒RMCE中还需要两个选择性标记。一个选择性标记表达盒被分成两部分。前质粒将包含启动子,随后是起始密码子和RRS3序列。后质粒将具有与选择性标记编码区的减去了起始密码子(ATG)的N末端融合的RRS3序列。可能需要在RRS3位点与选择性标记序列之间插入额外的核苷酸,以确保融合蛋白质发生框架内翻译(即可操作的连接)。仅当两个质粒均正确插入时,选择性标记的完整表达盒才将被组装,并因此使细胞对相应的选择性试剂具有抗性。图1为示出双质粒RMCE策略的示意图。
单载体RMCE和双载体RMCE都允许通过精确交换存在于供体DNA上的DNA序列与哺乳动物细胞基因组中整合位点所在的DNA序列,来将一种或多种供体DNA分子单向整合到哺乳动物细胞基因组的预定位点中。这些DNA序列的特征在于两个异种特异性RRS,其侧接:i)至少一个选择性标记或如在某些双载体RMCE中的“分裂选择性标记”;和/或ii)至少一个外源SOI。
RMCE涉及靶标基因组基因座内的两个异种特异性RRS与供体DNA分子之间的双重组交叉事件,这些事件由重组酶催化。RMCE被设计成将来自组合的前载体和后载体的DNA序列的拷贝引入哺乳动物细胞基因组的预定基因座中。与仅涉及一次交叉事件的重组不同,RMCE可以实现为使得原核载体序列不被引入哺乳动物细胞的基因组中,从而减少和/或防止不必要的触发宿主免疫或防御机制。RMCE过程可以用多个DNA序列重复。
在某些实施方案中,靶向整合通过两次RMCE实现,其中两种不同的DNA序列均整合到适用于TI的哺乳动物细胞的基因组的预定位点中,其中每种DNA序列均包含至少一个编码异源多聚体多肽的一部分的表达盒和/或至少一个侧接两个异种特异性RRS的选择性标记或其部分。在某些实施方案中,靶向整合通过多次RMCE实现,其中来自多个载体的DNA序列全部整合到适用于TI的哺乳动物细胞的基因组的预定位点中,其中每种DNA序列均包含至少一个编码异源多聚体多肽的一部分的表达盒和/或至少一个侧接两个异种特异性RRS的选择性标记或其部分。在某些实施方案中,该选择性标记可以在第一载体上部分编码并且在第二载体上部分编码,使得只有通过双RMCE正确整合两者才能够表达该选择性标记。这种系统的一个示例呈现于图1中。
在某些实施方案中,经由重组酶介导的重组进行的靶向整合导致多聚体多肽的选择性标记和/或不同的表达盒整合到不含来自原核载体的序列的宿主细胞基因组的一个或多个预定整合位点中。
II.e根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn的用途
新生儿Fc受体(FcRn),诸如来自人、小鼠或食蟹猴的FcRn,在IgG分解代谢中起重要作用。IgG的体外FcRn结合特性/特征指示其体内药代动力学特性。此类体外方法可以避免重复的体内研究(减少动物实验、时间和成本),因此在抗体开发期间具有重大价值。此类分析可以使用下列方法来实施:表面等离子体共振(SPR)测定(Wang,W.等人,DrugMetab.Disp.39(2011)1469-1477;Datta-Mannan,A.等人,Drug Metab.Disp.40(2012)1545-1555;Vaughn,D.E.和Bjorkman,P.J.,Biochemistry 36(1997)9374-9380;Raghavan,M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)11200-11204;Martin,W.L.和Bjorkman,P.J.,Biochemistry 38(1999)12639-12647);量热式非对称流场流分馏方法(Huber,A.H.等人,J.Mol.Biol.230(1993)1077-1083;Pollastrini,J.等人,Anal.Biochem.414(2011)88-98);以及FcRn亲和层析(WO 2013/120929)。迄今为止最便利的方法是FcRn亲和层析。其他方法的组合可以获得与FcRn亲和层析相当的分析结果,但代价是增加了复杂性和工作量。
此外,非pH依赖性方法不能适当地反映FcRn结合特征的生理pH依赖性,所述FcRn结合特征需要酸性pH来结合核内体,而需要中性pH来在细胞表面处释放IgG。pH环境也对FcRn分子的自缔合特性有影响。在一个pH的标准条件下工作时,因此,仅检测复合物FcRn-IgG相互作用的快照需要多次测量以汇集FcRn结合的完整pH依赖性。在FcRn亲和层析中,这可以在单次测量中完成。
FcRn亲和层析允许在适当的生理条件下分析样品,其中在具有化学计量比(包括1:2、1:1和2:2化学计量比)和pH梯度的混合物中,2:1化学计量比占主导地位,并且pH梯度可以被调节以微调样品中发现的不同峰的分离。不同的峰可以通过它们各自的曲线下面积来定量,并且对应于每个峰的洗脱物可以进行二次分析,例如用于功能性测定、再次层析或质谱分析。
此外,为了提供治疗目前已知以及将来会揭示的多种疾病的治疗方案,需要定制抗体以及含有Fc区的融合多肽。
为了定制抗体或包含Fc区的融合多肽的FcRn结合特征,修饰参与Fc区介导的效应子功能的残基,并且测试所得的经修饰的抗体和融合多肽。如果不满足所要求的特征,则再次执行相同的过程。
利用FcRn亲和层析,提供了基于简单层析方法预测经修饰抗体的特征性质变化的方法,并且不需要体内研究来分析经修饰抗体的特征变化。
在一些情况下,需要具有延长的半衰期的抗体。例如,在需要治疗的患者的循环中具有延长的半衰期的药物需要减少给药或增加给药间隔。此类抗体还具有与疾病部位(例如肿瘤)的接触增加的优点。
新生儿Fc受体(FcRn)对于体内IgG抗体的代谢命运很重要。
根据本发明的或用根据本发明的方法生产的(生物素化)FcRn可以用作亲和层析配体。
因此,本发明的一个方面是根据本发明的固定化FcRn作为亲和层析配体在具有正线性pH梯度的亲和层析中用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽的用途,
其中该FcRn与固相结合,
其中该FcRn被单生物素化并且固相用链霉抗生物素蛋白衍生化,
其中pH梯度为第一pH值至第二pH值,由此第一pH值为pH 3.5至pH 6.4并且第二pH值为pH 7.4至pH 9.5。
因此,本发明的另一个方面是FcRn亲和层析方法,所述方法包括以下步骤:
-将具有第一pH值并且包含至少含有Fc区的抗体或融合多肽的溶液施加到包含根据本发明的FcRn的FcRn亲和层析材料上,
-将具有从第一pH值至第二pH值的pH梯度的溶液施加到上一步的亲和层析材料上,以及
-确定所述抗体或融合多肽的洗脱,
其中该FcRn亲和层析材料包含与固相结合的根据本发明的FcRn,其中该FcRn被单生物素化并且固相用链霉抗生物素蛋白衍生化,并且
其中第一pH值为pH 3.5至pH 6.4,并且第二pH值为pH 7.4至pH 9.5。
使用如本文所报道的方法/用途,可以分开、分离和表征其体内性质密切相关(即,影响FcRn结合的单个氨基酸残基或有限数量的氨基酸残基存在不同)的抗体种类。
因此,如本文所报道的层析方法可以用于表征/鉴定影响FcRn相关半衰期的氨基酸位置。
因此,使用如本文所报道的方法,可以分离一种亲本抗体的不同变体并且确定这些变体之间的特定比率。这可以通过i)重组生产的FcRn固定在层析支持物上和ii)线性pH梯度的组合来实现。
具有FcRn结合减少的经修饰Fc区的抗体的保留时间较短,而具有FcRn结合增强的经修饰Fc区的抗体的保留时间比具有野生型Fc区的抗体的保留时间更长。
在一个实施方案中,该FcRn与固相结合。在一个实施方案中,固相为层析材料。在一个实施方案中,该FcRn是I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)和β2-微球蛋白(b2m)的非共价复合物并且被生物素化,固相用链霉抗生物素蛋白衍生化。
在一个实施方案中,β2-微球蛋白来自与所述FcRn相同的物种。
在一个实施方案中,所述抗体是融合多肽的单特异性抗体或抗体片段,或者融合多肽的双特异性抗体或抗体片段,或者融合多肽的三特异性抗体或抗体片段,或者融合多肽的四特异性抗体或抗体片段。
如本文所报道的示例性方法是用于选择具有预定的体内半衰期的抗体的方法,其中进行层析并且选择具有相对于野生型IgG1在给定保留时间窗内的保留时间的抗体。
FcRn亲和层析可以通过峰面积和保留时间曲线来区分IgG样品。FcRn亲和层析允许在体外分析FcRn与IgG之间的相互作用,并且可以深入了解治疗性IgG有关体内药代动力学的结构和功能完整性。
因此,突变体IgG和野生型IgG的FcRn亲和层析可以用于半定量地预测体内药代动力学。另外,FcRn亲和层析可以用于监测FcRn-IgG相互作用,例如用于IgG批次表征或用于可比性研究。
已经发现,标准化的pH梯度FcRn亲和液相层析方法的条件与IgG和FcRn之间的体内相互作用机制非常相似。例如,人FcRn固定在柱上作为亲和配体,并且应用线性pH梯度,例如pH 5.5至8.8。
例如,分析型FcRn亲和层析允许通过峰型和保留时间曲线对IgG样品和变体进行鉴定和表征。该方法可以区分:1)具有不同Fab片段的相同IgG,2)氧化IgG形式与非氧化IgG形式,3)单体的聚集体,以及4)在Fc区中具有变化的抗体。
已经发现,变体IgG(Fc区变体)的FcRn亲和层析分布相对于野生型IgG的变化预测了体内药代动力学分布。这些结果表明,FcRn亲和层析是有用的新方法,其用于表征FcRn-IgG相互作用、IgG完整性以及至多IgG本身。
如本文所报道的一个方面是根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为亲和层析配体的用途。
示例性亲和层析柱包括基质和基质结合的层析官能团,其特征在于基质结合的层析官能团包括根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn。
包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料的示例性用途是通过确定抗体的保留时间与参考抗体的保留时间的比率来确定抗体的体内半衰期。参考抗体可以是全长人IgG1抗体。
用于确定抗体相对于参考抗体的体内半衰期的示例性方法是通过确定在抗体和参考抗体的FcRn亲和柱上确定的保留时间的比率。
本发明的一个方面是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽的用途。
本文还报道了使用FcRn亲和层析来分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽的方法。
在一个实施方案中,分离选自纯化、生产和分析。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于将IgG1亚类的抗体与IgG3亚类的抗体分离的用途。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于确定抗体的甲硫氨酸氧化的用途。
示例性方法是使用如本文所报道的亲和层析方法来确定抗体Fc区中的氧化甲硫氨酸残基对FcRn结合的影响的方法。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于确定抗体的寡聚化水平的用途。
示例性方法是使用如本文所报道的亲和层析方法来确定抗体的寡聚化水平的方法。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的至少包含Fc区的FcRn结合部分的经修饰抗体或经修饰融合多肽的文库,以寻找与所述亲本抗体或亲本融合多肽相比,对FcRn的结合亲和力改变的那些经修饰抗体或经修饰融合多肽的用途。
示例性方法是用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的至少包含Fc区的FcRn结合部分的经修饰抗体或经修饰融合多肽的文库,以寻找与亲本抗体或亲本融合多肽相比,对FcRn的结合亲和力改变的那些经修饰抗体或经修饰融合多肽的方法,该方法包括以下步骤:
(a)将该文库的各个成员和亲本抗体或亲本融合多肽施加到如本文所报道的FcRn亲和层析柱上;
(b)用正线性pH梯度回收文库的各个成员并且确定各个保留时间;以及
(c)选择与亲本抗体或亲本融合多肽相比对FcRn的结合亲和力改变的那些抗体或融合多肽。
本文报道了用于从多肽混合物中纯化至少包含Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽的方法,该方法包括将所述混合物施加到如本文所报道的FcRn亲和柱上,以及用正线性pH梯度洗脱至少包含Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽,从而纯化所述抗体或融合多肽。在一个实施方案中,Fc区的FcRn部分属于人Fc区、小鼠Fc区,或食蟹猴Fc区。
在一个实施方案中,在第一pH值下将反应/生产混合物或者粗制或部分纯化的培养上清液施加到FcRn亲和柱上,并且在第二pH值下从该FcRn亲和柱回收所述抗体或融合多肽。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于鉴定至少包含Fc区的FcRn结合部分(例如,免疫球蛋白(诸如IgG1)的恒定结构域)的抗体或融合多肽的用途,所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体(FcRn)的结合发生改变。
示例性方法是用于鉴定至少包含Fc区的FcRn结合部分(例如,免疫球蛋白(诸如IgG1)的恒定结构域)的抗体或融合多肽的方法,所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体(FcRn)的结合发生改变。
当与亲本抗体或融合多肽相比或者与参考抗体或参考融合蛋白质相比时,此类经修饰的抗体或融合多肽表现出与FcRn的结合增加或减少,并且因此分别在血清中具有延长或缩短的半衰期。
预测对FcRn的亲和力增加(即,如本文所报道的,与亲本抗体或参考抗体相比,在FcRn柱上的保留时间增加,但仍然在pH 7.4的pH值之前洗脱)的Fc区变体与对FcRn的亲和力降低的那些Fc区变体相比具有较长的血清半衰期。对FcRn的亲和力增加的Fc区变体可应用于治疗哺乳动物(尤其是人)的方法中,其中期望施用的抗体或融合多肽具有长半衰期,诸如在治疗慢性疾病或疾患时。对FcRn的亲和力降低的Fc区变体可应用于治疗哺乳动物(尤其是人)的方法中,其中期望施用的抗体或融合多肽具有短半衰期,诸如在体内诊断成像时。
具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区变体很可能能够穿过胎盘,因此可以用于治疗怀孕妇女(尤其是胎儿)的疾病或疾患。此外,对于那些旨在施用/转运至脑、肾和/或肝的药物,可能需要降低的FcRn结合亲和力。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于鉴定表现出从脉管系统穿过肾小球上皮的转运减少的抗体或融合多肽的用途。
如本文所报道的包含经修饰Fc区的抗体或融合多肽可以表现出从脉管系统穿过肾小球上皮的转运减少。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于鉴定表现出从大脑穿过血脑屏障进入脉管空间的转运减少的抗体或融合多肽的用途。
如本文所报道的包含人源的经修饰Fc区的抗体或融合多肽可以表现出从大脑穿过血脑屏障(BBB)进入脉管空间的转运减少。
在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中,Fc区的至少一部分是人源的Fc区的至少一部分。在本文报道的所有方面的一个实施方案中,FcRn选自人FcRn、食蟹猴FcRn和小鼠FcRn。
在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中,β2-微球蛋白来自与α-FcRn相同的物种。
在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中,β2-微球蛋白来自与α-FcRn不同的物种。
在一个实施方案中,Fc区或Fc区的FcRn结合部分来源于任何同种型的重链。
在一个实施方案中,Fc区的至少一部分至少包含人源CH2结构域的氨基酸残基282-340(根据Kabat的编号)。在一个实施方案中,Fc区的至少一部分包含完整的CH2结构域(按照根据Kabat的EU编号,人源抗体重链多肽Fc区的约氨基酸残基231-340)。在一个实施方案中,Fc区的至少一部分至少包含CH2结构域,以及下列中的至少一者:铰链区(根据EU编号,人源抗体重链多肽Fc区的约氨基酸残基216-230)或CH3结构域(根据EU编号,人源抗体重链多肽Fc区的约氨基酸残基341-446)。在一个实施方案中,Fc区的至少一部分包含人源抗体重链的CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中,Fc区的至少一部分包含人源抗体重链Fc区的铰链、CH2结构域和CH3结构域。人源Fc区或者人源部分Fc区的FcRn结合部分可以来源于任何同种型的重链。在一个实施方案中,该人同种型为IgG1。
与靶标特异性结合的抗体可以通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如经纯化的抗原、包含此类抗原的细胞或细胞提取物,或者编码此类抗原的DNA)和任选地佐剂而在哺乳动物中产生。
在一个实施方案中,所述抗体为单克隆抗体。
一般来讲,该结合结构域与Fc区的至少一个FcRn结合部分的C末端或N末端融合。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于选择在pH 7.4的pH值下与所述FcRn结合的抗体以进行体内(共)靶向的用途。共靶向可以是内化。
在如本文所报道的所有方面的一个实施方案中,根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn与固相结合。
“固相”表示非流体物质,并且包括:由诸如聚合物、金属(顺磁性颗粒、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷等材料制成的颗粒(包括微粒和珠粒);凝胶物质,诸如二氧化硅凝胶、氧化铝凝胶和聚合物凝胶;毛细管,其可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成;沸石和其他多孔物质;电极;微量滴定板;实心条;以及比色皿、管或其他光谱仪样品容器。测定的固相组分与惰性固体表面的区别在于,“固体支持物”在其表面上包含至少一个部分,其旨在与分子发生化学相互作用。固相可以是固定组分,诸如芯片、管、条、比色皿或微量滴定板,或者可以是非固定组分,诸如珠粒和微粒。微粒也可以用作均相测定形式的固体支持物。可以使用允许蛋白质和其他物质非共价连接或共价连接的多种微粒。此类颗粒包括聚合物颗粒,诸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯);金颗粒,诸如金纳米颗粒和金胶体;以及陶瓷颗粒,诸如二氧化硅颗粒、玻璃颗粒和金属氧化物颗粒。参见例如Martin,C.R.等人,AnalyticalChemistry-News&Features,5月1日(1998)322A-327A。在一个实施方案中,所述固体支持物为琼脂糖凝胶。
根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn经由特异性结合对与固相缀合。根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn与生物素缀合,并且经由固体支持物固定的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白固定至固体支持物。
在如本文所报道的用途和方法中,通过线性梯度洗脱来回收与如本文所报道的FcRn亲和层析柱结合的抗体。线性梯度为pH梯度。
原则上,任何缓冲物质均可以用于如本文所报道的方法中。
通过定点诱变已经鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc残基(参见例如,Dall’Acqua,W.F.等人,J.Immunol 169(2002)5171-5180)。该相互作用涉及残基I253、H310、H433、N434和H435(根据Kabat的EU编号)(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533;Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993;Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。Dall’Acqua等人已经通过蛋白质-蛋白质相互作用研究将残基M252Y、S254T、T256E描述为用于改善FcRn结合(Dall'Acqua,W.F.等人,J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。对人Fc-人FcRn复合物的研究已表明,残基I253、S254、H435和Y436对于该相互作用至关重要(Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993;Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已经报道并且检查了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
在一个实施方案中,在FcRn亲和层析步骤或方法中使用了药用缓冲物质,诸如磷酸或其盐、乙酸或其盐、柠檬酸或其盐、吗啉、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或其盐、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)或其盐。
在一个实施方案中,该缓冲物质选自磷酸或其盐,或者乙酸或其盐,或者柠檬酸或其盐,或者组氨酸或其盐。
在一个实施方案中,该缓冲物质具有10mM至500mM的浓度。在一个实施方案中,该缓冲物质具有10mM至300mM的浓度。在一个实施方案中,该缓冲物质具有10mM至250mM的浓度。在一个实施方案中,该缓冲物质具有10mM至100mM的浓度。在一个实施方案中,该缓冲物质具有15mM至50mM的浓度。在一个实施方案中,该缓冲物质具有约20mM的浓度。
在一个实施方案中,具有第一pH值的溶液中的缓冲物质和具有第二pH值的溶液中的缓冲物质是相同的缓冲物质。
在一个实施方案中,具有第一pH值的溶液中的缓冲物质和具有第二pH值的溶液中的缓冲物质是不同的缓冲物质。
具有第一pH值的示例性溶液包含20mM MES和150mM NaCl,被调节至pH 5.5。
具有第二pH值的示例性溶液包含20mM TRIS和150mM NaCl,被调节至pH 8.8。
具有第二pH值的示例性溶液包含20mM HEPES,被调节至pH 8.6。
具有第二pH值的示例性溶液包含20mM TRIS,被调节至pH 8.2。
在一个实施方案中,该缓冲溶液包含额外的盐。在一个实施方案中,额外的盐选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾。在一个实施方案中,包含额外的盐的50mM至1000mM的缓冲溶液。在一个实施方案中,包含额外的盐的50mM至750mM的缓冲溶液。在一个实施方案中,包含额外的盐的50mM至500mM的缓冲溶液。在一个实施方案中,包含额外的盐的50mM至750mM的缓冲溶液。在一个实施方案中,包含额外的盐的约50mM至约300mM的缓冲溶液。
在一个实施方案中,所述具有第一pH值和/或第二pH值的溶液包含氯化钠。在一个实施方案中,所述具有第一pH值和/或第二pH值的溶液包含约50mM至约300mM的氯化钠。
因此,示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于检测FAB修饰的用途。在一个实施方案中,修饰为糖基化或电荷分布。
一般来讲,如本文所报道的方法和用途中的保留时间取决于pH梯度的陡度和所采用的盐浓度。使用野生型抗体作为参考,较弱的结合由较短的保留时间(=洗脱较早)指示,而较强的结合由较长的保留时间(=洗脱较晚)(但仍然在pH 7.4的pH值之前)指示。
已经发现,IgG的Fc部分的不同突变体在FcRn柱上表现不同,显示出改变的保留时间。
已经发现,使用如本文所报道的FcRn柱,可以鉴定与FcRn结合的相关氨基酸,并且与未经修饰的野生型抗体相比对突变体进行排序。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于鉴定与FcRn结合的相关氨基酸并且用于与未经修饰的野生型抗体相比对突变体进行排序的用途。
已经发现,显示从FcRn柱洗脱较晚的抗体(即,在FcRn柱上具有较长保留时间的抗体)在体内具有较长的半衰期。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于确定抗体的体内半衰期的用途。
已经发现,通过使用如本文所报道的FcRn柱可以实现IgG制剂中半抗体的分析和去除。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于从IgG制剂中去除半抗体的用途。
已经发现,寡聚体和聚集体可以通过如本文所报道的FcRn层析法来分离。
示例性用途是包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料用于从IgG制剂中去除抗体聚集体和抗体寡聚体的用途。
已经发现,保留时间受到分析物分子中所包含的Fc部分的数量的影响。
已经发现,氧化对FcRn结合有影响,并且可以在FcRn亲和层析柱上通过保留时间差来确定。
已经证实,抗体形式对与FcRn亲和层析柱的结合没有影响。因此,FcRn亲和层析柱可以用于评价新的抗体形式。
根据本发明的或用根据本发明的方法生产的某个FcRn是单生物素化的。
如本文所报道的包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以用于分离/分开抗体片段,并且因此提供了常规蛋白质A亲和层析的替代方案。此外,通过使用如本文所报道的层析材料,与常规蛋白质A亲和层析相比,可以在更多生理条件(诸如pH值)下实现分离。
包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以用于确定/分离/富集包含修饰(诸如氧化、电荷变化、糖基化和脱酰胺)的抗体种类。包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以根据所选择的pH梯度(起始/结束pH值)用于富集某些抗体种类。
包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以用于通过分子量的变化/差异来分离/富集抗体种类。
包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以用于通过分子中FcRn结合位点的数量来分离/富集抗体。
包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以用于分离氨基酸修饰。包含根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn作为配体的层析材料可以用于分离/分开双特异性抗体错配,诸如孔-孔二聚体和半抗体。
根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn的用途的示例性实施方案为:
1.根据本发明的或用根据本发明的方法生产的固定化FcRn在具有正线性pH梯度的亲和层析中作为亲和层析配体的用途。
2.根据项1所述的用途,其中该用途是在具有正线性pH梯度的亲和层析中用于分离至少包含Fc区的抗体或融合多肽。
3.根据项1至项2中任一项所述的用途,其中α-FcRn和β2m彼此独立地来源于人、来源于小鼠,或来源于食蟹猴。
4.根据项1至项3中任一项所述的用途,其中β2m来自与α-FcRn相同的物种。
5.根据项1至项4中任一项所述的用途,其中α-FcRn和β2m为人野生型α-FcRn和人野生型β2m,其各自彼此独立地具有0个至10个氨基酸残基修饰。
6.根据项1至项5中任一项所述的用途,其中根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn与固相结合。
7.根据项6所述的用途,其中固相为层析材料。
8.根据项6至项7中任一项所述的用途,其中根据本发明的FcRn或用根据本发明的方法生产的FcRn被生物素化,并且所述固相用链霉抗生物素蛋白衍生化。
9.根据项1至项8中任一项所述的用途,其中pH梯度为第一pH值至第二pH值,由此第一pH值为约pH 3.5至约pH 7.5并且第二pH值为约pH 6.0至约pH9.5。
10.根据项1至项9中任一项所述的用途,其中第一pH值为约pH 5.5,并且第二pH值为约pH 8.8。
11.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途是通过确定抗体的保留时间与参考抗体的保留时间的比率来确定抗体的体内半衰期。
12.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途用于确定抗体的甲硫氨酸氧化。
13.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途用于确定抗体的寡聚化水平。
14.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途用于筛选亲本抗体或亲本融合多肽的至少包含Fc区的FcRn结合部分的经修饰抗体或经修饰融合多肽的文库,以寻找与亲本抗体或亲本融合多肽相比,对FcRn的结合亲和力改变的那些经修饰抗体或经修饰融合多肽。
15.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途用于鉴定至少包含Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽,所述抗体或融合多肽表现出与新生儿Fc受体的结合发生改变。
16.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途用于从IgG制剂中去除一半抗体。
17.根据项1至项10中任一项所述的用途,其中所述用途用于从IgG制剂中去除抗体聚集体和抗体寡聚体。
18.根据项1至项17中任一项所述的用途,其中所述抗体是融合多肽的单特异性抗体或抗体片段,或者融合多肽的双特异性抗体或抗体片段,或者融合多肽的三特异性抗体或抗体片段,或者融合多肽的四特异性抗体或抗体片段。
19.根据项1至项18中任一项所述的用途,其中所述用途用于将IgG1亚类的抗体与IgG3亚类的抗体分离。
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明,本发明的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解,在不脱离本发明实质的前提下,可以对阐明的程序进行修改。
附图说明
图1:双质粒RMCE策略的方案,其涉及使用三个RRS位点同时实施两次独立的RMCE。
序列描述
SEQ ID NO:01:Avi标签
SEQ ID NO:02:HisAvi标签
SEQ ID NO:03:不带标签、无前导肽的人α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:04:带标签、无前导肽的人α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:05:不带标签、有前导肽的人α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:06:带标签、有前导肽的人α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:07:无前导肽的人β2m
SEQ ID NO:08:有前导肽的人β2m
SEQ ID NO:09:不带标签、无前导肽的食蟹猴α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:10带标签、无前导肽的食蟹猴α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:11:不带标签、有前导肽的食蟹猴α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:12:带标签、有前导肽的食蟹猴α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:13:无前导肽的食蟹猴β2m
SEQ ID NO:14:有前导肽的食蟹猴β2m
SEQ ID NO:15:不带标签、无前导肽的鼠α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:16:带标签、无前导肽的鼠α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:17:不带标签、有前导肽的鼠α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:18:带标签、有前导肽的鼠α-FcRn细胞外结构域
SEQ ID NO:19:无前导肽的鼠β2m
SEQ ID NO:20:有前导肽的鼠β2m
SEQ ID NO:21:大肠杆菌BirA的示例性序列
SEQ ID NO:22:L3重组酶识别序列的示例性序列
SEQ ID NO:23:2L重组酶识别序列的示例性序列
SEQ ID NO:24:LoxFas重组酶识别序列的示例性序列
SEQ ID NO:25-27:人CMV启动子的示例性变体
SEQ ID NO:28:示例性SV40多聚腺苷酸化信号序列
SEQ ID NO:29:示例性bGH多聚腺苷酸化信号序列
SEQ ID NO:30:示例性hGT终止子序列
SEQ ID NO:31:示例性SV40启动子序列
SEQ ID NO:32:示例性GFP核酸序列
实施例:
实施例1
一般技术
重组DNA技术
使用标准方法来操纵DNA,如在Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。
DNA序列测定
DNA测序在SequiServe GmbH(Vaterstetten,Germany)进行
DNA和蛋白质序列分析及序列数据管理
EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套件)软件包和Invitrogen的Vector NTI 11.5版用于序列创建、映射、分析、注释和图示。
实施例2
靶向整合载体的克隆
为了产生稳定的CHO TI池来生产可溶性的人FcRn、鼠FcRn和食蟹猴FcRn,必须设计和克隆质粒。TI载体的克隆分两个克隆步骤进行。在第一个步骤中,在hCMV启动子的控制下,将FcRnα-链和β2-微球蛋白的基因合成克隆到前载体中。两个表达盒都以来自牛生长激素的多聚腺苷酸化信号结束(BGH多聚(A))。
在第二个克隆步骤中,将先前克隆的前载体的表达盒克隆到最终的TI载体中。最终的TI载体包含具有His-Avi标签的FcRnα链的表达盒,以及β2-微球蛋白的表达盒。
鼠FcRn的TI质粒和食蟹猴FcRn的TI质粒以类似于人FcRn的方式进行克隆。
通过基因合成(Geneart,Life Technologies Inc.)为所有三个物种产生了编码具有His-Avi标签的FcRnα链以及β2m的细胞外结构域的cDNA。在37℃下用HindIII-HF和EcoRI-HF(NEB)将基因合成载体和骨架载体消化1小时,并且通过琼脂糖凝胶电泳分离。从琼脂糖凝胶切下插入物和骨架的DNA片段,并且通过QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取。经纯化的插入物片段和骨架片段经由快速连接试剂盒(Roche),按照制造商的方案以3:1的插入物/骨架比连接。然后经由在42℃下热激30秒将连接方法转化到感受态大肠杆菌DH5α中,并且在37℃下温育1小时,之后将它们铺板在含有氨苄青霉素的琼脂平板上以供选择。在37℃下将平板温育过夜。
第二天,挑取克隆并且在37℃下振荡温育过夜,以进行最小量制备或最大量制备,这两种制备分别是用5075(Eppendorf)或QIAprep Spin Mini-Prep试剂盒(Qiagen)/NucleoBond Xtra Maxi EF试剂盒(Macherey&Nagel)来进行的。对所有构建体进行测序,以确保不存在任何不需要的突变(SequiServe GmbH)。
在第二个克隆步骤中,用KpnI-HF/SalI-HF和SalI-HF/MfeI-HF消化先前克隆的载体,条件与第一次克隆相同。用KpnI-HF和MfeI-HF消化TI骨架载体。如上所述进行分离和提取。按照制造方案,使用T4 DNA连接酶(NEB)以1:1:1的插入物/插入物/骨架比在4℃下过夜,来将经纯化的插入物和骨架连接,并且在65℃下灭活10min。如上所述进行以下克隆步骤。
克隆的质粒用于TI转染和池生成。
实施例3
BirA扩增和克隆
对于体内生物素化,设计并克隆了载体,其除了包含FcRnα链和β2m之外,还包含催化生物素化的BirA基因。最终的TI载体也分两个步骤克隆。在第一个步骤中,通过PCR扩增BirA基因,用HindIII-HF/EcoRI-HF(NEB)消化,并且如实施例2中所述克隆到骨架载体中。
在第二个步骤中,用限制性内切酶消化用于α-FcRn、β2m和BirA连接酶的质粒,并且将这些质粒克隆到相应的TI载体中(参见实施例2)。然后将最终的质粒用于TI转染和池生成。
实施例4
TI转染和池生成
CHO宿主细胞系的转染通过MaxCyte的Flow技术进行。因此,对于每种方法将3×10E7个细胞离心,并且弃去上清液。将总共30μg DNA(25μg质粒和5μg重组酶质粒)添加到细胞中,并且将所有样品与电加载缓冲液(Hyclone,MaxCyte)混合。经由MaxCyte电穿孔进行转染。转染后将细胞转移到摇瓶中,并且在37℃下静置温育30min。添加30mL回收培养基,并且将培养物短暂涡旋。将细胞在37℃、100rpm、5%CO2和85%湿度下温育。转染两天后,进行转染效率FACS,并且将细胞扩增到65mL回收培养基中。
在第5天,通过培养基交换开始选择。因此,将6×10E5个细胞/ml离心并且重悬在80ml选择性培养基I(化学成分确定的培养基,选择性标记1和2)中。从这一天起,将细胞在37℃、150rpm、5%CO2和85%湿度下温育,其间细胞不分裂。
为了促进细胞的回收,如果存活率>40%并且活细胞密度(VCD)>0.5×10E6个细胞/mL,则降低选择压力。因此,将4×10E5个细胞/ml离心并且重悬在40ml选择性培养基II(化学成分确定的培养基,1/2选择性标记1和2)中。将细胞在与之前相同的条件下温育,并且也不分裂。
在存活率>80%时,进行RMCE效率FACS,并且通过每三天或每四天在40mL中分裂成4×10E5个细胞/mL来将细胞传代。当存活率>95%时,建立摇瓶生产。
通过CEDEX分析仪在整个过程中检查存活率和活细胞密度(VCD)。
实施例5
FACS筛选
进行FACS分析以检查转染效率和转染的RMCE效率。将转染方法的4×10E5个细胞离心(1200rpm,4min),并且用1mL PBS洗涤两次。在用PBS进行的洗涤步骤之后,将沉淀物再悬浮于400μL PBS中并且转移到FACS管(带细胞滤网帽的圆底试管;Corning)中。使用FACS Canto II进行测量,并且通过软件FlowJo分析数据。
实施例6
分批补料式摇瓶生产
分批补料式生产在摇瓶中进行。因此,将细胞以1×10E6个细胞/mL的密度接种在40mL成分确定的培养基(分批补料式培养基I)中。在第3天、第7天和第10天对细胞补料。存活率测量和VCD测量由CEDEX分析仪进行。在分批补料开始后14天,通过离心(10min,1000rpm,以及10min,4000rpm)收获上清液,并且通过过滤(0.22μm)使其澄清。
使用第二种化学成分确定的培养基(分批补料式培养基II)进行第二次分批补料。因此,将细胞以2×10E6个细胞/mL的密度接种在30mL培养基中。从第3天开始,对细胞补料。在第3天、第5天、第7天、第10天、第12天和第14天测量葡萄糖浓度,如果浓度<7g/L,则储存至10g/L的浓度。另外,在测定葡萄糖浓度的那些天测定生物素浓度,以避免缺乏生物素。存活率测量和VCD测量由CEDEX分析仪进行。在分批补料开始后14天,通过离心(10min,1000rpm,以及10min,4000rpm)收获上清液,并且通过过滤(0.22μm)使其澄清。
实施例7
HEK293F中人FcRn的瞬时转染
在HEK293F细胞中用人FcRn进行瞬时转染。HEK293F细胞在转染当天以2.6×10E6个细胞/mL的密度接种。将20μg DNA与1.6mL Opti-Mem混合(40ml)并且温育5min。将50μlPEIpro添加到DNA/培养基混合物中并且再温育8min。将DNA/培养基/PEIpro混合物缓缓地添加到细胞中,并且将细胞在37℃、120rpm、7%CO2和80%湿度下温育。转染后5小时添加丙戊酸。转染后24小时,用葡萄糖和饲料对细胞补料。在第7天,通过离心(5min 1000rpm,20min 4000rpm)收获细胞,并且通过过滤(0.22μm)使其澄清。
实施例8
FcRn的纯化
所有三个物种的FcRn都用HisAvi标签来标记。该标签用于纯化FcRn。在第一个纯化步骤中,将来自分批补料的澄清上清液上样到Ni-NTA亲和层析柱(5ml HiTrap NiSepharose,GE Healthcare)上。在用含有500mM NaCl且处于pH 7.4下的20mM磷酸钠缓冲液(缓冲液A)进行两个洗涤步骤之后,第一次洗涤中没有咪唑,第二次洗涤中含有20mM咪唑,用含有300mM咪唑的相同缓冲液以3ml/min的流速将蛋白质洗脱。洗脱采用咪唑浓度为4%、60%和100%的分步洗脱进行。每次运行后都使用缓冲液A来使该柱再生。
将级分合并并且浓缩(Ultra 15ml,Millipore)至小于9ml的体积,之后通过尺寸排阻色谱(SEC,SuperdexTM 200,GE Healthcare)将其进一步纯化。以3ml/min的流速将样品进样,并且在pH 5.5的20mM柠檬酸钠、150mM KCl缓冲液中以相同的流速洗脱。
使用Nanodrop分光光度计(Nanodrop Technologies)对经纯化的蛋白质进行定量,并且在每个纯化步骤之后,通过分析型SEC(SuperdexTM 75,GE Healthcare)和CE-SDS(Caliper life science,PerkinElmer Company)在非还原条件和还原条件下进行分析。
分析型SEC用50μg样品在高效液相色谱(HPLC)上进行,并且通过Chromeleon 7.2软件进行分析。
对于CE-SDS,将样品与对应的样品缓冲液混合物(Caliper Life Sciences)混合(5μL样品,35μl样品缓冲液),并且对于还原条件,将5μL NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)添加到30μL样品缓冲液中,并且还与5μL样品混合。然后将样品在70℃下加热10min,并且添加70μl Milli-Q水。用Caliper LabChip GXII系统测量样品。
实施例9
经纯化FcRn的生物素化
为了将FcRn联接到链霉抗生物素蛋白琼脂糖凝胶珠粒,使用来自Avidity的生物素化试剂盒,根据制造商的说明将15mg经纯化的FcRn生物素化。该反应在30℃和300rpm下进行过夜。经由SEC(SuperdexTM 200,GE Healthcare)将生物素化蛋白质纯化,以去除过量生物素。因此,以2.5ml/min的流速将样品进样,并且用相同的缓冲液以3ml/min的流速洗脱。将级分合并并且浓缩(Ultra 15ml,Millipore)。生物素化蛋白质通过Nanodrop分光光度计定量,并且经由CE-SDS(Caliper life science,PerkinElmerCompany)和分析型SEC(SuperdexTM 75,GE Healthcare)进行分析。
链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用用于确定这些方法的生物素化水平。样品与链霉抗生物素蛋白(SA)1:1提供(50μg样品和链霉抗生物素蛋白),并且进行分析型SEC(SuperdexTM 75,GE Healthcare)。通过链霉抗生物素蛋白与生物素化分子的结合,分子量增加了约52kDa。因此,SEC可以区分经转化的FcRn(其被生物素化并且与SA相互作用)和未经转化的FcRn(其未被生物素化)。生物素化水平由经转化的FcRn与未经转化的FcRn之比确定。
实施例10
FcRn柱制备
经纯化和生物素化的FcRn经由生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用与珠粒结合。因此,将1mL琼脂糖凝胶链霉抗生物素蛋白珠粒(GE Healthcare)用H2O洗涤,然后在pH 5.5的20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、140mM NaCl(缓冲液A)中缓冲。随后将生物素化FcRn添加到制备的琼脂糖凝胶链霉抗生物素蛋白珠粒中,并且通过旋转温育过夜。将FcRn衍生的珠粒填充到4.6mm×50mm色谱柱(Tricorn 5/50柱,GE Healthcare)中,然后用缓冲液A平衡。为了测试填充柱的质量,将标准品应用于该柱。如果标准品显示典型的色谱图,则该柱可以用于进一步的测量。使用氧化的mAb作为标准品。在黑暗中和室温下用0.01%(体积/体积)H2O2将该抗体氧化18小时。先测试氧化质量,之后将mAb-ox透析过夜。
实施例11
FcRn亲和层析
将FcRn亲和柱用于HPLC系统上。柱温为25℃。将该柱用pH 5.5的20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、140mM NaCl(缓冲液A)以0.3ml/min平衡。随后将30μg各样品以pH 5.5的100μl His-His/HCl缓冲液体积,在独立运行中进样到FcRn柱上。将样品用pH 8.8的100%20mM Tris、140mM NaCl(缓冲液B)的连续梯度以0.5ml/min的流速洗脱。每次运行后都使用缓冲液A来使该柱再生,以使pH为6.0。在层析序列的开始和结束时将标准品进样。如果运行的样品超过10个,则每10个样品后进样一个标准品。通过连续测量280nm处的吸光度获得洗脱曲线。此外,在洗脱期间记录pH,以确定样品洗脱时的准确pH。
Claims (9)
1.一种用于生产C末端生物素化FcRn的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在含有生物素的培养基中培养包含编码FcRn和生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶(BirA)的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞,以及
b)从所述细胞或所述培养基中回收C末端生物素化FcRn,
其中所述编码FcRn和BirA的脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5’至3’方向上包含
-编码在C末端包含Avi标签的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第一表达盒,
-编码β2-微球蛋白(β2m)的第二表达盒,
-编码在C末端包含Avi标签的I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)的第三表达盒,
-编码β2-微球蛋白(β2m)的第四表达盒,以及
-编码生物素-[乙酰辅酶A羧化酶]连接酶的第五表达盒。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述编码FcRn和BirA的脱氧核糖核酸还包含
-位于所述第一表达盒的5’的第一重组识别序列,
-位于所述第五表达盒的3’的第二重组识别序列,以及
-位于所述第二表达盒与所述第三表达盒之间的第三重组识别序列,并且
其中所有重组识别序列都不同。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法,其中所述编码FcRn和BirA的脱氧核糖核酸包含编码选择性标记的另外的表达盒,并且编码所述选择性标记的所述表达盒部分地位于所述第三重组识别序列的5’并部分地位于所述第三重组识别序列的3’,其中所述表达盒的位于5’的部分包含启动子和起始密码子,并且所述表达盒的位于3’的部分包含没有起始密码子和多聚A信号的编码序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中所述表达盒中的每一者在5’至3’方向上包含启动子、编码序列和多聚腺苷酸化信号序列,任选地随后是终止子序列。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子,所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚A位点,并且所述终止子序列为除所述选择性标记的所述表达盒外的hGT终止子,其中所述启动子为SV40启动子,并且所述多聚腺苷酸化信号序列位点为SV40多聚A位点并且不存在终止子序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述FcRn为人FcRn,所述I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为人I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述β2-微球蛋白(β2m)为人β2-微球蛋白(β2m)。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述FcRn为鼠FcRn,所述I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为鼠I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述β2-微球蛋白(β2m)为鼠β2-微球蛋白(β2m)。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述FcRn为食蟹猴FcRn,所述I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn)为食蟹猴I类主要组织相容性复合物样蛋白质(α-FcRn),并且所述β2-微球蛋白(β2m)为食蟹猴β2-微球蛋白(β2m)。
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