JP7229219B2 - 流体通路を含むナノポアセンサ - Google Patents
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Description
本出願は、参照により全体として本明細書に組み入れられる、2015年2月5日に出願された米国特許仮出願第62/112,630号の恩典を主張する。
本発明は、NIHによって付与された契約第5DP1OD003900号の下、政府支援を受けて成されたものである。政府は本発明に特定の権利を有する。
[本発明1001]
支持構造中に配置されたナノポア;
第一の流体リザーバ;
流体通路幅を有し、該流体通路幅よりも大きい流体通路長を有する流体通路であって、該流体通路を介して該第一の流体リザーバを該ナノポアに流体的に接続するための、該第一の流体リザーバと該ナノポアとの間に配置された流体通路;
該ナノポアに流体的に接続された第二の流体リザーバであって、該ナノポアが該流体通路と該第二の流体リザーバとの間の流体接続を提供する、第二の流体リザーバ;
該第一および第二の流体リザーバの間で該ナノポアをはさんで電位差を加えるための、該第一および第二のリザーバ中に接続された電極;ならびに
該流体通路に局所的な電位を計測するための接続を有する、ナノポアセンサ中に配置された少なくとも1つの電気変換素子
を含む、ナノポアセンサ。
[本発明1002]
電気変換素子が流体通路内に配置されている、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1003]
電気変換素子がナノポア支持構造上に配置されている、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1004]
電気変換素子が、電位の変化に応答して蛍光を変化させる蛍光色素を含む、本発明1001、1002または1003のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1005]
電気変換素子が電気装置または装置領域を含む、本発明1001、1002または1003のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1006]
電気変換素子が電気回路を含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1007]
電気変換素子がトランジスタを含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1008]
電気変換素子が電界効果トランジスタを含む、本発明1007のナノポアセンサ。
[本発明1009]
電気変換素子がナノワイヤ電界効果トランジスタを含む、本発明1008のナノポアセンサ。
[本発明1010]
ナノワイヤがシリコンナノワイヤを含む、本発明1009のナノポアセンサ。
[本発明1011]
電気変換素子が単一電子トランジスタを含む、本発明1007のナノポアセンサ。
[本発明1012]
前記トランジスタがナノポア支持構造上に配置されている、本発明1007、1008、1009、1010または1011のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1013]
前記トランジスタが、ナノポアに配置されている電子伝導チャネルを含む、本発明1007、1008、1009、1010または1011のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1014]
電気変換素子が電気伝導チャネルを含む、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1015]
ナノポアが配置されている支持構造が膜を含む、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1016]
膜がグラフェンを含む、本発明1015のナノポアセンサ。
[本発明1017]
電気変換素子が、ナノポアが配置されているグラフェン層を含む、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1018]
支持構造が膜を含み、電気変換素子が、該膜上の流体通路中に配置されたナノワイヤを含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1019]
ナノポアが配置されている支持構造が固体材料を含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1020]
ナノポアが生物学的材料を含む、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1021]
ナノポアが、固体支持構造中の両親媒性層中に配置された生物学的材料を含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1022]
第一の流体リザーバが、第一のイオン濃度を有する第一の流体溶液を保持し、第二の流体リザーバが、該第一のイオン濃度とは異なる第二のイオン濃度を有する第二の流体溶液を保持する、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1023]
第二のイオン濃度が第一のイオン濃度よりも少なくとも約10倍高い、本発明1022のナノポアセンサ。
[本発明1024]
第二のイオン濃度が第一のイオン濃度よりも少なくとも約100倍高い、本発明1022のナノポアセンサ。
[本発明1025]
流体通路長が流体通路幅よりも少なくとも約10倍大きい、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1026]
流体通路長が流体通路幅よりも少なくとも約100倍大きい、本発明1025のナノポアセンサ。
[本発明1027]
流体通路長が流体通路幅よりも少なくとも約1000倍大きい、本発明1026のナノポアセンサ。
[本発明1028]
ナノポアをはさんで電位差を加えるために接続された電極が、対象物を流体リザーバ間で該ナノポアに通して電気泳動的に駆動するための、該ナノポアへの入口と該ナノポアからの出口との間の電圧バイアスを有する電気接続を、第一の流体リザーバと第二の流体リザーバとの間に含む、前記本発明のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1029]
電気変換素子が、DNA、DNAフラグメント、RNA、RNAフラグメント、PNA、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、およびポリマーからなる群より選択される少なくとも1つの対象物の、ナノポアを通過するトランスロケーションに応答して流体通路に局所的な電位を計測するために接続されている、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1030]
ナノポアを通過する対象物のトランスロケーションの速度を制御するためにナノポアに配置された分子モータをさらに含む、本発明1028のナノポアセンサ。
[本発明1031]
電気変換素子が、ポリマーの単位ごとに異なる電位信号値を生成するように接続されている、本発明1028、1029または1030のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1032]
電気変換素子が、k-merごとに異なる電位信号値を生成するように接続され、k-merはポリマーのkポリマー単位であり、kは正の整数である、本発明1028、1029または1030のいずれかのナノポアセンサ。
[本発明1033]
計測された電位を時間の関数として処理して、ナノポアを通過する対象物のトランスロケーションの時間および持続時間を決定するための、前記変換素子に接続された電気回路をさらに含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1034]
電気変換素子計測値を光学的に決定するための光学読み出し素子をさらに含む、本発明1001のナノポアセンサ。
[本発明1035]
支持構造中、第一の支持構造面と第二の支持構造面との間にナノポアを提供する工程;
第一のイオン濃度を有する第一の流体溶液を保持する第一の流体リザーバを提供する工程であって、該第一の流体リザーバは、流体通路幅および該流体通路幅よりも大きい流体通路長を有する流体通路を介して該ナノポアと流体接続する状態で配置される、工程;
第二のイオン濃度を有する第二の流体溶液を保持する第二の流体リザーバを提供する工程であって、該第二の流体リザーバは、該ナノポアと直接流体接続する状態で配置される、工程;
該流体通路中の電位を計測する工程;
該流体通路中の計測された電位に基づいて、該流体通路長にわたって電位差を決定し、該ナノポアをはさんで電位差を決定する工程;
該流体通路長にわたって決定された電位差を該ナノポアをはさんで決定された電位差と比較する工程;ならびに
該流体通路長にわたって決定された電位差が、該ナノポアをはさんで決定された電位差の少なくとも0.1倍~100倍になるまで、該第一のイオン濃度および該第二のイオン濃度の少なくとも1つを調節する工程
を含む、ナノポアセンサを較正する方法。
[本発明1036]
対象物をナノポアに通してトランスロケートし、トランスロケーション中の時間の関数として流体通路中の電位を計測する工程;
計測された電位を、該ナノポアを通過する公知の対象物の以前のトランスロケーションおよび該公知対象物トランスロケーションによる該流体通路中の電位の計測に基づく該流体通路中の公知の電位値と比較する工程;ならびに
該比較に基づいて該対象物を同定する工程
をさらに含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記公知の対象物が、DNA、DNAフラグメント、RNA、RNAフラグメント、PNA、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、およびポリマーからなる群より選択される、本発明1036の方法。
図1A~1Eは、ナノポア検出のための局所電位検出法を可能にする、本明細書に提供されるナノポアセンサ構成の略図である。説明を明確にするために、図示される装置特徴は一定の拡大縮尺で示されていない。図1Aを参照すると、膜のような支持構造14を含み、その支持構造中にナノポア12が配置されているナノポアセンサ3が示されている。ナノポア12は、支持構造中、ここではトランス側リザーバおよびシス側リザーバとして概略的に示される2つの流体リザーバの間で、シス側リザーバとトランス側リザーバとの間の唯一の流体連絡経路であるように構成されている。一方のリザーバはナノポアの入口に接続され、他方のリザーバはナノポアからの出口に接続されている。ナノポアを通過する種トランスロケーションの局所電位計測検知のためのナノポアセンサの動作においては、種の1つまたは複数の対象物、たとえば分子が、2つのリザーバの一方の流体溶液中に、ナノポアを通って2つのリザーバの他方へトランスロケートするように提供されている。多くの用途、特に分子検出用途の場合、分子または他の種対象物をリザーバの一方の中のイオン流体溶液中に提供することが好ましいといえ、リザーバのいずれか1つの中に提供することができる。
式中、Cは流体イオン濃度であり、tは時間であり、rは、リザーバ中の、ナノポアから計測された点における位置であり、zは、ナノポア長を通過する距離である。ナノポアから遠いシス側リザーバ中ではC=CCisであり、ナノポアから遠いトランス側リザーバ中ではC=CTransであり、流束がナノポア中および両リザーバに関して同じであり、各リザーバ中のナノポア開口における濃度が連続的である境界条件下でこれらの拡散方程式を解くならば、2つのリザーバおよびナノポアのイオン濃度を以下のように求めることができる:
式中、lおよびdは、それぞれ、ナノポア支持構造の厚さおよびナノポア直径である。したがってイオン濃度分布は公知であり、溶液伝導率は濃度に比例するため、溶液の伝導率σは以下のように求められる:
式中、Σは溶液のモル伝導率である。全電流がIであると仮定すると、シス側リザーバ電圧VC、トランス側リザーバ電圧VTおよびナノポア電圧VPで、ナノポアセンサを通しての電位降下を以下のように求めることができる:
ナノポアから遠い、シス側リザーバ中の電位は、構造または膜に印加される電圧、すなわち膜電圧(TMV)に等しく、対象物をナノポアに通して電気泳動的に駆動し、ナノポアから遠い、トランス側チャンバ中の電位は0Vであると特定する境界条件でこれら3つの式を解くならば、ナノポアセンサ中の電圧、すなわちシス側リザーバ中の電圧VC(r)、トランス側リザーバ中の電圧VT(r)およびナノポア中の電圧VP(r)は以下のように求められる:
リザーバに通じる両方のナノポア開口で電位は連続的であるため、また、印加される全電圧はVであるため、式(5)を以下のようにさらに簡約することができる:
この式を用いると、ナノポア内の電場EP(r)を以下のように求めることができる:
この式を用いると、ナノポア中の分子のような種対象物の存在によるナノポア面積Aの減少による電位変化によってナノポアのトランス側リザーバ側の電位変化を以下のように推定することができる:
式中、δAは分子の断面積である。ナノポアセンサの抵抗、すなわちRCis、RTransおよびRPoreは、リザーバおよびナノポアをはさんでの電圧降下のための上記式に基づいて以下のように計算することができる:
したがって、ナノポアセンサの全抵抗およびイオン電流は
として求められる。
となるように選択されることが好ましい。
式中、RPoreはナノポアの抵抗であり、RFPは流体通路の抵抗であり、V0は、回路からナノポアに印加される電圧16である。
として求められる。
であるとき最大化され、RFP=RPoreであることを要求する。この関係は、流体通路抵抗がナノポア抵抗と同じでない場合、検出することができる電圧信号は可能な最大化電圧信号よりも小さくなるということを実証する。達成される実際の電圧信号と最大化計測電圧信号との比RSignalは、システムが最適状態からどのくらい離れているかを示し、比率メトリクスは
として求められる。
と記される条件において等しく、それにより、界面濃度CIを
と決定することができ、よって、ナノポア中のイオン濃度CPoreおよび流体通路中のイオン濃度CFPは
として求められる。
σ=Σ・C
式中、Σは溶液のモル伝導率であり、Cはイオン濃度である。この関係により、ナノポアの抵抗RPoreおよび流体通路の抵抗RFPは以下のように求められる:
そして、式(18)から、抵抗比を
として決定することができる。
として得られる。
から求めることができる。
ナノポアセンサ中のSiNW FETの作製
Auナノ粒子触媒化学蒸着(CVD)法を使用してSiNWを合成した。直径30nmの金ナノ粒子(Ted Pella Inc., Redding, CA)を、厚さ600nmの酸化ケイ素層(NOVA Electronic Materials Inc., Flower Mound, TX)でコートされたシリコンウェーハ上に分散させた。シリコン供給源として2.4標準立方センチメートル/分(sccm)のシラン、ホウ素ドーパント供給源として3sccmジボラン(ヘリウム中100ppm)およびキャリアガスとして10sccmアルゴンを用いて、435℃および30torrでホウ素ドープp型SiNWを合成した。公称ドーピング比は4000:1(Si:B)であり、成長時間は20分間であった。得られたSiNWを約10秒間の穏やかな超音波処理によってエタノール中に溶解した。次いで、NW溶液を厚さ50nmの100μm×100μm窒化ケイ素TEM膜グリッド(SPI supplies, West Chester, PA)に付着させた。電子ビームリソグラフィーおよび厚さ60nmのニッケル層の蒸着を実施して、ナノワイヤ上に約1μm離間したソースおよびドレイン電極を作製した。次いで、金属蒸着の直後に、厚さ約75~100nmの窒化ケイ素の層をプラズマ強化CVD(NEXX Systems, Billerica, MA)によってチップに付着させて、すべての電極を不動態化した。
ナノポアセンサ中のSiNW FETの感度プロファイリング
ナノポアセンサのSiNW FETセンサの感度を走査型ゲート顕微鏡検査(SGM)によって特性決定した。実施例Iの方法にしたがって、ここでは約2μmのチャネル長で、SGMの限られた空間分解能を受け入れるためにSiNW FET装置を作製した。SGMは、Nanoscope IIIa Multi-Mode AFM(Digital Instruments Inc., Tonawanda, NY)中、- 10Vバイアスを加えた伝導性AFMチップ(PPP-NCHPt, Nanosensors Inc., Neuchatel, SW)の位置の関数としてナノワイヤのコンダクタンスを記録することによって実施した。AFMチップは、SGM記録中、表面から20nm上にあった。
ナノポアセンサ中のナノワイヤ-ナノポアの清浄およびアセンブリ
上記実施例Iの方法によって製造したナノワイヤ-ナノポアアセンブリの各側を、ナノポアの形成後、UVオゾンストリッパ(Samco International Inc.)によって150℃で25分間清浄化した。この清浄プロセスは、構造上の任意の潜在的炭素付着物を除去するために好ましい。次いで、この構造をフォーミングガス中250℃~350℃で30秒間アニールして、ナノワイヤのコンダクタンスを回復させた。さらに25分間の室温UV-オゾン清浄を構造物の各側で実施して、アセンブリ直前にナノポアの親水性を確保した。
ナノポアを通過するDNAトランスロケーションのナノポア検出
上記例の方法によって製造され、かつ実施例IIIによって規定されたバッファ濃度を有する溶液とアセンブルされたナノワイヤ-ナノポア構造を作動させて、種対象物、すなわち1.4nMのpUC19(dsDNA)の二本鎖DNA分子のトランスロケ-ションを検出した。ナノポアを通過するイオン電流およびナノワイヤFET装置からの電流の両方を計測した。
シス側およびトランス側リザーババッファ濃度差への局所電位計測依存
ナノポアセンサのシス側およびトランス側リザーバ中の異なるイオン濃度流体の影響を決定するために、上記実施例IIIの手順にしたがって、ただし、ここではシス側およびトランス側チャンバの両方が、異なるバッファ濃度を有する溶液ではなく、1MのKClバッファ溶液で満たされる状態で、ナノワイヤ-ナノポア構造を構成した。上記実施例IVの手順にしたがって、0.6VのTMVで、dsDNAをトランス側リザーバ中に提供してナノポアセンサの操作を実施した。ナノワイヤを通過するイオン電流を、局所電位と同じく、実施例IVのやり方でナノワイヤFETコンダクタンスを介して計測した。
マルチチャネルナノポア検出
上記例の方法にしたがって3つのナノワイヤナノポアセンサを構築した。3つのナノポアセンサを、シス側チャンバ中の1MのKClバッファ溶液およびトランス側チャンバ中の10mMのKClバッファで、共通のリザーバシステムと統合した。3Vの膜電圧を用い、ナノポアを通過するトランスロケーションのためにpUC19 DNA 1.4nMを提供した。
流体通路を有するナノポアセンサ
上記例の方法にしたがってナノワイヤナノポアセンサを構築した。流体リザーバとナノポアとの間に接続された誘電材料中に直径1μm、長さ50μmの流体通路を含めた。ナノワイヤ中、ナノワイヤチャネル中の約100nmの開口の脂質二重層中にタンパク質ナノポアを配置した。タンパク質ナノポアは、直径1.5nmおよび長さ4.5nmの有効形状を有するものであった。シス側リザーバに1.6Mのイオン溶液を提供し、トランス側リザーバに1mMのイオン溶液を提供した。ssDNAをナノポアに通して電気泳動的に駆動するために、300mVバイアスをナノポアに印加した。
Claims (18)
- 第一の流体リザーバにおける第一のイオン溶液中の分子を、ナノポアの入口に向ける工程であって、第一の流体リザーバは、ナノポアの入口と直接流体接続する状態で配置されている、前記工程と、
ナノポアを通して、ナノポアの出口の外へ、次いで、前記ナノポアの出口と直接流体接続する状態で配置されている流体通路であって、前記ナノポアの直径よりも大きい断面方向の大きさを有する前記流体通路を通して、第一のイオン溶液中の前記分子をトランスロケーションさせる工程であって、前記流体通路は、前記流体通路の断面方向の大きさよりも大きい流体通路長を備える、前記工程と、
前記分子を、前記流体通路と直接流体接続する状態で配置された第二の流体リザーバにおける第二のイオン溶液に向ける工程と、
ナノポアを通した前記分子のトランスロケーション中の、前記流体通路に局所的なトランスロケーション電位を計測する工程と
を含む、ナノポアを通した分子のトランスロケーションを検出する方法。 - ナノポアを通して分子をトランスロケーションさせる工程が、DNA、DNAフラグメント、RNA、RNAフラグメント、PNA、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸およびポリマーから選択される少なくとも一つの分子をトランスロケーションさせることを含む、請求項1記載の方法。
- 計測されたトランスロケーション電位に基づいて、ナノポアを通してトランスロケーションする分子を示す電気信号を生成することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 第一のイオン溶液と第二のイオン溶液との間に、ナノポアを通して分子を電気泳動的にトランスロケーションさせるように作動する電圧を印加することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- ナノポアを通して分子をトランスロケーションさせる工程が、タンパク質ナノポアを通して前記分子をトランスロケーションさせることを含む、請求項1記載の方法。
- ナノポアを通した分子のトランスロケーションを示す電気信号を生成することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- ナノポアを通した分子のトランスロケーションの持続時間を決定するために、前記電気信号を時間の関数として処理することをさらに含む、請求項6記載の方法。
- 分子を同定するために前記電気信号を時間の関数として処理することをさらに含む、請求項6記載の方法。
- 分子のポリマー単位の配列確率を決定するために、前記電気信号を時間の関数として処理することをさらに含む、請求項6記載の方法。
- 分析対象物の存在を確認するために前記電気信号を処理することをさらに含む、請求項6記載の方法。
- ナノポアに配置された分子モーターにより、ナノポアを通した分子のトランスロケーションの速度を制御することをさらに含む、請求項1記載の方法。
- ナノポアおよび流体通路を通して分子をトランスロケーションさせる工程は、横方向の流体通路区分を通して、および垂直方向の流体通路区分を通して分子をトランスロケーションさせることを含む、請求項1記載の方法。
- ナノポアおよび流体通路を通して分子をトランスロケーションさせる工程は、ナノポア支持構造内のナノポアと同一面に配置された横方向の流体通路区分を通して分子をトランスロケーションさせることを含む、請求項1記載の方法。
- ナノポアおよび流体通路を通して分子をトランスロケーションさせる工程は、少なくとも二つの異なる流体通路チャネルを通して分子をトランスロケーションさせることを含む、請求項1記載の方法。
- 流体通路に局所的なトランスロケーション電位を計測する工程は、流体通路に局所的なトランスロケーション電位を示す電気信号を生成する少なくとも一つの電気変換素子によって生成される信号を計測することを含む、請求項1記載の方法。
- 流体通路に局所的なトランスロケーション電位を計測する工程は、流体通路に局所的なトランスロケーション電位を示す電気信号を生成する電気変換素子に接続された電気回路によって生成される信号を計測することを含む、請求項1記載の方法。
- 流体通路に局所的なトランスロケーション電位を計測する工程は、トランジスタによって生成される信号、電界効果トランジスタによって生成される信号、またはナノワイヤ電界効果トランジスタによって生成される信号を計測することを含む、請求項1に記載の方法。
- 流体通路に局所的なトランスロケーション電位を計測する工程は、流体通路に局所的なトランスロケーション電位に応答して電圧を検出するように接続された検出電極の電圧を計測することを含む、請求項1記載の方法。
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