JP2014235023A - 液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビンfの定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)ヘモグロビンF含有試料をカラムに供し、ヘモグロビンFを他のヘモグロビンから分離して溶出させ、クロマトグラムを得る工程、
(b)クロマトグラムからヘモグロビンFの溶出ピークを同定し、その溶出開始時間、ピーク頂点及びピーク頂点の溶出時間(t0)を同定する工程、
(c)ヘモグロビンFのピーク頂点からクロマトグラムベースラインに向かう垂線上で、当該ピーク頂点高さの1/2となる点(1/2h)を同定する工程、
(d)クロマトグラムベースラインと平行で1/2hを通過する直線と、ヘモグロビンFの溶出ピーク背面との交点を求め、該交点の溶出時間とt0の差(t)を求める工程、
(e)ヘモグロビンFの溶出ピークの面積計算を、ヘモグロビンF溶出開始時間からt0+Kt(Kは2以上かつ3以下の整数)の範囲で行う工程。
非多孔性陽イオン交換樹脂(東ソー(株)製、TSKgel(登録商標)SP―NPR(登録商標))を直径4.6mm、長さ3.5cmのSUS製カラムに充填し、市販の自動ヘモグロビン分析装置(東ソー(株)製、グリコヘモグロビン分析装置 HLC―723(登録商標))に取り付けて以下の実験を行った。なお、溶離液としては、前記装置用に市販されているもの(G8 ベータサラセミアエリューションバッファーキット)を使用し、試料注入時は1液を、注入後2.4分経過時点2液に切り替え、試料注入後3.4分から5分にかけて、2液からリニアグラジエントで3液に切り替えた。
実施例1の装置を使用して濃度の異なるヘモグロビンF試薬を混合して調製した試料を測定し、得られたクロマトグラムからヘモグロビンF濃度とピーク溶出開始時間(PS)及びピーク頂点溶出時間(PT)の関係を調査した。結果を図4に示す。ヘモグロビンF濃度が高くなるに従いPTが著しく遅くなる一方で、PSはヘモグロビンF濃度に関係なく、ほぼ安定していることが分かる。
実施例1の装置を使用して、濃度の異なるヘモグロビンF試薬を混合して調製した試料を測定し、得られたクロマトグラムについて、本発明に従う波形処理を行った。波形処理は、前記装置を制御するコンピューターにてK=3として行った。理論的に測定されるべきグリコヘモグロビン濃度と実際に定量された値の比(回収率)を表1に示す。本発明により、ヘモグロビンFの濃度が0.7から68%までの範囲で良好な回収率が得られ、広い濃度範囲で正確な定量が可能であることが分かる。
実施例1の装置を使用して、濃度の異なるヘモグロビンF試薬を混合して調製した極低濃度試料(ヘモグロビンF濃度 0.4%)、中濃度試料(ヘモグロビンF濃度 4.6%)及び高濃度試料(ヘモグロビンF濃度 74.0%)をそれぞれ5回測定し、得られたクロマトグラムについて、本発明に従う波形処理を行った。波形処理は、前記装置を制御するコンピューターにてK=3として行った。定量結果を表2に示す。本発明により、ヘモグロビンFの濃度が大きく異なる3種類の試料それぞれについて、5回の測定を再現良く実施できることが分かる。
実施例4における波形処理を、K=2として行った。定量結果を表3に示す。実施例4と比較するとヘモグロビンFのピーク面積を算出する終点(溶出終了時間)が早くなる分、定量結果は若干低値となるが、K=2の場合でもほぼ正確かつ再現性良くヘモグロビンFを定量可能であることが分かる。
実施例4で得たクロマトグラムについて、ヘモグロビンFのピーク溶出終了点をピーク接線の傾きから検出し、ヘモグロビンF溶出開始時間から溶出終了時間の範囲で溶出ピークの面積を計算して定量を行った。結果を表4に示す。このような、従来の方法では、ヘモグロビンFの定量ができないというわけではないが、5回の定量結果がわずかながら変動している。このことから、本発明では、従来方法と比較して特に再現性の面で有効であることが分かる。
Claims (1)
- 陽イオン交換カラムを用いる液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンFの定量方法であって、以下の工程からなる方法。
(a)ヘモグロビンF含有試料をカラムに供し、ヘモグロビンFを他のヘモグロビンから分離して溶出させ、クロマトグラムを得る工程、
(b)クロマトグラムからヘモグロビンFの溶出を同定し、その溶出開始時間、ピーク及びピーク溶出時間(t0)を同定する工程、
(c)ヘモグロビンFピークからクロマトグラムベースラインに向かう垂線上で、当該ピーク高さの1/2となる点(h1/2点)を同定する工程、
(d)クロマトグラムベースラインと平行でh1/2点を通過する直線と、ヘモグロビンFのクロマトグラム背面との交点を求め、該交点の溶出時間とt0の差(t)を求める工程、
(e)ヘモグロビンFのクロマトグラムの面積計算を、ヘモグロビンF溶出開始時間からt0+Kt(Kは2以上かつ3以下の整数)の範囲で行う工程。
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JP2013115108A JP2014235023A (ja) | 2013-05-31 | 2013-05-31 | 液体クロマトグラフィーを用いたヘモグロビンfの定量方法 |
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EP4249905A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-27 | ARKRAY, Inc. | Method of measuring hemoglobin f |
EP4249906A1 (en) | 2022-03-22 | 2023-09-27 | ARKRAY, Inc. | Method of measuring hemoglobin f |
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2013
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