JP2020527343A - プロバイオティクスの性質を有する弱毒生コレラワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号AI042347およびAI−120665による政府支援でなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
この出願は、2017年7月12日に出願された米国特許出願第62/531,551号明細書、および2018年6月4日に出願された米国特許出願第62/680,286号明細書の優先権の利益を主張する。前述の出願のそれぞれの内容は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
本出願は、ASCII形式で電子出願され、全体として参照により本明細書に組み入れられる配列表を含有する。2018年7月10日に作成された前記ASCIIコピーは、29618−0175WO1_SL.txtという名前であり、サイズが5.03メガバイトである。
対象への投与から24時間以内に毒性コレラ菌(Vibrio cholerae)からの保護を誘導するために用いられ得る遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌が、本明細書で提供される。弱毒生コレラ菌(V. cholerae)細菌株でのワクチン接種は、その細菌に対する防御免疫応答を誘導するための有望なストラテジーである。コレラ菌(V. cholerae)における主要な毒性因子、コレラ毒素(CT)をコードする遺伝子(ctxAおよびctxB)は、多くの弱毒生コレラ菌(V. cholerae)ワクチン候補から欠失しているが、CTXΦ(コレラ菌(V. cholerae)に感染し、それのゲノムをコレラ菌(V. cholerae)染色体へ組み込み、および/またはプラスミドとして染色体外で複製する糸状バクテリオファージ)により運ばれる。したがって、コレラ菌(V. cholerae)の弱毒株のCTXΦ感染が、その株を毒性状態に復帰変異するように誘導し得る重大なリスクがある;自然形質転換を含む、遺伝子獲得の他の手段もまた、復帰変異を媒介することができる。例えば、弱毒コレラ菌(V. cholerae)細菌株によるCTXΦ感染または形質転換により、コレラ毒素の獲得の可能性を防止および/または軽減する方法は、弱毒コレラ菌(V. cholerae)株を含むワクチンのバイオセーフティを保証するために非常に望ましい。
本開示はさらに、事前に細菌株から除去された遺伝子(例えば、毒性遺伝子)を特異的にターゲットするプログラム可能なRNAガイドヌクレアーゼシステムを含む組換え細菌株を提供する。細菌株から除去された遺伝子をターゲットすることにより、組換え細菌による毒性表現型の復帰変異が、(例えば、前記遺伝子の再獲得を防止することにより)防止および/または改善され得る。本明細書に記載されているようなプログラム可能なRNAガイドヌクレアーゼシステムの使用は、弱毒生ワクチン細菌株において、その株の弱毒表現型を維持するために、特に有用である。
いくつかの実施形態において、毒性遺伝子はCTXΦ遺伝子であり、細菌は、弱毒コレラ菌(V. cholerae)細菌である。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、CTXΦゲノムの核酸配列を特異的にターゲットすることにより、CTXΦゲノムのコレラ菌(V. cholerae)細菌ゲノムへの組込みおよび/またはCTXΦゲノムのプラスミドとしての維持(それらのいずれも、細菌を、毒性状態に適応させ、および/または復帰変異させ得る)を防止することが可能である。gRNAは、CTXΦゲノムに存在する標的核酸配列と相補的なターゲティングドメインを含み得る;しかしながら、gRNAがCTXΦゲノムの核酸配列を特異的にターゲットし、および細菌ゲノム核酸配列をターゲットしないことが好ましい。いくつかの実施形態において、gRNAは、CTXΦ遺伝子に存在する標的核酸配列(例えば、rstR、rstA、rstB、psh、cep、orfU(gIII)、ace、zot、ctxA、およびctxB)と相補的なターゲティングドメインを含む。ctxAをターゲットすることが特に望ましい。いくつかの実施形態において、gRNAは、ctxA遺伝子に存在する標的核酸配列と相補的なターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態において、gRNAは、核酸配列:5’−cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc−3’(配列番号3;ctxAに特異的なターゲティング配列は下線で強調されている)を含む。いくつかの実施形態において、gRNAは、核酸配列:5’−tttttgtcgattatcttgctgttctagagagcgggagctcaagttagaataaggctagtccgtattcagtgcgggagcacggcaccgattcggtgc−3’(配列番号4;rstAに特異的なターゲティング配列は下線で強調されている)を含む。いくつかの実施形態において、gRNAは、核酸配列:5’−taaacaaagggagcattatagttggagaggcatgagaatgccaagttccaataaggctagtccgtacacacctaggagactaggggcaccgagtcggtgc−3’(配列番号5;ctxAに特異的なターゲティング配列は下線で強調されている)を含む。
さらなる態様は、本明細書に提供された遺伝子組換え型細菌(例えば、遺伝子組換え型コレラ菌(V. cholerae)細菌)を用いる方法を包含する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌を対象に(例えば、経口で)投与することにより対象の免疫系を調節するための方法が本明細書に提供される。方法は、本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌を含む組成物の有効量を対象(例えば、ヒト対象)に投与することを含む。組成物の有効量が、所望の応答(例えば、防御応答、粘膜応答、体液性応答、または細胞応答)を生じるだろう量であることを当業者は認識しているだろう。応答は、当技術分野において知られた方法により定量化することができる。
本明細書に記載された遺伝子組換え型細菌を含む薬学的組成物は、任意選択で、担体、保存剤、凍結保護物質(例えば、スクロースおよびトレハロース)、安定剤、アジュバント、および他の物質などの1つまたは複数の可能な薬学的に許容される賦形剤を含み得る。例えば、組成物が、生きている遺伝子組換え型細菌を含む場合、賦形剤は、その生細菌が死滅しないように、または対象に効果的にコロニー形成する細菌の能力が賦形剤の使用により損なわれないように、選択される。適切な薬学的担体は、当技術分野において知られており、例えば、それには、生理食塩水および生理的濃度での、またはそれに近い他の無毒性塩などの液体担体、ならびにタルクおよびスクロースなどの固体担体が挙げられる。いくつかの実施形態において、薬学的組成物はアジュバントを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、対象へのエアロゾル化投与に適した形をとり得る。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、フリーズドライの形(すなわち、凍結乾燥した形)をとる。いくつかの実施形態において、薬学的製剤はゼラチンカプセルである。適切な薬学的担体およびアジュバントおよび剤形の調製は、参照により本明細書に組み入れられている、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Edition, (Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985)に記載されている。
遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌株は、投与から1日以内にコレラ菌(V. cholerae)の毒性株に対する抵抗性を与える
イエメンおよびハイチにおける大規模かつ進行中のコレラの流行は、この古代からの下痢性疾患が未だに公衆衛生にとっての重大な脅威であることを示している(Balakrishnan (2017) Lancet Infect. Dis. 17, 700-1;およびAli et al. (2015) PLoS Negl. Trop Dis. 9, e0003832)。コレラは、グラム陰性細菌病原体である、コレラ菌(Vibrio cholerae)により汚染された水または食物の摂取に起因する。コレラ菌(V. cholerae)は、小腸でコロニー形成し、そこで、それは、コレラ毒素を産生し、そのコレラ毒素が、激しい水様性下痢および結果としての脱水症状を引き起こし、それは、補水治療がなければ、速やかに死に至り得る(Clemens et al. (2017) Lancet 390(10101): 1539-49)。コレラ伝播を制限する公衆衛生介入は重要であり、そうでなければコレラ流行の激しい拡散が、特に、衛生インフラおよび給水における崩壊を伴って、起こるからである。死滅したコレラ菌(V. cholerae)細胞全体からなる経口コレラワクチン(OCV)は、流行地において穏やかな防御効力を生じ(Qadri et al. (2015) Lancet 386(10001): 1362-71)、これらのワクチンは最近、コレラの拡散をブロックすることを目指した「受け身的ワクチン接種」プログラムの一部として非流行区域において、大発生中に配備された(例えば、Luquero et al. (2014) N. Engl. J. Med. 370(22): 2111-20参照)。しかしながら、死滅型OCVの最適な効力は、14日間離して投与される2回分の冷蔵用量を必要とし(例えば、Kabir (2014) Clin. Vaccine Immunol. 21(9): 1195-1205参照)、これらの特徴は、不安定な、または資源の乏しい設定において、進行中の大発生を迅速に抑制する死滅型OCVの能力を制限し得る。単回投与の弱毒生OCVは、曝露研究(例えば、Chen et al. (2016) Clin. Infect. Dis. 62(11): 1329-35参照)および流行地における初期臨床試験(Qadri et al. (2007) Vaccine 25(2): 231-8)において効力を示し、弱毒生OCVでの受け身的ワクチン接種が、大発生中のコレラの発生率の減少に寄与した可能性がある(Calain et al. (2004) Vaccine 22(19): 2444-51参照)。しかしながら、2010年のハイチコレラ大発生の原因である株のような、世界的に優勢な「バリアント」El Tor株に基づいた生OCVはない(Chin et al. (2011) N. Engl. J. Med. 364(1): 33-42参照)。さらに、コレラからの迅速な(例えば、投与から24時間以内の)保護を媒介することが示されている、死滅型OCVも弱毒生OCVもなく、それどころか、現在のワクチンは、コレラからの保護を生じ得る、防御的適応免疫応答を誘発するのに必要な時間(最低1週間)を必要とすると考えられている。この実施例は、投与から1日以内に、乳児ウサギを致死性コレラ様疾患から迅速に保護することが見出された、ハイチの大発生株に基づいた新しい弱毒生コレラワクチンの作製を記載する。
以下の材料および方法を、この実施例で用いた。
研究デザイン
この研究の目的は、新しい弱毒生コレラワクチン候補をデザインし、腸に安全にコロニー形成するその株の能力を評価し、その株が、それの投与後すぐにコレラ様疾患から動物を保護することができるかどうかを決定し、観察される保護パラメータの、流行中コレラ感染の発生率への潜在的影響を定量化することであった。ワクチン候補を、世界的に優勢なコレラ菌(V. cholerae)株の分離株から、連続的アレル交換ステップ(遺伝子操作参照)によって導き出し、変異を、全ゲノムシーケンシング(全ゲノムシーケンシング参照)により検証した。腸管定着およびコレラ様疾患の研究を、研究における動物の使用に関する連邦政府および機関のガイドラインに従って、乳児ウサギの感染モデルを用いて行った(乳児ウサギ感染研究参照)。日齢1〜2日の動物を、処置群へランダムに割り当て、同腹仔内(すなわち、同時飼育され、かつ同年齢)の対照を用いて、同腹仔間の変動の影響を最小限にした。疾患進行の研究について、評価者は、各群に投与された処置を知らず、曝露から10時間以内に死亡が見出された動物は、母親の拒絶と一致した身体外傷が原因として、排除された。トランスポゾン挿入シーケンシング研究を、ARTISTパイプラインを用いて行い、そのARTISTパイプラインは、実験ノイズをモデル化し、それを補い、効果サイズ閾値の設定についての推奨を提供する(トランスポゾン挿入シーケンシング分析を参照)。最後に、疾患伝播についての以前に発表されたパラメータのセットへワクチン保護までの可変時間を組み入れるモデル化を実施した(コレラ大発生のモデル化参照)。
2つの試料の比較を、t検定の両側検定(α=0.05)(液体貯留比)、ノンパラメトリックなデータについてのマン−ホイットニーU検定(細菌負荷量)、またはログランク検定(生存曲線)を用いて実施した。3つの試料の比較を、クラスカル−ウォリス検定、続いて、Dunnの多重比較検定を用いて実施した(細菌負荷量)。
表3は、この研究に用いられる株のリストを含有する。特に断りのない限り、コレラ菌(V. cholerae)および大腸菌(E. coli)を、溶原性ブロス(LB:10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl)中、37℃で振盪(250RPM)させながら増殖させた。ファージ形質導入アッセイにおけるレシピエント株を、AKI培地(15g/Lペプトン、4g/L酵母抽出物、5g/L NaCl、オートクレーブし、その後、新鮮に作製されて、滅菌濾過された0.3%NaHCO3を追加した)中で増殖させた。
全ての遺伝子欠失および置換を、自殺ベクターpCVD442、DH5α−λpir、およびドナー株MFD−λpir(Ferrieres et al. (2010) J. Bacteriol. 192(24): 6418-27参照)またはSM10−λpir(表3)を用いて、相同組換えによって構築した。全ての欠失について、それぞれのORFの上流および下流のおよそ500〜700bp相同領域を、下記のプライマー組合せを用いて増幅し、XbaIにより消化されたpCVD442へ等温アセンブリーを用いてクローニングした。
HaitiWTおよびHaitiV由来のゲノムDNAを、Nextera XTライブラリー調製キット(ILLUMINA)を用いて調製し、MiSeq(試薬キットv2、2×250)においてシーケンシングした。HaitiVの細菌染色体のゲノム配列は、本明細書で配列番号7および51として提供されている。HaitiV株は、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110、USAにあるアメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC)に2018年6月22日、ブダペスト条約の条件の下、寄託され、ATCC Patent Deposit Designation PTA−125138を付与された。各試料を、GATK3.6を用いて同定されたそれの推定ゲノムおよびバリアントへマッピングした。
CTXΦ−IGKn(ゲノムがctxAを含むファージ(例えば、Lazar and Walder (1998) Infect. lmmun. 66: 394-7参照)またはCTX−KnΦ(ゲノムがctxAを欠損するファージ(例えば、Waldor and Mekalanos (1996) Science 272(5270): 1910-4参照)を有するコレラ菌(Vibrio cholerae)O395株(LB中、1.0のOD600まで30℃で増殖させた)由来の上清を濃縮し(およそ50倍;Ultracel−100K遠心フィルター、MILLIPORE)、濾過して(0.22μmフィルター、MILLIPORE)、無細胞ファージ上清を得た。CTXΦ感受性についてアッセイすることになっている株においてTCP(ファージ受容体)の発現を誘導するために、一晩のLB培養物を、16×150mmガラス培養チューブ中10mL AKIへ逆に1:100希釈し、振盪なしで37℃、4時間、インキュベートした。その後、培養物の1mLを除いた全部を捨て、その培養物を、37℃でさらに2時間の好気培養のために振盪機(250rpm)に移した。レシピエント培養物を、遠心分離により1回、洗浄し、ファージ上清と2:1に混合し、室温で20分間、インキュベートした。その後、段階希釈物を、LB寒天プレートおよびLB+カナマイシン(100μg/mL)寒天プレート上にプレーティングし、形質導入効率を、(CFU/mL)Kan100/(CFU/mL)LBとして計算した。
pir依存性HimarトランスポゾンベクターpSC189を有する大腸菌(E. coli)SM10λpir(Chiang and Rubin (2002) Gene 296(1-2): 179-85)を、レシピエントHaitiWTと接合させて、トランスポゾン挿入ライブラリーを作製した。各株の一晩の培養物を、37℃で好気的に増殖させ、その後、37℃で培地中、1:100希釈した。4時間の増殖後、各培養物の4mLをペレット化し、LBで1回、洗浄した。その後、培養物を1:1比で混合し、ペレット化し、800μL LB中に再懸濁した。その混合物の50μLを、LB寒天プレート上の0.45μmフィルター上へ、合計16個の接合反応として、スポットした。反応物を37℃で4時間、インキュベートし、その後、フィルターをLB(1mL/フィルター)中、ボルテックスして、付着細菌を再懸濁した。懸濁液を、245mm2 LB+Sm/Kan寒天プレート上へプレーティングして、コレラ菌(V. cholerae)接合完了体について選択した(2mL懸濁液/プレート)。細菌コロニーを数え上げるために、プレートを30℃で一晩、インキュベートした。ライブラリーは、約300,000個のコロニーからなり、それを掻爬してLB+25%グリセロール中へ入れた。OD600をおよそ10に調整し、アリコートを下流での使用のために−80℃で保存した。
乳児ウサギ研究を、Brigham and Women’s Hospital Committee on Animalsにより認可されたプロトコール(Institutional Animal Care and Use Committeeプロトコール番号2016N000334、Animal Welfare Assurance of Compliance番号A4752−01)により、かつ米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針および米国農務省の動物福祉法における推奨に従って、行った。
トランスポゾン挿入ライブラリーは、大量並行シーケンシングにより特徴付けられた;以前記載されているように(Pritchard et al. (2014) PLoS Genet. 10(11): e1004782参照)、配列データを処理し、コレラ菌(V. cholerae)H1ゲノム(例えば、Bashir et al. (2012) Nat. Biotechnol. 30(7): 701-7参照)へマッピングした。より複雑度が高いライブラリー(>30,000個の固有遺伝子型)を、ARTISTパイプラインを用いて、インプットライブラリーと比較した。データを、100,000bpウィンドウのLOESS補正を用いて開始点近接について補正した。接種データセットを、Con−ARTISTの多項分布に基づいたランダムサンプリング(n=100)を用いて、腸データセットに対して独立的に正規化した。Con−ARTISTのマン−ホイットニーU関数の改変バージョンを用いて、腸データセットをそれらの100個の類似した対照データセットと比較した。平均情報部位の閾値>5|Log2(平均倍数変化)|>1、平均逆P値>100を課して、接種材料に比べて、腸データセットにおいて、対応する挿入変異体が有意に濃縮され、または枯渇している、遺伝子座を同定した。
以前の研究(Azman (2015) PLoS Med. 12: e1001867)から適応させた本発明者らのモデルは、図10Aに概略的に描かれている。疾患伝播についてのパラメータは以前に発表されている(図10B)。ワクチンロールアウトを、総集団の70%がワクチン接種されるまで、キャンペーンの期間(図6D、11Bにおいては7日間;11Aにおいては様々である)に渡って1日あたり一定数の投薬で進行するものとしてモデル化した。キャンペーンは、症候性の症例の数(すでに感受性のある集団における総感染者の25%と推定される;Jackson et al. (2013) Am. J. Trop. Med. Hyg. 89: 654-64参照)が閾値(図6D、11Aにおいて1,000人;図11Bにおいては様々)を超えた時、発動された。シミュレーションに用いられる伝播速度(β)を、R0=β/γを用いて、基本再生産数(R0)を以前のコレラ大発生と一致した1〜5の範囲内と仮定して計算した。以前のモデル化研究(Azman et al. (2013) J. Infect. 66: 432-8)と一致して、家庭内伝播研究において推定された平均感染力期間(1/γ)が想定された(Weil et al. (2009) Clin. Infect. Dis. 49: 1473-9)。感染に対する同等の効力をもつより遅効性の代替物に対して、HaitiVなどの速効性ワクチンを用いることの影響を比較するために、単一用量の受入後1日間対10日間の保護の発生までの平均時間(1/τ)が想定された。獲得率を70%、低下させるワクチン作用の「リーキーな(leaky)」モード(θ)をモデル化した。常微分方程式を、そうでなければ感受性集団における単回曝露された個体の初期条件を以て、ode45関数を用いるMATLAB R2016b(Mathworks, Natick, MA)において解いた。このモデルについて、微分方程式のシステムは以下である:
弱毒生ワクチンとして用いる、遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌株HaitiVの作製
新しいワクチン、HaitiVを導くために9つの異なる改変を生じさせ(表5)、全ゲノムシーケンシングを用いて、変異が存在することを確認した。野生型コレラ菌(V. cholerae)およびいくつかの以前試験された生ワクチン候補(Cohen et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1965-70; and Chen et al. (2016) Clin. Infect. Dis. 62(11): 1329-35)と同様に、単回経口投与後長期間免疫を与える可能性が高いように、腸管定着するHaitiVの能力を維持しながら、コレラワクチンの間で前例のない程度まで、バイオセーフティを保証するために、変異を企てた。HaitiVの安全性を保証するために、本発明者らは、病原体の主要な毒性因子である、コレラ毒素(CT)をコードするバクテリオファージ(CTXΦ)を除去し(Waldor and Mekalanos (1996) Science 272(5270): 1910-4)(図1)、かつ毒素産生性復帰変異に対する厳しい妨害を施した。CTXΦの境界の欠失は、それの染色体組込みに必要な配列、加えて、多機能MARTX毒素、rtxAをコードする遺伝子(Fullner et al. (2002) J. Exp. Med. 195(11): 1455-62参照)の除去を生じる。さらに、HaitiVは、CTXΦのエピソーム維持に必要な遺伝子である、hupB(Martinez et al. (2015) PLoS Genet. 11(5): e1005256参照)を欠く。HaitiVはまた、毒素遺伝子ctxAを特異的にターゲットするCRISPR/Cas9システムをコードする。無傷ctxAを有するCTXΦは、このシステムを有するワクチンに感染することができなかったが、ctxAを欠くCTXΦバリアントは感染に対するそのような障害を示さなかった(図3A〜3C)。追加のワクチン操作は、1)コレラ菌(V. cholera)の5つのフラゲリンを欠失させることにより潜在的ワクチン反応源性を低下させるためのステップ(Rui et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(9): 4359-64参照);2)SXT組込み接合エレメント(Integrative Conjugative Element:ICE)内にある、抗生物質に対する抵抗性を与える遺伝子を移動させるワクチンの能力を排除するためのステップ(図2);3)腸内毒素原性大腸菌(E. coli)およびコレラ菌(V. cholerae)により引き起こされる下痢性疾患からの保護を誘発し得る、CT(図7)の無毒性Bサブユニット(Kauffman et al. (2016) MBio. 7(6): e 02021-16)をワクチンが産生するのを可能にするステップ;ならびに4)recAを欠失させて、それによりDNA組換えを行う株の能力を著しく低下させることにより、潜在的遺伝子獲得を最小限にするためのステップを含んだ。HaitiV弱毒生コレラワクチンにおける遺伝子変化は表5に要約されている。
経口胃的に接種されたHaitiVの、それが由来した野生型コレラ菌(V. cholerae)分離株(本明細書ではHaitiWTと呼ばれる)と比較しての比較研究を、乳児ウサギ(急速な死亡率を含むヒトコレラの多くの側面を再現する小動物モデル)において実施した(Ritchie et al. (2010) MBio. 1(1): e00047-10参照)。HaitiWTを接種された全ての動物は、接種後18時間目(18HPI)までに瀕死状態へ進行した。剖検において、これらの動物の盲腸は、ctxAB依存性コレラ下痢に似ていることが以前見出されている液体で満たされた(図4A)(Ritchie et al. (2010)参照)。著しく対照的に、HaitiVを接種された同腹仔の盲腸において、18HPIまでに、微量の液体が蓄積され、または全く蓄積されなかった(図4A)。HaitiVを接種された動物は、90HPIに及ぶ観察期間の間、コレラ様疾患を示さなかったが、稀な場合として、動物は、軽度かつ自己限定性の非コレラ性下痢を示した。HaitiVを接種された動物は、90HPIまで体重が増加し続け、HaitiV接種がその動物の健康全般または発育に有害ではないというさらなるしるしを提供した(図4B)。
HaitiVのロバストかつ長期の腸の占有を前提として、HaitiVコロニー形成した動物が、適応免疫応答の発生前さえも、例えば、病原体の腸内適所の変化による、HaitiWTによるコロニー形成に対する抵抗性を示し得るかどうかを決定するために実験を実施した。動物を、HaitiV(生ワクチン)、ホルマリン死滅型HaitiV(死滅型ワクチン)またはバッファー対照(モック)のいずれかを接種し、その後、24時間後、致死量のHaitiWTに曝露させた。バッファーおよびホルマリン群における動物は、HaitiWT曝露後、重度のコレラ様疾患を発症し、これらの動物におけるHaitiWTの腸内負荷量は、前処置なしの動物に似ていた(図5A、5B、および4C)。逆に、生ワクチンを受けたいずれの動物も、HaitiWT曝露から18時間以内に重篤な疾患の徴候を示さず、死滅型ワクチンを接種された動物と対比して、生ワクチンを前もって接種された動物の腸から、より低いレベルのHaitiWTが回収された(図5B)。HaitiWT負荷量の低下は、生ワクチンを前もって接種された動物に渡って振幅が様々であり、2匹の動物においては検出限界を下回った。生ワクチンのHaitiWTコロニー形成の拮抗作用(すなわち、コロニー形成抵抗性)は、HaitiVの事前接種に依存するように思われた;逐次的というよりむしろ同時にその2つの株を接種された動物においてHaitiWTの通常の負荷量が観察された(図4E対図5B)。
コレラ様疾患からのHaitiV依存性保護を定量化するために、乳児ウサギに、生ワクチンまたは死滅型ワクチンを接種し、24時間後、HaitiWTに曝露させ、それらの状態を評価するために定期的にモニターした。死滅型ワクチンを接種された全ての動物は、下痢を発症し(発生中央値15時間)、HaitiWT接種から29時間以内に瀕死状態へ進行した(中央値18.8時間)(図6A)。著しく対照的に、生ワクチンを接種された動物は、下痢を発症するのが有意により遅く(中央値28.3時間;1匹の動物は目に見える下痢を発症しなかった)、致死性曝露後の生存時間(中央値>41.3時間;図6A)および下痢発生後の生存率(対照動物における5時間に対して>13時間;図6B)における顕著な増加を示した。さらに、生ワクチンを接種された4匹の動物は、研究が致死性曝露から40時間後に終了した時、全ての動物において検出可能なHaitiWTコロニー形成があったにも関わらず、瀕死状態に達していなかった(図6Aおよび6C)。したがって、HaitiVは、絶対的なコロニー形成抵抗性ではない場合でさえも、疾患から保護し得る。HaitiV誘導性コロニー形成抵抗性および疾患防御の迅速性、ならびに新生仔の感染モデルにおけるこれらの表現型の観察は、ワクチン誘発性適応免疫防御と一致しない。それどころか、データは、HaitiVが、腸にコロニー形成し、かつコレラからの生存能依存性保護を媒介すること(プロバイオティクス剤の定義と一致する性質)を示している(Hill et al. (2014) Nat. Rev. Gastroenetrol. Hepatol. 11: 506-514参照)。
HaitiVは、マウスにおいて殺ビブリオ性抗体応答および抗OSP抗体を誘導する
HaitiVはマウスにおいて殺ビブリオ性抗体応答を誘導する
HaitiVの接種が、殺ビブリオ性抗体応答を誘導するかどうかを決定するために、C57BL/6およびSwiss−WebsterマウスにHaitiVか、CVD103−HgR*と本明細書で呼ばれるコレラ菌(V. cholerae)細菌株CVD103−HgRに由来した自発性ストレプトマイシン抵抗性変異体(対照)のいずれかを接種した。CVD−103HgR(Vaxchora(商標);PaxVax,Inc.、Redwood City、CA、USA)は、成人旅行者においてコレラ菌(V. cholerae)O1により引き起こされるコレラの予防として現在、認可されている。血清殺ビブリオ性活性を、コレラ菌(V. cholerae) PIC018(Inaba血清型)またはPIC158(Ogawa血清型)の補体媒介性細胞溶解を評価するインビトロの微量希釈アッセイを用いて分析した。図12A〜12Dに示されているように、HaitiVまたはCVD103−HgR*のいずれも初回接種から7日後、マウスから収集された血清中に、ロバストな殺ビブリオ性応答が観察された。
HaitiVの接種が、O抗原特異的多糖(OSP)に対する抗体応答を誘導するかどうかを決定するために、C57BL/6およびSwiss−Websterマウスに、HaitiVかまたはCVD103−HgR*(対照)のいずれかを接種し、Ogawa由来かまたはInaba由来かのいずれかのOSPに対する抗OSP IgAおよび抗OSP IgG抗体の存在量を、ELISAを用いて測定した。図13A〜13Dおよび14A〜14Dに示されているように、抗OSP IgAおよびIgG抗体の存在量は時間と共に増加した。HaitiVを接種されたマウスは、CVD103−HgR*を接種されたマウスよりOgawa由来OSPに対するより顕著なIgG応答を示した。
以下の材料および方法がこの実施例に用いられた。
CVD−103HgR(Vaxchora(商標);PaxVax,Inc.、Redwood City、CA、USA)のストレプトマイシン抵抗性株を作製するために、その細菌株を、5mLのLBブロスへ接種し、通気しながら(250rpm)、37℃で一晩、培養した。1mLの一晩培養物を、LB寒天+ストレプトマイシン(1000μg/mL)上にプレーティングし、37℃で一晩、インキュベートした。LB寒天+ストレプトマイシン(1000μg/mL)上に生じたコロニーは、CVD−103HgRの自発性ストレプトマイシン抵抗性変異体と考えられ、以後、CVD103−HgR*と呼ばれた。
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本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、本発明を例証することを意図され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されることは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (49)
- (a)コレラ毒素サブユニットAをコードする核酸配列における欠失;
(b)Cas9ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列;および
(c)ガイドRNA(gRNA)をコードする異種性核酸配列であって、前記gRNAがctxAの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列
を含む遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。 - 前記コレラ毒素サブユニットAをコードする核酸配列における欠失が、前記細菌のゲノムへ組み込まれたctxA遺伝子内に位置する、請求項1に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記細菌のゲノムへ組み込まれたCTXΦゲノムのコア領域の核酸配列における欠失を含む、請求項1または2に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記細菌のゲノムへ組み込まれたCTXΦゲノムのRS2領域の核酸配列における欠失を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記細菌のゲノムへ組み込まれたCTXΦゲノムの完全な欠失を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- (a)Cas9ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列;および
(b)ガイドRNA(gRNA)をコードする異種性核酸配列であって、前記gRNAがCTXΦの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列
を含む遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。 - 前記細菌ゲノムへ組み込まれたCTXΦゲノムのコピーを事前に含んでいない、請求項6に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記CTXΦゲノムの標的核酸配列が、rstR、rstA、rstB、psh、cep、orfU、ace、zot、ctxA、およびctxBからなる群から選択される遺伝子内に位置する、請求項6または7に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記CTXΦゲノムの標的核酸配列が、ctxA遺伝子内に位置する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記gRNAが、核酸配列5’−cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc−3’(配列番号3)を含む、請求項9に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 多機能性自己プロセシング毒素内リピート(MARTX)毒素をコードする核酸配列における欠失を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記MARTX毒素をコードする核酸配列が、rtxA、rtxB、rtxC、rtxD、およびrtxEからなる群から選択される、請求項11に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- DNA結合タンパク質HU−ベータをコードする核酸配列における欠失をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記DNA結合タンパク質HU−ベータをコードする核酸配列が、hupB遺伝子である、請求項13に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- フラゲリンをコードする核酸における欠失をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記フラゲリンをコードする核酸配列がflaA、flaB、flaC、flaD、およびFlaEからなる群から選択される、請求項15に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記細菌が異種性核酸を含み、前記異種性核酸が、プロモーターに作動可能に連結しているコレラ毒素サブユニットBをコードする遺伝子を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記コレラ毒素サブユニットBをコードする遺伝子がctxB遺伝子である、請求項17に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項17または18に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記プロモーターがPhtpgプロモーターである、請求項17〜19のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- RecAタンパク質をコードする核酸配列における欠失を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記RecAタンパク質をコードする核酸配列がrecA遺伝子である、請求項21に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- (a)rtxA、rtxB、rtxC、rtxD、rtxE、およびrtxHからなる群から選択されるMARTX毒素をコードする1つまたは複数の核酸配列における欠失;
(b)flaA、flaB、flaC、flaD、およびFlaEからなる群から選択される1つまたは複数のフラゲリン遺伝子における欠失;
(c)recA遺伝子における欠失;ならびに
(d)前記異種性核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結したctxB遺伝子を含む、異種性核酸
を含む遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。 - 前記細菌のゲノムへ組み込まれたCTXΦゲノムの完全な欠失を含む、請求項23に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記細菌ゲノムへ組み込まれたCTXΦプロファージゲノムのコピーを事前に含んでいない、請求項23に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- (a)Cas9ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列;および
(b)ガイドRNA(gRNA)をコードする異種性核酸配列であって、前記gRNAが、ctxAの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列
をさらに含む、請求項23に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。 - 前記CTXΦの標的核酸配列がctxA遺伝子内に位置する、請求項26に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記gRNAが核酸配列5’−cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc−3’(配列番号3)を含む、請求項27に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、およびクロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列のうちの1つまたは複数における欠失を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がdfrAである、請求項29に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がsul2である、請求項29に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がstrABである、請求項29に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 前記クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がfloRである、請求項29に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- El Torバイオタイプに属する親株に由来する、請求項1〜33のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- Haiti親株に由来する、請求項1〜34のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 配列番号7の核酸配列を含む第1の細菌染色体を含む、遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 配列番号51の核酸配列を含む第2の細菌染色体を含む、請求項36に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 細菌が、それの親株と比べて、ATCC寄託番号PTA−125138を有する株と同じ遺伝子における変異を有する、遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- ATCC寄託番号PTA−125138を有するコレラ菌(V. cholerae)株である、遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- 請求項1〜39のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- 対象においてコレラ菌(Vibrio cholerae)の毒性株に対する防御応答を誘導する方法であって、請求項1〜39のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌、または請求項40に記載の薬学的組成物を前記対象に投与して、それにより、前記対象において前記コレラ菌(Vibrio cholerae)の毒性株に対する防御応答を誘導することを含む、方法。
- 前記対象がヒト対象である、請求項41に記載の方法。
- 前記防御応答が、前記遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌または前記薬学的組成物を対象へ投与してから24時間以内に誘導される、請求項41または42に記載の方法。
- (a)少なくとも1つの毒性遺伝子の欠失;
(b)Cas9ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列;および
(c)ガイドRNA(gRNA)をコードする1つまたは複数の異種性核酸であって、前記gRNAが前記欠失した毒性遺伝子の標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸
を含む遺伝子組換え型細菌であって、前記Cas9ヌクレアーゼ分子が前記gRNAと結合して、それにより複合体を形成する能力があり、前記複合体が、前記欠失した毒性遺伝子の核酸配列をターゲットして、切断する能力がある、遺伝子組換え型細菌。 - コレラ菌(Vibrio cholerae)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソンネイ(Shigella sonnei)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、およびクロストリディオイデス・ディフィシル(Clostridioides difficile)からなる群から選択される種である、請求項44に記載の遺伝子組換え型細菌。
- 前記毒性遺伝子が、ctxA、aroA、aroQ、aroC、aroD、htrA、ssaV、cya、crp、phoP、phoQ、guaB、guaA、clpX、clpP、set、sen、virG/icsA、luc、aroA、msbB2、stxA、stxB、ampG、dnt、tcdA、およびtcdBからなる群から選択される、請求項44または45に記載の遺伝子組換え型細菌。
- 請求項44〜46のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
- 対象においてコレラ菌(Vibrio cholerae)の毒性株に対する防御応答を誘導する方法における使用のための、請求項1〜39のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
- コレラ菌(Vibrio cholerae)の毒性株を有する対象を処置する方法における使用のための、請求項1〜39のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型コレラ菌(Vibrio cholerae)細菌。
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