CN114113280A - 用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于高分子聚合物的分析技术领域，具体涉及一种用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测方法。该检测体系包括纳米孔载体材料、flowcell、检测缓冲液，将纳米孔载体材料安装在flowcell中，制备3‑4nm的纳米孔道。在所述检测体系施加外加电场，检测待检测高分子聚合物通过纳米孔道的离子电流信号，根据离子电流信号鉴定待检测高分子聚合物的自组装结构。该方法适用于纳摩尔级别的分子检测浓度，可以将不同结构特性和不同溶液自组装构象态的高分子明显区分，相比于现有的高分子结构鉴定方法，该方法能更准确灵敏的给出聚合物组装态的单分子结构信息，且检测速度快、低成本、操作步骤简单。

Description

用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测方法
技术领域
本发明属于高分子聚合物的分析技术领域，具体涉及一种用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测方法。
背景技术
高分子聚合物种类很多，分类方法也有多种，按几何形状来分有线型和体型两类。线型嵌段聚合物中嵌段共聚物因含有不同的嵌段功能片段而展现很好的自组装性能，尤其是两亲性共聚物，通过调节混合溶剂配比能调控聚合物自助装形态。树状大分子属于体型聚合物，由一个中心衍生多重支链，树状分子的分子量是能通过一代一代衍生精确控制的。聚合物的性质不仅和它的化学组成和结构相关，更取决于在溶液体系的自组装构象态。聚合物的聚合度和分子量可以通过传统的凝胶渗透色谱(GPC)和质谱(MALDI-TOF)来表征,聚合物制备的原理决定聚合物的分子量不是固定的。尺寸排阻法的缺陷是聚合物在过凝胶柱时尺寸不是唯一排开体积，还受排开离子和疏水作用影响。质谱也只能给出聚合物的大概分子量，无法提供不同构象态信息。线型和树枝状大分子的物理尺寸可以通过动态光散射(DLS)来表征，但仍受到环境和扩散体系的影响，无法呈现单分子自组装构象态的信息。
高分子聚合物结构设计和功能拓展在很大程度上依赖于新的表征手段和研究方法的建立。在纳米尺度上研究高分子组装体的结构，能提供功能聚合物单分子构象态信息，有助于建立结构与功能之间的桥梁。扫描探针技术、高分辨透射电镜和近场光学显微镜等一批纳米表征技术的出现，使人们能够很直观地研究超分子组装体的形貌及拓扑结构，这极大地推动了高分子科学的发展。选区电子衍射可以研究超分子组装体在几个纳米尺度上的晶体结构，高分辨电镜可以提供样品微区组分的分析，这些都可以很好地对高分子组装体的化学组成及结构进行表征。核磁共振技术可以提供超分子组装体在溶液中的结构及其结构变化的信息。这些检测技术虽然成功地进行超分子结构鉴定，但存在不同的缺点，它们通常存在需要较长的时间，较为复杂的操作步骤，对操作人员有较高的要求和设备昂贵等问题。
利用固态纳米孔进行不同嵌段聚合物及树状大分子结构鉴定的方式，至今未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种基于固态纳米孔单分子电学技术的用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测、鉴别高分子自组装结构(构象态)方法。单分子组装态的表征直接能指导聚合物分子设计及关联功能预测。传统的聚合物的物化属性表征手段大多是对分子量，化学基团，物理组装尺寸及表面形貌的观测，在单分子水平对比不同种类聚合物在溶液中的自组装构象态差异的报道很有限。
本发明首先是构建固态纳米孔单分子检测体系，包括纳米孔载体材料氮化硅薄膜去污处理及电介质击穿纳米孔制备；以及检测缓冲体系的选取及合成聚合物样品的配置；检测条件的设置及样品信号的采集分析，最后通过检测水溶性均聚物、两亲性嵌段共聚物和树状大分子在水相缓冲体系中，不同分子构象态通过纳米孔时引起的离子电流脉冲特征信号，通过比对电流信号幅值、阻滞时间等得出聚合物分子的体积、表面电荷、伸展状态等构象信息，如图1所示。
用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系，包括纳米孔载体材料、flowcell、检测缓冲液，将所述纳米孔载体材料安装在所述flowcell中，制备3-4nm的纳米孔道。
进一步，所述检测缓冲液包括0.5-1.5M KCl、5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA。
优选地，所述检测缓冲液包括1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA，pH为7-8。
在某些具体实施例中，为了得到更好的检测信噪比，采用1M KCl、10mM Tris、1mMEDTA(pH 7.4)作为检测缓冲液体系。
进一步，所述纳米孔载体材料可以选自任何可以市售的纳米孔载体材料，优选为硅基氮化硅薄膜或与其具有相似化学或物理性质的纳米孔载体材料。
进一步，纳米孔载体材料厚度为13-17nm，优选为15nm。
更有选地，选择15nm的硅基氮化硅薄膜或与其具有相似化学或物理性质的纳米孔载体材料。
进一步，所述纳米孔载体材料的窗口大小为9-11μm2，优选为10μm2。
更优地，选择窗口大小为10μm2的硅基氮化硅薄膜。
具体地，纳米孔制备芯片是由200um厚度的硅基底上长有15nm膜厚的氮化硅组成。在硅基底中间刻蚀了一个窗口，让窗口上方的氮化硅悬空在硅基底上，对这层悬空氮化硅薄膜进行电击穿制备纳米通道。
进一步，所述制备3-4nm的纳米孔道的方法可以选择电介质击穿的方式进行制备。
进一步，flowcell用的是PDMS和PEEK材质的液体池，有较好的疏水性，且耐一定的有机溶剂。PDMS透明，利于观察细节，PEEK不透明，酸碱及有机溶剂耐受性强。
进一步，所述纳米孔载体材料在使用前，先使用食人鱼洗液进行清洁处理，同时增加亲水性能，提高后续在电解质中的浸润性。
在某些实施例中，包括：芯片安装在注有1M KCl、10mM Tris、1mM EDTA(pH为8)的缓冲液的flowcell中，采用电介质击穿的方式，制备孔径为3-4nm左右的纳米孔道。
在某些实施例中，通过膜片钳测定孔道的I-V曲线得到纳米孔电导G，并由模型公式计算纳米孔的实际物理尺寸。其中，所述模型公式为：G＝σ[(4L/πd2)+(1/d)]-1，其中d为孔径，L为通道长度也即膜厚，σ为缓冲液电导率，G为纳米孔的电导，由I-V测试得出。
在某些具体实施例中，所述纳米孔载体材料在使用前，首先将硅基氮化硅基片用体积比丙酮：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡去除纳米孔表面的无机盐和有机杂质。再将清洗后的纳米孔用食人鱼洗液(VH2SO4:VH2O2＝3:1)在80℃条件下浸泡1h，然后将硅片置于45℃的去离子水溶液中清洗去除氮化硅薄膜上的酸液，使硅片表面充分羟基化将亲水处理过的硅基氮化硅芯片浸泡在乙醇水溶液(V去离子水：V乙醇＝1：1)。
进一步，提供前任一所述的用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系鉴定高分子聚合物自组装结构的方法，所述方法包括；在所述检测体系施加外加电场，检测待检测高分子聚合物通过所述纳米孔道的离子电流信号，根据所述离子电流信号鉴定所述待检测高分子聚合物的自组装结构。
进一步，所述待检测高分子聚合物为均聚物、嵌段共聚物或树状大分子。
进一步，所述待检测高分子聚合物为PAA均聚物、PEI均聚物、或PEO-PVP嵌段共聚物。
进一步，所述待检测高分子聚合物的浓度为150-250nM，优选为200nm。
在某些具体实施例中，不同高分子聚合物样品先用去离子水配成高浓度母液充分震荡均匀，确保完全溶解分散，再按摩尔比稀释得所述待检测高分子聚合物。
在某些具体实施例中，所述待检测高分子聚合物如均聚物带有电荷，而共聚物和树状大分子均为不带电的中性分子，将配置好的样品测试液加入检测池，由于金属离子盐自身的晶格能大小，中性聚合物与金属离子会形成复合物从而使聚合物带电，能在电场作用下电泳穿过纳米孔。不同聚合物结构，荷电极性不同，通过纳米孔使用的电压极性也不同。将溶在1M KCl、10mM Tris(pH 7.4)中的100-200nM均聚物、共聚物或树状分子溶液注入flow cell一端，另一端加空白缓冲液，通过在液体池两端施加不同电压(50mV、100mV、150mV)，利用膜片钳记录溶液中不同构象态聚合物穿过纳米孔引起的离子电流波动信号。
进一步，所述外加电场的电压为50mV-150mV，优选为150mV。
进一步，使用Clampfit软件将采集的电流信号转换成文本数据，并通过Origin进行数据整理和作图。对比不同高分子在不同电压下的信号特征，从而得出不同分子构象态的结构信息。
进一步，根据所述离子电流信号鉴定所述待检测高分子聚合物的自组装结构的方法为：所采用的穿孔电压极性能反应聚合物的带电极性，相对电流阻塞幅值的分布的多样性能判别聚合物在检测体系中的自组装形态的种类或过孔模式的多样性，过孔阻滞时间长短能反应出聚合物组装形态的尺寸差异。
具体地，若相对电流阻塞幅值呈单峰分布，则判断为带正电均聚物；若相对电流阻塞幅值呈双重分布，则判断为带负电均聚物；若相对电流阻塞幅值呈双重以上分布，则判断为嵌段共聚物。
本发明中的方法同样适用于超支化和树状分子的组装结构解析，这类分子通常呈现较复杂的化学结构和难于预测的组装构象态。为高分子聚合物的液相态结构的调控和解析提供了科学、高效的鉴定手段，在功能材料和催组装等领域会有很好的应用前景。
本发明有益效果在于
本发明提供的用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测、鉴别高分子自组装结构(构象态)方法，适用于纳摩尔级别的分子检测浓度，采用单分子精度的纳米孔检测平台，可以将不同结构特性和不同溶液自组装构象态的高分子明显区分，相比于现有的高分子结构鉴定方法，比如扫描探针技术、高分辨透射电镜和近场光学显微镜等一批纳米表征技术来说，本发明方法能更准确灵敏的给出聚合物组装态的单分子结构信息，且检测速度快、低成本、操作步骤简单，为不同高分子聚合物自组装构象态的鉴定提供了一种新的技术手段。
本发明提供的用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系及检测、鉴别高分子自组装结构(构象态)方法基于纳米孔单分子电学检测技术，具有化学稳定性、热稳定性和机械稳定性，尺寸可调节和易集成以及检测速度快、低成本、操作步骤简单等优势，使得不同高分子聚合物在溶液相的自助装构象态的鉴别更加便捷。
附图说明
图1为固态纳米孔检测不同种类高分子聚合物示意图。
图2为带负电的均聚物PAA在150mV电压下的过孔时间(dwell time)统计图。
图3为带正电的PEI均聚物在150mV电压下的过孔时间(dwell time)统计图。
图4为中性的PEO-PVP嵌段共聚物在150mV电压下的过孔时间(dwell time)统计图。
图5为带负电的均聚物PAA在150mV电压下的相对电流阻塞幅值(I/Io)统计图。
图6为带正电的均聚物PEI在150mV电压下的相对电流阻塞幅值(I/Io)统计图。
图7中性的PEO-PVP嵌段共聚物在150mV电压下的相对电流阻塞幅值(I/Io)统计图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，flowcell设置为：PDMS或PEEK液体池一对，侧边两腔室容积200uL，中间有凹和凸嵌合结构把纳米孔芯片用垫圈夹持在中间。
实施例1
(1)硅基氮化硅薄膜前处理与纳米孔制备
首先将硅基氮化硅基片用体积比丙酮：异丙醇：去离子水＝1:1:1的混合溶剂浸泡去除纳米孔表面的无机盐和有机杂质。再将清洗后的纳米孔用食人鱼洗液(VH2SO4:VH2O2＝3:1)在80℃条件下浸泡1h，然后将硅片置于45℃的去离子水溶液中清洗去除氮化硅薄膜上的酸液，使硅片表面充分羟基化将亲水处理过的硅基氮化硅芯片浸泡在乙醇水溶液(V去离子水：V乙醇＝1：1)中片刻然后安装在flowcell中，注入1M KCl,10mM Tris,1mM EDTA,pH 8的缓冲液，对其施加脉冲电流，采用介电击穿原理，制备3-4nm左右的纳米孔。
(2)测试样品的配制
本发明实施例测试对比了200nM均聚物(PAA,PEI)、共聚物(PVP-PEO)以及树状分子样品在外加电场作用下通过纳米孔的离子电流信号。
配置200nM PEO91-PVP19溶液：取60mg分子量为6000的PEO-PVP样品，溶解在1mL去离子水中，得到10mM的母液；母液再用去离子水稀释至中间浓度，最后用测试缓冲液稀释到到200nM并在测试前充分震荡分散，避免团聚。
配置PEI均聚物：取1800分子量的PEI均聚物18mg，溶解在1mL水中配成10mM母液；母液再用去离子水稀释至中间浓度，最后用测试缓冲液稀释到到200nM并在测试前充分震荡分散，避免团聚。
配置PAA均聚物：取2000分子量的PAA均聚物20mg，溶解在1mL水中配成10mM母液；母液再用去离子水稀释至中间浓度，最后用测试缓冲液稀释到到200nM并在测试前充分震荡分散，避免团聚。
(3)纳米孔电学信号采集
首先，用去离子水清洗flowcell两腔室，然后注入测试缓冲液(1M KCl，10mMTris，pH 7.4)，测试至少三个电压正负两向的(50mV、100mV、150mV)空白信号；然后，将不同测试样品注入膜端腔室，检测其在不同电压(50mV、100mV、150mV)下的电流信号。
两个不同均聚物和共聚物在同一电压下(150mV)同一个尺寸的纳米孔中的过孔数据对比如图2-图7所示(50mV、100mV下的信号量不多)。
这三种聚合物的重复单元数非常接近，因此从长度上很有可比性。但由于不同种性的电荷以及不同链段的自组装特性差异，三种聚合物(带负电的均聚物PAA,正电的PEI以及中性的PEO-PVP)呈现明显差异的纳米孔电流信号。
从过孔时间(dwell time)统计图(见图2、图3、图4)来看，三个聚合物呈现明显差异。带正电的PEI与表面带负电的氮化硅有较强相互作用，因此过孔时间最长，而中性两嵌段聚合物过孔最快，捕获率也最低。
从相对电流阻塞幅值(I/Io)的分布统计图(见图5、图6、图7)来看，两嵌段分子在体相中呈现多种组装构象态，因此过孔阻塞分布呈多峰分布。带负电的PAA由于和表面负电性的孔内壁有排斥，过孔有碰撞和穿孔两种状态，呈两重分布。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (10)

1.用于高分子聚合物自组装结构检测的检测体系，其特征在于，包括纳米孔载体材料、flowcell、检测缓冲液，将所述纳米孔载体材料安装在所述flowcell中，制备3-4nm的纳米孔道。
2.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测缓冲液包括0.5-1.5M KCl、5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA。
3.根据权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述纳米孔载体材料选自硅基氮化硅薄膜。
4.根据权利要求3所述的检测体系，其特征在于，所述硅基氮化硅薄膜的窗口大小为9-11μm2。
5.利用权利要求1-5任一所述的检测体系鉴定高分子聚合物自组装结构的方法，其特征在于，所述方法包括；在所述检测体系施加外加电场，检测待检测高分子聚合物通过所述纳米孔道的离子电流信号，根据所述离子电流信号鉴定所述待检测高分子聚合物的自组装结构。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待检测高分子聚合物为均聚物、嵌段共聚物或树状大分子。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待检测高分子聚合物为PAA均聚物、PAA均聚物、或PEO-PVP嵌段共聚物。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待检测高分子聚合物的浓度为150-250nM。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述外加电场的电压为50mV-150mV。
10.根据权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于，根据所述离子电流信号鉴定所述待检测高分子聚合物的自组装结构的方法包括：若相对电流阻塞幅值呈单峰分布，则判断为带正电均聚物；若相对电流阻塞幅值呈双重分布，则判断为带负电均聚物；若相对电流阻塞幅值呈三重以上分布，则判断为嵌段共聚物。
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