CN113138223A - 针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法 - Google Patents

针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，包括以下步骤：(1)构建蛋白纳米孔道‑磷脂检测系统；(2)设计污染物分子‑引导链的待测结构；(3)纳米孔道转导区域和污染物分子空间位阻的模拟计算；(4)检测多个污染物纯样以及建立电流阻断‑空间位阻的函数模型；(5)检测污染物混合样以及预测未知样品。本发明通过检测多个污染物纯样建立了电流阻断‑空间位阻的函数模型，该模型能够将污染物混合样中的信号峰与已知纯样一一对应，并且无需标准品就能够预测未知样品。相比现有检测方法，本发明能够在单分子水平上实现针对全氟和多氟烷基污染物更为灵敏、快速的检测，并且无需标准品就能够完成对未知样品的预测。

Description

针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法
技术领域
本发明涉及环境分析技术领域，尤其涉及一种针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法。
背景技术
全氟和多氟烷基化合物(PFAS)是一类新型持久性有机污染物，其分布广、在环境中含量高，具有相当的生物毒性和环境持久性。现阶段，在各行各业、数以万计产品的生产过程中，仍然无法规避PFAS的生产和使用。由于工艺上的差异，在PFAS的生产过程中会不可避免地产生数量庞大、结构各异的异构体及同系物。因为PFAS异构体之间存在着各异的环境行为、毒性效应和生物蓄积性等性质，所以用于区分和检测不同PFAS的方法亟待开发。
现有的针对全氟和多氟烷基污染物的检测方法，大体上可以分为液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)两类。在基于LC-MS/MS的检测方法中，标准品的选用至关重要，而对于异构体、同系物种类繁多的PFAS，合成哪些未知物质的标准品、以及如何合成和制备标准品都是难以预料且难以解决的问题；此外，GC-MS方法检测PFAS异构体，还存在检出限过高、分析时间过长等不足。由于标准品之于质谱技术的必要性，所以在检测全氟和多氟烷基污染物这一方面，尤其是针对其异构体和同系物的检测，现有方法存在着固有的缺陷。因此，开发高灵敏、耗时短以及无需标准品就能够将分析物拓展至PFAS各种异构体和同系物的检测分析新方法是十分必要的。
纳米孔道电化学分析是一种能够分辨待测分子结构及其动态相互作用过程的超灵敏、高通量、无标记的检测分析方法。由于纳米孔道孔径的限制，待测分子只能逐个依次进入到孔道转导区域，从而使该方法具备了单分子水平的检测灵敏度，能够用于识别不同分子量的结构异构体、顺反异构体、甚至对映异构体。纳米孔道现已广泛应用于核酸与蛋白质的测序或分析，包括生物分子间的动态相互作用、单分子化学反应等一系列研究领域，在环境分析领域中也日趋得到重视。
发明内容
本发明的目的是克服上述现有技术的缺点，提供一种针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法。该方法对于PFAS及其一系列异构体、同系物，在一定区间内建立了相对电流阻断与待测分子空间位阻之间的函数模型，无需标准品就能够对其进行分辨和预测。
本发明提供的技术方案具体为，针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)构建蛋白纳米孔道-磷脂检测系统；
(2)设计污染物分子-引导链的待测结构；
(3)纳米孔道转导区域和污染物分子空间位阻的模拟计算；
(4)检测多个污染物纯样以及建立电流阻断-空间位阻的函数模型；
(5)检测污染物混合样以及预测未知样品。
较佳地，在所述的步骤(1)中，所述的蛋白纳米孔道-磷脂检测系统为经活化的成孔毒素蛋白在电解液中组装成孔，并在电场作用下插入到脂双层中形成。
较佳地，所述的脂双层的制备方法具体为：
配制磷脂溶液；
用移液枪蘸取磷脂溶液，在液面下吹出由磷脂包裹的气泡并触碰电解池中央的微米通道，使部分磷脂附着在微米通道上并形成一层较厚的磷脂膜；
用移液枪对准涂有磷脂膜的微米通道反复吹吸由电解液包裹的气泡，观测磷脂膜的电容和电阻，直至将较厚的磷脂膜减薄至均匀的脂双层结构。
较佳地，在所述的步骤(2)中，将一系列污染物分子及其异构体、同系物所共有的官能团与引导链的一个特定基团反应，在同种引导链的同一位置连接不同的待测分子。
较佳地，在所述的步骤(3)中，所述的纳米孔道转导区域的模拟计算为：
导入纳米孔道的蛋白结构；
对污染物分子-引导链的待测结构通过蛋白纳米孔道的运动作分子动力学模拟，确定纳米孔道的转导区域；
建立纳米孔道的转导区域的几何模型，在相应的蛋白结构上测定其尺寸并计算得到纳米孔道转导区域的体积；
所述的污染物分子空间位阻的模拟计算为：
建立蛋白纳米孔道-磷脂检测系统的稳态模型；
在蛋白纳米孔道-磷脂检测系统的稳态模型内，分别计算污染物分子、引导链和污染物分子-引导链结构的空间位阻；
模拟计算污染物分子及其异构体、同系物的空间位阻，并建立全氟和多氟烷基化合物异构体及同系物的空间位阻表。
较佳地，所述的步骤(4)中，所述的检测多个污染物纯样具体为：
(4-1)确定一系列的污染物分子及其异构体、同系物，将不同待测分子与同种引导链在同一位置以共价键的形式连接，并将不同污染物分子-引导链的待测结构配制为相同浓度的溶液，分别加入蛋白纳米孔道-磷脂检测系统；
(4-2)某一污染物分子-引导链的待测结构通过纳米孔道时，产生特定大小的电流阻断ΔI，计算该待测结构过孔时产生的相对电流阻断Blockade，其中，
Figure BDA0003035653410000031
(4-3)统计一定时间内，特定污染物分子-引导链的待测结构通过纳米孔道时所产生的全部相对电流阻断，对其作频数直方图，并对该频数直方图作高斯拟合，得到这一特定待测结构通过纳米孔道时产生的相对电流阻断的数学期望和标准差；
(4-4)控制检测时间一致，统计所有不同的待测结构通过纳米孔道时产生的相对电流阻断，重复步骤(4-3)，分别得到不同污染物分子-引导链的待测结构所对应的相对电流阻断期望值与标准差。
建立电流阻断-空间位阻的函数模型：
(4-5)验证污染物分子的空间位阻等于污染物分子-引导链结构与引导链的空间位阻之差；
(4-6)所述的函数模型的自变量为空间位阻或碳链长度，因变量为相对电流阻断，是由相对电流阻断期望值-污染物分子空间位阻的散点图作一元线性回归分析得到。
较佳地，所述的步骤(5)中，检测污染物混合样以及预测未知样品具体为：
(5-1)使用蛋白纳米孔道-磷脂检测系统检测未知组分的污染物混合样，统计一定时间内相对电流阻断的频数直方图；
(5-2)使用高斯分布模型，对相对电流阻断的频数直方图作多峰拟合，确定不同峰值位置并读取各个峰的相对电流阻断期望值，并与不同纯样的相对电流阻断作对照，将污染物混合样中出现的若干信号峰与纯样一一对应；
(5-3)读取已知纯样以外未知峰值的相对电流阻断，通过电流阻断-空间位阻的函数模型确定该信号峰所对应污染物分子的空间位阻。查询经模拟得到的全氟和多氟烷基化合物异构体及同系物的空间位阻表，将污染物混合样中出现的未知信号峰与已知纯样的异构体或同系物一一对应。
全氟和多氟烷基污染物存在数量庞大、结构各异的异构体及同系物。本发明通过检测多个污染物纯样建立了电流阻断-空间位阻的函数模型，该模型能够将污染物混合样中的信号峰与已知纯样一一对应，并且无需标准品就能够预测未知样品。相比现有检测方法，本发明能够在单分子水平上实现针对全氟和多氟烷基污染物更为灵敏、快速的检测，并且无需标准品就能够完成对未知样品的预测。
附图说明
图1a～1b为蛋白纳米孔道-磷脂检测系统示意图。
图2a～2c为不同纯样的相对电流阻断直方图。
图3为混合样的相对电流阻断直方图。
图4为电流阻断-碳链长度(或空间位阻)的函数模型。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
实施例1
一种针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，用于检测全氟辛基磺酸(PFOS)及其异构体、同系物，包括以下步骤：
(1)构建蛋白纳米孔道-磷脂检测系统
①配制磷脂溶液；
②用移液枪蘸取少量磷脂溶液，在液面下吹出由磷脂包裹的气泡并轻轻触碰微米通道，使部分磷脂附着在微米通道上并形成一层较厚的磷脂膜；
③用干净的移液枪对准涂有磷脂膜的微米通道反复吹吸由电解液包裹的气泡，观测磷脂膜的电容和电阻，直至将较厚的磷脂膜减薄至均匀的脂双层结构；
④将经活化的成孔毒素蛋白加入到电解液中使其组装成孔，并在电场作用下插入到脂双层2中；
⑤如图1a所示，电解液采用KCl溶液，将一对Ag/AgCl电极4分别插入到KCl电解液3中由脂双层所分隔的两个区域，两个区域由蛋白纳米孔道1连通；
⑥如图1b所示，通过两个电极对电解液施加电压，使此蛋白纳米孔道-磷脂检测系统构成电解池回路，其中有离子流通过单孔发生定向移动，记为开孔电流I0。
(2)设计污染物分子-引导链的待测结构
待测结构的特点为：污染物分子与引导链之间以共价键连接。
具体体现为，将一系列污染物分子及其异构体、同系物所共有的官能团与引导链的一个特定基团反应，在同种引导链的同一位置连接不同的待测分子。例如，使用多肽作为引导链，将其与污染物分子共价连接。选择多肽引导链的一个特定基团与全氟辛基磺酸及其异构体、同系物所共有的官能团反应，在引导链的同一位置连接不同的待测分子。
由此，待测结构具有以下优点：①待测分子连接在引导链上，只需调节同一种引导链的受力就能够控制不同待测分子的运动；②通过对引导链结构以及实验条件的调整，能够显著提升不同待测分子的捕获率、增大信号量，从而保证该方法的检出限、响应时间和统计显著性；③控制待测分子通过纳米孔道的速度及其在纳米孔道内的停留时间，以提升对于不同待测分子的分辨率。
(3)纳米孔道转导区域和污染物分子空间位阻的模拟计算
模拟计算纳米孔道转导区域：
①在PyMol中导入纳米孔道的蛋白结构；
②对污染物分子-引导链的待测结构通过蛋白纳米孔道的运动作分子动力学模拟(MD)，确定纳米孔道的转导区域；
③建立该转导区域的几何模型，在相应的蛋白结构上测量其尺寸并计算得到此纳米孔道转导区域的体积。
模拟计算所述污染物分子空间位阻：
①建立蛋白纳米孔道-磷脂检测系统的稳态模型；
②在蛋白纳米孔道-磷脂检测系统的稳态模型内，分别计算全氟丁基磺酸、全氟己基磺酸、全氟辛基磺酸分子，多肽引导链，污染物分子-引导链结构的空间位阻；
③进一步地，模拟计算全氟丁基磺酸一系列异构体、同系物的空间位阻，并建立全氟丁基磺酸异构体及同系物的空间位阻表。
(4)检测多个污染物纯样以及建立电流阻断-碳链长度(或空间位阻)的函数模型
①将不同污染物分子-引导链的待测结构配制为相同浓度的溶液，分别加入蛋白纳米孔道-磷脂检测系统；
②计算不同污染物分子-引导链的待测结构通过纳米孔道时产生的相对电流阻断；
③统计一定时间内，特定污染物分子-引导链的待测结构通过纳米孔道时产生的全部电信号的相对电流阻断，并且作频数直方图，如图2a～2c所示。对该频数直方图作高斯拟合，得到这一特定待测结构通过纳米孔时产生的相对电流阻断的数学期望和标准差；
④控制检测时间一致，统计三种不同待测结构通过纳米孔道时产生的相对电流阻断，重复步骤③，分别得到全氟丁基磺酸、全氟己基磺酸、全氟辛基磺酸分子-引导链待测结构的相对电流阻断期望值与标准差。
⑤验证全氟丁基磺酸、全氟己基磺酸、全氟辛基磺酸分子的空间位阻分别等于三种污染物分子-引导链结构与引导链的空间位阻之差；
⑥如图4所示，以碳链长度(或空间位阻)作横轴、相对电流阻断作纵轴，绘制相对电流阻断期望值-全氟磺酸碳链长度(或全氟磺酸空间位阻)的散点图，并对其作一元线性回归分析，确定函数模型。
(5)检测污染物混合样以及预测未知样品
①使用蛋白纳米孔道-磷脂检测系统检测包含上述三种待测结构但组分未知的污染物混合样，统计一定时间内相对电流阻断的频数直方图，如图3所示；
②使用高斯分布模型，对相对电流阻断的频数直方图作多峰拟合，确定不同峰值位置并读取各个峰所对应相对电流阻断的期望值，并与步骤(4)所得三种纯样的相对电流阻断作对照，将污染物混合样中出现的若干信号峰与已知纯样一一对应；
③读取已知纯样以外未知峰值的相对电流阻断，通过电流阻断-碳链长度的函数模型确定该信号峰所对应污染物分子的碳链长度区间和大致空间位阻。查询经模拟得到的全氟丁基磺酸异构体及同系物的空间位阻表，将污染物混合样中出现的左右两个未知信号峰与1,1,2,3,3,3-六氟-2-三氟甲基-丙磺酸、全氟庚基磺酸一一对应。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (6)

1.一种针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)构建蛋白纳米孔道-磷脂检测系统；
(2)设计污染物分子-引导链的待测结构；
(3)纳米孔道转导区域和污染物分子空间位阻的模拟计算；
(4)检测多个污染物纯样以及建立电流阻断-空间位阻的函数模型；
(5)检测污染物混合样以及预测未知样品。
2.根据权利要求1所述的针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，在所述的步骤(1)的蛋白纳米孔道-磷脂检测系统中，脂双层的制备方法具体为：
配制磷脂溶液；
用移液枪蘸取磷脂溶液，在液面下吹出由磷脂包裹的气泡并触碰电解池中央的微米通道，使部分磷脂附着在微米通道上并形成一层较厚的磷脂膜；
用移液枪对准涂有磷脂膜的微米通道反复吹吸由电解液包裹的气泡，观测磷脂膜的电容和电阻，直至将较厚的磷脂膜减薄至均匀的脂双层结构。
3.根据权利要求1所述的针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中，将一系列污染物分子及其异构体、同系物所共有的官能团与引导链的一个特定基团反应，在同种引导链的同一位置连接不同的待测分子。
4.根据权利要求1所述的针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，在所述的步骤(3)中，所述的纳米孔道转导区域的模拟计算为：
导入纳米孔道的蛋白结构；
对污染物分子-引导链的待测结构通过蛋白纳米孔道的运动作分子动力学模拟，确定纳米孔道的转导区域；
建立纳米孔道的转导区域的几何模型，在相应的蛋白结构上测定其尺寸并计算得到纳米孔道转导区域的体积；
所述的污染物分子空间位阻的模拟计算为：
建立蛋白纳米孔道-磷脂检测系统的稳态模型；
在蛋白纳米孔道-磷脂检测系统的稳态模型内，分别计算污染物分子、引导链和污染物分子-引导链结构的空间位阻；
模拟计算污染物分子及其异构体、同系物的空间位阻，并建立全氟和多氟烷基化合物异构体及同系物的空间位阻表。
5.根据权利要求1所述的针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，
建立电流阻断-空间位阻的函数模型具体为：
验证污染物分子的空间位阻等于污染物分子-引导链结构与引导链的空间位阻之差；
所述的函数模型的自变量为空间位阻或碳链长度，因变量为相对电流阻断，是由相对电流阻断期望值-污染物分子空间位阻的散点图作一元线性回归分析得到。
6.根据权利要求1所述的针对全氟和多氟烷基污染物的单分子检测方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，预测未知样品具体为：
读取已知纯样以外未知峰值的相对电流阻断，通过电流阻断-空间位阻的函数模型确定该信号峰所对应污染物分子的空间位阻；
查询经模拟得到的全氟和多氟烷基化合物异构体及同系物的空间位阻表，将污染物混合样中出现的未知信号峰与已知纯样的异构体或同系物一一对应。
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