JP7231607B2 - プロバイオティクスの性質を有する弱毒生コレラワクチン - Google Patents

Description

ATCC PTA-125138

連邦政府資金援助による研究または開発
この発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号ＡＩ０４２３４７およびＡＩ－１２０６６５による政府支援でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年７月１２日に出願された米国特許出願第６２／５３１，５５１号明細書、および２０１８年６月４日に出願された米国特許出願第６２／６８０，２８６号明細書の優先権の利益を主張する。前述の出願のそれぞれの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。

遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌、前記細菌を含む薬学的組成物、ならびに前記細菌および／または前記細菌を含む薬学的組成物を用いて、迅速なプロバイオティクスによる保護と適応免疫応答の誘発の組合せを通して、コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株により引き起こされる疾患から保護する方法が本明細書に記載されている。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子出願され、全体として参照により本明細書に組み入れられる配列表を含有する。２０１８年７月１０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２９６１８－０１７５ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズが５．０３メガバイトである。

コレラは、グラム陰性細菌コレラ菌（Vibrio cholerae）の感染により引き起こされる下痢性疾患である。その疾患は、急速な致死性であり得、大発生が、爆発的に広がる場合が多い。その疾患と戦う取り組みとして、経口的水分補給および抗生物質治療が挙げられる。しかしながら、その疾患は、発展途上国および不安定な国においては、公衆衛生上の大きな危険である（例えば、Bohles et al. (2014) Hum. Vaccin. Immunother. 10(6): 1522-35）。死滅したコレラ菌（Vibrio cholerae）細菌株を含むワクチンを配備するワクチン接種キャンペーンは現在、進行中である。しかしながら、進行中の流行の拡散を抑えるため（いわゆる「受け身的ワクチン接種（reactive vaccination）」）のこれらのワクチンの有用性は、ワクチン接種された対象がコレラに対して抵抗性になるのに必要とされる時間に依存する。現在のワクチンにより誘発される防御免疫応答は、典型的には、顕在化するのに数日または数週間かかり、複数回のワクチン投与を必要とする場合が多い。したがって、単回投与後にコレラ菌（Vibrio cholerae）からの迅速な保護を誘導することができるワクチンの必要性がある。

Bohles et al. (2014) Hum. Vaccin. Immunother. 10(6): 1522-35

コレラから迅速に保護するためのプロバイオティクス剤として、および既存のコレラワクチンについて見られるコレラに対する長寿命の防御免疫を誘発し得る伝統的なワクチンとしての両方で、前例のない様式で作用する弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌株が本明細書に記載されている。ＨａｉｔｉＶのような本明細書に記載された弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌株は、最近の臨床分離株に由来し、複数の遺伝子改変を含み、ヒトにおいてコレラに対する長寿命免疫を生じるそれらの潜在能力を示唆／予測する、ロバストな、複数日の腸の占有を示す。驚くべきことに、弱毒細菌株の単回投与は、コレラの乳児ウサギモデルにおいてＨａｉｔｉＶ投与から２４時間以内に致死的曝露からの保護を与える能力がある。感染の新生仔モデルにおけるそのような迅速な保護の観察は、伝統的なワクチンにより誘発される防御免疫とは一致しない。それどころか、複数の曝露株に対するコロニー形成抵抗性および疾患保護を迅速に媒介する、生きているＨａｉｔｉＶの能力は、ＨａｉｔｉＶが、既存のワクチンと違って、コレラからのプロバイオティクスによる保護を与えることを示す。さらに、数学的モデル化は、ＨａｉｔｉＶ媒介性保護の前例のない速度が、受け身的ワクチン接種の公衆衛生上の影響を劇的に向上させ得ることを示している。したがって、本明細書に記載された細菌株の投与は、コレラ感染のリスクを、特に、進行中の流行の間、迅速と長寿命の両方の保護を生じることにより、低下させるために用いることができる。

さらに、弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌株は、毒性遺伝子を再獲得することにより毒性株へ復帰するように誘導され得、ＨａｉｔｉＶの毒素産生性への復帰変異の可能性を防止および／または軽減する方法もまた提供される。特に懸念されるのは、病原体の主要な下痢原性因子である、コレラ毒素をコードする遺伝子であり、それらは、生コレラワクチンから欠失している。コレラ毒素をコードするバクテリオファージ（ＣＴＸΦ）による再感染または自然形質転換を含む遺伝子水平移動の任意の手段は、ワクチン復帰変異を誘導するのに十分であり得る。本出願人らは、コレラ毒素の活性サブユニットをコードするｃｔｘＡ遺伝子を特異的にターゲットする能力があるＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼシステムを含むように改変された弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌株を開発した。このストラテジーは、コレラ菌（V. cholerae）細菌が、ＣＴＸΦプロファージの感染を含む任意の手段によりｃｔｘＡを再獲得することを防止するためのバイオセーフティ機構を提供する。さらに、このストラテジーは、プラスミドにコードされたまたは染色体に組み込まれた構築物から抗毒性因子ＣＲＩＳＰＲシステムを産生するように菌株を設計することにより、他の弱毒ワクチン株（例えば、ＶａｘｃｈｏｒａおよびＰｅｒｕ－１５）へ一般化することができる。

一態様において、本開示は、コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失；Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を有する遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を提供する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌のゲノムへ組み込まれたｃｔｘＡ遺伝子内に位置するコレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコア領域の核酸配列における欠失を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのＲＳ２領域の核酸配列における欠失を有する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を有する。

別の態様において、本開示は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列、およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがＣＴＸΦの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を有する遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を提供する。

いくつかの実施形態において、ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列は、ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｔｘＡ、およびｃｔｘＢからなる群から選択される遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列は、ｃｔｘＡ遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、核酸配列５’－ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号３）を含み、またはそれからなる。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコピーを事前に有していない。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、多機能性自己プロセシング毒素内リピート（ＭＡＲＴＸ）毒素をコードする核酸配列における欠失を有する。いくつかの実施形態において、ＭＡＲＴＸ毒素をコードする核酸配列は、ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、およびｒｔｘＥからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ－ベータをコードする核酸配列における欠失を有する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ－ベータをコードする核酸配列は、ｈｕｐＢ遺伝子である。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、フラゲリンをコードする核酸配列における欠失を有する。いくつかの実施形態において、フラゲリンをコードする核酸配列は、ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は異種性核酸を含み、前記異種性核酸は、プロモーターに作動可能に連結しているコレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、コレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子は、ｃｔｘＢ遺伝子である。いくつかの実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｐ_ｈｔｐｇプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列における欠失を有する。いくつかの実施形態において、ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列はｒｅｃＡ遺伝子である。

別の態様において、本開示は、ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、ｒｔｘＥ、およびｒｔｘＨからなる群から選択されるＭＡＲＴＸ毒素をコードする１つまたは複数の核酸配列における欠失；ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される１つまたは複数のフラゲリン遺伝子における欠失；ｒｅｃＡ遺伝子における欠失；ならびに前記異種性核酸がプロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）に作動可能に連結したｃｔｘＢ遺伝子を含む、異種性核酸を有する、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を提供する。いくつかの実施形態において、前記細菌は、その細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、前記細菌は、その細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦプロファージゲノムのコピーを事前に有していない。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡが、ｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＴＸΦの標的核酸配列は、ｃｔｘＡ遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、核酸配列５’－ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔ ａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号３）を含み、またはそれからなる。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、およびクロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列のうちの１つまたは複数における欠失を有する。いくつかの実施形態において、トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子は、ｄｆｒＡである。いくつかの実施形態において、スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子は、ｓｕｌ２である。いくつかの実施形態において、ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子は、ｓｔｒＡＢである。いくつかの実施形態において、クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子は、ｆｌｏＲである。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｅｌ Ｔｏｒバイオタイプに属する親株に由来する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｈａｉｔｉ親株に由来する。

いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、配列番号７の核酸配列を含み、またはそれからなる第１の細菌染色体を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、配列番号５１の核酸配列を含み、またはそれからなる第２の細菌染色体を含む。

一態様において、本開示は、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であって、前記細菌が、それの親株（例えば、毒性親株）と比べて、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２５１３８を有する株と同じ遺伝子における変異を有する、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を提供する。

別の態様において、本開示は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２５１３８を有するコレラ菌（V. cholerae）株である、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を提供する。

本開示はまた、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。

本開示はさらに、対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法であって、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌、または前記細菌を含む薬学的組成物を前記対象に投与して、それにより、前記対象（例えば、ヒト対象）においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、防御応答は、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌または薬学的組成物を対象へ投与してから２４時間以内に誘導される。

本開示はまた、対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法における使用のための、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を提供する。

コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株を有する対象を処置する方法における使用のための、本明細書に提供された遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌もまた提供される。

別の態様において、本開示はまた、少なくとも１つの毒性遺伝子の欠失；Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸；およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つまたは複数の異種性核酸であって、前記ｇＲＮＡが前記欠失した毒性遺伝子の標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸を有する遺伝子組換え型細菌であって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子が前記ｇＲＮＡと結合して、それにより複合体を形成する能力があり、前記複合体が、前記欠失した毒性遺伝子の核酸配列をターゲットして、切断する能力がある、遺伝子組換え型細菌を提供する。いくつかの実施形態において、前記細菌は、コレラ菌（Vibrio cholerae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびクロストリディオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）からなる群から選択される種である。いくつかの実施形態において、毒性遺伝子は、ｃｔｘＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＱ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｈｔｒＡ、ｓｓａＶ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｓｅｔ、ｓｅｎ、ｖｉｒＧ／ｉｃｓＡ、ｌｕｃ、ａｒｏＡ、ｍｓｂＢ２、ｓｔｘＡ、ｓｔｘＢ、ａｍｐＧ、ｄｎｔ、ｔｃｄＡ、およびｔｃｄＢからなる群から選択される。

本開示はまた、本明細書に提供された遺伝子組換え型細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。

本明細書に提供された遺伝子組換え型細菌または前記遺伝子組換え型細菌を含む薬学的組成物を対象に投与し、それにより前記対象（例えば、ヒト対象）において細菌の毒性株に対する防御応答を誘導することを含む、対象において本明細書に記載された細菌の毒性株（例えば、コレラ菌（Vibrio cholerae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびクロストリディオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile））に対する防御応答を誘導する方法もまた提供される。

他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される；当技術分野において知られた他の適切な方法および材料もまた、用いることができる。その材料、方法、および例は、例証となるのみであり、限定することを意図するものではない。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図から、ならびに特許請求の範囲から、明らかであろう。

ＣＴＸΦプロファージ、およびサテライトプロファージ、ＴＬＣとＲＳ１を含む隣接配列、ならびにＭＡＲＴＸ毒素遺伝子の欠失を描く図である（影の部分が欠失した領域である）。 トリメトプリム（ｄｆｒＡ）、スルファメトキサゾール（ｓｕｌ２）、ストレプトマイシン（ｓｔｒＡＢ）、およびクロラムフェニコール（ｆｌｏＲ）に対する抵抗性を与える遺伝子における欠失を描く図である。 図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、ＣＴＸΦ感染に対する免疫を提供する抗ｃｔｘＡ ＣＲＩＳＰＲシステムを描く図である。図３Ａは、ＨａｉｔｉＶ ｌａｃＺ遺伝子座へ組み込まれた、ｃｔｘＡをターゲットするガイドＲＮＡをコードする配列と共に化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９を描く。図３Ｂは、抗ｃｔｘＡ Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡ複合体によるＣＴＸΦゲノムのターゲティングを示す概略図である。図３Ｃは、ＣＴＸΦ－ＩＧＫｎ（標的＋；遺伝子間Ｋａｎ^Ｒカセット、無傷ｃｔｘＡ）またはＣＴＸ－ＫｎΦ（標的－；ｃｔｘＡがＫａｎ^Ｒカセットに置き換えられている）のいずれかに感染したＣＲＩＳＰＲシステム有り／無し（ＣＲＩＳＰＲ＋／－）のＨａｉｔｉＶにおける形質導入効率を示す棒グラフであり、形質導入体の数がモニターされた。検出可能なＫａｎ^Ｒ形質導入体がない場合は「^＊」として示されている。 図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、および４Ｅは、ＨａｉｔｉＶが、コレラ様疾患を引き起こすことなく乳児ウサギ腸にコロニー形成することを示す図である。図４Ａは、同腹仔が、野生型（「ＷＴ」；ｎ＝１１）かまたはＨａｉｔｉＶ（「ワクチン」；ｎ＝１０）のいずれかを接種された後の液体貯留比を描く棒グラフである。プロットは、２匹の同腹仔から導かれた平均および標準偏差を示す。^＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、独立ｔ検定。図４Ｂは、およそ１０^９ＣＦＵ ＨａｉｔｉＶを接種された動物（ｎ＝１０）の連続的な毎日の体重を示す折れ線グラフである。図４Ｃは、接種後１日目または４日目におけるウサギ遠位小腸（ｄＳＩ）から回収されたＷＴ ＣＦＵ（丸）またはＨａｉｔｉＶ ＣＦＵ（四角形）を示すドットプロットである（２匹の同腹仔／群）。線は幾何平均を示す。中空の点は、ＣＦＵが回収されなかった検出の限界を示す。ＮＳ：Ｐ＞０．０５、クラスカル－ウォリス検定、続いて、Ｄｕｎｎの多重比較検定。 図４Ｄは、ＷＴとＨａｉｔｉＶの１：１混合物の接種から１日後のｄＳＩ細菌の競争力指数（ＣＩ）を描く。中空の点は、ワクチンＣＦＵが回収されなかった検出の限界を示す；線およびバーは、２匹の同腹仔に渡るＣＩの幾何平均および幾何標準偏差を示す（ｎ＝６）。図４Ｅは、同時接種された動物から回収されたＷＴ ＣＦＵ（丸）およびＨａｉｔｉＶ ＣＦＵ（四角形）を示すドットプロットである；線は幾何平均を示す。 図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、および５Ｇは、ＨａｉｔｉＶが、様々なサイズの感染ボトルネックに関連したコロニー形成抵抗性を媒介することを示す図である。図５Ａは、ＷＴの接種から１８時間後に動物のｄＳＩから回収されたＷＴ ＣＦＵ（丸）を示す。同腹仔は、ＷＴ曝露の２４時間前に炭酸水素ナトリウムバッファー（モック、ｎ＝８）またはホルマリン死滅型ＨａｉｔｉＶ（死滅型ワクチン、ｎ＝７）で前処置された；３匹の同腹仔に渡る各群の幾何平均が示されている。ＮＳ：Ｐ＞０．０５、マン－ホイットニー検定。図５Ｂは、ＷＴでの曝露から１８時間後に動物のｄＳＩから回収されたＷＴ ＣＦＵ（丸）またはＨａｉｔｉＶ ＣＦＵ（四角形）を示す。動物は、曝露の２４時間前に死滅型ワクチン（ｎ＝６）または生ワクチン（ｎ＝８）で前処置された。中空の点は、ＣＦＵが回収されなかった検出の限界を示し、線は、２匹の同腹仔に渡る各群の幾何平均を示す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、マン－ホイットニー検定。 図５Ｃは、Ｎ１６９６１株のＷＴでの曝露から１８時間後に動物のｄＳＩから回収されたＷＴ ＣＦＵ（丸）またはＨａｉｔｉＶ ＣＦＵ（四角形）を示す。動物は、曝露の２４時間前に死滅型ワクチン（ｎ＝６）または生ワクチン（ｎ＝８）で前処置された。中空の点は、ＣＦＵが回収されなかった検出の限界を示し、線は、２匹の同腹仔に渡る各群の幾何平均を示す。^＊Ｐ＜０．０５、マン－ホイットニー検定。図５Ｄは、前処置なしにトランスポゾン変異体ライブラリーの接種から１日後に個々の動物（ウサギｒ１～ｒ６）のｄＳＩから回収された、ＷＴ ＣＦＵ（丸）および固有のトランスポゾン変異体（三角形）を描く。 図５Ｆは、トランスポゾン変異体ライブラリーの接種から１日後に個々の動物（ウサギｒ１～ｒ７）のｄＳＩから回収された、ＷＴ ＣＦＵ（丸）、ＨａｉｔｉＶ ＣＦＵ（四角形）、および固有のトランスポゾン変異体（三角形）を描く。動物は、トランスポゾン変異体ライブラリーでの曝露の２４時間前にＨａｉｔｉＶで前処置された。図５Ｅは、最大数の固有の遺伝子型での単一接種試料（ウサギｒ４）についてのＣｏｎ－ＡＲＴＩＳＴ（Pritchard et al. (2014) PLoS Genet. 10: e1004782参照）分析の結果を描く。ｘ軸は、インビボでの遺伝子あたりの挿入変異体の相対的存在量の変化を示し、ｙ軸は、各遺伝子内の独立した挿入変異体の一致を示す。複数の変異体に渡る２倍より大きい倍数変化（Ｌｏｇ_２（平均倍数変化）＜－１または＞１）を示す遺伝子（平均逆Ｐ値＞１０^２）は、枯渇した／濃縮されたと考えられる。濃縮された変異体ｃｑｓＳおよびｈａｐＲが示されている。毒素共調整線毛生合成（丸）、ならびに関連した転写制御因子ｔｏｘＲおよびｔｏｘＳ（アスタリスク）を含む重要なコロニー形成因子における変異が枯渇した。 図５Ｇは、最大数の固有の遺伝子型での逐次的接種試料（ウサギｒ６）についてのＣｏｎ－ＡＲＴＩＳＴ（Pritchard et al. (2014) PLoS Genet. 10: e1004782参照）分析の結果を描く。ｘ軸は、インビボでの遺伝子あたりの挿入変異体の相対的存在量の変化を示し、ｙ軸は、各遺伝子内の独立した挿入変異体の一致を示す。複数の変異体に渡る２倍より大きい倍数変化（Ｌｏｇ_２（平均倍数変化）＜－１または＞１）を示す遺伝子（平均逆Ｐ値＞１０^２）は、枯渇した／濃縮されたと考えられる。濃縮された変異体ｃｑｓＳおよびｈａｐＲが示されている。毒素共調整線毛生合成（丸）、ならびに関連した転写制御因子ｔｏｘＲおよびｔｏｘＳ（アスタリスク）を含む重要なコロニー形成因子における変異が枯渇した。 図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、ＨａｉｔｉＶコロニー形成が、ＨａｉｔｉＷＴ曝露後の疾患から保護し、モデル化がコレラ大発生中の迅速な保護の恩恵を実証することを示す図である。図６Ａは、死滅型ワクチン（黒色）または生ワクチン（赤色）での前処置（ｔ＝－２４時間目における）後、０時間目にＷＴを接種された動物における瀕死の疾患状態への進行を追跡する生存曲線を描く。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｌｏｇランク検定。図６Ｂは、目に見える下痢を発症した（図６Ａからの）動物における下痢の発生から瀕死状態への疾患進行を描く。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｌｏｇランク検定。 図６Ｃは、瀕死の疾患状態へ進行しなかった（図６Ａからの）動物のｄＳＩから回収されたＷＴ ＣＦＵ（丸）を描く。図６Ｄは、点線で示された、症候性個体の数が１０００個（全集団の１％）に達した時点で、受け身的ワクチン接種キャンペーン（ＲＶＣ）が発動される場合、１００，０００個の感受性個体の集団における単一感染から始まるシミュレーションされた大発生（Ｒ_０＝２．１）におけるコレラ感染者の数への受け身的ワクチン接種の効果を描く。投薬のロールアウトは、最近の受け身的ワクチン接種キャンペーンにより達成されているように、集団の７０％がワクチン接種されるまで、７日間を通して一定の割合を以て、モデル化される。モデル化パラメータは図１０Ｂに記載されている。 ＨａｉｔｉＶがコレラ毒素のＢサブユニットのみを産生することを示すウェスタンブロットの図である。Ｈａｉｔｉ野生型（「Ｈａｉｔｉ ＷＴ」）およびＨａｉｔｉＶ、加えて、精製されたコレラ毒素（「精製ＣＴ」）由来の無細胞上清は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離された。ポリクローナル抗ＣＴＸ抗体でのイムノブロッティングにより、ＨａｉｔｉＶの上清においてＣＴ－Ｂの存在が明らかにされたが、ＣＴ－Ａの存在は示されなかった。 図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄは、単一接種試料についてのＣｏｎ－ＡＲＴＩＳＴ分析の結果を示す。ｘ軸は、インビボでの遺伝子あたりの挿入変異体の相対的存在量の変化を示し、ｙ軸は、各遺伝子内の独立した挿入変異体の一致を示す。複数の変異体に渡る２倍より大きい倍数変化（Ｌｏｇ_２（平均倍数変化）＜－１または＞１）を示す遺伝子（平均逆Ｐ値＞１００）は、枯渇した／濃縮されたと考えられる。ｃｑｓＳおよびｈａｐＲが示されている。毒素共調整線毛生合成コンポーネント（丸）、ならびに関連した転写制御因子ｔｏｘＲおよびｔｏｘＳ（アスタリスク）を含むコロニー形成因子のサブセットもまた示されている。 図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、および９Ｄは、逐次的接種試料についてのＣｏｎ－ＡＲＴＩＳＴ分析の結果を示す。ｘ軸は、インビボでの遺伝子あたりの挿入変異体の相対的存在量の変化を示し、ｙ軸は、各遺伝子内の独立した挿入変異体の一致を示す。複数の変異体に渡る２倍より大きい倍数変化（Ｌｏｇ_２（平均倍数変化）＜－１または＞１）を示す遺伝子（平均逆Ｐ値＞１０^２）は、枯渇した／濃縮されたと考えられる。ｃｑｓＳおよびｈａｐＲが示されている。毒素共調整線毛生合成コンポーネント（丸）、ならびに関連した転写制御因子ｔｏｘＲおよびｔｏｘＳ（アスタリスク）を含むコロニー形成因子のサブセットもまた示されている。 図１０Ａは、遅延性ワクチン効果に関するＳＥＩＲコレラ伝播モデルの概観を描く図である。円は、モデルの亜集団（感受性亜集団（Susceptible）、曝露された亜集団（Exposed）、感染性亜集団（Infectious）、回復した亜集団（Recovered）、下付き文字Ｕ：ワクチン接種されていない、Ｖ：ワクチン接種されたが、まだ保護されていない、およびＰ：保護された）を示し、一方、矢印は、亜集団間の移行を示す。図１０Ｂはモデル化に用いられたパラメータのリストである。 図１１Ａおよび１１Ｂは、ワクチン接種キャンペーンの伝播能力（Ｒ_０）およびロールアウト率（図１１Ａ）または発動閾値（図１１Ｂ）のいずれかの、遅効性ワクチンに対する速効性ワクチンの相対的保護（症例における低下率）への影響を示す図である。 図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、および図１２Ｄは、ＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を接種されたマウス由来の血清の殺ビブリオ性活性を描くグラフである。図１２Ａは、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株に対する、ＨａｉｔｉＶを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来の血清の殺ビブリオ性応答を描くグラフである。図１２Ｂは、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株に対する、ＨａｉｔｉＶ（黒塗り丸）かまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（白抜き四角形および点線）のいずれかを接種されたＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス由来の血清の殺ビブリオ性応答を描くグラフである。図１２Ｃは、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株に対する、ＨａｉｔｉＶを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウス由来の血清の殺ビブリオ性応答を描くグラフである。図１２Ｄは、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株に対する、ＨａｉｔｉＶ（黒塗り丸）またはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（白抜き四角形および点線）のいずれかを接種されたＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス由来の血清の殺ビブリオ性応答を描くグラフである。ｘ軸より上の肉太の黒色ダッシュ記号は、動物がＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を経口胃的に接種された時点を示す。ｙ軸に沿った点線はアッセイの検出限界を示す。 図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃ、および１３Ｄは、ＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を接種されたマウスにおける経時的な、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯ抗原特異的多糖（ＯＳＰ）に対するＩｇＡおよびＩｇＧ応答を描くグラフである。図１３Ａは、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＡ応答を描くグラフである。図１３Ｂは、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶ（黒塗り丸）またはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（白抜き四角形および点線）のいずれかを接種されたＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＡ応答を描くグラフである。図１３Ｃは、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＧ応答を描くグラフである。図１３Ｄは、血清型Ｏｇａｗａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶ（黒塗り丸）またはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（白抜き四角形および点線）のいずれかを接種されたＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＧ応答を描くグラフである。ｘ軸より上の肉太の黒色ダッシュ記号は、動物がＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を経口胃的に接種された時点を示す。 図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、および１４Ｄは、ＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を接種されたマウスにおける経時的な、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯ抗原特異的多糖（ＯＳＰ）に対するＩｇＡおよびＩｇＧ応答を描くグラフである。図１４Ａは、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＡ応答を描くグラフである。図１４Ｂは、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶ（黒塗り丸）またはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（白抜き四角形および点線）のいずれかを接種されたＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＡ応答を描くグラフである。図１４Ｃは、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶを接種されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＧ応答を描くグラフである。図１４Ｄは、血清型Ｉｎａｂａコレラ菌（V. cholerae）株由来のＯＳＰに対する、ＨａｉｔｉＶ（黒塗り丸）またはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（白抜き四角形および点線）のいずれかを接種されたＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおける抗ＯＳＰ ＩｇＧ応答を描くグラフである。ｘ軸より上の肉太の黒色ダッシュ記号は、動物がＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を経口胃的に接種された時点を示す。

遺伝子組換え型細菌
対象への投与から２４時間以内に毒性コレラ菌（Vibrio cholerae）からの保護を誘導するために用いられ得る遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌が、本明細書で提供される。弱毒生コレラ菌（V. cholerae）細菌株でのワクチン接種は、その細菌に対する防御免疫応答を誘導するための有望なストラテジーである。コレラ菌（V. cholerae）における主要な毒性因子、コレラ毒素（ＣＴ）をコードする遺伝子（ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ）は、多くの弱毒生コレラ菌（V. cholerae）ワクチン候補から欠失しているが、ＣＴＸΦ（コレラ菌（V. cholerae）に感染し、それのゲノムをコレラ菌（V. cholerae）染色体へ組み込み、および／またはプラスミドとして染色体外で複製する糸状バクテリオファージ）により運ばれる。したがって、コレラ菌（V. cholerae）の弱毒株のＣＴＸΦ感染が、その株を毒性状態に復帰変異するように誘導し得る重大なリスクがある；自然形質転換を含む、遺伝子獲得の他の手段もまた、復帰変異を媒介することができる。例えば、弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌株によるＣＴＸΦ感染または形質転換により、コレラ毒素の獲得の可能性を防止および／または軽減する方法は、弱毒コレラ菌（V. cholerae）株を含むワクチンのバイオセーフティを保証するために非常に望ましい。

いくつかの実施形態において、細菌は、弱毒化されている（すなわち、それが由来した親株と比較して毒性が低下している）。細菌は、弱毒化状態を達成するために、本明細書に記載された遺伝子改変の１つまたは複数を含み得る。遺伝子改変には、遺伝子の完全なまたは部分的な欠失、およびその遺伝子を発現する細菌の能力を変化させる（例えば、それを作動不能にするプロモーターエレメントへの変化）遺伝子改変が挙げられるが、それらに限定されない。

いくつかの実施形態において、細菌はビブリオ属である。いくつかの実施形態において、細菌は、コレラ菌（Vibrio cholerae）種である。臨床分離株を含む任意のコレラ菌（V. cholerae）株が本明細書に記載されているように用いることができる。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏ１血清型に属する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏ１血清型に属し、古典的バイオタイプである。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏ１血清型に属し、Ｅｌ Ｔｏｒバイオタイプである。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏ１血清型に属し、バリアントＥｌ Ｔｏｒバイオタイプである。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏ１３９血清型に属する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｉｎａｂａ血清型に属する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏｇａｗａ血清型に属する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｈｉｋｏｊｉｍａ血清型に属する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｈａｉｔｉａｎ臨床分離株に由来する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｏ３９５、Ｎ１６９６１、Ｂ３３、ＩＢ４１２２、ＩＢ４６４２、およびＩＢ４７５５からなる群から選択される株に由来する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、Ｈ１株（ＫＷ３株としても知られている（ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ． ＧＣＦ＿０００２７５６４５．１およびＲｅｆ．Ｓｅｑ． ＧＣＦ＿００１３１８１８５．１参照））に由来する。毒性コレラ菌（V. cholerae）株は、以下の２つの主要な毒性因子をコードする：溶原性バクテリオファージＣＴＸΦおよび染色体病原性島、によりそれぞれコードされる、コレラ毒素（ＣＴ）および毒素共調整線毛（ＴＣＰ）。バクテリオファージＣＴＸΦは、コレラ菌（V. cholerae）の非病原性株を病原性株へ、ファージ感染（ファージゲノムが、宿主ゲノムへ統合され、またはプラスミドとして維持される過程であり、それらのどちらも宿主細菌に毒性遺伝子を提供する）を通して、変えることができる。

ＣＴＸΦゲノムは、サイズがおよそ６．９ｋｂであり、２つの機能的に別個の領域へと組織化される（例えば、McLeod et al. (2005) Mol. Microbiol. 57(2): 347-56；およびKim et al. (2014) J. Microbiol. Biotechnol. 24(6): 725-31参照）。第１の領域、リピート配列２（ＲＳ２）は、３つの遺伝子：ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、およびｒｓｔＢを含む。ｒｓｔＡおよびｒｓｔＢは、タンパク質ＲｓｔＡおよびＲｓｔＢ、それぞれをコードし、それらのタンパク質は、ＣＴＸΦ ＤＮＡ複製および細菌染色体への組込みに必要とされる。ｒｓｔＲは、レプレッサータンパク質ＲｓｔＲをコードする。コア領域と呼ばれる第２の領域は、遺伝子ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ（ｇＩＩＩ）、ａｃｅ、ｚｏｔ、およびｃｔｘＡＢを含む。ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ、ａｃｅ、およびｚｏｔ遺伝子は、タンパク質Ｐｓｈ、Ｃｅｐ、ＯｒｆＵ（ｐＩＩＩ^ＣＴＸ）、Ａｃｅ、およびＺｏｔ、をそれぞれコードし、それらのタンパク質は、ファージパッケージングおよび分泌に必要とされる。ｃｔｘＡＢは、コレラ毒素のタンパク質サブユニット、ＣｔｘＡおよびＣｔｘＢ、をそれぞれコードするｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子を含むオペロンである。一緒になって、ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢは、１つのＣＴ－Ａサブユニットおよび５つのＣＴ－Ｂサブユニットからなるコレラ毒素（ＣＴ）毒性因子をコードする。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたコレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌の毒性を低下させるために、細菌ゲノムに組み込まれる１つまたは複数のＣＴＸΦゲノム遺伝子の発現を低下させ、阻害し、および／または変化させるための１つまたは複数の遺伝子変化を含む。遺伝子変化には、遺伝子産物の発現および機能を変化させるためのＣＴＸΦゲノム遺伝子のオープンリーディングフレームにおける、または遺伝子の発現を阻害するためのプロモーターもしくは転写制御エレメントにおける欠失、変異、挿入が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、組み込まれたＣＴＸΦゲノムおよび隣接した（および関連した）ＲＳ１エレメント（ＣＴＸΦによりパッケージングされ得るサテライトファージ）の全コピーの欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、組み込まれたＣＴＸΦゲノム遺伝子の核酸配列における欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、細菌染色体へ組み入れられたＣＴＸΦゲノムを含み、またはそれからなる核酸配列を完全に欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、細菌染色体へ組み入れられたＣＴＸΦゲノムを含む核酸配列を部分的に欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、細菌染色体へ組み入れられたＣＴＸΦゲノムのＲＳ２領域を含み、またはそれからなる核酸配列を欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、細菌染色体へ組み入れられたＣＴＸΦゲノムのコア領域を含み、またはそれからなる核酸配列を欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ（ｇＩＩＩ）、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｔｘＡ、およびｃｔｘＢからなる群から選択される遺伝子を含み、またはそれからなる核酸配列を欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｃｔｘＡ遺伝子を含み、またはそれからなる核酸配列を欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｃｔｘＢ遺伝子を含み、またはそれからなる核酸配列を欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｃｔｘＡＢオペロンを含み、またはそれからなる核酸配列を欠失させるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＣＴＸΦファージが統合されるａｔｔＢ（付着）部位を欠失させるように遺伝子改変されている。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、細菌ゲノムに組み込まれる１つもしくは複数のＲＳ１サテライトファージ遺伝子および／または１つもしくは複数のＴＣＬサテライトファージ遺伝子の発現を低下させ、阻害し、および／または変化させるための１つまたは複数の遺伝子変化を含む。ＣＴＸΦプロファージゲノムの組み込まれたコピーに、ＲＳ１サテライトファージおよびＴＬＣサテライトファージのコピーが隣接している場合が多い。ＴＬＣサテライトファージは、コレラ菌（V. cholerae）ゲノムを、ＣＴＸΦおよびＲＳ１ファージの組込みを増強するように変化させることに関与し、一方、ＲＳ１ファージは、パッケージングおよび分泌のためにＣＴＸΦコードタンパク質の一部を用いる（例えば、Samruzzaman et al. (2014) Infect. Immun. 82(9): 3636-43参照）。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＲＳ１ファージゲノムの組み込まれたコピーの部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＲＳ１ファージゲノムの組み込まれたコピーの完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＲＳ１ファージ遺伝子の組み込まれたコピーの部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＲＳ１ファージ遺伝子の組み込まれたコピーの完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＴＬＣファージゲノムの組み込まれたコピーの部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＴＬＣファージゲノムの組み込まれたコピーの完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＴＬＣファージ遺伝子の組み込まれたコピーの部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＴＬＣファージ遺伝子の組み込まれたコピーの完全な欠失を含む。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌を、ＣＴＸΦの複製を促進する能力がないようにする遺伝子改変を含む。例えば、ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵβは、コレラ菌（V. cholerae）においてプラスミド型のＣＴＸΦの複製を促す（Martinez et al. (2015) PLoS Genetics 11(5): e1005256参照、その全内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている）。コレラ菌（V. cholerae）において、ＨＵβはｈｕｐＢ（ＶＣ１９１９としても知られている）によりコードされる。したがって、いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｈｕｐＢの機能および／または発現を変化させる遺伝子変化を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｈｕｐＢ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｈｕｐＢ遺伝子の完全な欠失を含む。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌を、多機能性自己プロセシング毒素内リピート（ＭＡＲＴＸ）毒素を産生および／または分泌する能力がないようにする遺伝子改変を含む。コレラ菌（V. cholerae）におけるＭＡＲＴＸ毒素ｒｔｘ遺伝子座は、２つの、異なって転写されるオペロン、ｒｔｘＨＣＡおよびｒｔｘＢＤＥからなる。コレラ菌（V. cholerae）において、ＭＡＲＴＸ毒素、ＲｔｘＡは、遺伝子ｒｔｘＡによりコードされ、腸の細菌コロニー形成を促進する（例えば、Satchell et al. (2015) Microbiol. Spectr. 3(3)、Fullner et al. (2002) J. Exp. Med. 195(11): 1455-62；およびOlivier et al. (2009) PLoS One 4(10): e7352参照、それらのそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられている）。隣接遺伝子ｒｔｘＣは、推定上のアシルトランスフェラーゼｒｔｘＣをコードし、一方、ｒｔｘＨは、特徴付けられていない機能を有する仮定上のタンパク質をコードする（Gavin and Satchell (2015) Pathog. Dis. 73(9): ftv092参照、その全内容は参照により本明細書に組み入れられている）。ｒｔｘＢＤＥオペロンの遺伝子は、専用のＭＡＲＴＸ毒素１型分泌装置（Ｔ１ＳＳ）をコードし、それにより、ｒｔｘＢおよびｒｔｘＥは、ＡＴＰアーゼタンパク質ＲｔｘＢおよびＲｔｘＥ、をそれぞれコードし、ｒｔｘＤは、膜貫通タンパク質ＲｔｘＤをコードし、そのＲｔｘＤは、外膜ポリンＴｏｌＣと協力して、ＲｔｘＡを細菌細胞質から細胞外環境へ分泌するように働く（Gavin and Satchell (2015)参照）。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ＭＡＲＴＸ毒素の機能を変化させる遺伝子変化を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＡ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＡ遺伝子の完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＢ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＢ遺伝子の完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＣ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＣ遺伝子の完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＤ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＤ遺伝子の完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＥ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＥ遺伝子の完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＨ遺伝子の部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＨ遺伝子の完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＨＣＡオペロンの部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＨＣＡオペロンの完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＢＤＥオペロンの部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｔｘＢＤＥオペロンの完全な欠失を含む。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、対象（例えば、ヒト対象）への投与後のその細菌の反応源性を低下させるための遺伝子改変を含む。いくつかの弱毒経口コレラ菌（V. cholerae）ワクチン株は、非コレラ性下痢および腹部仙痛を含む反応源性症状を引き起こしている；しかしながら、フラゲリンコード遺伝子を欠くコレラ菌（V. cholerae）株は、動物モデルにおいて反応源性の低下を示すことが実証されている（例えば、Rui et al. (2010) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 107(9): 4359-64参照、その全内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている）。コレラ菌（V. cholerae）は、５つのフラゲリンコード遺伝子を含む、２つのオペロン、ｆｌａＡＣおよびｆｌａＤＢＥを含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、フラゲリンをコードする少なくとも１つの遺伝子の機能を変化させる遺伝子変化を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、フラゲリンをコードする遺伝子における部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、フラゲリンをコードする遺伝子における完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびｆｌａＥからなる群から選択されるフラゲリン遺伝子における完全なまたは部分的な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｆｌａＡＣオペロンの完全なまたは部分的な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｆｌａＢＤＥオペロンの完全なまたは部分的な欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｆｌａＡＣオペロンとｆｌａＢＤＥオペロンの両方の完全なまたは部分的な欠失を含む。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、抗生物質抵抗性遺伝子の他の細菌への分散を防止するために抗生物質抵抗性遺伝子における欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、抗生物質抵抗性遺伝子における部分的欠失を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、抗生物質抵抗性遺伝子における完全な欠失を含む。いくつかの実施形態において、抗生物質抵抗性遺伝子は、ｆｌｏＲ（クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える）、ｓｔｒＡＢ（ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える）、ｓｕｌ２（スルフィソキサゾールおよびスルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える）、およびｄｆｒＡ（トリメトプリムに対する抵抗性を与える）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、以下の抗生物質抵抗性遺伝子のそれぞれの完全な欠失を含む：ｆｌｏＲ、ｓｔｒＡＢ、ｄｆｒＡ、およびｓｕｌ２。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その細菌を、ＲｅｃＡを産生する能力がないようにする遺伝子改変を含む。遺伝子ｒｅｃＡは、相同組換え、ＤＮＡ修復、およびＳＯＳ応答に関与する多機能タンパク質ＲｅｃＡをコードする（例えば、Thompson et al. (2004) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54 (Pt. 3): 919-24参照、その全内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている）。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｒｅｃＡ遺伝子における欠失を含む。いくつかの実施形態において、その欠失は部分的欠失である。いくつかの実施形態において、その欠失は完全な欠失である。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ｒｅｃＡの欠失は、コレラ菌（V. cholerae）細菌による相同組換え依存性遺伝子獲得およびＵＶ光などの環境的曝露から生じる変異を回復させるそれの能力を阻止する。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、異種性核酸または異種性遺伝子を含む。用語「異種性核酸」または「異種性遺伝子」は、天然で所定の細胞に通常見出されない核酸（例えば、所定の細胞へ外因的に導入される核酸、または対応する天然核酸とは異なる形で宿主細胞へ導入されている核酸）を指す。異種性核酸が、本明細書に記載されたコレラ菌（V. cholerae）細菌における使用のためにコドン最適化されている遺伝子を含み得ることは当業者により容易に理解されるだろう。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、抗原ポリペプチドをコードする異種性核酸を含む。いくつかの実施形態において、抗原ポリペプチドをコードする核酸の発現は、構成的プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態において、抗原ポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態において、抗原ポリペプチドをコードする異種性核酸は、細菌ゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態において、抗原ポリペプチドをコードする異種性核酸は、プラスミド上に存在する。いくつかの実施形態において、抗原ポリペプチドはコレラ毒素サブユニットＣｔｘＢである。本明細書に記載されたコレラ菌（V. cholerae）細菌によるコレラ毒素ＣｔｘＢサブユニットの発現は、その細菌が投与される対象において抗ＣｔｘＢ免疫応答の誘導を促して、それによりコレラ菌（V. cholerae）および腸内毒素原性大腸菌（E. coli）（ＥＴＥＣ）に対する免疫防御を生じ得るので、特に有利であり得る（例えば、Kauffman et al. (2016) mBio 7(6): e02021-16参照、その全内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている）。したがって、いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、コレラ菌（V. cholerae）ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、誘導性プロモーター（例えば、Ｐ_ｈｔｐｇプロモーター）に作動可能に連結しているコレラ菌（V. cholerae）ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、誘導性プロモーターに作動可能に連結しているコレラ菌（V. cholerae）ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸は、細菌染色体上に存在する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、変異Ｎ９００＿１１５５０：：Ｐｈｔｐｇ－ｃｔｘＢを含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その染色体へ、ＨａｉｔｉＷＴ（Ｂｉｏｐｒｏｊｅｃｔアクセッション番号ＰＲＪＮＡ２１５２８１；Ｂｉｏｓａｍｐｌｅアクセッション番号ＳＡＭＮ０４１９１５１４）のＮ９００＿１１５５０遺伝子座と相同な遺伝子座において組み込まれたＣｔｘＢをコードする異種性核酸を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その染色体へ、ＨａｉｔｉＷＴのＮ９００＿ＲＳ０７０４０遺伝子座と相同な遺伝子座において組み込まれたＣｔｘＢをコードする異種性核酸を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、その染色体へ、ＨａｉｔｉＷＴのＮ９００＿ＲＳ０７０４５遺伝子座と相同な遺伝子座において組み込まれたＣｔｘＢをコードする異種性核酸を含む。

いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、配列番号７の核酸配列を含み、またはそれからなる細菌染色体を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、配列番号５１の核酸配列を含み、またはそれからなる細菌染色体を含む。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、第１の細菌染色体および第２の細菌染色体を含み、前記第１の細菌染色体が配列番号７の核酸配列を含み、またはそれからなり、および前記第２の細菌染色体が配列番号５１の核酸配列を含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、コレラ菌（V. cholerae）細菌は、それの親株と比べて、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２５１３８を有する株と同じ遺伝子における変異を有する。いくつかの実施形態において、コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２５１３８を有するコレラ菌（V. cholerae）株（本明細書でＨａｉｔｉＶとして記載される）である。

プログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステム
本開示はさらに、事前に細菌株から除去された遺伝子（例えば、毒性遺伝子）を特異的にターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含む組換え細菌株を提供する。細菌株から除去された遺伝子をターゲットすることにより、組換え細菌による毒性表現型の復帰変異が、（例えば、前記遺伝子の再獲得を防止することにより）防止および／または改善され得る。本明細書に記載されているようなプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムの使用は、弱毒生ワクチン細菌株において、その株の弱毒表現型を維持するために、特に有用である。

任意の弱毒細菌株は、プログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを発現して、毒性表現型への復帰変異を防止および／または改善するように改変することができる。例えば、コレラ菌（V. cholerae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびクロストリディオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）（以前はクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile））の種の弱毒生細菌株が、その株において欠失している遺伝子（すなわち、その弱毒細菌株が由来した株と比較して）をターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを発現するように遺伝子操作することができる。例示的な弱毒生細菌株、およびその株において欠失する毒性遺伝子の説明は、表１に提供されている。これらの弱毒生細菌株において欠失する毒性遺伝子の例示的な配列は表２に提供されている。表１に提供された細菌株のそれぞれは、その株において欠失している遺伝子の少なくとも１つを特異的にターゲットするＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含むように、本明細書に記載されているように遺伝子改変することができる。例えば、いくつかの実施形態において、細菌株は、ｃｔｘＡ遺伝子における欠失、加えて、ｃｔｘＡ遺伝子をターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列）を含むコレラ菌（V. cholerae）株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｈｔｒＡ、ｓｓａＶ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｃｌｐＸ、およびｃｌｐＰから選択される少なくとも１つの毒性遺伝子における欠失、加えて、その欠失した毒性遺伝子（例えば、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｈｔｒＡ、ｓｓａＶ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｃｌｐＸ、およびｃｌｐＰ）の少なくとも１つをターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含むＳ．エンテリカ（S. enterica）株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｓｅｔ、ｓｅｎ、ｖｉｒＧ／ｉｃｓＡ、ｌｕｃ、ａｒｏＡ、およびｍｓｂＢ２から選択される少なくとも１つの毒性遺伝子における欠失、加えて、その欠失した毒性遺伝子（例えば、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｓｅｔ、ｓｅｎ、ｖｉｒＧ／ｉｃｓＡ、ｌｕｃ、ａｒｏＡ、およびｍｓｂＢ２）の少なくとも１つをターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含むＳ．フレクスネリ（S. flexneri）株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｓｅｎ、ｓｔｘＡ、ｓｔｘＢ、およびｍｓｂＢ２から選択される少なくとも１つの毒性遺伝子における欠失、加えて、その欠失した毒性遺伝子（例えば、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｓｅｎ、ｓｔｘＡ、ｓｔｘＢ、およびｍｓｂＢ２）の少なくとも１つをターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含む志賀赤痢菌（S. dysenteriae）株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、ｓｔｘＡ遺伝子および／またはｓｔｘＢ遺伝子における欠失、加えて、その欠失した毒性遺伝子（例えば、ｓｔｘＡおよび／またはｓｔｘＢ）をターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含むＳ．ソンネイ（S. sonnei）株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、ｄｎｔ遺伝子、ａｒｏＡ遺伝子および／またはａｒｏＱ遺伝子における欠失、加えて、その欠失した毒性遺伝子（例えば、ｄｎｔ、ａｒｏＡ、および／またはａｒｏＱ）をターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含む百日咳菌（B. pertussis）株である。いくつかの実施形態において、細菌株は、ｔｃｄＡ遺伝子および／またはｔｃｄＢ遺伝子における欠失、加えて、その欠失した毒性遺伝子（例えば、ｔｃｄＡおよび／またはｔｃｄＢ）をターゲットするプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを含むＣ．ディフィシル（C. difficile）株である。

いくつかの実施形態において、細菌は、ＣＴＸΦ核酸を特異的にターゲットし、それにより、以下の過程：ＣＴＸΦ遺伝子材料の細菌ゲノムへの挿入、ＣＴＸΦの複製、ＣＴＸΦのアセンブリー、および／もしくはＣＴＸΦの細菌からの放出の１つもしくは複数を防止もしくは中断し、またはＣＴＸΦゲノムの組み込まれたコピーを含む細菌を死滅させる、プログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを有するコレラ菌（V. cholerae）細菌である。いくつかの実施形態において、プログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムはｃｔｘＡ遺伝子をターゲットする。

用いられ得る関連ヌクレアーゼシステムには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、プレボテラ属およびフランシセラ属由来のＣＲＩＳＰＲ１（CRISPR from Prevotella and Francisella 1：Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、プログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムに関する用語「編集」は、標的核酸における点変異、挿入、欠失、フレームシフト、またはミスセンス変異などの変異を含む。ＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムは、毒性遺伝子（例えば、ｃｔｘＡなどのＣＴＸΦゲノムに存在する遺伝子）における核酸の配列に相補的である配列（すなわち、ターゲティングドメイン）、およびヌクレアーゼ分子（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子）によりターゲット可能である配列（例えば、ＰＡＭ配列またはダイレクトリピート配列）を含むガイドＲＮＡを含む。本明細書で用いられる場合、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）という用語は、ヌクレアーゼ分子を標的核酸へガイドする任意のＲＮＡ分子（例えば、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなど）を含む。ターゲティングに成功すると、ヌクレアーゼ分子は、毒性遺伝子（例えば、ｃｔｘＡ）における核酸を切断する。毒性遺伝子をプログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムで特異的にターゲットすることにより、弱毒細菌（例えば、弱毒サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）またはコレラ菌（V. cholerae）細菌）の毒性細菌への復帰変異は、防止および／または改善され得る。用語「防止」は、弱毒細菌が毒性型へ復帰変異し得るリスクの、どんなにわずかであろうと（例えば、１００％低下である必要はない）、任意の低下を指す。

いくつかの実施形態において、細菌は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸を含む。本例は、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子（ＳｐＣａｓ９）の使用を例示するが、下記で論じられているような、他の種由来の他のＣａｓ９ヌクレアーゼ分子（例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子（ＳａＣａｓ９））もまた用いることができる。複数のＣａｓ９ヌクレアーゼ分子の配列、加えて、それらのそれぞれのＰＡＭ配列は、当技術分野において知られている（例えば、Kleinstiver et al. (2015) Nature 523 (7561): 481-5；Hou et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.；Fonfara et al. (2014) Nucleic Acids Res. 42: 2577-90；Esvelt et al. (2013) Nat. Methods 10: 1116-2１；Cong et al. (2013) Science 339: 819-23；およびHorvath et al. (2008) J. Bacteriol. 190: 1401-12；国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット、および国際公開第２０１４／１４４７６１号パンフレット；米国特許第９，５１２，４４６号明細書；および米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５７号明細書参照；それらのそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられている）。ＳｐＣａｓ９システムのバリアントもまた用いることができる（例えば、切断型ｓｇＲＮＡ（Tsai et al. (2015) Nat. Biotechnol. 33: 187-97；Fu et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 279-84）、ニッカーゼ変異(Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 833-8 (2013)；Ran et al. (2013) Cell 154: 1380-9)、ＦｏｋＩ－ｄＣａｓ９融合体（Guilinger et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 577-82；Tsai et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32: 569-76；および国際公開第２０１４／１４４２８８号パンフレット；それらのそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み入れられている）。ヌクレアーゼには、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１１３５Ｅバリアント；ＳｐＣａｓ９ ＶＲＥＲバリアント；ＳｐＣａｓ９ ＥＱＲバリアント；ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲバリアント；ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子（ＳｔＣａｓ９）；トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子（ＴｄＣａｓ９）；または髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子（ＮｍＣａｓ９）の１つまたは複数、加えて、由来する酵素の少なくとも１つの機能、例えば、ｇＲＮＡと複合体形成し、そのｇＲＮＡにより特定化された標的ＤＮＡと結合し、その標的ＤＮＡの配列を変化させる（例えば、切断する）能力を保持する、それらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるそれらのバリアントを含み得る。

いくつかの実施形態において、細菌（例えば、コレラ菌（V. cholerae）細菌）は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸を含む。Ｃｐｆ１は、標的ＤＮＡ配列を切断するようにプログラムすることができるＣａｓタンパク質である（Zetsche et al. (2015) Cell 163: 759-71; Schunder et al. (2013) Int. J. Med. Microbiol. 303: 51-60；Makarova et al. (2015) Nat. Rev. Microbiol. 13: 722-36；Fagerlund et al. (2015) Genome Biol. 16: 251）。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ分子は、アシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１；ＮＣＢＩ参照配列：ＷＰ＿０２１７３６７２２．１）、またはそのバリアントである。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ分子は、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＷＰ＿０５１６６６１２８．１）またはそのバリアントである。ＳｐＣａｓ９と違って、Ｃｐｆ１は、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに相補的である２３ｎｔを３’末端に有する、単一の４２－ｎｔ ｃｒＲＮＡのみを必要とする（Zetsche et al. (2015)）。さらに、ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサーの３’側にあるＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識するが、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’側に見出されるＴＴＴＮ ＰＡＭを認識する（Zetsche et al. (2015)）。いくつかの実施形態において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ分子は、野生型Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ分子と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である、野生型Ｃｐｆ１分子のバリアントであり、それが由来した酵素の少なくとも１つの機能、例えば、ｇＲＮＡと複合体形成し、そのｇＲＮＡにより特定化された標的ＤＮＡと結合し、その標的ＤＮＡの配列を変化させる（例えば、切断する）能力を保持する。

２つの配列のパーセント同一性を決定するために、それらの配列は、最適な比較を目的としてアラインメントされる（最適なアラインメントに必要とされる場合、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方においてギャップが導入され、比較を目的として非相同配列が無視され得る）。比較を目的としてアラインメントされる参照配列の長さは、少なくとも８０％である（いくつかの実施形態において、参照配列の長さの約８５％、９０％、９５％、または１００％がアラインメントされる）。その後、対応する位置におけるヌクレオチドまたは残基が比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じヌクレオチドまたは残基によって占有されている時、その分子は、その位置において同一である。２つの配列間でのパーセント同一性は、その２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である。

配列の比較、および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムへ組み入れられているＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 444-53参照）を用いて決定することができる。

野生型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の通りである：

野生型ＳａＣａｓ９のアミノ酸配列は以下の通りである：

いくつかの実施形態において、細菌は、ｇＲＮＡをコードする異種性核酸配列を含み、前記ｇＲＮＡが、毒性遺伝子（例えば、ｃｔｘＡなどのＣＴＸΦゲノム遺伝子）の標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、表２に列挙された毒性遺伝子（例えば、ｃｔｘＡ、ａｒｏＤ、またはｈｔｒＡ）に存在する標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む。特定の標的に対する特異性を有するｇＲＮＡをデザインおよび作製する方法は、当技術分野において知られており、例えば、Prykhozhij et al. (2015) PLos One 10(3):e0119372；Doench et al. (2014) Nat. Biotechnol. 32(12): 1262-7；およびGraham et al. (2015) Genome Biol. 16: 260（それらのそれぞれは、参照により本明細書に明確に組み入れられている）に記載されている。

プログラム可能なＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムを有するコレラ菌（V. cholerae）
いくつかの実施形態において、毒性遺伝子はＣＴＸΦ遺伝子であり、細菌は、弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌である。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ＣＴＸΦゲノムの核酸配列を特異的にターゲットすることにより、ＣＴＸΦゲノムのコレラ菌（V. cholerae）細菌ゲノムへの組込みおよび／またはＣＴＸΦゲノムのプラスミドとしての維持（それらのいずれも、細菌を、毒性状態に適応させ、および／または復帰変異させ得る）を防止することが可能である。ｇＲＮＡは、ＣＴＸΦゲノムに存在する標的核酸配列と相補的なターゲティングドメインを含み得る；しかしながら、ｇＲＮＡがＣＴＸΦゲノムの核酸配列を特異的にターゲットし、および細菌ゲノム核酸配列をターゲットしないことが好ましい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＣＴＸΦ遺伝子に存在する標的核酸配列（例えば、ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ（ｇＩＩＩ）、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｔｘＡ、およびｃｔｘＢ）と相補的なターゲティングドメインを含む。ｃｔｘＡをターゲットすることが特に望ましい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ｃｔｘＡ遺伝子に存在する標的核酸配列と相補的なターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、核酸配列：５’－ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号３；ｃｔｘＡに特異的なターゲティング配列は下線で強調されている）を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、核酸配列：５’－ｔｔｔｔｔｇｔｃｇａｔｔａｔｃｔｔｇｃｔｇｔｔｃｔａｇａｇａｇｃｇｇｇａｇｃｔｃａａｇｔｔａｇａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔａｔｔｃａｇｔｇｃｇｇｇａｇｃａｃｇｇｃａｃｃｇａｔｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号４；ｒｓｔＡに特異的なターゲティング配列は下線で強調されている）を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、核酸配列：５’－ｔａａａｃａａａｇｇｇａｇｃａｔｔａｔａｇｔｔｇｇａｇａｇｇｃａｔｇａｇａａｔｇｃｃａａｇｔｔｃｃａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔａｃａｃａｃｃｔａｇｇａｇａｃｔａｇｇｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号５；ｃｔｘＡに特異的なターゲティング配列は下線で強調されている）を含む。

上で記載されているように、いくつかの実施形態において、遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸を含み得る。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ＣｔｘＢの発現は、対象において抗ｃｔｘＢ免疫応答を誘導し得る。この抗ｃｔｘＢ免疫応答は、毒性コレラ菌（V. cholerae）細菌株および／または腸内毒素原性大腸菌（E. coli）（ＥＴＥＣ）のいずれかにより引き起こされる下痢性疾患から保護し得る（例えば、Kauffman et al. (2016) MBio. 7(6): e 02021-16参照）。細菌が、ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸、加えてｃｔｘＢ遺伝子に存在する標的核酸配列と相補的なターゲティングドメインを含むｇＲＮＡを含むならば、前記ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸または前記ｇＲＮＡをコードする核酸のいずれかが、前記ｇＲＮＡが、前記ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸をターゲットしないように遺伝子組換えされ得ることを、当業者は容易に認識しているだろう。例えば、ｃｔｘＢ遺伝子を含む異種性核酸は、それがｇＲＮＡターゲティングドメイン配列に相補的ではないように、コドン配列を同義のコドン配列と置き換えるよう改変され得る。

使用方法
さらなる態様は、本明細書に提供された遺伝子組換え型細菌（例えば、遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌）を用いる方法を包含する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌を対象に（例えば、経口で）投与することにより対象の免疫系を調節するための方法が本明細書に提供される。方法は、本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌を含む組成物の有効量を対象（例えば、ヒト対象）に投与することを含む。組成物の有効量が、所望の応答（例えば、防御応答、粘膜応答、体液性応答、または細胞応答）を生じるだろう量であることを当業者は認識しているだろう。応答は、当技術分野において知られた方法により定量化することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された遺伝子改変型コレラ菌（V. cholerae）細菌、または本明細書に記載された遺伝子改変型コレラ菌（V. cholerae）細菌を含む薬学的組成物を投与することを含む、対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、防御応答は、薬学的組成物の遺伝子改変型細菌の対象への投与から約１２時間以内、約１８時間以内、約２４時間以内、約３６時間以内、約４８時間以内、約６０時間以内、約７２時間以内、または約８４時間以内に発生する。いくつかの実施形態において、防御免疫応答は、薬学的組成物の遺伝子改変型細菌の対象への投与から１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、６０時間以内、７２時間以内、８４時間以内、またはそれ以上の時間内に発生する。

さらなる実施形態において、本明細書に記載された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌は、必要としている宿主においてコレラの１つまたは複数の症状を改善するための方法に用いられ得る。コレラ症状には、下痢、悪心、嘔吐、および脱水症状が挙げられる。方法は、本明細書に記載された遺伝子組換え型コレラ菌（V. cholerae）細菌を含む組成物の有効量を投与することを含む。

本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌および前記細菌を含む組成物は、任意の対象に投与され得る。遺伝子組換え型細菌を含む例示的なワクチン組成物製剤および投与方法は下記で詳述されている。

薬学的組成物
本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌を含む薬学的組成物は、任意選択で、担体、保存剤、凍結保護物質（例えば、スクロースおよびトレハロース）、安定剤、アジュバント、および他の物質などの１つまたは複数の可能な薬学的に許容される賦形剤を含み得る。例えば、組成物が、生きている遺伝子組換え型細菌を含む場合、賦形剤は、その生細菌が死滅しないように、または対象に効果的にコロニー形成する細菌の能力が賦形剤の使用により損なわれないように、選択される。適切な薬学的担体は、当技術分野において知られており、例えば、それには、生理食塩水および生理的濃度での、またはそれに近い他の無毒性塩などの液体担体、ならびにタルクおよびスクロースなどの固体担体が挙げられる。いくつかの実施形態において、薬学的組成物はアジュバントを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象へのエアロゾル化投与に適した形をとり得る。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、フリーズドライの形（すなわち、凍結乾燥した形）をとる。いくつかの実施形態において、薬学的製剤はゼラチンカプセルである。適切な薬学的担体およびアジュバントおよび剤形の調製は、参照により本明細書に組み入れられている、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, (Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985)に記載されている。

本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌の対象への投与は、任意の公知の技術によることができ、その技術には、経口投与、直腸投与、腟内投与、または経鼻投与が挙げられるが、それらに限定されない。

対象に投与される遺伝子組換え型細菌の投薬量は、当業者により認識されているように、遺伝子組換え型細菌、投与経路、および意図される対象に依存して異なる。一般的に言えば、投薬量は、対象において防御的宿主応答を誘発するのに十分であることのみを必要とする。例えば、経口投与についての典型的な投薬量は、その細菌が投与される対象の年齢によって、約１×１０^７～１×１０^１０のコロニー形成単位（ＣＦＵ）であり得る。遺伝子組換え型細菌の複数回の投薬量を投与することもまた、所望のレベルの保護を提供するのに必要とされる場合、用いられ得る。

本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌または薬学的組成物を含むキットもまた提供される。いくつかの実施形態において、キットはさらに、使用説明書を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は凍結乾燥されており、それゆえに、水和剤（例えば、緩衝食塩水）の添加により組成物が再構成されて、対象への（例えば、経口での）投与に適した薬学的組成物を生じる。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例に開示された技術は、本発明の実施においてよく機能し得る、本発明者らにより発見された技術を代表することは、当業者により認識されているはずである。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態において多くの変化がなされ得、かつなお同様のまたは類似した結果を獲得し得ることを、当業者は、本開示を鑑みれば、認識するはずであり、それゆえに、記述されまたは添付の図面に示された全ての事柄は、例証として解釈されるべきであり、限定する意味に解釈されるべきではない。

本発明はさらに以下の実施例において記載され、その実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。

[実施例１]
遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌株は、投与から１日以内にコレラ菌（V. cholerae）の毒性株に対する抵抗性を与える
イエメンおよびハイチにおける大規模かつ進行中のコレラの流行は、この古代からの下痢性疾患が未だに公衆衛生にとっての重大な脅威であることを示している（Balakrishnan (2017) Lancet Infect. Dis. 17, 700-1;およびAli et al. (2015) PLoS Negl. Trop Dis. 9, e0003832）。コレラは、グラム陰性細菌病原体である、コレラ菌（Vibrio cholerae）により汚染された水または食物の摂取に起因する。コレラ菌（V. cholerae）は、小腸でコロニー形成し、そこで、それは、コレラ毒素を産生し、そのコレラ毒素が、激しい水様性下痢および結果としての脱水症状を引き起こし、それは、補水治療がなければ、速やかに死に至り得る（Clemens et al. (2017) Lancet 390(10101): 1539-49）。コレラ伝播を制限する公衆衛生介入は重要であり、そうでなければコレラ流行の激しい拡散が、特に、衛生インフラおよび給水における崩壊を伴って、起こるからである。死滅したコレラ菌（V. cholerae）細胞全体からなる経口コレラワクチン（ＯＣＶ）は、流行地において穏やかな防御効力を生じ（Qadri et al. (2015) Lancet 386(10001): 1362-71）、これらのワクチンは最近、コレラの拡散をブロックすることを目指した「受け身的ワクチン接種」プログラムの一部として非流行区域において、大発生中に配備された（例えば、Luquero et al. (2014) N. Engl. J. Med. 370(22): 2111-20参照）。しかしながら、死滅型ＯＣＶの最適な効力は、１４日間離して投与される２回分の冷蔵用量を必要とし（例えば、Kabir (2014) Clin. Vaccine Immunol. 21(9): 1195-1205参照）、これらの特徴は、不安定な、または資源の乏しい設定において、進行中の大発生を迅速に抑制する死滅型ＯＣＶの能力を制限し得る。単回投与の弱毒生ＯＣＶは、曝露研究（例えば、Chen et al. (2016) Clin. Infect. Dis. 62(11): 1329-35参照）および流行地における初期臨床試験（Qadri et al. (2007) Vaccine 25(2): 231-8）において効力を示し、弱毒生ＯＣＶでの受け身的ワクチン接種が、大発生中のコレラの発生率の減少に寄与した可能性がある（Calain et al. (2004) Vaccine 22(19): 2444-51参照）。しかしながら、２０１０年のハイチコレラ大発生の原因である株のような、世界的に優勢な「バリアント」Ｅｌ Ｔｏｒ株に基づいた生ＯＣＶはない（Chin et al. (2011) N. Engl. J. Med. 364(1): 33-42参照）。さらに、コレラからの迅速な（例えば、投与から２４時間以内の）保護を媒介することが示されている、死滅型ＯＣＶも弱毒生ＯＣＶもなく、それどころか、現在のワクチンは、コレラからの保護を生じ得る、防御的適応免疫応答を誘発するのに必要な時間（最低１週間）を必要とすると考えられている。この実施例は、投与から１日以内に、乳児ウサギを致死性コレラ様疾患から迅速に保護することが見出された、ハイチの大発生株に基づいた新しい弱毒生コレラワクチンの作製を記載する。

材料および方法
以下の材料および方法を、この実施例で用いた。
研究デザイン
この研究の目的は、新しい弱毒生コレラワクチン候補をデザインし、腸に安全にコロニー形成するその株の能力を評価し、その株が、それの投与後すぐにコレラ様疾患から動物を保護することができるかどうかを決定し、観察される保護パラメータの、流行中コレラ感染の発生率への潜在的影響を定量化することであった。ワクチン候補を、世界的に優勢なコレラ菌（V. cholerae）株の分離株から、連続的アレル交換ステップ（遺伝子操作参照）によって導き出し、変異を、全ゲノムシーケンシング（全ゲノムシーケンシング参照）により検証した。腸管定着およびコレラ様疾患の研究を、研究における動物の使用に関する連邦政府および機関のガイドラインに従って、乳児ウサギの感染モデルを用いて行った（乳児ウサギ感染研究参照）。日齢１～２日の動物を、処置群へランダムに割り当て、同腹仔内（すなわち、同時飼育され、かつ同年齢）の対照を用いて、同腹仔間の変動の影響を最小限にした。疾患進行の研究について、評価者は、各群に投与された処置を知らず、曝露から１０時間以内に死亡が見出された動物は、母親の拒絶と一致した身体外傷が原因として、排除された。トランスポゾン挿入シーケンシング研究を、ＡＲＴＩＳＴパイプラインを用いて行い、そのＡＲＴＩＳＴパイプラインは、実験ノイズをモデル化し、それを補い、効果サイズ閾値の設定についての推奨を提供する（トランスポゾン挿入シーケンシング分析を参照）。最後に、疾患伝播についての以前に発表されたパラメータのセットへワクチン保護までの可変時間を組み入れるモデル化を実施した（コレラ大発生のモデル化参照）。

統計的解析
２つの試料の比較を、ｔ検定の両側検定（α＝０．０５）（液体貯留比）、ノンパラメトリックなデータについてのマン－ホイットニーＵ検定（細菌負荷量）、またはログランク検定（生存曲線）を用いて実施した。３つの試料の比較を、クラスカル－ウォリス検定、続いて、Ｄｕｎｎの多重比較検定を用いて実施した（細菌負荷量）。

株、培地、および培養条件
表３は、この研究に用いられる株のリストを含有する。特に断りのない限り、コレラ菌（V. cholerae）および大腸菌（E. coli）を、溶原性ブロス（ＬＢ：１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）中、３７℃で振盪（２５０ＲＰＭ）させながら増殖させた。ファージ形質導入アッセイにおけるレシピエント株を、ＡＫＩ培地（１５ｇ／Ｌペプトン、４ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、オートクレーブし、その後、新鮮に作製されて、滅菌濾過された０．３％ＮａＨＣＯ_３を追加した）中で増殖させた。

抗生物質および基質を、特に断りのない限り、以下の濃度で用いた：ストレプトマイシン（Ｓｍ）（２００μｇ／ｍＬ）、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）、ＳＸＴ（１６０μｇ／ｍＬスルファメトキサゾール、３２μｇ／ｍＬトリメトプリム）、カナマイシン（Ｋｎ）（５０μｇ／ｍＬ）、および５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ ６０ｍｇ／ｍＬ）。

遺伝子操作
全ての遺伝子欠失および置換を、自殺ベクターｐＣＶＤ４４２、ＤＨ５α－λｐｉｒ、およびドナー株ＭＦＤ－λｐｉｒ（Ferrieres et al. (2010) J. Bacteriol. 192(24): 6418-27参照）またはＳＭ１０－λｐｉｒ（表３）を用いて、相同組換えによって構築した。全ての欠失について、それぞれのＯＲＦの上流および下流のおよそ５００～７００ｂｐ相同領域を、下記のプライマー組合せを用いて増幅し、ＸｂａＩにより消化されたｐＣＶＤ４４２へ等温アセンブリーを用いてクローニングした。

ＨａｉｔｉＷＴ株からのＨａｉｔｉＶの誘導について、まず、ＣＴＸΦプロファージおよび周囲配列を、プライマーＴＤＰｓＣＴＸ１／ＴＤＰｓＣＴＸ２およびＴＤＰｓＣＴＸ３／ＴＤＰｓＣＴＸ４を用いて欠失させて、この領域の５’末端におけるｒｔｘ毒素トランスポーターの上流および３’末端上の推定デヒドロゲナーゼの上流の相同領域を増幅した。これは、結果として、ｃｔｘＡＢを含むＣＴＸΦプロファージ全体、ＣＴＸ付着部位、ＲＳ１およびＴＬＣサテライトプロファージ、ならびにＭＡＲＴＸ毒素遺伝子ｒｔｘＡＢＣＤＥを含む４２，６５０ｂｐ断片の欠失を生じる。そのノックアウトを、プライマーＴＤ１０２７／ＴＤＰ１０２８を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって確証した。

次に、ｆｌａＢＤＥオペロンを、以前、Millet et al. (2014) PLoS Pathog. 10(10): e1004405に記載されているように欠失させた。ｆｌａＡＣオペロン欠失プラスミドを、プライマーＴＤＰ１１７２／１１７４（上流相同）およびＴＤＰ１１７３ａ／ＴＤＰ１１７３（下流相同）を用いて構築した。その後、ＳＸＴ ＩＣＥコード抗生物質抵抗性遺伝子座、ｄｆｒＡ、ｓｕｌ２、ｓｔｒＡＢ、およびｆｌｏＲを、プライマーＴＤＰ１１９３／ＴＤＰ１１９４＋ＴＤＰ１１９５／１１９６（ｄｆｒＡ、トリメトプリム抵抗性）およびＴＤＰ１２８７／ＴＤＰ１２８８＋ＴＤＰ１２９１／ＴＤＰ１２９２（スルファメトキサゾール、ストレプトマイシン、およびクロラムフェニコール抵抗性遺伝子座）を用いて欠失させた。全ゲノムシーケンシングにより、アレル交換過程における第２のクロスオーバーは、自殺プラスミドに含まれる相同領域間で起こらず、むしろ染色体のｆｌｏｒ／ｓｕｌ領域に隣接する重複配列（Ｎ９００＿１１２１０とＮ９００＿１１２６０）間で起こったことが明らかにされた。ワクチン前駆体株のＳｍ^Ｒ変異体を、ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）上にプレーティングすることにより単離し、ｒｐｓＬ^Ｋ４３Ｒ ＳＮＶを、サンガーシーケンシングにより確認した。

ＣｔｘＢ過剰発現について、ｈｔｐＧプロモーターを、Ｐｅｒｕ－１５（Kenner et al. (1995) J. Infect. Dis. 172(4): 1126-9参照）からプライマーＦＤ５４／ＦＤ１０３を用いて、（強いリボソーム結合部位ＡＧＧＡＧＧ（配列番号６）を付加して）増幅し、ｃｔｘＢを、（ｃｔｘＢアレルを含有する）ＨａｉｔｉＷＴからプライマーＦＤ３３／ＦＤ３４を用いて増幅した。確証された天然遺伝子座の遺伝子間領域に隣接する相同領域ｖｃ０６１０／Ｎ９００＿１１５５０（Abel et al. (2015) Nat. Methods 12(3): 223-6参照）を、プライマーペアＦＤ３０／ＦＤ３１およびＦＤ７３／ＦＤ７４で増幅した。その後、これらの断片を、ｐＣＶＤ４４２へ一段階等温アセンブリー反応でクローニングした。ＣｔｘＢ過剰発現を、上記のＡＫＩ条件で増殖した培養物由来の無細胞上清においてウェスタンブロットにより確認した。（Ａｂｃａｍ ａｂ１２３１２９、抗コレラ毒素；図７）。

次に、ｈｕｐＢ欠失プラスミドを、プライマーペアＶｃ－ｈｕｐＢ５－Ｆ１／Ｖｃ－ｈｕｐＢ５－Ｒ１およびＶＣ－ｈｕｐＢ３－Ｆ１／Ｖｃ－ｈｕｐＢ３－Ｒ１を用いて構築した。その欠失を、プライマーＶＣ－ｈｕｐＢ－ＳＦ２／Ｂｃ－ｈｕｐＢ－ＳＲ２で検証した。

ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡモジュールについて、ｃａｓ９を、プラスミドＤＳ＿ＳｐＣａｓ９（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４８６４５／）からプライマーＴＤＰ１７４７／ＴＤＰ１７４８で増幅した。ｓｇＲＮＡ領域を、ｇＢｌｏｃｋ「ＶＣ＿３ｘ＿ｓｇＲＮＡ＿ｇＢｌｏｃｋ」（表４）からプライマーＴＤＰ１７６１／ＴＤＰ１７６２で増幅した。両方の断片を、組み合わせて、ｐＪＬ１のＳｔｕＩ部位（Butterton (1995) Infect Immun 63: 2689-96）へ等温アセンブリーによってクローニングした。シーケンシングにより、アセンブリー中の組換え事象が、３個のｓｇＲＮＡのうちの２個を除去して、ｃｔｘＡをターゲットする単一のガイドを残したことが明らかにされた。この自殺ベクターを、ワクチン株へ、ヘルパープラスミドｐＲＫ６００との三親接合によって導入した。

最後に、ｒｅｃＡ欠失プラスミドを、プライマーペアＶｃ－ｒｅｃＡ５－ Ｆ１／Ｖｃ－ｒｅｃＡ５－Ｒ１およびＶｃ－ｒｅｃＡ３－Ｆ１／Ｖｃ－ｒｅｃＡ３－Ｒ１を用いて構築した；欠失を、プライマーＶｃ－ｒｅｃＡ－ＳＦ２／Ｖｃ－ｒｅｃＡ－ＳＲ２で検証した。

全ゲノムシーケンシング
ＨａｉｔｉＷＴおよびＨａｉｔｉＶ由来のゲノムＤＮＡを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴライブラリー調製キット（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）を用いて調製し、ＭｉＳｅｑ（試薬キットｖ２、２×２５０）においてシーケンシングした。ＨａｉｔｉＶの細菌染色体のゲノム配列は、本明細書で配列番号７および５１として提供されている。ＨａｉｔｉＶ株は、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０、ＵＳＡにあるアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に２０１８年６月２２日、ブダペスト条約の条件の下、寄託され、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＰＴＡ－１２５１３８を付与された。各試料を、ＧＡＴＫ３．６を用いて同定されたそれの推定ゲノムおよびバリアントへマッピングした。

ＣＴＸΦ形質導入アッセイ
ＣＴＸΦ－ＩＧＫｎ（ゲノムがｃｔｘＡを含むファージ（例えば、Lazar and Walder (1998) Infect. lmmun. 66: 394-7参照）またはＣＴＸ－ＫｎΦ（ゲノムがｃｔｘＡを欠損するファージ（例えば、Waldor and Mekalanos (1996) Science 272(5270): 1910-4参照）を有するコレラ菌（Vibrio cholerae）Ｏ３９５株（ＬＢ中、１．０のＯＤ_６００まで３０℃で増殖させた）由来の上清を濃縮し（およそ５０倍；Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１００Ｋ遠心フィルター、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、濾過して（０．２２μｍフィルター、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、無細胞ファージ上清を得た。ＣＴＸΦ感受性についてアッセイすることになっている株においてＴＣＰ（ファージ受容体）の発現を誘導するために、一晩のＬＢ培養物を、１６×１５０ｍｍガラス培養チューブ中１０ｍＬ ＡＫＩへ逆に１：１００希釈し、振盪なしで３７℃、４時間、インキュベートした。その後、培養物の１ｍＬを除いた全部を捨て、その培養物を、３７℃でさらに２時間の好気培養のために振盪機（２５０ｒｐｍ）に移した。レシピエント培養物を、遠心分離により１回、洗浄し、ファージ上清と２：１に混合し、室温で２０分間、インキュベートした。その後、段階希釈物を、ＬＢ寒天プレートおよびＬＢ＋カナマイシン（１００μｇ／ｍＬ）寒天プレート上にプレーティングし、形質導入効率を、（ＣＦＵ／ｍＬ）_{Ｋａｎ１００}／（ＣＦＵ／ｍＬ）_ＬＢとして計算した。

ＨａｉｔｉＷＴ－Ｔｎライブラリーの作製
ｐｉｒ依存性ＨｉｍａｒトランスポゾンベクターｐＳＣ１８９を有する大腸菌（E. coli）ＳＭ１０λｐｉｒ（Chiang and Rubin (2002) Gene 296(1-2): 179-85）を、レシピエントＨａｉｔｉＷＴと接合させて、トランスポゾン挿入ライブラリーを作製した。各株の一晩の培養物を、３７℃で好気的に増殖させ、その後、３７℃で培地中、１：１００希釈した。４時間の増殖後、各培養物の４ｍＬをペレット化し、ＬＢで１回、洗浄した。その後、培養物を１：１比で混合し、ペレット化し、８００μＬ ＬＢ中に再懸濁した。その混合物の５０μＬを、ＬＢ寒天プレート上の０．４５μｍフィルター上へ、合計１６個の接合反応として、スポットした。反応物を３７℃で４時間、インキュベートし、その後、フィルターをＬＢ（１ｍＬ／フィルター）中、ボルテックスして、付着細菌を再懸濁した。懸濁液を、２４５ｍｍ^２ ＬＢ＋Ｓｍ／Ｋａｎ寒天プレート上へプレーティングして、コレラ菌（V. cholerae）接合完了体について選択した（２ｍＬ懸濁液／プレート）。細菌コロニーを数え上げるために、プレートを３０℃で一晩、インキュベートした。ライブラリーは、約３００，０００個のコロニーからなり、それを掻爬してＬＢ＋２５％グリセロール中へ入れた。ＯＤ_６００をおよそ１０に調整し、アリコートを下流での使用のために－８０℃で保存した。

乳児ウサギ感染研究
乳児ウサギ研究を、Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓにより認可されたプロトコール（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅプロトコール番号２０１６Ｎ０００３３４、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ番号Ａ４７５２－０１）により、かつ米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針および米国農務省の動物福祉法における推奨に従って、行った。

接種のための細菌を調製するために、一晩の培養物を、１００ｍＬ ＬＢ中、１：１００に希釈し、対数期の後期（ＯＤ_６００ ０．５～０．９）まで３７℃で通気培養した。およそ２×１０^１０ ＣＦＵを、６，０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化し、上清を除去し、細胞ペレットを、１０ｍＬの２．５％炭酸水素ナトリウム溶液（１００ｍＬ水中２．５ｇ；ｐＨ ９．０）中におよそ２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬの最終細胞密度に再懸濁した。同時感染研究について、およそ１×１０^１０ ＣＦＵを、６，０００ｒｐｍでの遠心分離によりペレット化し、上清を除去し、細胞ペレットを、５ｍＬ ２．５％炭酸水素ナトリウム溶液中に再懸濁し、生じた懸濁液を組み合わせて、およそ２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬの細胞密度での１：１混合物を得た。ＨａｉｔｉＷＴトランスポゾンライブラリーを用いる研究について、ライブラリーの１ｍＬ凍結ストック（ＯＤ_６００＝１０）を、１００ｍＬ ＬＢへ０．１の初期ＯＤ_６００まで移した。その後、ライブラリーを、ＯＤ_６００ ０．８まで３７℃で通気培養し（およそ２時間）、２．５％炭酸水素ナトリウム溶液中およそ２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬ細胞懸濁液を上記のように調製した。ホルマリン死滅型ワクチンの調製は、以下の追加のステップを必要とした：細胞ペレットを、８ｍＬの１０％ホルマリン中に再懸濁し、ホルマリン懸濁液を、６，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去し、細胞を、５体積の１×リン酸緩衝食塩水（４０ｍＬ １×ＰＢＳ）中に再懸濁して、過剰なホルマリンを洗い流し、ＰＢＳ懸濁液を、６，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を除去し、細胞を、１０ｍＬの２．５％炭酸水素ナトリウム溶液中に再懸濁した。この手順は、全ての生存可能なコレラ菌（V. cholerae）を排除した。全ての実験について、最終の細胞懸濁液を、１×ＰＢＳ中に段階希釈し、ＬＢ＋Ｓｍ／Ｘ－Ｇａｌ上に３連でプレーティングし、正確な用量を数え上げるために３０℃で一晩、インキュベートした。同時感染研究について、ＨａｉｔｉＶにおけるｌａｃＺの破壊により、ＨａｉｔｉＷＴ ＣＦＵおよびＨａｉｔｉＶ ＣＦＵ、それぞれ、青色コロニーおよび白色コロニーの数え上げが可能になった。ＨａｉｔｉＷＴトランスポゾンライブラリーを用いる研究について、ライブラリー接種材料のおよそ２×１０^１０ ＣＦＵを、ＬＢ＋Ｓｍ２００／Ｋａｎ５０上にプレーティングし、３０℃で一晩、インキュベートして、その後の統計的比較に用いられるライブラリー接種材料のそれぞれの試料を作製した。

乳児ウサギ感染を、以前に記載されているように（Ritchie et al. (2010) MBio. 1(1): e00047-10）、下記に詳述されたわずかな改変を加えて、実施した。全ての実験を、日齢１～４日のニュージーランドホワイトウサギを用いて行い、動物を、全研究の期間（評価される表現型に基づいて長さが異なる）の間、同腹仔および授乳中の母親と共に同時飼育した。動物は、Ｐｉｎｅ Ａｃｒｅ Ｒａｂｂｉｔｒｙ（Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａのいずれかから入手され、表現型は、両方のベンダーからの動物に渡って一致した。動物研究は常に、同腹仔間の変動の影響を最小限にするために同腹仔内の対照を用いて行われた。ＨａｉｔｉＷＴおよびＨａｉｔｉＶコロニー形成の最初の研究（図４Ａ～Ｃ）を、胃の酸性度を低下させるために塩酸ラニチジン（２μｇ／ｇ体重）の腹腔内注射後、行ったが、この処理を、全てのその後の研究から省略し、それが、ＨａｉｔｉＷＴコロニー形成にもＨａｉｔｉＶコロニー形成にも識別可能な影響を生じなかったからである。動物に、およそ１０^９ ＣＦＵ（５００μＬの２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬ細菌懸濁液）をサイズ５のＦｒｅｎｃｈカテーテル（Ａｒｒｏｗ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて経口胃的に接種した。単一接種および同時接種研究のために日齢１日の動物を用いた。これらの動物を、典型的には、接種からおよそ１８時間後、安楽死させた；しかしながら、ＨａｉｔｉＶコロニー形成の縦断的研究を、日齢１日の動物に接種し、接種後およそ９０時間の間、それらの状態をモニターすることにより、行った。逐次的接種研究について、日齢１日の動物に以下の３つの処置のうちの１つを接種した：「モック」 － ５００μＬ ２．５％炭酸水素ナトリウム溶液、「死滅型ワクチン」 － ホルマリン死滅型ＨａｉｔｉＶの２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬ懸濁液の５００μＬ、または「生ワクチン」 － ＨａｉｔｉＶの２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬ懸濁液の５００μＬ。２４時間後、同じ動物に、およそ１０^９ ＣＦＵ（曝露株：ＨａｉｔｉＷＴ：図５Ａ、５Ｂ、６Ａ～Ｃ；Ｎ１６９６１：図５Ｃ；またはＨａｉｔｉＴｎ：図５Ｄおよび５Ｆの２×１０^９ ＣＦＵ／ｍＬ懸濁液の５００μＬ）を接種した。細菌負荷量を報告する逐次的接種研究について、動物を、図６Ｃを除いて、曝露からおよそ１８時間後、安楽死させた。

剖検において、腸管全体を取り出し、２６－１/２ゲージ針を用いて盲腸液を抽出し、事前に計量したＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。盲腸全体と共に、遠位小腸の２～３ｃｍ切片を、１ｍＬ無菌ＰＢＳおよび２個の３．２ｍｍステンレススチールビーズ（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ、ＵＳＡ）を含有する、事前に計量したホモジナイゼーションチューブ内に置き、全ての充填されたチューブの重量を計量した。盲腸から回収された液体の質量を、盲腸の質量で割り算して、液体貯留比（ＦＡＲ）を得た。組織を含有するチューブを、ｍｉｎｉ－ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ－１６（ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、ＯＫ、ＵＳＡ）において２分間、ホモジナイズし、１×ＰＢＳ中に段階希釈し、プレーティングした。プレートを３０℃で一晩、インキュベートし、観察されたコロニーの数を、適切な希釈率と対応する組織／液体試料の質量で割り算して、ＣＦＵ／ｇ組織の測定値を得た。ホモジネートを、総負荷量（すなわち、ＨａｉｔｉＷＴ＋ＨａｉｔｉＶ）を数え上げるためにＬＢ＋Ｓｍ２００／Ｘ－Ｇａｌ６０上に、ＨａｉｔｉＷＴ負荷量のみを数え上げるためにＬＢ＋ＳＸＴ上にプレーティングした。同時接種または逐次的接種研究について、ＨａｉｔｉＶ特異的な選択マーカーがないことにより、ＨａｉｔｉＶの負荷量がＨａｉｔｉＷＴと同等（すなわち、１００倍以内）ではない限り、ＨａｉｔｉＶ ＣＦＵの数え上げが回避された。同様に、ＳＸＴに感受性があるＮ１６９６１ ＷＴ株を利用する研究について、ＬＢ＋Ｓｍ２００／Ｘ－Ｇａｌ６０上での青色コロニーの数が、ＷＴ負荷量を数え上げるのに用いられた。同時接種研究について、競争力指数を以下として計算した：

ＨａｉｔｉＷＴトランスポゾンライブラリーを用いる研究について、遠位小腸の末端１０ｃｍを剖検時に取得し、重量を測定し、上記のようにホモジナイズした。ホモジネートを、１×ＰＢＳ中に段階希釈し、総負荷量を数え上げるためにＬＢ＋Ｓｍ２００／Ｘ－Ｇａｌ６０上に、ＨａｉｔｉＴｎの負荷量を数え上げるためにＬＢ＋Ｓｍ２００／Ｋａｎ５０上にプレーティングした。その後のトランスポゾン挿入の部位の分析に用いられるインビボ継代されたＨａｉｔｉＴｎライブラリーの代表的な試料を回収するために、希釈されていない組織ホモジネートの残りの９００μＬを、ＬＢ＋Ｓｍ２００／Ｋａｎ５０上にプレーティングした。

コロニー形成データは、疾患進行の研究において疾患の瀕死状態に達した動物については報告されておらず、これは、これらの研究において実質的に様々である、接種と安楽死の間の間隔が細菌負荷量に影響をする可能性が高いからである。その代わり、目に見える下痢（腹側表面の汚れ）、脱水症状（スキンテンティング）、体重減少、嗜眠（最小の動作）、および体温低下（触ってみると冷たい）の組合せにより特徴付けられる瀕死状態の評価により、動物を安楽死させた。これらの評価は、動物が死滅型ワクチンを受けたか生ワクチンを受けたかに関して盲検様式で行われた。１匹の動物が、目に見える下痢を発症することなしに瀕死状態へ進行し、そのことが図６Ａと図６Ｂの試料サイズの差の説明となる。

トランスポゾン挿入シーケンシング分析
トランスポゾン挿入ライブラリーは、大量並行シーケンシングにより特徴付けられた；以前記載されているように（Pritchard et al. (2014) PLoS Genet. 10(11): e1004782参照）、配列データを処理し、コレラ菌（V. cholerae）Ｈ１ゲノム（例えば、Bashir et al. (2012) Nat. Biotechnol. 30(7): 701-7参照）へマッピングした。より複雑度が高いライブラリー（＞３０，０００個の固有遺伝子型）を、ＡＲＴＩＳＴパイプラインを用いて、インプットライブラリーと比較した。データを、１００，０００ｂｐウィンドウのＬＯＥＳＳ補正を用いて開始点近接について補正した。接種データセットを、Ｃｏｎ－ＡＲＴＩＳＴの多項分布に基づいたランダムサンプリング（ｎ＝１００）を用いて、腸データセットに対して独立的に正規化した。Ｃｏｎ－ＡＲＴＩＳＴのマン－ホイットニーＵ関数の改変バージョンを用いて、腸データセットをそれらの１００個の類似した対照データセットと比較した。平均情報部位の閾値＞５｜Ｌｏｇ_２（平均倍数変化）｜＞１、平均逆Ｐ値＞１００を課して、接種材料に比べて、腸データセットにおいて、対応する挿入変異体が有意に濃縮され、または枯渇している、遺伝子座を同定した。

コレラ大発生のモデル化
以前の研究（Azman (2015) PLoS Med. 12: e1001867）から適応させた本発明者らのモデルは、図１０Ａに概略的に描かれている。疾患伝播についてのパラメータは以前に発表されている（図１０Ｂ）。ワクチンロールアウトを、総集団の７０％がワクチン接種されるまで、キャンペーンの期間（図６Ｄ、１１Ｂにおいては７日間；１１Ａにおいては様々である）に渡って１日あたり一定数の投薬で進行するものとしてモデル化した。キャンペーンは、症候性の症例の数（すでに感受性のある集団における総感染者の２５％と推定される；Jackson et al. (2013) Am. J. Trop. Med. Hyg. 89: 654-64参照）が閾値（図６Ｄ、１１Ａにおいて１，０００人；図１１Ｂにおいては様々）を超えた時、発動された。シミュレーションに用いられる伝播速度（β）を、Ｒ_０＝β／γを用いて、基本再生産数（Ｒ_０）を以前のコレラ大発生と一致した１～５の範囲内と仮定して計算した。以前のモデル化研究（Azman et al. (2013) J. Infect. 66: 432-8）と一致して、家庭内伝播研究において推定された平均感染力期間（１／γ）が想定された（Weil et al. (2009) Clin. Infect. Dis. 49: 1473-9）。感染に対する同等の効力をもつより遅効性の代替物に対して、ＨａｉｔｉＶなどの速効性ワクチンを用いることの影響を比較するために、単一用量の受入後１日間対１０日間の保護の発生までの平均時間（１／τ）が想定された。獲得率を７０％、低下させるワクチン作用の「リーキーな（leaky）」モード（θ）をモデル化した。常微分方程式を、そうでなければ感受性集団における単回曝露された個体の初期条件を以て、ｏｄｅ４５関数を用いるＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１６ｂ（Mathworks, Natick, MA）において解いた。このモデルについて、微分方程式のシステムは以下である：

結果
弱毒生ワクチンとして用いる、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌株ＨａｉｔｉＶの作製
新しいワクチン、ＨａｉｔｉＶを導くために９つの異なる改変を生じさせ（表５）、全ゲノムシーケンシングを用いて、変異が存在することを確認した。野生型コレラ菌（V. cholerae）およびいくつかの以前試験された生ワクチン候補（Cohen et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1965-70; and Chen et al. (2016) Clin. Infect. Dis. 62(11): 1329-35）と同様に、単回経口投与後長期間免疫を与える可能性が高いように、腸管定着するＨａｉｔｉＶの能力を維持しながら、コレラワクチンの間で前例のない程度まで、バイオセーフティを保証するために、変異を企てた。ＨａｉｔｉＶの安全性を保証するために、本発明者らは、病原体の主要な毒性因子である、コレラ毒素（ＣＴ）をコードするバクテリオファージ（ＣＴＸΦ）を除去し（Waldor and Mekalanos (1996) Science 272(5270): 1910-4）（図１）、かつ毒素産生性復帰変異に対する厳しい妨害を施した。ＣＴＸΦの境界の欠失は、それの染色体組込みに必要な配列、加えて、多機能ＭＡＲＴＸ毒素、ｒｔｘＡをコードする遺伝子（Fullner et al. (2002) J. Exp. Med. 195(11): 1455-62参照）の除去を生じる。さらに、ＨａｉｔｉＶは、ＣＴＸΦのエピソーム維持に必要な遺伝子である、ｈｕｐＢ（Martinez et al. (2015) PLoS Genet. 11(5): e1005256参照）を欠く。ＨａｉｔｉＶはまた、毒素遺伝子ｃｔｘＡを特異的にターゲットするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをコードする。無傷ｃｔｘＡを有するＣＴＸΦは、このシステムを有するワクチンに感染することができなかったが、ｃｔｘＡを欠くＣＴＸΦバリアントは感染に対するそのような障害を示さなかった（図３Ａ～３Ｃ）。追加のワクチン操作は、１）コレラ菌（V. cholera）の５つのフラゲリンを欠失させることにより潜在的ワクチン反応源性を低下させるためのステップ（Rui et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(9): 4359-64参照）；２）ＳＸＴ組込み接合エレメント（Integrative Conjugative Element：ＩＣＥ）内にある、抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子を移動させるワクチンの能力を排除するためのステップ（図２）；３）腸内毒素原性大腸菌（E. coli）およびコレラ菌（V. cholerae）により引き起こされる下痢性疾患からの保護を誘発し得る、ＣＴ（図７）の無毒性Ｂサブユニット（Kauffman et al. (2016) MBio. 7(6): e 02021-16）をワクチンが産生するのを可能にするステップ；ならびに４）ｒｅｃＡを欠失させて、それによりＤＮＡ組換えを行う株の能力を著しく低下させることにより、潜在的遺伝子獲得を最小限にするためのステップを含んだ。ＨａｉｔｉＶ弱毒生コレラワクチンにおける遺伝子変化は表５に要約されている。

ＨａｉｔｉＶは弱毒コレラ菌（V. cholerae）細菌株である
経口胃的に接種されたＨａｉｔｉＶの、それが由来した野生型コレラ菌（V. cholerae）分離株（本明細書ではＨａｉｔｉＷＴと呼ばれる）と比較しての比較研究を、乳児ウサギ（急速な死亡率を含むヒトコレラの多くの側面を再現する小動物モデル）において実施した（Ritchie et al. (2010) MBio. 1(1): e00047-10参照）。ＨａｉｔｉＷＴを接種された全ての動物は、接種後１８時間目（１８ＨＰＩ）までに瀕死状態へ進行した。剖検において、これらの動物の盲腸は、ｃｔｘＡＢ依存性コレラ下痢に似ていることが以前見出されている液体で満たされた（図４Ａ）（Ritchie et al. (2010)参照）。著しく対照的に、ＨａｉｔｉＶを接種された同腹仔の盲腸において、１８ＨＰＩまでに、微量の液体が蓄積され、または全く蓄積されなかった（図４Ａ）。ＨａｉｔｉＶを接種された動物は、９０ＨＰＩに及ぶ観察期間の間、コレラ様疾患を示さなかったが、稀な場合として、動物は、軽度かつ自己限定性の非コレラ性下痢を示した。ＨａｉｔｉＶを接種された動物は、９０ＨＰＩまで体重が増加し続け、ＨａｉｔｉＶ接種がその動物の健康全般または発育に有害ではないというさらなるしるしを提供した（図４Ｂ）。

ＨａｉｔｉＷＴまたはＨａｉｔｉＶ接種に対する異なる応答は、その２つの株による腸管定着の間での差とは関連付けられなかった。１８ＨＰＩにおいて、ＨａｉｔｉＶまたはＨａｉｔｉＷＴを接種された同腹仔間の遠位小腸のコレラ菌（V. cholerae）コロニー形成における有意な差はなかった（図４Ｃ）。ＨａｉｔｉＶ負荷量は、９０ＨＰＩまでに低下を示さず（図４Ｃ）、ＨａｉｔｉＶによる長期腸管定着が疾患を引き起こさないことを示した。ＨａｉｔｉＶおよびＨａｉｔｉＷＴによる腸管定着のレベルは、単一接種実験において統計的に識別できなかったが、動物にＨａｉｔｉＷＴとＨａｉｔｉＶの１：１混合物を同時接種した場合、野生型株は、そのワクチン株を打ち負かした（図４Ｄ）。ＨａｉｔｉＶのコロニー形成は、Ｐｅｒｕ－１５の近縁株（Rui et al. (2010)参照）（安全であること、および単回投与で防御免疫を与えることが見出された初期の生コレラワクチン候補）のそれに匹敵する(Cohen et al. (2002)参照)；したがって、ＨａｉｔｉＶの単回投与が、防御適応免疫を促進することが予想される。

ＨａｉｔｉＶの接種は、毒性コレラ菌（V. cholerae）細菌株ＨａｉｔｉＷＴに対する防御応答を誘導する
ＨａｉｔｉＶのロバストかつ長期の腸の占有を前提として、ＨａｉｔｉＶコロニー形成した動物が、適応免疫応答の発生前さえも、例えば、病原体の腸内適所の変化による、ＨａｉｔｉＷＴによるコロニー形成に対する抵抗性を示し得るかどうかを決定するために実験を実施した。動物を、ＨａｉｔｉＶ（生ワクチン）、ホルマリン死滅型ＨａｉｔｉＶ（死滅型ワクチン）またはバッファー対照（モック）のいずれかを接種し、その後、２４時間後、致死量のＨａｉｔｉＷＴに曝露させた。バッファーおよびホルマリン群における動物は、ＨａｉｔｉＷＴ曝露後、重度のコレラ様疾患を発症し、これらの動物におけるＨａｉｔｉＷＴの腸内負荷量は、前処置なしの動物に似ていた（図５Ａ、５Ｂ、および４Ｃ）。逆に、生ワクチンを受けたいずれの動物も、ＨａｉｔｉＷＴ曝露から１８時間以内に重篤な疾患の徴候を示さず、死滅型ワクチンを接種された動物と対比して、生ワクチンを前もって接種された動物の腸から、より低いレベルのＨａｉｔｉＷＴが回収された（図５Ｂ）。ＨａｉｔｉＷＴ負荷量の低下は、生ワクチンを前もって接種された動物に渡って振幅が様々であり、２匹の動物においては検出限界を下回った。生ワクチンのＨａｉｔｉＷＴコロニー形成の拮抗作用（すなわち、コロニー形成抵抗性）は、ＨａｉｔｉＶの事前接種に依存するように思われた；逐次的というよりむしろ同時にその２つの株を接種された動物においてＨａｉｔｉＷＴの通常の負荷量が観察された（図４Ｅ対図５Ｂ）。

コロニー形成抵抗性の特異性を評価するために、コレラ菌（V. cholerae）Ｎ１６９６１（コレラワクチン効力の研究においてヒトボランティアに投与された初期のＥｌ Ｔｏｒ株）（Chen et al. (2016) Clin. Infect. Dis. 62(11): 1329-35参照）に曝露させるワクチン研究を繰り返した。重要なことには、ハイチ株およびＮ１６９６１株は、独立して単離され、異なる血清型である（Chin et al. (2011) N. Engl. J. Med. 364(1): 33-42参照）。生ＨａｉｔｉＶを接種された動物はまた、Ｎ１６９６１ ＷＴ曝露に対してコロニー形成抵抗性を示したが、死滅型ＨａｉｔｉＶは示さず、ＨａｉｔｉＶ媒介性コロニー形成抵抗性が株特異的でも血清型特異的でもないことを実証した（図５Ｃ）。

ＨａｉｔｉＶを接種された動物におけるＨａｉｔｉＷＴ負荷量の低レベルを考慮すれば、ワクチンの腸の占有が、曝露株によるコロニー形成に必要とされる過程に干渉することが考えられる。したがって、ＨａｉｔｉＷＴがワクチン媒介性拮抗作用に抵抗し、または逃れるのを可能にする変異を同定する順遺伝学的スクリーニングを実施した。そのような変異は、ＨａｉｔｉＶがコロニー形成抵抗性を媒介する機構に関する洞察を提供し得、特にＨａｉｔｉＶコロニー形成された腸において、ＨａｉｔｉＷＴに適応度優位性を与えることが予想された。前処置の非存在下（単一接種、図５Ｄおよび５Ｅ）、または生ワクチンでの接種から２４時間後（逐次的接種、図５Ｆおよび５Ｇ）、プールされたＨａｉｔｉＷＴトランスポゾン挿入ライブラリー（ＨａｉｔｉＴｎ）に動物を曝露させた。前処置の非存在下でのＨａｉｔｉＴｎコロニー形成は、モック処置または死滅型ワクチンを前もって接種された動物のＨａｉｔｉＷＴコロニー形成と識別できなかった（図５Ｄ対図５Ａおよび５Ｂ）。さらに、ワクチン前処置された動物におけるＨａｉｔｉＴｎコロニー形成の範囲は、ＨａｉｔｉＶおよびＨａｉｔｉＷＴの逐次的接種で観察された、ばらつきが大きいＨａｉｔｉＷＴ負荷量を再現した（図５Ｆ対図５Ｂ）。

濃縮された変異体を同定するために、遠位小腸から回収されたＨａｉｔｉＴｎ由来のトランスポゾン接合部をシーケンシングし、前処置なし（図５）またはＨａｉｔｉＶ接種後（図５Ｇ）のＨａｉｔｉＴｎ曝露に供された動物における変異体存在量のゲノムワイド比較を実施した。必要な統計的検出力を保証するために、遺伝子あたり複数の独立した破壊を包含する十分に多様なＨａｉｔｉＴｎ集団によりコロニー形成された動物に分析を制限した（単一接種についてウサギｒ３～ｒ６、逐次的接種についてウサギｒ４～ｒ７）。注目すべきことには、ビブリオ特異的クオラムセンシング（ＱＳ）経路のコンポーネントである、ｃｑｓＳおよびｈａｐＲを破壊する挿入が、前処置とは無関係に、複数の動物において濃縮された（図５Ｅおよび５Ｇ、図８Ａ～９Ｄ）。ＱＳが、高い細胞密度における毒性因子およびコロニー形成因子の発現を下方制御し（Rutherford and Bassler (2012) Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2(11): pii: a012427；Zhu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 3129-34；Duan and March (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: 11260-4；およびHsiao et al. (2014) Nature 515: 423-6）、この阻害に左右されないｃｑｓＳおよびｈａｐＲ変異体の濃縮は、ＱＳ経路が腸におけるＨａｉｔｉＷＴ増殖を抑圧することを示唆している。対応するＱＳ変異体の濃縮は、近縁コレラ菌（V. cholerae）分離株の類似した分析において同定されず（Kamp et al. (2013) PLoS Pathog. 9: e1003800）、ＱＳが、バリアントＥｌ Ｔｏｒ株の病変形成において異なる役割を果たし得ることを示唆している。ゲノムワイドスクリーニングは、ワクチンコロニー形成された動物において一貫的かつ特異的に濃縮されたいかなる変異体も同定することができず、単一の機能喪失変異体が、ＨａｉｔｉＷＴがワクチン媒介性拮抗作用に抵抗し、または逃れるのを可能にする可能性が低いことを示している。

上記の実験に利用されたＨａｉｔｉＴｎライブラリーに内在する遺伝的多様性は、ＨａｉｔｉＶ媒介性コロニー形成抵抗性が、コレラ菌（V. cholerae）がインビボで遭遇する感染ボトルネックの厳しさの変化に関連しているかどうかに関する評価を可能にした（Abel et al. (2015) Nat. Methods 12: 223-6；Abel et al. (2015) PLoS Pathog. 11: e1004823）。腸から回収されたコレラ菌（V. cholerae）は、細菌接種材料の確率論的収縮後に持続する生物体の創始集団から生じる（Abel et al. (2015) Nat. Methods 12: 223-6）。この感染ボトルネックの厳しさは、腸から回収された固有のトランスポゾン挿入変異体の数から推定することができる（Chao et al. (2016) Nat. Rev. Microbiol. 14: 119-28）。生ワクチンを前もって接種された動物のサブセットは、相対的に少数の固有の挿入変異体によってコロニー形成され、低いＨａｉｔｉＴｎ負荷量を示し（図５Ｆ、ウサギｒ１～ｒ３）、ＨａｉｔｉＶ媒介性コロニー形成抵抗性が、場合によっては、高度に制限的な感染ボトルネックと関連していることを示唆している。重要なことには、多様性が低い動物から回収された変異体において重複はなく、いくつかのＨａｉｔｉＶ接種された動物において観察された制限的な感染ボトルネックが、確率論的であり、遺伝子型に依存しないことを示している。ワクチンがボトルネックを課すようには見えなかった動物において、コロニー形成の低下もまた観察された（図５Ｆ、ウサギｒ４～７）。ワクチン拮抗作用に対して抵抗性である変異体を同定することができないことと共に、ワクチンコロニー形成された動物において観察された様々なボトルネックは、コロニー形成抵抗性の根底にある機構が複雑および／または多因子性であり得ることの可能性を浮き彫りにしている。しかしながら、ワクチンコロニー形成された動物の、曝露後のＨａｉｔｉＷＴのより低い負荷量および重篤な疾患の欠如は、ＨａｉｔｉＶの接種が、コレラ様疾患から保護するのに十分であり得ることを示唆している。

ＨａｉｔｉＶは、投与から２４時間以内に毒性コレラ菌（Vibrio cholerae）株ＨａｉｔｉＷＴからの保護を誘導する
コレラ様疾患からのＨａｉｔｉＶ依存性保護を定量化するために、乳児ウサギに、生ワクチンまたは死滅型ワクチンを接種し、２４時間後、ＨａｉｔｉＷＴに曝露させ、それらの状態を評価するために定期的にモニターした。死滅型ワクチンを接種された全ての動物は、下痢を発症し（発生中央値１５時間）、ＨａｉｔｉＷＴ接種から２９時間以内に瀕死状態へ進行した（中央値１８．８時間）（図６Ａ）。著しく対照的に、生ワクチンを接種された動物は、下痢を発症するのが有意により遅く（中央値２８．３時間；１匹の動物は目に見える下痢を発症しなかった）、致死性曝露後の生存時間（中央値＞４１．３時間；図６Ａ）および下痢発生後の生存率（対照動物における５時間に対して＞１３時間；図６Ｂ）における顕著な増加を示した。さらに、生ワクチンを接種された４匹の動物は、研究が致死性曝露から４０時間後に終了した時、全ての動物において検出可能なＨａｉｔｉＷＴコロニー形成があったにも関わらず、瀕死状態に達していなかった（図６Ａおよび６Ｃ）。したがって、ＨａｉｔｉＶは、絶対的なコロニー形成抵抗性ではない場合でさえも、疾患から保護し得る。ＨａｉｔｉＶ誘導性コロニー形成抵抗性および疾患防御の迅速性、ならびに新生仔の感染モデルにおけるこれらの表現型の観察は、ワクチン誘発性適応免疫防御と一致しない。それどころか、データは、ＨａｉｔｉＶが、腸にコロニー形成し、かつコレラからの生存能依存性保護を媒介すること（プロバイオティクス剤の定義と一致する性質）を示している（Hill et al. (2014) Nat. Rev. Gastroenetrol. Hepatol. 11: 506-514参照）。

ＨａｉｔｉＶの迅速な保護がどのように受け身的ワクチン接種キャンペーンに影響し得るかを調べるために、以前発表された、感受性集団におけるコレラ大発生の数学的モデル（受け身的ＯＣＶ介入について優先される流行的状況）を改変した（Azman (2015) PLoS Med. 12: e1001867; Reyburn et al. (2011) PLoS Negl. Trop. Dis. 5: e952）。数学的モデルの改変（図１０Ａ）は、１日間（速効性ワクチン － 図５Ａ～５Ｇ、６Ａ、および６Ｂにおける観察に基づいて）または１０日間（遅効性ワクチン － 死滅型ＯＣＶのいく人かのレシピエントが殺ビブリオ性力価を顕在化する場合（Matias et al. (2016) PLoS Negl. Trop. Dis. 10: e0004753））で同程度の保護を与えるワクチンの効果の算出を可能にした。異なるモデルパラメータを変化させることにより、遅効性ワクチンに対して速効性ワクチンの最大の恩恵は、最近の大発生（Ｒ０：１．５～３）および迅速なワクチン投与（図１０Ｂ、１１Ａ、および１１Ｂ）と一致した伝播動態下で生じることが明らかにされた。これらのシミュレーションにより、遅効性ワクチンと比較して、同等の効力がある速効性ワクチンが、遅効性ワクチンの投与と防御免疫の出現の間の空白時間において獲得され得る感染を防止することにより、１００，０００人の集団においてさらなる２０，０００人の感染を防ぐことができる（図６Ｄ）ことが明らかにされた。

新しい弱毒生コレラワクチン候補、ＨａｉｔｉＶのデザインおよび特徴づけが本明細書に提供される。上記の研究は、ＨａｉｔｉＶが毒素産生性復帰変異に対して抵抗性であること、およびそれが、コレラ様疾患も他の悪影響も引き起こすことなく、コレラの動物モデルにコロニー形成することを示している。乳児ウサギモデルは、上記で報告された腸管定着および疾患進行研究によく適している。研究は、ウサギ新生仔のあまり特徴付けられていない腸内微生物叢および適応免疫能力（それらは、この系におけるＨａｉｔｉＶの作用機構および免疫原性のさらなる研究を制限する）により制限される。コレラに対する適応免疫を調べるためのロバストな動物モデルがない；以前のコレラワクチンと同様に、ＨａｉｔｉＶにより誘発された適応免疫応答を評価することは、ヒトボランティア研究を必要とするだろう。励まされることには、ＨａｉｔｉＶのコロニー形成が、同じモデルにおいて、Ｐｅｒｕ－１５の近縁株（Rui et al. (2010) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 107(9): 4359-64）（死滅型ＯＣＶにより保護されない５歳未満の子どもにおいてさえも、ヒトにおいて安全であること（Qadri (2007) Vaccine 25: 231-8）、および単回投与で保護を与えること（Cohen et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1965-70）が見出された初期の生コレラワクチン候補）のそれと同等であった。驚くべきことに、ＨａｉｔｉＶは、投与から２４時間以内（適応免疫に一致せず、かつ既存のワクチンの中では前例のない間隔）に保護を与えることが見出された。注目すべきことには、これらの効果は、生存可能なＨａｉｔｉＶの使用を必要とした；ホルマリン死滅型ＨａｉｔｉＶは、疾患からの急性保護を提供せず、迅速な保護は、死滅型ＯＣＶにより誘発される可能性が低いプロバイオティクス効果を必要とすることを示唆している。ヒト曝露研究は、ＯＣＶにより誘発される適応免疫防御を評価するための十分確立された系である（Chen et al. (2016) Clin. Infect. Dis. 62(11): 1329-35 and Cohen et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1965-70）。追加の急性曝露（例えば、ワクチン接種後２４時間以内）を組み入れることは、ＯＣＶ保護の発生および持続期間を明らかにし、それにより、乳児ウサギモデルにおいて観察されたように、ＨａｉｔｉＶまたは他のＯＣＶが適応免疫応答前に保護を誘発するかどうかを評価するだろう。

ＨａｉｔｉＶの急性保護の根底にある機構は、複雑である可能性が高く、さらなる解明を必要とするが、この研究において記載された数学的モデル化により、ＨａｉｔｉＶの迅速な保護の公衆衛生上の影響が、コレラ流行中の受け身的ワクチン接種の関連において変革の力があり得ることが示されている。対照と比べて、致死量のＨａｉｔｉＷＴに曝露されたＨａｉｔｉＶ接種動物は、下痢発生後、より長く生存し、より低いレベルのＨａｉｔｉＷＴコロニー形成を示し、場合によっては、コレラから完全に保護された。ＨａｉｔｉＶ誘導性の疾患進行の遅延は、ＨａｉｔｉＶを接種された後に病原性コレラ菌（V. cholerae）に感染する個体が、症状の発生後に救命処置を利用する、より長い時間があり得ることを示唆している。症状の発生と処置の投与の間に経過する時間は、コレラ大発生中の致死率の決定因子である場合が多く、補水療法が、事実上全ての症候性個体において死を防止するのに十分であるからである（Farmer et al. (2011) PLoS Negl. Trop. Dis. 5: e1145）。さらに、ホルマリン死滅型ＨａｉｔｉＶによっては媒介されないが、ＨａｉｔｉＶにより媒介されるコロニー形成抵抗性は、ＨａｉｔｉＶの接種が、大発生を持続させる伝播経路である、毒性コレラ菌（V. cholerae）の環境への脱粒を低下させ得ることを示唆している。ＨａｉｔｉＶの伝播への潜在的効果は、モデル化研究へ組み入れられなかったが、伝播の低下は、ＨａｉｔｉＶが生じ得る大発生管理へのただでさえ劇的な影響を強化する可能性が高い。全体的に見て、上記研究は、適応免疫を誘発すると同時に、疾患からの迅速な保護を媒介するプロバイオティクスワクチンは、大発生管理への変革的影響をもつ、新しいクラスの治療用物質を構成し得ることを示唆している。

[実施例２]
ＨａｉｔｉＶは、マウスにおいて殺ビブリオ性抗体応答および抗ＯＳＰ抗体を誘導する
ＨａｉｔｉＶはマウスにおいて殺ビブリオ性抗体応答を誘導する
ＨａｉｔｉＶの接種が、殺ビブリオ性抗体応答を誘導するかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６およびＳｗｉｓｓ－ＷｅｂｓｔｅｒマウスにＨａｉｔｉＶか、ＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊と本明細書で呼ばれるコレラ菌（V. cholerae）細菌株ＣＶＤ１０３－ＨｇＲに由来した自発性ストレプトマイシン抵抗性変異体（対照）のいずれかを接種した。ＣＶＤ－１０３ＨｇＲ（Ｖａｘｃｈｏｒａ（商標）；ＰａｘＶａｘ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、成人旅行者においてコレラ菌（V. cholerae）O1により引き起こされるコレラの予防として現在、認可されている。血清殺ビブリオ性活性を、コレラ菌（V. cholerae） ＰＩＣ０１８（Ｉｎａｂａ血清型）またはＰＩＣ１５８（Ｏｇａｗａ血清型）の補体媒介性細胞溶解を評価するインビトロの微量希釈アッセイを用いて分析した。図１２Ａ～１２Ｄに示されているように、ＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊のいずれも初回接種から７日後、マウスから収集された血清中に、ロバストな殺ビブリオ性応答が観察された。

ＨａｉｔｉＶを接種されたマウスにおいて時間と共に抗ＯＳＰ ＩｇＡおよびＩｇＧ力価が増加する
ＨａｉｔｉＶの接種が、Ｏ抗原特異的多糖（ＯＳＰ）に対する抗体応答を誘導するかどうかを決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６およびＳｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに、ＨａｉｔｉＶかまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊（対照）のいずれかを接種し、Ｏｇａｗａ由来かまたはＩｎａｂａ由来かのいずれかのＯＳＰに対する抗ＯＳＰ ＩｇＡおよび抗ＯＳＰ ＩｇＧ抗体の存在量を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。図１３Ａ～１３Ｄおよび１４Ａ～１４Ｄに示されているように、抗ＯＳＰ ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の存在量は時間と共に増加した。ＨａｉｔｉＶを接種されたマウスは、ＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊を接種されたマウスよりＯｇａｗａ由来ＯＳＰに対するより顕著なＩｇＧ応答を示した。

材料および方法
以下の材料および方法がこの実施例に用いられた。
ＣＶＤ－１０３ＨｇＲ（Ｖａｘｃｈｏｒａ（商標）；ＰａｘＶａｘ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）のストレプトマイシン抵抗性株を作製するために、その細菌株を、５ｍＬのＬＢブロスへ接種し、通気しながら（２５０ｒｐｍ）、３７℃で一晩、培養した。１ｍＬの一晩培養物を、ＬＢ寒天＋ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）上にプレーティングし、３７℃で一晩、インキュベートした。ＬＢ寒天＋ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）上に生じたコロニーは、ＣＶＤ－１０３ＨｇＲの自発性ストレプトマイシン抵抗性変異体と考えられ、以後、ＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊と呼ばれた。

ＨａｉｔｉＶ免疫原性研究を、研究の期間中、ＢＬ－２動物施設において飼育された雌、無菌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝７、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｈｏｓｔ－Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ）および雌、無菌Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝６、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）を用いて行った。ＨａｉｔｉＶまたはＣＶＤ１０３－ＨｇＲ^＊細菌を、２．５％炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）中に１ｍＬあたり１０^１０コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）の最終濃度に再懸濁した。マウスを、イソフルラン吸入により麻酔し、１００μＬの細菌懸濁液（マウスあたり１０^９ＣＦＵ）を強制経口投与した。この手順を、初回免疫化後２日目、４日目、６日目、１４日目、２８日目、および４２日目に繰り返した。マウスを、疾患の徴候について毎日、モニターし、４～５日ごと、各免疫化前に体重測定した。各体重測定時点において糞便ペレットを入手し、ペレットを、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中にホモジナイズし、段階希釈溶液を、ＬＢ＋ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍＬ）上にプレーティングして、ＨａｉｔｉＶの糞便負荷量を数え上げた。Ｃ５７ＢＬ／６コホートについて、免疫化後７日目、１４日目、２８日目、および４２日目に、尾静脈切り込みにより血液試料を採取した。Ｓｗｉｓｓ－Ｗｅｂｓｔｅｒコホートについて、免疫化後１日目、７日目、１４日目、２８日目、および４２日目に、尾静脈切り込みにより血液試料を採取した。血液を、室温で１時間、凝血させておき、１３，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清（血清）を収集し、次の分析のために－２０℃で保存した。

殺ビブリオ性抗体定量化を、以前に記載されているように（Rollenhagen et al. (2009) Vaccine 27(36): 4917-22、およびTarique et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol. 19(4): 594-60、それらのそれぞれは、参照により本明細書に組み入れられている）、コレラ菌（V. cholerae） ＰＩＣ０１８（Ｉｎａｂａ）またはＰＩＣ１５８（Ｏｇａｗａ）の補体媒介性細胞溶解のインビトロの微量希釈アッセイにより実施した。殺ビブリオ性応答は、血清が加えられていないウェルと比較してコレラ菌（V. cholerae）光学密度における５０％低下を引き起こす力価（すなわち、血清の希釈度）として報告されている。参照により本明細書に組み入れられたAktar et al. (2016) Clin. Vaccine Immunol. 23(5): 427-35に記載されているように、ＩｎａｂａかまたはＯｇａｗａのいずれかのＯ抗原特異的多糖（ＯＳＰ）に対する抗体応答を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により評価した。データは、各プレート上に含まれる血清の標準化プールに対する、試験試料についてのＥＬＩＳＡシグナルの比である、正規化された応答として表されている。

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他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、本発明を例証することを意図され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されることは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．（ａ）コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失；
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含む遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２．前記コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失が、前記細菌のゲノムへ組み込まれたｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、上記１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコア領域の核酸配列における欠失を含む、上記１または２に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
４．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのＲＳ２領域の核酸配列における欠失を含む、上記１～３のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
５．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む、上記１～４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
６．（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがＣＴＸΦの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含む遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
７．前記細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコピーを事前に含んでいない、上記６に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
８．前記ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列が、ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｔｘＡ、およびｃｔｘＢからなる群から選択される遺伝子内に位置する、上記６または７に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
９．前記ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列が、ｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、上記６～８のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１０．前記ｇＲＮＡが、核酸配列５’－ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号３）を含む、上記９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１１．多機能性自己プロセシング毒素内リピート（ＭＡＲＴＸ）毒素をコードする核酸配列における欠失を含む、上記１～１０のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１２．前記ＭＡＲＴＸ毒素をコードする核酸配列が、ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、およびｒｔｘＥからなる群から選択される、上記１１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１３．ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ－ベータをコードする核酸配列における欠失をさらに含む、上記１～１２のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１４．前記ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ－ベータをコードする核酸配列が、ｈｕｐＢ遺伝子である、上記１３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１５．フラゲリンをコードする核酸における欠失をさらに含む、上記１～１４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１６．前記フラゲリンをコードする核酸配列がｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される、上記１５に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１７．前記細菌が異種性核酸を含み、前記異種性核酸が、プロモーターに作動可能に連結しているコレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子を含む、上記１～１６のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１８．前記コレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子がｃｔｘＢ遺伝子である、上記１７に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１９．前記プロモーターが誘導性プロモーターである、上記１７または１８に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２０．前記プロモーターがＰ _ｈｔｐｇ プロモーターである、上記１７～１９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２１．ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列における欠失を含む、上記１～２０のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２２．前記ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列がｒｅｃＡ遺伝子である、上記２１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２３．（ａ）ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、ｒｔｘＥ、およびｒｔｘＨからなる群から選択されるＭＡＲＴＸ毒素をコードする１つまたは複数の核酸配列における欠失；（ｂ）ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される１つまたは複数のフラゲリン遺伝子における欠失；
（ｃ）ｒｅｃＡ遺伝子における欠失；ならびに
（ｄ）前記異種性核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結したｃｔｘＢ遺伝子を含む、異種性核酸
を含む遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２４．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む、上記２３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２５．前記細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦプロファージゲノムのコピーを事前に含んでいない、上記２３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２６．（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡが、ｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列
をさらに含む、上記２３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２７．前記ＣＴＸΦの標的核酸配列がｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、上記２６に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２８．前記ｇＲＮＡが核酸配列５’－ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号３）を含む、上記２７に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２９．トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、およびクロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列のうちの１つまたは複数における欠失を含む、上記１～２８のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３０．前記トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｄｆｒＡである、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３１．前記スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｓｕｌ２である、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３２．前記ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｓｔｒＡＢである、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３３．前記クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｆｌｏＲである、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３４．Ｅｌ Ｔｏｒバイオタイプに属する親株に由来する、上記１～３３のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３５．Ｈａｉｔｉ親株に由来する、上記１～３４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３６．配列番号７の核酸配列を含む第１の細菌染色体を含む、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３７．配列番号５１の核酸配列を含む第２の細菌染色体を含む、上記３６に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３８．細菌が、それの親株と比べて、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２５１３８を有する株と同じ遺伝子における変異を有する、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３９．ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ－１２５１３８を有するコレラ菌（V. cholerae）株である、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
４０．上記１～３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
４１．対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法であって、上記１～３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌、または上記４０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与して、それにより、前記対象において前記コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導することを含む、方法。
４２．前記対象がヒト対象である、上記４１に記載の方法。
４３．前記防御応答が、前記遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌または前記薬学的組成物を対象へ投与してから２４時間以内に誘導される、上記４１または４２に記載の方法。
４４．（ａ）少なくとも１つの毒性遺伝子の欠失；
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つまたは複数の異種性核酸であって、前記ｇＲＮＡが前記欠失した毒性遺伝子の標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸
を含む遺伝子組換え型細菌であって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子が前記ｇＲＮＡと結合して、それにより複合体を形成する能力があり、前記複合体が、前記欠失した毒性遺伝子の核酸配列をターゲットして、切断する能力がある、遺伝子組換え型細菌。
４５．コレラ菌（Vibrio cholerae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびクロストリディオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）からなる群から選択される種である、上記４４に記載の遺伝子組換え型細菌。
４６．前記毒性遺伝子が、ｃｔｘＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＱ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｈｔｒＡ、ｓｓａＶ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｓｅｔ、ｓｅｎ、ｖｉｒＧ／ｉｃｓＡ、ｌｕｃ、ａｒｏＡ、ｍｓｂＢ２、ｓｔｘＡ、ｓｔｘＢ、ａｍｐＧ、ｄｎｔ、ｔｃｄＡ、およびｔｃｄＢからなる群から選択される、上記４４または４５に記載の遺伝子組換え型細菌。
４７．上記４４～４６のいずれかに記載の遺伝子組換え型細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
４８．対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法における使用のための、上記１～３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
４９．コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株を有する対象を処置する方法における使用のための、上記１～３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。

Claims (14)

1. 遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であって、
   （ａ）コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失であって、前記細菌が前記コレラ毒素サブユニットＡを発現できなくなるようにする前記欠失；
   （ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列であって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子が前記細菌のゲノムに組み込まれる、異種性核酸配列；
   （ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列；
   （ｄ）多機能性自己プロセシング毒素内リピート（ＭＡＲＴＸ）毒素をコードする核酸配列における欠失であって、前記細菌が前記ＭＡＲＴＸ毒素を発現できなくなるようにする前記欠失；
   （ｅ）フラゲリンをコードする核酸における欠失であって、前記細菌が前記フラゲリンを発現できなくなるようにする前記欠失；および
   （ｆ）ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列における欠失であって、前記細菌が前記ＲｅｃＡタンパク質を発現できなくなるようにする前記欠失
   を含み、Ｅｌ Ｔｏｒバイオタイプに属する親株に由来する、前記細菌。
2. 前記コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失が、前記細菌のゲノムへ組み込まれたｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
3. 前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコア領域の核酸配列における欠失を含む、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
4. 前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのＲＳ２領域の核酸配列における欠失を含む、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
5. 前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
6. 前記ｇＲＮＡが、核酸配列５’－ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ－３’（配列番号３）を含む、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
7. 前記ＭＡＲＴＸ毒素をコードする核酸配列が、ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、およびｒｔｘＥからなる群から選択される；および／またはＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ－ベータをコードする核酸配列における欠失をさらに含み、好ましくは前記ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ－ベータをコードする核酸配列が、ｈｕｐＢ遺伝子である；および／または前記フラゲリンをコードする核酸配列がｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
8. 前記細菌が異種性核酸を含み、前記異種性核酸が、プロモーターに作動可能に連結しているコレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子を含み、好ましくは前記コレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子がｃｔｘＢ遺伝子である、および／または前記プロモーターが誘導性プロモーターである、および／または前記プロモーターがＰ_ｈｔｐｇプロモーターである、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
9. 以下の１つまたは複数の欠失：
   トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードするｄｆｒＡ遺伝子であって、前記欠失が、他の細菌へのｄｆｒＡ遺伝子の分散を防止する、ｄｆｒＡ遺伝子；
   スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードするｓｕｌ２遺伝子であって、前記欠失が、他の細菌へのｓｕｌ２遺伝子の分散を防止する、ｓｕｌ２遺伝子；
   ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードするｓｔｒＡＢ遺伝子であって、前記欠失が、他の細菌へのｓｔｒＡＢ遺伝子の分散を防止する、ｓｔｒＡＢ遺伝子；および
   クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードするｆｌｏＲ遺伝子であって、前記欠失が、他の細菌へのｆｌｏＲ遺伝子の分散を防止する、ｆｌｏＲ遺伝子；
   を含む、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
10. Ｈａｉｔｉ親株、および／またはＩｎａｂａ血清型、Ｏｇａｗａ血清型、またはＨｉｋｏｊｉｍａ血清型に由来する、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
11. コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失が、前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコア領域の核酸配列内に存在し、かつ前記欠失が、ＣＴＸΦの染色体組込みを防止することにより毒素産生性復帰変異から保護する、請求項１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
13. 対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を含む組成物。
14. コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株を有する対象を処置する方法における使用のための、請求項１～１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌を含む組成物。

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