JP7246680B2 - クロマトグラフ及びクロマトグラフィの定量方法 - Google Patents
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Description
本発明は、液体クロマトグラフ、ガスクロマトグラフなどのクロマトグラフ及びクロマトグラフィの定量方法に関する。
従来、液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）等のクロマトグラフィの定量分析として、外部標準法と内部標準法が知られている。このうち、内部標準法は、クロマトグラフの感度や状態の日々の変化、サンプル注入量の変動、溶媒の揮発等による誤差を防止し、外部標準法より定量精度が高いとされている。
なお、JISK0214:2013には、クロマトグラフィに関する用語が規定されている。
この内部標準法では、濃度が既知の測定物質と一定濃度の（内）標準物質とを含む試料を、測定物質の濃度を種々変えて測定し、測定物質の強度と内部標準の強度との強度比と、測定物質の濃度との関係を一次式で表した検量線を得て、検量線により未知試料を定量している（特許文献１）。
なお、JISK0214:2013には、クロマトグラフィに関する用語が規定されている。
この内部標準法では、濃度が既知の測定物質と一定濃度の（内）標準物質とを含む試料を、測定物質の濃度を種々変えて測定し、測定物質の強度と内部標準の強度との強度比と、測定物質の濃度との関係を一次式で表した検量線を得て、検量線により未知試料を定量している（特許文献１）。
ところで、内部標準法では、未知試料の測定に際しても一定濃度の標準物質を試料に添加する必要があるが、一定濃度の標準物質を秤量する操作が煩雑かつ熟練を要すると共に、標準物質の秤量が不正確であると却って定量精度が低下するという問題がある。
そこで、本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、内部標準法による検量線を用いつつも、未知試料に標準物質を添加する作業を不要とし、測定を簡易にすると共に定量精度の低下を抑制したクロマトグラフ及びクロマトグラフィの定量方法の提供を目的とする。
そこで、本発明は上記の課題を解決するためになされたものであり、内部標準法による検量線を用いつつも、未知試料に標準物質を添加する作業を不要とし、測定を簡易にすると共に定量精度の低下を抑制したクロマトグラフ及びクロマトグラフィの定量方法の提供を目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明のクロマトグラフは、制御部と、記憶部とを備え、所定の測定対象を定量するクロマトグラフであって、前記記憶部は、前記測定対象に所定濃度の内部標準を加えて求められ、前記測定対象の強度と前記内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による検量線データを記憶し、前記所定濃度の前記内部標準を含むＱＣサンプルのクロマトグラムと、濃度未知の前記測定対象を含み前記内部標準を含まない未知試料のクロマトグラムとを測定したとき、前記制御部は、前記ＱＣサンプルの前記内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とから前記強度比を算出し、前記検量線に基づいて前記未知試料の前記測定対象を定量し、前記内部標準は、前記測定対象のクロマトグラフのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含み、前記検量線データは、それぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準に対応した第１検量線データ及び第２検量線データを少なくとも含み、前記制御部は、前記未知試料の前記測定対象を定量する際、前記ＱＣサンプルのそれぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とからそれぞれ算出した第１強度比及び第２強度比から、それぞれ前記第１検量線データ及び前記第２検量線データを参照して前記測定対象を別個に定量し、その定量値を平均する。
このクロマトグラフによれば、内部標準法による検量線を用いつつも、未知試料に標準物質を添加せずに定量を行える。このため、未知試料に一定濃度の標準物質を秤量する煩雑かつ熟練を要する操作が不要で、標準物質の秤量が不正確になって定量精度が低下することを抑制できる。その結果、未知試料に標準物質を添加する作業を不要とし、測定を簡易にすると共に定量精度の低下を抑制できる
また、このクロマトグラフによれば、内部標準が測定対象のクロマトグラムのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含むので、測定精度が向上する。
また、このクロマトグラフによれば、内部標準が測定対象のクロマトグラムのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含むので、測定精度が向上する。
本発明のクロマトグラフにおいて、前記記憶部は、前記所定濃度の前記内部標準を含む標準クロマトグラムの波形又は強度に基づく診断基準を記憶し、前記制御部は、前記ＱＣサンプルのクロマトグラムの波形又は強度に対し、前記診断基準に基づいて前記未知試料の測定の可否を判断してもよい。
未知試料に標準物質を添加せずに定量を行うのは、通常の管理・保守を行えば、測定のばらつきが小さい範囲内に収まることを前提としている。そこで、未知試料の測定に先立って、ＱＣサンプルのクロマトグラフィを測定し、その内部標準の強度が、未知試料に内部標準を加えたと仮定した場合の未知試料中の内部標準の強度と同一であるとみなすのである。従って、クロマトグラフの状態が悪化し、測定のばらつきが大きくなった場合に本法を用いると、誤った測定結果となってしまう。
そこで、このクロマトグラフによれば、クロマトグラフの状態を予め診断し、装置状態が正常とみなしたときに未知試料の定量を行うことで、誤測定を防止できる。
そこで、このクロマトグラフによれば、クロマトグラフの状態を予め診断し、装置状態が正常とみなしたときに未知試料の定量を行うことで、誤測定を防止できる。
本発明のクロマトグラフにおいて、前記記憶部は、前記測定対象と異なる追加の測定対象に前記所定濃度の前記内部標準を加えて求められ、前記追加の測定対象の強度と前記内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による追加の検量線データであって、前記追加の測定対象が共存したときの前記所定濃度の前記内部標準の強度Ａ２と、前記追加の測定対象と同一濃度の前記測定対象が共存したときの前記所定濃度の前記内部標準の強度Ａ１との内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）で、前記追加の検量線データにおける前記内部標準の強度を補正した検量線データを記憶し、前記ＱＣサンプルは、濃度既知の前記測定対象をさらに含み、前記追加の測定対象を定量する場合に、前記ＱＣサンプルのクロマトグラムを測定し、前記制御部が前記診断基準に基づいて前記未知試料の測定を許容したとき、前記制御部は、前記補正した検量線データに基づいて、濃度未知の前記追加の測定対象を含み前記内部標準を含まない第２の未知試料における、前記追加の測定対象を定量してもよい。
測定対象と異なる、追加の測定対象を定量する場合、通常は、測定対象と同様な検量線を記憶しておけば、ＱＣサンプルのクロマトグラムと未知試料のクロマトグラムとを測定すれば同様に行える。
一方、ＱＣサンプルとして、測定対象を含んだＱＣサンプルを用いて測定対象を定量すれば、クロマトグラフの診断精度が向上するが、このＱＣサンプルを追加の測定対象の定量にも兼用すると、追加の測定対象の測定精度が低下するおそれがある。しかし、追加の測定対象毎にＱＣサンプルを用意すると作業性が低下するので、測定対象を含んだＱＣサンプルを、すべての測定（追加の測定対象の測定）で兼用させたいという要望がある。
そこで、追加の測定対象についての内部標準法による追加の検量線データとして、内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）で補正した検量線データを記憶しておく。そして、この補正した検量線データを用いて追加の測定対象を定量することで、測定対象を含んだＱＣサンプルを追加の測定対象の定量に兼用しつつも、追加の測定対象を精度よく定量できるようになる。
一方、ＱＣサンプルとして、測定対象を含んだＱＣサンプルを用いて測定対象を定量すれば、クロマトグラフの診断精度が向上するが、このＱＣサンプルを追加の測定対象の定量にも兼用すると、追加の測定対象の測定精度が低下するおそれがある。しかし、追加の測定対象毎にＱＣサンプルを用意すると作業性が低下するので、測定対象を含んだＱＣサンプルを、すべての測定（追加の測定対象の測定）で兼用させたいという要望がある。
そこで、追加の測定対象についての内部標準法による追加の検量線データとして、内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）で補正した検量線データを記憶しておく。そして、この補正した検量線データを用いて追加の測定対象を定量することで、測定対象を含んだＱＣサンプルを追加の測定対象の定量に兼用しつつも、追加の測定対象を精度よく定量できるようになる。
本発明のクロマトグラフにおいて、前記診断基準は、前記標準クロマトグラフの波形の広がりの第１閾値を含み、前記制御部は、前記ＱＣサンプルのクロマトグラフの波形の広がりが前記第１閾値を超えた場合に、前記未知試料の測定を不可と判断してもよい。
このクロマトグラフによれば、ＱＣサンプルのクロマトグラフの波形の広がりに基づいて、未知試料の測定の可否をさらに精度よく判断できる。
このクロマトグラフによれば、ＱＣサンプルのクロマトグラフの波形の広がりに基づいて、未知試料の測定の可否をさらに精度よく判断できる。
本発明のクロマトグラフにおいて、前記診断基準は、前記標準クロマトグラフの強度の第２閾値を含み、前記制御部は、前記ＱＣサンプルのクロマトグラフの強度が前記第２閾値未満の場合に、前記未知試料の測定を不可と判断してもよい。
このクロマトグラフによれば、標準クロマトグラフの強度に基づいて、未知試料の測定の可否をさらに精度よく判断できる。
このクロマトグラフによれば、標準クロマトグラフの強度に基づいて、未知試料の測定の可否をさらに精度よく判断できる。
本発明のクロマトグラフィの定量方法は、所定の測定対象を定量するクロマトグラフィの定量方法であって、前記測定対象に所定濃度の内部標準を加えて求められ、前記測定対象の強度と前記内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による検量線データを予め記憶し、前記所定濃度の前記内部標準を含むＱＣサンプルのクロマトグラムと、濃度未知の前記測定対象を含み前記内部標準を含まない未知試料のクロマトグラムとを測定したとき、前記ＱＣサンプルの前記内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とから前記強度比を算出し、前記検量線に基づいて前記未知試料の前記測定対象を定量し、前記内部標準は、前記測定対象のクロマトグラフのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含み、前記検量線データは、それぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準に対応した第１検量線データ及び第２検量線データを少なくとも含み、さらに、前記未知試料の前記測定対象を定量する際、前記ＱＣサンプルのそれぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とからそれぞれ算出した第１強度比及び第２強度比から、それぞれ前記第１検量線データ及び前記第２検量線データを参照して前記測定対象を別個に定量し、その定量値を平均する。
本発明によれば、クロマトグラフィの定量において、内部標準法による検量線を用いつつも、未知試料に標準物質を添加する作業を不要とし、測定を簡易にすると共に定量精度の低下を抑制できる。
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図１は、本発明の実施形態に係る液体クロマトグラフ１００の構成を示す図である。
液体クロマトグラフ１００は所定の測定対象を定量するものであり、全体を制御するデータ処理装置（制御部）７、移動相（溶離液と溶媒の混合溶液）１、移動相１を送液するポンプ２、試料を注入するオートサンプラ３、成分を分離するカラム４、カラム４を恒温にするカラムオーブン５、分離された成分を検出する検出器６、表示部１０を備える。
データ処理装置７は、分析を実行し分析結果を解析する制御部（ＣＰＵ）９、分析結果または解析結果を保存する記憶部（ハードディスク等）８を有するコンピュータから構成される。表示部（モニタ）１０は、分析結果や解析結果を表示する。
図１は、本発明の実施形態に係る液体クロマトグラフ１００の構成を示す図である。
液体クロマトグラフ１００は所定の測定対象を定量するものであり、全体を制御するデータ処理装置（制御部）７、移動相（溶離液と溶媒の混合溶液）１、移動相１を送液するポンプ２、試料を注入するオートサンプラ３、成分を分離するカラム４、カラム４を恒温にするカラムオーブン５、分離された成分を検出する検出器６、表示部１０を備える。
データ処理装置７は、分析を実行し分析結果を解析する制御部（ＣＰＵ）９、分析結果または解析結果を保存する記憶部（ハードディスク等）８を有するコンピュータから構成される。表示部（モニタ）１０は、分析結果や解析結果を表示する。
検出器６は信号強度を検出する素子を複数持ち、時間に対する信号強度を複数波長において同時に取得可能な３次元検出器である。
試料は、オートサンプラ３のインジェクタ（図示せず）から注入され、ポンプ２から送液される移動相１とともにカラム４を通過し、試料中の種々の成分に分離される。
成分に分離された試料は、検出器６で検出される。検出器６の信号はデータ処理装置７に送られてデータ処理が行われる。
カラム４は、移動相１中に存在する試料の成分を分離する分離部として一般的に使用される装置である。カラム４としては、充填型カラムやモノリスカラム等がある。カラム４のカラム充填剤としては、吸着型、分配型、イオン交換型等の種々のタイプのものを使用することができる。カラム４を恒温に保ち、再現性よく試料の分離ができるように、カラム４は、カラムオーブン５内に設置されていることが望ましい。
試料は、オートサンプラ３のインジェクタ（図示せず）から注入され、ポンプ２から送液される移動相１とともにカラム４を通過し、試料中の種々の成分に分離される。
成分に分離された試料は、検出器６で検出される。検出器６の信号はデータ処理装置７に送られてデータ処理が行われる。
カラム４は、移動相１中に存在する試料の成分を分離する分離部として一般的に使用される装置である。カラム４としては、充填型カラムやモノリスカラム等がある。カラム４のカラム充填剤としては、吸着型、分配型、イオン交換型等の種々のタイプのものを使用することができる。カラム４を恒温に保ち、再現性よく試料の分離ができるように、カラム４は、カラムオーブン５内に設置されていることが望ましい。
測定対象を定量するため、記憶部８は、測定対象の強度と内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による検量線データを記憶する。検量線データは一般的な内部標準法によるものであれば良いが、例えば図２～図３に示すようにして得ることができる。
まず、図２に示すように、測定対象をＸとしたとき、濃度既知の測定対象をＳＴＤ－Ｘ（標準試料）で表す。そして、ＳＴＤ－Ｘに所定濃度の内部標準ａ、ｂを加えてクロマトグラムを取得する。このクロマトグラムは、測定対象Ｘの濃度をＸ１、Ｘ２、Ｘ３、と種々変えてそれぞれ測定する。
又、内部標準ａ、ｂは、測定対象Ｘのクロマトグラムのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる。内部標準ａ、ｂが、それぞれ特許請求の範囲の「第１内部標準」、「第２内部標準」に相当する。
まず、図２に示すように、測定対象をＸとしたとき、濃度既知の測定対象をＳＴＤ－Ｘ（標準試料）で表す。そして、ＳＴＤ－Ｘに所定濃度の内部標準ａ、ｂを加えてクロマトグラムを取得する。このクロマトグラムは、測定対象Ｘの濃度をＸ１、Ｘ２、Ｘ３、と種々変えてそれぞれ測定する。
又、内部標準ａ、ｂは、測定対象Ｘのクロマトグラムのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる。内部標準ａ、ｂが、それぞれ特許請求の範囲の「第１内部標準」、「第２内部標準」に相当する。
次に、図３（ａ）に示すように、内部標準ａにつき、濃度既知の測定対象ＳＴＤ－Ｘ１、ＳＴＤ－Ｘ２、ＳＴＤ－Ｘ３、の各強度と内部標準ａの強度との強度比（ＳＴＤ/ａ）を縦軸にプロットし、測定対象ＳＴＤ－Ｘ１、ＳＴＤ－Ｘ２、ＳＴＤ－Ｘ３、の各濃度Ｃｏｎｃを横軸にプロットし、強度比と測定対象Ｘの濃度との関係を表す一次式の第１検量線データＣＡＬ１が得られる。
同様に内部標準ｂについても、図３（ｂ）に示すように、濃度既知の測定対象ＳＴＤ－Ｘ１、ＳＴＤ－Ｘ２、ＳＴＤ－Ｘ３、の各強度と内部標準ｂの強度との強度比（ＳＴＤ/ｂ）を縦軸にプロットし、測定対象ＳＴＤ－Ｘ１、ＳＴＤ－Ｘ２、ＳＴＤ－Ｘ３、の各濃度Ｃｏｎｃを横軸にプロットし、強度比と測定対象Ｘの濃度との関係を表す一次式の第２検量線データＣＡＬ２が得られる。
なお、検量線データは、強度比と、測定対象の濃度との関係を表すものであれば、一次式に限らず、テーブル、近似曲線等でもよい。
同様に内部標準ｂについても、図３（ｂ）に示すように、濃度既知の測定対象ＳＴＤ－Ｘ１、ＳＴＤ－Ｘ２、ＳＴＤ－Ｘ３、の各強度と内部標準ｂの強度との強度比（ＳＴＤ/ｂ）を縦軸にプロットし、測定対象ＳＴＤ－Ｘ１、ＳＴＤ－Ｘ２、ＳＴＤ－Ｘ３、の各濃度Ｃｏｎｃを横軸にプロットし、強度比と測定対象Ｘの濃度との関係を表す一次式の第２検量線データＣＡＬ２が得られる。
なお、検量線データは、強度比と、測定対象の濃度との関係を表すものであれば、一次式に限らず、テーブル、近似曲線等でもよい。
次に、図４～図５を参照し、濃度未知の測定対象を含む未知試料のクロマトグラムを測定して測定対象を定量する方法について説明する。
まず、図４（ａ）に示すように、図２、図３で検量線データ（第１検量線データＣＡＬ１、第２検量線データＣＡＬ２）を作成した際の各内部標準ａ、ｂと同一濃度の内部標準ａ、ｂを含むＱＣサンプルのクロマトグラムを測定する。
次に、図４（ｂ）に示すように、濃度が未知の測定対象Ｘｎを含み、内部標準ａ、ｂを含まない未知試料のクロマトグラムを測定する。
まず、図４（ａ）に示すように、図２、図３で検量線データ（第１検量線データＣＡＬ１、第２検量線データＣＡＬ２）を作成した際の各内部標準ａ、ｂと同一濃度の内部標準ａ、ｂを含むＱＣサンプルのクロマトグラムを測定する。
次に、図４（ｂ）に示すように、濃度が未知の測定対象Ｘｎを含み、内部標準ａ、ｂを含まない未知試料のクロマトグラムを測定する。
すると、図５に示すように、制御部９は、ＱＣサンプルの第１内部標準ａの強度と、未知試料の測定対象Ｘｎの強度とから第１強度比Ｘｎ/ａを算出し、第１強度比Ｘｎ/ａから第１検量線データＣＡＬ１に基づいて測定対象Ｘｎの濃度Ｃｏｎｃ１を求める。同様にして、制御部９は、ＱＣサンプルの第２内部標準ｂの強度と、未知試料の測定対象Ｘｎの強度とから第２強度比Ｘｎ/ｂを算出し、第２強度比Ｘｎ/ｂから第２検量線データＣＡＬ２に基づいて測定対象Ｘｎの濃度Ｃｏｎｃ２を求める。
次に、制御部９は、濃度Ｃｏｎｃ１、Ｃｏｎｃ２を平均したＣｏｎｃ Ｘｎ＝（Ｃｏｎｃ１＋Ｃｏｎｃ２）/２を求め、測定対象Ｘｎの濃度とする。このようにして、制御部９は、未知試料の測定対象Ｘｎを定量する。
次に、制御部９は、濃度Ｃｏｎｃ１、Ｃｏｎｃ２を平均したＣｏｎｃ Ｘｎ＝（Ｃｏｎｃ１＋Ｃｏｎｃ２）/２を求め、測定対象Ｘｎの濃度とする。このようにして、制御部９は、未知試料の測定対象Ｘｎを定量する。
なお、理想的には、Ｃｏｎｃ１＝Ｃｏｎｃ２であるが、各種夾雑物の影響等により、検量線によって算出されるＣｏｎｃ１とＣｏｎｃ２が等しくならないことがあるので、これらを平均したＣｏｎｃ Ｘｎを求めると定量精度がより向上する。
又、平均値Ｃｏｎｃ Ｘｎを採用するのは、内部標準が２つ以上の場合であって、内部標準が１つの場合は平均化は不要であり、単一の検量線を参照すればよい。
又、平均値Ｃｏｎｃ Ｘｎを採用するのは、内部標準が２つ以上の場合であって、内部標準が１つの場合は平均化は不要であり、単一の検量線を参照すればよい。
このように、内部標準法による検量線を用いつつも、未知試料に標準物質を添加せずに定量を行える。このため、未知試料に一定濃度の標準物質を秤量する煩雑かつ熟練を要する操作が不要で、標準物質の秤量が不正確になって定量精度が低下することを抑制できる。その結果、未知試料に標準物質を添加する作業を不要とし、測定を簡易にすると共に定量精度の低下を抑制できる。
なお、未知試料に標準物質を添加せずに定量を行うのは、液体クロマトグラフの進歩により、通常の管理・保守を行えば、測定のばらつきが小さい範囲内に収まることを前提としている。そこで、未知試料の測定に先立って、図４（ａ）に示すＱＣサンプルのクロマトグラフィを測定し、その内部標準の強度が、未知試料に内部標準を加えたと仮定した場合の未知試料中の内部標準の強度と同一であるとみなすのである。
従って、液体クロマトグラフの状態が悪化し、測定のばらつきが大きくなった場合に本法を用いると、誤った測定結果となってしまう。
従って、液体クロマトグラフの状態が悪化し、測定のばらつきが大きくなった場合に本法を用いると、誤った測定結果となってしまう。
そこで、液体クロマトグラフ１００の状態を予め診断し、装置状態が正常とみなしたときに未知試料の定量を行うようにすると好ましい。
この診断は、例えば図６～図７に示すようにして行うことができる。まず、記憶部８は、ＱＣサンプルと同濃度の内部標準を少なくとも含む標準クロマトグラフの波形又は強度に基づく診断基準を記憶する。
この診断は、例えば図６～図７に示すようにして行うことができる。まず、記憶部８は、ＱＣサンプルと同濃度の内部標準を少なくとも含む標準クロマトグラフの波形又は強度に基づく診断基準を記憶する。
この診断基準は、例えば図６に示す既知の濃度Ｘ１の測定対象Ｘと内部標準ａ、ｂを含むクロマトグラム（標準クロマトグラム）ＣＲの波形のデータが挙げられる。本例では、標準クロマトグラムＣＲは、図２に示した測定対象Ｘの濃度Ｘ１の検量線作成用のクロマトグラムと同一である。
但し、診断基準は、ＱＣサンプルと同濃度の内部標準ａ、ｂを含むクロマトグラムの波形又は強度に基づくものであれば、測定対象Ｘのピークを含まなくてもよい。
そして制御部９は、ＱＣサンプルのクロマトグラムの波形又は強度について、診断基準に基づいて未知試料の測定の可否を判断する。
但し、診断基準は、ＱＣサンプルと同濃度の内部標準ａ、ｂを含むクロマトグラムの波形又は強度に基づくものであれば、測定対象Ｘのピークを含まなくてもよい。
そして制御部９は、ＱＣサンプルのクロマトグラムの波形又は強度について、診断基準に基づいて未知試料の測定の可否を判断する。
ＱＣサンプルは、図４（ａ）に示すように内部標準ａ、ｂのみを含むものでもよいが、図６のクロマトグラムＣＲａ、ＣＲｂ、ＣＲｃに示すように、内部標準ａ、ｂと、濃度既知の測定対象Ｘを含むようにすると、測定対象Ｘのピークも用いて診断を行えるので、診断精度が向上する。
なお、以下の説明では、診断基準及びＱＣサンプルが既知の濃度Ｘ１の測定対象Ｘも含むものとするが、診断基準及びＱＣサンプルが測定対象Ｘを含まくてもよいのはいうまでもない。
なお、以下の説明では、診断基準及びＱＣサンプルが既知の濃度Ｘ１の測定対象Ｘも含むものとするが、診断基準及びＱＣサンプルが測定対象Ｘを含まくてもよいのはいうまでもない。
図６に、標準クロマトグラムＣＲ、及びＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲａ、ＣＲｂ、ＣＲｃを示す。
図６に示すように、標準クロマトグラムＣＲは、測定対象ＸのピークＳ０、ピークＳ０の前後の保持時間にそれぞれ現れる第１内部標準ａ、ｂのピークＳ１、Ｓ２を有する。
各ピークＳ０、Ｓ１、Ｓ２につき、それぞれ半値幅（波形の広がり）をＷ０、Ｗ１、Ｗ２、強度（例えばピーク面積）をＡ０、Ａ１、Ａ２で表す。
図６に示すように、標準クロマトグラムＣＲは、測定対象ＸのピークＳ０、ピークＳ０の前後の保持時間にそれぞれ現れる第１内部標準ａ、ｂのピークＳ１、Ｓ２を有する。
各ピークＳ０、Ｓ１、Ｓ２につき、それぞれ半値幅（波形の広がり）をＷ０、Ｗ１、Ｗ２、強度（例えばピーク面積）をＡ０、Ａ１、Ａ２で表す。
図７に、記憶部８に記憶された診断基準（テーブル）Ｊ１の一例を示す。この診断基準Ｊ１は、標準クロマトグラムＣＲに基づいており、各ピークＳ０、Ｓ１、Ｓ２につき、それぞれ半値幅の第１閾値Ｗｘ、Ｗｙ、Ｗｚ、及び強度（ピーク面積）の第２閾値Ａｘ、Ａｙ、Ａｚを記憶する。
制御部９は、診断基準Ｊ１に基づいて診断を行い、未知試料の測定の可否を判断する。
制御部９は、診断基準Ｊ１に基づいて診断を行い、未知試料の測定の可否を判断する。
例えば、図６に示すように、ＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲａが得られたとする。制御部９は、ＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲａから各ピークＳ０～Ｓ２の半値幅及び強度を取得し、例えばピークＳ０、Ｓ２の半値幅Ｗ０ａ、Ｗ２ａがそれぞれ第１閾値Ｗｘ、Ｗｚを超えた場合、未知試料の測定を不可と判断する。
なお、半値幅Ｗ０ａ、Ｗ１がそれぞれ第１閾値Ｗｘ、Ｗｚを超えた場合とは、固定相（カラム４）の不具合が想定される。
なお、半値幅Ｗ０ａ、Ｗ１がそれぞれ第１閾値Ｗｘ、Ｗｚを超えた場合とは、固定相（カラム４）の不具合が想定される。
また、図６に示すように、別のＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｂが得られたとする。制御部９は、ＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｂから各ピークＳ０～Ｓ２の半値幅及び強度を取得し、例えばピークＳ１の強度Ａ１ｂが第２閾値Ａｙ未満の場合、未知試料の測定を不可と判断する。
なお、強度Ａ１ｂが第２閾値Ａｙ未満の場合とは、検出器の不具合（例えば、検出器のランプ交換要）が想定される。
なお、強度Ａ１ｂが第２閾値Ａｙ未満の場合とは、検出器の不具合（例えば、検出器のランプ交換要）が想定される。
また、図６に示すように、さらに別のＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｃが得られたとする。制御部９は、ＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｃから各ピークＳ０～Ｓ２の半値幅及び強度を取得し、例えばピークＳ１又はＳ２の半値幅Ｗ１ｃ、Ｗ２ｃの少なくとも一方が第１閾値Ｗｙ又はＷｚを超えた場合、未知試料の測定を不可と判断する。
なお、半値幅Ｗ１ｃ、Ｗ２ｃの少なくとも一方が第１閾値Ｗｙ又はＷｚを超えた場合とは、移動相の不具合が想定される。
なお、半値幅Ｗ１ｃ、Ｗ２ｃの少なくとも一方が第１閾値Ｗｙ又はＷｚを超えた場合とは、移動相の不具合が想定される。
なお、図６のＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｂの例では、ピークＳ１の強度Ａ１ｂが第２閾値Ａｙ未満の場合に未知試料の測定を不可と判断したが、ピークＳ０～Ｓ２の強度Ａ０ｂ～Ａ２ｂのすべてがそれぞれ第２閾値未満の場合や、これらの強度ｖのうち２以上が第２閾値未満の場合、強度Ａ０ｂ～Ａ２ｂのうちいずれか１つが第２閾値未満の場合に未知試料の測定を不可と判断してもよい。
又、図６のＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｃの例では、半値幅Ｗ１ｃ、Ｗ２ｃの少なくとも一方が第１閾値Ｗｙ又はＷｚを超えた場合に未知試料の測定を不可と判断したが、ピークＳ０～Ｓ２の半値幅Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃのすべてがそれぞれ第１閾値を超えた場合や、これらの半値幅Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃのうち２以上が第１閾値を超えた場合、半値幅Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃのいずれか１つが第１閾値を超えた場合に未知試料の測定を不可と判断してもよい。
又、図６のＱＣサンプルのクロマトグラムＣＲｃの例では、半値幅Ｗ１ｃ、Ｗ２ｃの少なくとも一方が第１閾値Ｗｙ又はＷｚを超えた場合に未知試料の測定を不可と判断したが、ピークＳ０～Ｓ２の半値幅Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃのすべてがそれぞれ第１閾値を超えた場合や、これらの半値幅Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃのうち２以上が第１閾値を超えた場合、半値幅Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃのいずれか１つが第１閾値を超えた場合に未知試料の測定を不可と判断してもよい。
又、制御部９は、未知試料の測定を不可と判断した際、不可の旨を表示部１０に表示したり、音声を鳴動させて作業者に注意を喚起しても良いし、液体クロマトグラフ１００の測定ができないような制御を行ってもよい。この制御は、物理的に測定を阻止しても良いが、測定を実行するコンピュータプログラムが進まないよう、ソフトウェア上で制御するのが簡便である。
又制御部９は、未知試料の測定を許容した際、その旨を表示部１０に表示したり、音声を鳴動させて作業者に告知しても良いし、液体クロマトグラフ１００の測定が進行するような制御を行ってもよい。この制御は、例えば測定を実行するコンピュータプログラムを自動的に進行させ、ソフトウェア上で制御するのが簡便である。
又制御部９は、未知試料の測定を許容した際、その旨を表示部１０に表示したり、音声を鳴動させて作業者に告知しても良いし、液体クロマトグラフ１００の測定が進行するような制御を行ってもよい。この制御は、例えば測定を実行するコンピュータプログラムを自動的に進行させ、ソフトウェア上で制御するのが簡便である。
ところで、測定対象Ｘと異なる追加の測定対象Ｙを定量する場合、通常は、測定対象Ｘと同様な検量線を記憶しておけば、図４に示すのと同様にして、ＱＣサンプルのクロマトグラムと未知試料のクロマトグラムとを測定すれば同様に行える。
一方、ＱＣサンプルとして、上述の図６のように測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルを用いて測定対象Ｘを定量する場合、液体クロマトグラフ１００の診断精度が向上するが、このＱＣサンプルを測定対象Ｙの定量にも兼用すると、測定対象Ｙの測定精度が低下するおそれがある。
一方、ＱＣサンプルとして、上述の図６のように測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルを用いて測定対象Ｘを定量する場合、液体クロマトグラフ１００の診断精度が向上するが、このＱＣサンプルを測定対象Ｙの定量にも兼用すると、測定対象Ｙの測定精度が低下するおそれがある。
これは、図８に示すように、ＱＣサンプル中の内部標準ａ、ｂが同一物質、同一濃度であっても、測定対象Ｙが内部標準ａ、ｂと共存すると内部標準ａ、ｂのピーク強度等が変化し、測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルの内部標準ａ、ｂのピーク強度と異なる場合があるからである。なお、図８の例では、測定対象Ｙを含む場合、内部標準ａ、ｂのピーク強度が高くなっている。
一方で、追加の測定対象Ｙ毎に、測定対象Ｙを含んだＱＣサンプルを用意すると作業性が低下するので、測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルを、すべての測定で兼用させたいという要望がある。
一方で、追加の測定対象Ｙ毎に、測定対象Ｙを含んだＱＣサンプルを用意すると作業性が低下するので、測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルを、すべての測定で兼用させたいという要望がある。
そこで、記憶部８に、測定対象Ｙの内部標準法による追加の検量線データとして、以下の内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）で補正した検量線データを記憶しておく。
そして、この補正した検量線データを用いて測定対象Ｙを定量することで、測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルを測定対象Ｙの定量に兼用しつつも、測定対象Ｙを精度よく定量できるようになる。
そして、この補正した検量線データを用いて測定対象Ｙを定量することで、測定対象Ｘを含んだＱＣサンプルを測定対象Ｙの定量に兼用しつつも、測定対象Ｙを精度よく定量できるようになる。
具体的には、まず図９に示すように、図２、図３の測定対象Ｘの場合と同様にして、測定対象Ｙにつき、第１検量線ＣＡＬ３、第２検量線ＣＡＬ４のデータを作成する。
第１検量線ＣＡＬ３は、図９（ａ）に示すように、内部標準ａにつき、濃度既知の測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各強度と内部標準ａの強度との強度比（ＳＴＤ/ａ）を縦軸にプロットし、測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各濃度Ｃｏｎｃを横軸にプロットし、強度比と測定対象Ｘの濃度との関係を表す一次式が得られる。
第２検量線ＣＡＬ４は、同様に内部標準ｂについて、図９（ｂ）に示すように、濃度既知の測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各強度と内部標準ｂの強度との強度比（ＳＴＤ/ｂ）を縦軸にプロットし、測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各濃度Ｃｏｎｃを横軸にプロットし、強度比と測定対象Ｘの濃度との関係を表す一次式が得られる。
第２検量線ＣＡＬ４は、同様に内部標準ｂについて、図９（ｂ）に示すように、濃度既知の測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各強度と内部標準ｂの強度との強度比（ＳＴＤ/ｂ）を縦軸にプロットし、測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各濃度Ｃｏｎｃを横軸にプロットし、強度比と測定対象Ｘの濃度との関係を表す一次式が得られる。
次に、図８に示すように、測定対象Ｙが共存したときのＱＣサンプルと同濃度の内部標準ａ、ｂの強度Ａ２と、測定対象Ｙと同一濃度での測定対象Ｘが共存したときのＱＣサンプルと同濃度の内部標準ａ、ｂの強度Ａ１との内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）を求める。
内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）は、各内部標準ａ、ｂごとに算出され、例えば内部標準ａについては、（Ａ２/Ａ１）＝（ａｙ/ａｘ）であり、内部標準ｂについては、（Ａ２/Ａ１）＝（ｂｙ/ｂｘ）である。
内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）は、各内部標準ａ、ｂごとに算出され、例えば内部標準ａについては、（Ａ２/Ａ１）＝（ａｙ/ａｘ）であり、内部標準ｂについては、（Ａ２/Ａ１）＝（ｂｙ/ｂｘ）である。
図９に示すように、記憶部８は、内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）で、第１検量線ＣＡＬ３のデータ、第２検量線ＣＡＬ４における内部標準の強度を補正した検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６を記憶する。
この補正は、第１検量線ＣＡＬ３の縦軸における測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各強度と内部標準ａの強度との強度比（ＳＴＤ/ａ）の分母のａの値に、（ａｙ/ａｘ）を乗じる。つまり、補正後の強度比＝ＳＴＤ/｛ａ×（ａｙ/ａｘ）｝となる。
図８に示すように、本例ではａｙ＞ａｘであるので補正後の強度比は小さくなり、図９に示すように、補正後の検量線データＣＡＬ５は第１検量線ＣＡＬ３よりも傾きが小さくなる。補正後の検量線データＣＡＬ６も同様にして、第２検量線ＣＡＬ４よりも傾きが小さくなる。
検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６がそれぞれ特許請求の範囲の「補正した（追加の）検量線データ」に相当する。
なお、検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６は、強度比と、測定対象の濃度との関係を表すものであれば、一次式に限らず、テーブル、近似曲線等でもよい。
この補正は、第１検量線ＣＡＬ３の縦軸における測定対象ＳＴＤ－Ｙ１、ＳＴＤ－Ｙ２、ＳＴＤ－Ｙ３、の各強度と内部標準ａの強度との強度比（ＳＴＤ/ａ）の分母のａの値に、（ａｙ/ａｘ）を乗じる。つまり、補正後の強度比＝ＳＴＤ/｛ａ×（ａｙ/ａｘ）｝となる。
図８に示すように、本例ではａｙ＞ａｘであるので補正後の強度比は小さくなり、図９に示すように、補正後の検量線データＣＡＬ５は第１検量線ＣＡＬ３よりも傾きが小さくなる。補正後の検量線データＣＡＬ６も同様にして、第２検量線ＣＡＬ４よりも傾きが小さくなる。
検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６がそれぞれ特許請求の範囲の「補正した（追加の）検量線データ」に相当する。
なお、検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６は、強度比と、測定対象の濃度との関係を表すものであれば、一次式に限らず、テーブル、近似曲線等でもよい。
次に、上述のように、濃度既知の測定対象Ｘと、所定濃度の内部標準ａ、ｂを含むＱＣサンプルのクロマトグラムを測定する。
すると、制御部９は、上記診断基準とＱＣサンプルのクロマトグラムとに基づいて、上述のように未知試料の測定の可否を判断する。そして、測定を許容した場合には、制御部９は、補正後の検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６を参照し、未知試料の測定対象Ｙを定量する。定量の方法は測定対象Ｘと同様であり、検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６から図５と同様にして、測定対象Ｙの濃度をそれぞれ求め、それを平均する。
このように、補正した検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６を用いることで、測定対象Ｘを含むＱＣサンプルを測定対象Ｙの定量に兼用しつつも、未知試料に標準物質を添加せずに測定対象Ｙを精度よく定量できるようになる。
すると、制御部９は、上記診断基準とＱＣサンプルのクロマトグラムとに基づいて、上述のように未知試料の測定の可否を判断する。そして、測定を許容した場合には、制御部９は、補正後の検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６を参照し、未知試料の測定対象Ｙを定量する。定量の方法は測定対象Ｘと同様であり、検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６から図５と同様にして、測定対象Ｙの濃度をそれぞれ求め、それを平均する。
このように、補正した検量線データＣＡＬ５、ＣＡＬ６を用いることで、測定対象Ｘを含むＱＣサンプルを測定対象Ｙの定量に兼用しつつも、未知試料に標準物質を添加せずに測定対象Ｙを精度よく定量できるようになる。
本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の思想と範囲に含まれる様々な変形及び均等物に及ぶことはいうまでもない。
内部標準は複数に限らず、１つでもよい。但し、内部標準が測定対象のクロマトグラムのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含むと、測定精度が向上するので好ましい。
補正した（追加の）検量線データＣＡＬ５，ＣＡＬ６は、予めクロマトグラフ装１００の出荷時に記憶部８に記憶しておいてもよく、後から作業者が測定対象Ｙと内部標準ａ、ｂを含むＱＣサンプルを一回だけ作製して内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）を求め、、記憶部８に後から記憶させてもよい。
内部標準は複数に限らず、１つでもよい。但し、内部標準が測定対象のクロマトグラムのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含むと、測定精度が向上するので好ましい。
補正した（追加の）検量線データＣＡＬ５，ＣＡＬ６は、予めクロマトグラフ装１００の出荷時に記憶部８に記憶しておいてもよく、後から作業者が測定対象Ｙと内部標準ａ、ｂを含むＱＣサンプルを一回だけ作製して内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）を求め、、記憶部８に後から記憶させてもよい。
８ 記憶部
９ 制御部
１０ 記憶部
１００ （液体）クロマトグラフ
ＣＲ 標準クロマトグラフ
ＣＲ１～Ｃｒ３ ＱＣサンプルのクロマトグラフ
Ｊ１ 診断基準
Ｗ０～Ｗ２ 標準クロマトグラフの波形
Ａ０～Ａ２ 標準クロマトグラフの強度
Ｗ０ａ、Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃ ＱＣサンプルのクロマトグラフの波形
Ａ０ｂ～Ａ２ｂ ＱＣサンプルのクロマトグラフの強度
Ｗｘ～Ｗｚ 第１閾値
Ａｘ～Ａｚ 第２閾値
Ｘ、Ｘｎ 測定対象
ａ 第１内部標準
ｂ 第２内部標準
ＣＡＬ１ 第１検量線データ
ＣＡＬ２ 第２検量線データ
ＣＲ 標準クロマトグラム
ＣＲａ、ＣＲｂ、ＣＲｃ ＱＣサンプルのクロマトグラム
Ｙ 追加の測定対象
ＣＡＬ５，ＣＡＬ６ 補正した検量線データ
Ｘｎ/ａ 第１強度比
Ｘｎ/ｂ 第２強度比
９ 制御部
１０ 記憶部
１００ （液体）クロマトグラフ
ＣＲ 標準クロマトグラフ
ＣＲ１～Ｃｒ３ ＱＣサンプルのクロマトグラフ
Ｊ１ 診断基準
Ｗ０～Ｗ２ 標準クロマトグラフの波形
Ａ０～Ａ２ 標準クロマトグラフの強度
Ｗ０ａ、Ｗ０ｃ～Ｗ２ｃ ＱＣサンプルのクロマトグラフの波形
Ａ０ｂ～Ａ２ｂ ＱＣサンプルのクロマトグラフの強度
Ｗｘ～Ｗｚ 第１閾値
Ａｘ～Ａｚ 第２閾値
Ｘ、Ｘｎ 測定対象
ａ 第１内部標準
ｂ 第２内部標準
ＣＡＬ１ 第１検量線データ
ＣＡＬ２ 第２検量線データ
ＣＲ 標準クロマトグラム
ＣＲａ、ＣＲｂ、ＣＲｃ ＱＣサンプルのクロマトグラム
Ｙ 追加の測定対象
ＣＡＬ５，ＣＡＬ６ 補正した検量線データ
Ｘｎ/ａ 第１強度比
Ｘｎ/ｂ 第２強度比
Claims (6)
- 制御部と、記憶部とを備え、所定の測定対象を定量するクロマトグラフであって、
前記記憶部は、前記測定対象に所定濃度の内部標準を加えて求められ、前記測定対象の強度と前記内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による検量線データを記憶し、
前記所定濃度の前記内部標準を含むＱＣサンプルのクロマトグラムと、濃度未知の前記測定対象を含み前記内部標準を含まない未知試料のクロマトグラムとを測定したとき、前記制御部は、前記ＱＣサンプルの前記内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とから前記強度比を算出し、前記検量線に基づいて前記未知試料の前記測定対象を定量し、
前記内部標準は、前記測定対象のクロマトグラフのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含み、
前記検量線データは、それぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準に対応した第１検量線データ及び第２検量線データを少なくとも含み、
前記制御部は、前記未知試料の前記測定対象を定量する際、前記ＱＣサンプルのそれぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とからそれぞれ算出した第１強度比及び第２強度比から、それぞれ前記第１検量線データ及び前記第２検量線データを参照して前記測定対象を別個に定量し、その定量値を平均するクロマトグラフ。 - 前記記憶部は、前記所定濃度の前記内部標準を含む標準クロマトグラムの波形又は強度に基づく診断基準を記憶し、
前記制御部は、前記ＱＣサンプルのクロマトグラムの波形又は強度に対し、前記診断基準に基づいて前記未知試料の測定の可否を判断する請求項１に記載のクロマトグラフ。 - 前記記憶部は、前記測定対象と異なる追加の測定対象に前記所定濃度の前記内部標準を加えて求められ、前記追加の測定対象の強度と前記内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による追加の検量線データであって、前記追加の測定対象が共存したときの前記所定濃度の前記内部標準の強度Ａ２と、前記追加の測定対象と同一濃度の前記測定対象が共存したときの前記所定濃度の前記内部標準の強度Ａ１との内部標準強度比（Ａ２/Ａ１）で、前記追加の検量線データにおける前記内部標準の強度を補正した検量線データを記憶し、
前記ＱＣサンプルは、濃度既知の前記測定対象をさらに含み、
前記追加の測定対象を定量する場合に、前記ＱＣサンプルのクロマトグラムを測定し、前記制御部が前記診断基準に基づいて前記未知試料の測定を許容したとき、
前記制御部は、前記補正した検量線データに基づいて、濃度未知の前記追加の測定対象を含み前記内部標準を含まない第２の未知試料における、前記追加の測定対象を定量する請求項２に記載のクロマトグラフ。 - 前記診断基準は、前記標準クロマトグラフの波形の広がりの第１閾値を含み、
前記制御部は、前記ＱＣサンプルのクロマトグラフの波形の広がりが前記第１閾値を超えた場合に、前記未知試料の測定を不可と判断する請求項２又は３に記載のクロマトグラフ。 - 前記診断基準は、前記標準クロマトグラフの強度の第２閾値を含み、
前記制御部は、前記ＱＣサンプルのクロマトグラフの強度が前記第２閾値未満の場合に、前記未知試料の測定を不可と判断する請求項２、３又は４に記載のクロマトグラフ。 - 所定の測定対象を定量するクロマトグラフィの定量方法であって、
前記測定対象に所定濃度の内部標準を加えて求められ、前記測定対象の強度と前記内部標準の強度との強度比を有する内部標準法による検量線データを予め記憶し、
前記所定濃度の前記内部標準を含むＱＣサンプルのクロマトグラムと、濃度未知の前記測定対象を含み前記内部標準を含まない未知試料のクロマトグラムとを測定したとき、前記ＱＣサンプルの前記内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とから前記強度比を算出し、前記検量線に基づいて前記未知試料の前記測定対象を定量し、
前記内部標準は、前記測定対象のクロマトグラフのピークの前後の時間にそれぞれピークが現れる少なくとも第１内部標準及び第２内部標準の２種類を含み、
前記検量線データは、それぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準に対応した第１検量線データ及び第２検量線データを少なくとも含み、
さらに、前記未知試料の前記測定対象を定量する際、前記ＱＣサンプルのそれぞれ前記第１内部標準と前記第２内部標準の強度と、前記未知試料の前記測定対象の強度とからそれぞれ算出した第１強度比及び第２強度比から、それぞれ前記第１検量線データ及び前記第２検量線データを参照して前記測定対象を別個に定量し、その定量値を平均する、クロマトグラフィの定量方法。
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