CN108181358A - 基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，包括以下步骤：⑴设计连有醛基的DNA探针；⑵将氨基酸连接到DNA探针上；⑶制备气单胞菌溶素生物纳米通道：①活化气单胞菌溶素；②配制磷脂正癸烷溶液；③制备磷脂双分子层；④形成气单胞菌溶素生物纳米通道；⑷用气单胞菌溶素检测氨基酸：①采集DNA探针单分子信号；②采集氨基酸单分子信号；③采集DNA探针‑氨基酸单分子信号；④对采集到的DNA探针‑氨基酸单分子信号进行统计，得到氨基酸特征信息，基于此对不同的氨基酸同时进行检测。本发明能在单分子水平上同时对不同的氨基酸进行检测，且操作方便、实时准确，能实现超灵敏分辨，对生命科学研究具有非常积极的意义。

Description

基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及生命化学中分析检测单分子的检测技术，具体的是一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法。
技术背景
生物纳米通道是现代兴起的检测核酸、多肽、糖类的一种单分子检测手段。目前应用较多的蛋白孔为葡萄球菌α-溶血素(α-hemolsyin)、耻垢分枝杆菌(MspA)。然而，由于所述蛋白孔自身孔径的限制，上述两种蛋白通道对实现DNA分子的微小分辨还存在不足。而气单胞菌溶素生物纳米通道具有更小的孔径，更高的灵敏度，且其内腔带正电荷，能有效减慢DNA的过孔速率，从而实现高通量、无标记、高灵敏、基于DNA探针的、单分子水平上的检测生物小分子技术。
氨基酸，包括修饰的氨基酸，如磷酸化氨基酸，其不仅是组成蛋白质的基石，而且其本身在生物体内也发挥着非常重要的作用。例如组氨酸(Histine)，它不仅控制着生物体内金属元素的运输，而且能把外来微伤引起的内出血降到最低。组氨酸的缺陷经常会引起弗里德赖希共济失调、癫痫症、帕金森病、红细胞失调；而组氨酸太高又会导致生物体中毒。此外，天冬氨酸能够消除或降低外来毒素对大脑的影响，在增强免疫系统方面发挥重要的作用。修饰的氨基酸在生物体内有极其重要的作用，它调控着生物体内大部分蛋白的结构与功能。因此，基于氨基酸在生物体内的重要作用，对氨基酸进行检测是非常重要的。但是，目前能够对多种氨基酸同时进行检测的方法还不多，氨基酸分析仪虽然能够对不同的氨基酸同时进行分析，但是它操作复杂、耗时、成本也相对较高。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，该方法能在单分子水平上超灵敏分辨并检测多种氨基酸；将生命化学中的分析检测技术提高到一个新的水平。
为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。
基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计连有醛基的DNA探针，所述DNA探针包含探针1和探针2；
(2)将20μL、50μM～500μM、pH值为7.0～9.0的DNA探针1或者DNA探针2溶液与 10μL、0.5mM～5mM、pH值为7.0～9.0的氨基酸溶液混合，70℃下置放10个小时以上，利用醛基与氨基的加成反应，将氨基酸连接到DNA探针上；
(3)制备气单胞菌溶素生物纳米通道
①活化气单胞菌溶素
将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，在恒温箱内25℃下放置30分钟进行活化；活化后用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液进行稀释并在-20℃冰箱内保存；
②配制磷脂正癸烷溶液
在常温下将1，2-二植烷酰基磷脂溶于正癸烷溶液中，浓度为25mg/mL；
③制备磷脂双分子层
采用聚缩醛树脂检测池，所述聚缩醛树脂检测池含有cis检测池和trans检测池，在trans 检测池上刻蚀直径为50nm的小孔，再用毫毛笔在所述小孔内外两侧均匀涂抹步骤(3)②配制的磷脂正癸烷溶液，用氮气吹干或让其自然晾干；
将cis检测池与trans检测池进行组装，在cis检测池与trans检测池内分别加入1mL 电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入到电解质溶液中，通过电流放大器施加+100mV电压，指定cis检测池端为接地端；反复刷破和提拉磷脂膜，直到形成的磷脂膜能被400mV电压击破为止，此时的磷脂膜即为可允许气单胞菌溶素自组装并穿过的磷脂双分子层膜；
④形成气单胞菌溶素生物纳米通道
在形成稳定的磷脂双分子层膜后，在cis检测池中靠近磷脂双分子层膜附近注射3～5uL 气单胞菌溶素溶液，施加100mV的跨膜电压，驱动气单胞菌溶素靠近磷脂双分子层膜并自组装嵌入膜上，当形成单个稳定的气单胞菌溶素生物纳米通道时，离子流在所述浓度电解质溶液和pH下发生50±5pA的台阶式上升；
(4)用气单胞菌溶素检测氨基酸
①采集DNA探针单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入10μL、100μM DNA探针分子，DNA探针在电场力驱动下会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生单分子信号；
②采集氨基酸单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入20μL、5mM 氨基酸溶液，分析其产生的单分子信号，由于其分子体积太小以至于不能引起纳米通道离子流的阻断信号；
③采集DNA探针-氨基酸单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入含有DNA探针-氨基酸的反应液，在电场力驱动下DNA-氨基酸会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生DNA探针-氨基酸单分子信号——这种信号是能反应氨基酸特征的单分子信号；
④对采集到的DNA探针-氨基酸单分子信号进行统计
对统计的阻断时间、阻断电流、阻断信号频率分别进行解析，得到氨基酸的特征信息，基于此能同时对不同的氨基酸进行检测。
进一步，步骤(1)所述的DNA探针1和DNA探针2上连有醛基，碱基的长度为4。
进一步，所述DNA探针1是在4个碱基核苷酸的中间位置修饰有醛基；所述DNA探针2是在4个碱基核苷酸的5’端位置；所述DNA探针1和DNA探针2上的醛基能够与氨基酸的氨基进行加成反应，最终形成DNA探针-氨基酸加合物。
进一步，步骤(3)①所述的气单胞菌溶素与胰蛋白酶-EDTA溶液的比例为1︰100。
进一步，步骤(4)④所述的能同时对不同的氨基酸进行检测包括以下步骤：
(1)分别混合不同的氨基酸与DNA探针反应后的得到不同的DNA-氨基酸加合物单分子；
(2)利用气单胞菌溶素纳米通道分别对不同的DNA-氨基酸加合物单分子进行分析；
(3)统计各种DNA-氨基酸加合物单分子的阻断电流和阻断时间，对比不同DNA-氨基酸加合物单分子的阻断电流与阻断时间的差别，得到不同的DNA-氨基酸加合物单分子的特征信号；
(4)将一个未知的氨基酸与DNA探针混合反应后，加入到cis检测池中，根据步骤(3) 获得的不同的DNA-氨基酸加合物单分子的特征信号，能获知混合物中含有哪些氨基酸，进一步基于信号频率能定量所述混合物中氨基酸的含量。
本发明基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法的积极效果是：
(1)提供了一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，它利用DNA探针、聚缩醛树脂检测池和气单胞菌溶素纳米通道能在单分子水平上同时对不同的氨基酸进行检测，实现了超灵敏分辨，这是传统的检测方法无法企及的。
(2)本发明的方法操作方便、实时准确、且价格不贵，对生命科学研究以及某些疾病的临床治疗具有非常积极的意义。
附图说明
图1为本发明基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法的原理图。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法的具体实施方式。但是应该明确的是：本发明的实施不限于以下的实施方式；即本发明的具体实施例不限制本发明的保护范围。
实施例1
参见图1。一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，用于检测半胱氨酸，包括以下步骤：
(1)设计DNA探针1和DNA探针2，所述DNA探针1和DNA探针2上连有醛基，碱基的长度为4。
所述DNA探针1与氨基酸反应的机理为：
所述DNA探针2与氨基酸反应的机理为：
(2)将20μL、200μM、pH值为8.0的DNA探针1或者DNA探针2溶液与10μL、5mM、 pH值为7.0～9.0的半胱氨酸溶液混合，70℃下置放10个小时，利用醛基与氨基的加成反应，将半胱氨酸连接到DNA探针上。
(3)制备气单胞菌溶素生物纳米通道
①活化气单胞菌溶素
将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，气单胞菌溶素与胰蛋白酶-EDTA溶液的比例为 1︰100；在恒温箱内25℃下放置30分钟进行活化；活化后用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液进行稀释并保存在-20℃冰箱内。
②配制磷脂正癸烷溶液
在常温下将1，2-二植烷酰基磷脂溶于正癸烷溶液中，浓度为25mg/mL。
③制备磷脂双分子层
采用聚缩醛树脂检测池，所述聚缩醛树脂检测池含有cis检测池和trans检测池，在trans 检测池上刻蚀直径为50nm的小孔，再用毫毛笔在所述小孔内外两侧均匀涂抹步骤(3)②配制的磷脂正癸烷溶液，用氮气吹干或让其自然晾干。
将cis检测池与trans检测池进行组装，在cis检测池与trans检测池内分别加入1mL 电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入到电解质溶液中，通过电流放大器施加+100mV电压，指定cis检测池端为接地端；反复刷破和提拉磷脂膜，直到形成的磷脂膜能被400mV电压击破为止；此时的磷脂膜即为可允许气单胞菌溶素自组装并穿过的磷脂双分子层膜。
④形成气单胞菌溶素生物纳米通道
在形成稳定的磷脂双分子层膜后，在cis检测池中靠近磷脂双分子层膜附近注射3～5uL 气单胞菌溶素溶液，施加100mV的跨膜电压，驱动气单胞菌溶素靠近磷脂双分子层膜并自组装嵌入膜上，当形成单个稳定的气单胞菌溶素生物纳米通道时，离子流在所述浓度电解质溶液和pH下发生50±5pA的台阶式上升。
(4)用气单胞菌溶素检测氨基酸
①采集DNA探针单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入5～10μL、 100μMDNA探针分子，DNA探针在电场力驱动下会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生单分子信号，得到DNA探针1和DNA探针2的阻断电流为I/I0＝ 0.4～0.45；其中，I0为开孔电流值；I为阻断剩余电流值。
②采集半胱氨酸单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入20μL、5mM 半胱氨酸，分析其产生的单分子信号，由于其分子体积太小以至于不能引起纳米通道离子流的阻断信号。
③采集DNA探针-半胱氨酸单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入10uL上述得到的含有DNA探针-半胱氨酸的反应液，在电场力驱动下DNA-半胱氨酸会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生DNA探针-半胱氨酸单分子特征信号——这种信号是能反应半胱氨酸特征的单分子信号。
④对采集到的DNA探针-半胱氨酸单分子信号进行统计，对统计的阻断时间、阻断电流、阻断信号频率分别进行解析，得到DDNA探针-半胱氨酸的特征阻断电流为I/I0＝0.35～0.40，其不同DNA探针的信号。基于此能实现对半胱氨酸进行检测。
实施例2
一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，用于检测组氨酸，基本步骤同实施例1。
所不同的是：
(1)(同实施例1)。
(2)将20μL、200μM、pH值为8.0的DNA探针1或者探针2溶液与10μL、500mM、 pH值为8.0的组氨酸溶液混合，70℃下置放10个小时，利用醛基与氨基的加成反应，将组氨酸连接到DNA探针上。
(3)(同实施例1)。
(4)用气单胞菌溶素检测组氨酸
③采集DNA探针-组氨酸单分子信号
在cis检测池加入的是得到的DNA探针-组氨酸的反应液；采集到DNA探针-组氨酸单分子特征信号——这种信号是能反应组氨酸特征的单分子信号。
④实施例2经对采集到的DNA探针-组氨酸单分子信号进行统计，得到DNA探针-组氨酸单分子的特征阻断电流为I/I0＝0.30-0.35；其中，I0为开孔电流值；I为阻断剩余电流值；基于此能实现对组氨酸进行检测。
实施例3
一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，用于检测丙氨酸，基本步骤同实施例1。
所不同的是：
(1)(同实施例1)。
(2)将20μL、200μM、pH值为8.0的DNA探针1或者DNA探针2溶液与10μL、500mM、 pH值为8.0的丙氨酸溶液混合，70℃下置放10个小时，利用醛基与氨基的加成反应，将丙氨酸连接到DNA探针上。
(3)(同实施例1)。
(4)用气单胞菌溶素检测丙氨酸
③采集DNA探针-丙氨酸单分子信号
在cis检测池加入的是得到的DNA探针-丙氨酸的反应液；采集到DNA探针-丙氨酸单分子特征信号——这种信号是能反应丙氨酸特征的单分子信号。
④实施例3经对采集到的DNA探针-丙氨酸单分子信号进行统计，得到DNA探针-丙氨酸单分子的特征阻断电流为I/I0＝0.25～0.30；其中，I0为开孔电流值；I为阻断剩余电流值；基于此能实现对丙氨酸进行检测。
实施例4
一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，用于检测组氨酸和丙氨酸的混合物，基本步骤同实施例1。
所不同的是：
(1)(同实施例1)。
(2)将20μL、200μM、pH值为8.0的DNA探针1或者DNA探针2溶液与10μL含100 mM组氨酸和100mM丙氨酸、pH值为8.0的溶液混合，70℃下置放10个小时，利用醛基与氨基的加成反应，将组氨酸和丙氨酸分别连接到DNA探针上。
(3)(同实施例1)。
(4)用气单胞菌溶素检测混合物中的组氨酸和丙氨酸
③采集DNA探针-氨基酸单分子信号
在cis检测池加入的是得到的DNA探针-组氨酸和DNA探针-丙氨酸的混合反应液；采集到DNA探针-组氨酸和DNA探针-丙氨酸特征信号——这种信号是能分别反应组氨酸和丙氨酸特征的信号。
④实施例4经对采集到的DNA探针-组氨酸和DNA探针-丙氨酸信号进行统计，得到DNA 探针-组氨酸以及DNA探针-丙氨酸两类特征信号，其中，特征阻断电流为I/I0＝0.30～0.35 是DNA探针-组氨酸引起的；另外一种特征阻断电流为I/I0＝0.25～0.30是DNA探针-丙氨酸引起的；基于此，能实现对混合物中的组氨酸以及丙氨酸进行同时检测。
本发明的基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法利用DNA探针、聚缩醛树脂检测池和气单胞菌溶素纳米通道能在单分子水平上同时对不同的氨基酸进行检测，实现了超灵敏分辨，且操作方便、实时准确，对生命科学研究以及某些疾病的临床治疗具有积极的意义。

Claims (5)

1.一种基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设计连有醛基的DNA探针，所述DNA探针包含探针1和探针2；
（2）将20μL、50μM～500μM、pH值为7.0～9.0的DNA探针1或者DNA探针2溶液与10μL、0.5mM～5mM、pH值为7.0～9.0的氨基酸溶液混合，70℃下置放10个小时以上，利用醛基与氨基的加成反应，将氨基酸连接到DNA探针上；
（3）制备气单胞菌溶素生物纳米通道
①活化气单胞菌溶素
将气单胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，在恒温箱内25℃下放置30分钟进行活化；活化后用pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液进行稀释并在-20℃冰箱内保存；
②配制磷脂正癸烷溶液
在常温下将1，2-二植烷酰基磷脂溶于正癸烷溶液中，浓度为25mg/mL；
③制备磷脂双分子层
采用聚缩醛树脂检测池，所述聚缩醛树脂检测池含有cis检测池和trans检测池，在trans检测池上刻蚀直径为50nm的小孔，再用毫毛笔在所述小孔内外两侧均匀涂抹步骤（3）②配制的磷脂正癸烷溶液，用氮气吹干或让其自然晾干；
将cis检测池与trans检测池进行组装，在cis检测池与trans检测池内分别加入1mL电解质溶液，将一对Ag/AgCl电极浸入到电解质溶液中，通过电流放大器施加+100mV电压，指定cis检测池端为接地端；反复刷破和提拉磷脂膜，直到形成的磷脂膜能被400mV电压击破为止，此时的磷脂膜即为可允许气单胞菌溶素自组装并穿过的磷脂双分子层膜；
④形成气单胞菌溶素生物纳米通道
在形成稳定的磷脂双分子层膜后，在cis检测池中靠近磷脂双分子层膜附近注射3～5uL气单胞菌溶素溶液，施加100mV的跨膜电压，驱动气单胞菌溶素靠近磷脂双分子层膜并自组装嵌入膜上，当形成单个稳定的气单胞菌溶素生物纳米通道时，离子流在所述浓度电解质溶液和pH下发生50±5pA的台阶式上升；
（4）用气单胞菌溶素检测氨基酸
①采集DNA探针单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入5～10μL、100μM DNA探针分子，DNA探针在电场力驱动下会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生单分子信号；
②采集氨基酸单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入10～20μL、1mM氨基酸溶液，分析其产生的单分子信号，由于其分子体积太小以至于不能引起纳米通道离子流的阻断信号；
③采集DNA探针-氨基酸单分子信号
在气单胞菌溶素生物纳米通道的两端施加100mV电压，在cis检测池中加入含有DNA探针-氨基酸的反应液，在电场力驱动下DNA-氨基酸会从cis检测池穿过气单胞菌溶素生物纳米通道至trans检测池，进而产生DNA探针-氨基酸单分子信号——这种信号是能反应氨基酸特征的单分子信号；
④对采集到的DNA探针-氨基酸单分子信号进行统计
对统计的阻断时间、阻断电流、阻断信号频率分别进行解析，得到氨基酸的特征信息，基于此能同时对不同的氨基酸进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，步骤（1）所述的DNA探针1和DNA探针2上连有醛基，碱基的长度为4。
3.根据权利要求2所述的基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，所述DNA探针1是在4个碱基核苷酸的中间位置修饰有醛基；所述DNA探针2是在4个碱基核苷酸的5’端位置；所述DNA探针1和DNA探针2上的醛基能够与氨基酸的氨基进行加成反应，最终形成DNA探针-氨基酸加合物。
4.根据权利要求1所述的基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，步骤（3）①所述的气单胞菌溶素与胰蛋白酶-EDTA溶液的比例为1︰100。
5.根据权利要求1所述的基于气单胞菌溶素纳米通道检测氨基酸的方法，其特征在于，步骤（4）④所述的能同时对不同的氨基酸进行检测包括以下步骤：
（1）分别混合不同的氨基酸与DNA探针反应后的得到不同的DNA-氨基酸加合物单分子；
（2）利用气单胞菌溶素纳米通道分别对不同的DNA-氨基酸加合物单分子进行分析；
（3）统计各种DNA-氨基酸加合物单分子的阻断电流和阻断时间，对比不同DNA-氨基酸加合物单分子的阻断电流与阻断时间的差别，得到不同的DNA-氨基酸加合物单分子的特征信号；
（4）将一个未知的氨基酸与DNA探针混合反应后，加入到cis检测池中，根据步骤（3）获得的不同的DNA-氨基酸加合物单分子的特征信号，能获知混合物中含有哪些氨基酸，进一步基于信号频率能定量所述体系中氨基酸的含量。
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