JP7246729B2 - 脊髄小脳変性症36型の予防又は治療用組成物 - Google Patents
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Description
核酸医薬品とは、一般に、「核酸あるいは修飾型核酸が直鎖状に結合したオリゴ核酸を薬効本体とし、タンパク質を介さずに直接生体に作用し得るもので、化学合成により製造される医薬品」のことである。核酸医薬品のうち、細胞内部で機能するものとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド(以降、ASOと略記する場合がある)やsiRNAが挙げられ、既に複数のASOが医薬品として承認されている。
Gapmer型ASOとは、RNaseHによる標的RNAの切断を誘導し得るASOである。RNaseHは、細胞内に普遍的に存在し、DNA/RNA二重鎖構造を認識して該RNAを切断するエンドリボヌクレアーである。そのため、Gapmer型ASOは、標的RNAにハイブリダイズしてDNA/RNA二重鎖構造を安定に形成できるように、中央にデオキシリボヌクレオチドからなる領域を有し、その両側にヌクレアーゼ耐性の修飾ヌクレオチドを配した構造を一般に有する。
これに対し、Block型ASOとは、RNaseHによる標的RNAの切断を誘導することなく、標的RNAに結合することでその機能を阻害し得るASOである。代表的なものとしては、標的RNAのスプライシング制御部位に結合して該RNAのスプライシングパターンを変化させるスプライシング制御型や、miRNAに結合して該miRNAの(他のRNAとの)ハイブリダイゼーション能力をブロックするmiRNA阻害型等が挙げられる。
さらに、前記RNA fociは、当該リピート領域に他のRNAやタンパクが結合して凝集化したものであるため、該リピート領域に結合し得るASOの投与は凝集化を一段と促進するものと懸念されていた。
[1] 配列番号2で表される配列が1回以上連続した配列を有し、NOP56遺伝子のpre-mRNAと相補的なオリゴヌクレオチドであって、
前記pre-mRNAにハイブリダイズして形成される構造体がRNaseH耐性であること、
を特徴とするオリゴヌクレオチド。
[2] デオキシヌクレオシドを4ヌクレオシド以上連続して含まないことを特徴とする、前記[1]に記載のオリゴヌクレオチド。
[3] 糖部修飾ヌクレオシドを全ヌクレオシド中20%以上含むことを特徴とする、前記[1]又は[2]に記載のオリゴヌクレオチド。
[4] 前記糖部修飾ヌクレオシドが、2’位修飾型ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、及び置換型ヌクレオシドから選ばれる1種以上の糖部修飾ヌクレオシドである、前記[3]に記載のオリゴヌクレオチド
[5] 前記2’位修飾型ヌクレオシドが、2’-フルオロヌクレオシド、2’-O-メチルヌクレオシド、及び2’-O-メトキシエチルヌクレオシドから選ばれる1種以上の2’位修飾型ヌクレオシドである、前記[4]に記載のオリゴヌクレオチド。
[6] 前記架橋型ヌクレオシドが、BNA、ENA、LNAから選ばれる1種以上の架橋型ヌクレオシドである、前記[4]に記載のオリゴヌクレオチド。
[7] 前記置換型ヌクレオシドが、モルフォリノである、前記[4]に記載のオリゴヌクレオチド。
[8] 少なくとも1以上の修飾されたヌクレオシド間結合を有する、前記[1]-[6]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
[9] 前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、前記[8]に記載のオリゴヌクレオチド。
[10] 18-30ヌクレオチドからなることを特徴とする、前記[1]-[9]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
[11] 配列番号4または10で表される塩基配列を有することを特徴とする、前記[1]-[10]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
[12] 前記[1]-[11]のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、脊髄小脳変性症36型の予防又は治療用組成物。
脊髄小脳変性症36型(SCA36と略記する場合がある)は、脊髄小脳変性症に典型的な小脳性失調に加えて、舌萎縮や筋繊維の群萎縮といった筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis:ALS)に似た運動ニューロン徴候も認められることから、脊髄小脳変性症と運動ニューロン疾患の交差点的な疾患として注目を集めている常染色体優性遺伝型の神経変性疾患である。日本の研究者によって見出され、nucleolar protein 56(NOP56と略記)タンパク(NP_006383)をコードするNOP56遺伝子のイントロン1内に存在するGGCCTGリピートが異常伸長していることが原因であることが明らかにされた。当該リピート数は、健常人では約3-14の範囲内だが、SCA36型患者では約650-2,500にも伸長しており、他のリピート病(例として、C9ORF72遺伝子内のGGGGCCリピートの異常伸長を原因とするALS/FTD)と比較して、健常者と患者のリピート数の差が大きいことも特徴である(非特許文献1-3)。
本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、SCA36型変異を有するヒトニューロン内で自発的に生じるRNA foci(SCA36型RNA fociと呼ぶ場合がある)の形成を、NOP56 pre-mRNAの切断を誘導することなく、効果的に抑制し得るものである。ここで、SCA36型変異とは、NOP56遺伝子のイントロン1内に存在するGGCCTG(配列番号1)配列の繰り返し数(リピート数)が異常に増加した変異のことをいい、本願においては、当該リピート数が600以上のものを異常とする。よって、SCA36型RNA fociとは、ヒトNOP56 pre-mRNA内のイントロン1内の異常伸長したGGCCTGリピート領域を核として形成されるRNA fociのことである。本願では、SCA36型RNA fociを、単にRNA fociと呼ぶ場合がある。
さらに、安定性向上の観点から、本発明にかかるオリゴヌクレオチドは、NOP56 pre-mRNAへの結合を阻害しない範囲内で修飾されていることが好ましい。そのような修飾の例として、糖部修飾及び塩基部修飾が挙げられる。
2’位修飾型ヌクレオシドの例としては、糖の2’位のOH基が、H、OR、R、SH、SR、NH2、NHR、NR2、CN、及びHalogenから選択される基で置換されたヌクレオシドが挙げられる。前記Rは、C1-C6、好ましくはC1-C6のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、又はアルキニル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、メトキシエチル基、アミノ基、アミノプロピル基、又はイソプロピル基である。また、前記Halogenは、好ましくはF、Cl、Br、又はIであり、特に好ましくはFである。
このうち、2’-フルオロ、2’-O-メチル、又は2’-O-メトキシエチル修飾されたヌクレオシドを特に好適に用いることができる。
このうち、LNA、ENAが特に好ましく、最も好ましくはENAである。
そのような塩基配列の例として、配列番号10で表される塩基配列を挙げることができる。本発明には、配列番号10で表される塩基配列を有し、上記糖部修飾及び/または塩基部修飾を受けたオリゴヌクレオチドを好適に用いることができる。当該好適なオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号10で表されるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明にかかるSCA36型の予防又は治療用組成物は、前記SCA36型RNA fociを効果的に抑制するASOを有効成分として含むものである。本発明にかかる組成物は、前記有効成分の他に、医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント等を含むことができ、通常の製薬に用いられる方法によって製造することができる。
これらの薬物送達用ナノ粒子は、当業者に周知の方法に従って製造することが可能である。
PLGAナノ粒子の製造と本発明にかかる有効成分の該粒子への封入は、例えば、特許4340744号に記載された方法に従って行っても良い。PLGAナノ粒子は、生体適合性、生体内分解性、及び徐放性に非常に優れることから、前述した本発明にかかる有効成分を内包するPLGAナノ粒子の分散液は、吸入薬剤、筋注薬剤、ステント等として用いることも可能である(Tsukada Y., et al, New Developments in Polyactic Acid Research, published by Nova Science Publishers、 Chapter 6、pp153-182、2015;塚田雄亮他、PLGAナノ粒子が拓く新たなDDS製品の開発と実用化、医薬ジャーナル、第50巻、第73-80頁、2014年、参照のこと)。
本発明にかかるSCA36型の予防又は治療用組成物は、当該分野において公知の方法を用いて患者に投与することができる。例えば、前記液体の組成物を、静脈注射や輸液によって全身投与してもよく、又は、定位固定注射、ニードルやカテーテル、浸透圧ポンプやインフュージョンポンプ、薬剤溶出型ステント等を用いて脳室又は髄腔内に局所的に投与してもよい。さらに、本発明にかかる組成物が前記有効成分をウイルスベクターにコードされる状態で含む場合には、筋肉(好ましくは骨格筋)への定位固定注射によって投与してもよい。
なお、本発明における“健常者”とは、SCA36型に罹患していない者の意である。
本発明にかかる組成物は、NOP56遺伝子のイントロン1内のGGCCTGリピートが異常伸長(具体的には、600回以上)しているヒトに対し、予防又は治療薬として好適に投与することができる。
本発明においてニューロンとは、β-III tubulin等のニューロンのマーカー遺伝子を1以上発現し、且つ、神経突起(β-III tubulin陽性の突起(ニューライト))を有する細胞と定義される。また、本発明において運動ニューロンとは、Islet1、SMI32等の運動ニューロンのマーカー遺伝子を1以上発現するニューロンと定義される。さらに本発明では、細胞体が肥厚したニューロン、運動ニューロンを、各々、成熟ニューロン、成熟運動ニューロンと呼ぶ場合がある。
RNA foci陽性細胞の検出は、配列番号14(CCAGGCCCAGGCCCAG)で表される塩基配列を有し、5’末端がCy3で蛍光標識された2',4'-BNA(2',4'-BridgedNucleicAcid,LNA)からなるオリゴヌクレオチド(Gene Design社製)をプローブとして、FISH(fluorescence in situ hybridization)法により行った。当該オリゴヌクレオチドは、NOP56遺伝子のpre-mRNAのイントロン1内のGGCCUGリピートを含む領域に相補的であり、SCA36型患者の剖検組織におけるRNA fociの検出に用いられたものである。陰性コントロールとしては、当該プローブと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブ(以降、陰性コントロールプローブと呼ぶ)を用いた。
RNase処理をする場合には、前記固定を行った後、細胞を50 μg/mlとなるようにDNase-free RNase A(Roche社製)を添加し、37℃で1.5時間インキューベーションした。
解析では、直径が0.60μm以上のCy3シグナルをRNA fociとしてキャプチャーし、IN CELL Developer toolbox software 1.92を用いてRNA foci陽性細胞数を自動的に計測した。本願では、前記RNA fociを1以上有する細胞を、RNA foci陽性細胞とする。なお、この方法で検出されるRNA fociはすべてDAPIシグナル内にあったことから、核内に生じたRNA fociであると考えられる。
ASOは、健常者またはSCA36型患者由来iPSNの培養系に、終濃度が400 nMとなるように添加し、AmaxaTM 4D-NucleofectorTM(LONZA社製)を用いたエレクトロポーレーション法によって導入した。導入後48時間培養を行い、各種の解析を行った。実施例で使用したASOの配列を表1に示す。
ヒト健常者由来iPSCは、理化学研究所バイオリソースセンター(http://ja.brc.riken.jp/)から入手したもの(Cntrol-1,2)、及びMishimaらの方法(Mishima T, Ishikawa, T, Imamura, K, Kondo, T, Koshiba, Y, Takahashi, R, et al. (2016). Cytoplasmic aggregates of dynactin in iPSC-derived tyrosine hydroxylase-positive neurons from a patient with Perry syndrome. Parkinsonism Relat Disord 30: 67-72.AC)に従って製造したもの(Cntrol-3)を用いた。
SAC36型患者由来iPSC(SAC36-1~SAC36-3)は、Okitaらの方法(Okita, K, Yamakawa, T, Matsumura, Y, Sato, Y, Amano, N, Watanabe, A, et al. (2013). An Efficient Nonviral Method to Generate Integration-Free Human-Induced Pluripotent Stem Cells from Cord Blood and Peripheral Blood Cells. Stem Cells 31: 458-466.)に従って製造した。
本書では、以降、前記方法に従ってControl-iPSC、SCA36-iPSCからニューロンへと分化誘導した細胞を、Control-iPSN、SCA36-iPSNと各々呼ぶ場合がある。
SCA36-iPSNについて、患者におけるニューロンと同様にRNA fociが生じるかどうか、手法1に従って解析した。結果を図2に示す。
図2a上段パネルに示されるように、Control-iPSNでは、3名の健常者に由来するいずれのiPSNにおいても、プローブに由来するシグナルは実質的に検出されなかった。すなわち、健常者由来ニューロンでは、NOP56遺伝子のpre-mRNAのGGCCUGリピート領域を核とするRNA fociは生じないことが確認された。
よって、SCA36患者由来iPSCから分化誘導して得られるニューロン及び運動ニューロンでは、NOP56 pre-mRNA内のGGCCUGリピート領域を核とするRNA fociが自発的に生じることが明らかとなった。
よって、前記SCA36-iPSNで検出されたプローブ由来の蛍光シグナルは、該プローブがNOP56 pre-mRNA内のGGCCUGリピート領域にハイブリットすることで生じたものであり、NOP56遺伝子(すなわち、DNA)にハイブリットすることで生じたものではないことが確認されている。
次に、SCA36-iPSNにおいて自発的に生じるRNA fociを、効果的に抑制し得るASOの検討を行った。
表2に記載した5種類のASO(ASO-A~E)を[手法2]に従ってControl-iPSN、SCA36-iPSNに導入し、[手法1]に従ってRNA fociの有無を解析した。各ASOの標的部位を図3aに示す。図3a及び表1からわかるように、ASO-AとASO-Bは、GGCCUG配列に相補的な塩基配列(配列番号2)が連続して繰り返した配列からなるので、当該リピート領域内に複数分子が結合し得るものである。これに対し、ASO-C~ASO-Eは、NOP56 pre-mRNA内の特定部位に1分子のみ結合し得るものである。そして、ASO-AのみがBlock型で、ASO-B~ASO-EはGapmer型である。
表1及び図4aからわかるように、ASO-F~Hは、モルフォルノ修飾されているのでRNaseHによる標的RNAの切断を誘導せず、且つ、NOP56 pre-mRNAに1分子しか結合し得ないASOである。このうち、ASO-Fは、GGCCUG配列に相補的な塩基配列(配列番号2)を1つだけ有し、NOP56 pre-mRNAの当該リピート領域の開始部位に結合するASOである。そして、ASO-GとASO-Hは、GGCCUG配列に相補的な塩基配列(配列番号2)を有さないので、NOP56 pre-mRNAの当該リピート領域以外の部分に結合するASOである。
よって、GGCCUG配列に相補的な塩基配列(配列番号2)を1つ以上含み、当該リピート領域の開始部位を標的とするASOであれば、NOP56 pre-mRNAに1分子しか結合しないBlock型であっても、RNA foci形成を効果的に阻害できることが示された。
Claims (7)
- 配列番号2で表される塩基配列が1回以上連続した塩基配列を有し、NOP56遺伝子のpre-mRNAと相補的なオリゴヌクレオチドであって、
配列番号:4で表される塩基配列を有し、
配列番号:4で表される塩基配列中の1-3位、7-9位、13-15位および19-20位のヌクレオシドがENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)であり、4-6位、10-12位および16-18位のヌクレオシドが2’-O-メチルリボヌクレオシドであり、
デオキシヌクレオシドを4ヌクレオシド以上連続して含まず、
前記pre-mRNAにハイブリダイズして形成される構造体がRNaseH耐性であること、および
該オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合はすべてホスホロチオエート結合であること
を特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 糖部修飾ヌクレオシドを全ヌクレオシド中20%以上含むことを特徴とする、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記糖部修飾ヌクレオシドが、2’位修飾型ヌクレオシド、架橋型ヌクレオシド、及び置換型ヌクレオシドから選ばれる1種以上の糖部修飾ヌクレオシドである、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記2’位修飾型ヌクレオシドが、2’-フルオロヌクレオシド、2’-O-メチルヌクレオシド、及び2’-O-メトキシエチルヌクレオシドから選ばれる1種以上の2’位修飾型ヌクレオシドである、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記架橋型ヌクレオシドが、BNA、ENA、LNAから選ばれる1種以上の架橋型ヌクレオシドである、請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- 20-30ヌクレオチドからなることを特徴とする、請求項1-5のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1-6のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、脊髄小脳変性症36型の予防又は治療用組成物。
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