KR20080060060A - 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그를이용한 냄새 물질 검출 방법 - Google Patents

전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그를이용한 냄새 물질 검출 방법 Download PDF

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최수형
한정임
김숙영
이수석
이헌주
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삼성전자주식회사
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Abstract

본 발명은 양이온 교환막 및 제 1 전극에 의해 한정되고, 냄새 분자 및 칼슘 이온과 함께 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 반응 챔버;
상기 양이온 교환막 및 음이온 교환막에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 칼슘 이온 농축 챔버;
상기 음이온 교환막 및 제 2 전극에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 제 2 전극 챔버; 및
전기투석을 위해 상기 제 1 전극에 (+)의 전압, 제 2 전극에 (-)의 전압을 인가하기 위한 전압 제공부를 포함하는 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그 바이오센서를 이용한 냄새 물질 검출 방법을 제공한다.

Description

전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그를 이용한 냄새 물질 검출 방법{A biosensor for detecting an odorant material using electrodialysis and a method for detecting an odorant material using the same}
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서에 이용될 수 있는 전기투석장치의 측면도이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법에서, 세포 반응 챔버에서의 후각 수용체 단백질 발현 세포와 냄새 물질과의 반응을 나타낸 개념도이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법에서, 세포 반응 챔버에서 냄새 물질과 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포만을 남기고 이외의 물질을 제거한 상태를 나타낸 개념도이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법에서, 세포 반응 챔버에서 냄새 물질과 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포에 증류수를 가하여 세포를 용해한 상태를 나타낸 개념도이다.
도 2d는 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하 여 냄새 물질을 검출하는 방법에서, 세포를 증류수에 의해 용해한 다음, 전압을 가해 전기투석에 의해 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버로 이동시키는 과정을 나타낸 개념도이다.
도 3은 0.7 μM, 1.53 μM, 7 μM, 및 28 μM의 농도의 염화 칼슘 수용액에 대해 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 진동수의 변화에 따른 컨덕턴스를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법에 의해 칼슘 이온 농축된 칼슘 이온의 농도를 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법에서 전기 투석을 수행하지 않은 채, 세포 반응 챔버 내의 세포 용해물에서의 칼슘 이온 농도를 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
<도면의 주요 부분에 대한 설명>
101: 세포 반응 챔버 102: 칼슘 이온 농축 챔버
103: 제 2 전극 챔버 104: 제 1 전극
105: 제 2 전극 106: 전압 제공부
본 발명은 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그 바이오센서를 이용한 냄새 물질 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 전기투석을 이용한 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그 바이오센서를 이용하여 전기투석에 의한 Ca2+의 양을 분석함으로써 냄새 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
최근에 들어서 인간의 오감(시각, 촉각, 청각, 후각, 미각)의 디지털화 욕구가 증가하고 있다. 시각을 디지탈화 시킨 CCD(Charge Coupled Device), 전자현미경 등의 기술은 이미 상용화에 성공하여 일상생활에서 사용할 정도로 보편화 되었고, 청각을 디지탈화 시킨 음성인식 등이 개발되었다. 이러한 시각 및 청각의 디지털화에 비해, 후각의 경우는 디지탈화가 많이 이루어지지는 않았다. 그러나, 인간 후각의 기본적 메카니즘이 규명되기 시작하고 있으며, 특히 2004년 미국 리처드 액설 및 린다 B 벅은 후각 인지 메커니즘을 규명하여 노벨상을 수상하였다. 　
　　후각 센서는 환경, 식품, 포장, 의약, 화장품 등 다양한 산업 분야에 응용될 수 있으며, 전자 코(electronic nose)라는 형태로 인간의 후각시스템을 흉내낸 전기화학적 가스 센서들이 개발되었다. 　그러나, 이러한 전기화학적센서는 여러 가지 냄새를 구별하는데 있어서 그 선택성이 떨어지며, 더욱이 서로 상이한 냄새를 가지나 비슷한 구조를 보이는 화합물에 대한 구별이 매우 저조한 것으로 알려져 있다. 이에, 종래의 전기화학적 가스 센서의 선택성을 향상시키고, 인간 후각시스템을 모방하기 위하여 후각 수용체 단백질을 이용한 가스 센서 개발이 진행되고 있 다.
후각 바이오센서의 연구는 크게 대장균이나 효모에 유전자 재조합에 의해 발현시킨 후각 수용체 단백질을 이용하는 방법과 유전자 재조합에 의해 후각 수용체 단백질이 발현된 포유류 세포를 이용하는 전세포 측정 방법(whole-cell based assay)이 있다.
세포 상의 후각 수용체 단백질은 G-단백질과 연결되어 있고 세포막을 일곱번 통과하는 7-트랜스멤브레인 구조를 가지며, 이러한 특징은 후각 수용체의 기능에 중요한 역할을 한다. 후각 수용체 단백질에 유발되는 후각 신호 전달과정은 두 가지 경로를 통해 일어난다. 하나가 cAMP 경로이고, 다른 하나가 IP3 경로이다. 그러나, 거의 대부분의 포유동물들은 후각 신호전달 과정에서 cAMP 경로를 이용하고 IP3 의 역할은 아직 잘 알려져 있지 않다.
cAMP 경로에서는 후각 수용체와 냄새 분자의 결합에 의해 세포 내에 cAMP의 증가가 일어나고 이것에 의해 CNG-채널(cyclic nucleotide gated channel)이 열리고 세포 외부에서 Ca2+ 이온이 유입되면서 세포막의 전위가 변화여 신경신호가 발생하여 냄새가 인지된다. 그리하여, 전세포 측정 방법에 의한 후각 바이오센서의 연구에서는 후각 수용체 단백질이 발현된 포유류 세포에서 냄새 분자로 인한 세포 외부로부터 세포 내부로의 Ca2+ 이온의 유입을 측정하는 방법을 이용한다.
이러한 Ca2+ 이온의 세포 내부로의 유입을 측정하기 위해, fura-2 AM (Molecular probe)와 같은 형광물질을 이용하는 방법이 알려져 있다. fura-2 AM은 세포 외부에 부가 시 세포 내부로 유입되어, 세포 내부에 존재하는 Ca2+ 이온과 결합하여 Fura-Ca2+가 된다. 340 nm에서 흡광도를 나타내던 fura-2 AM이 Ca2+ 이온과 결합되어 Fura-Ca2+를 형성하면 흡광 밴드가 510 nm로 변화하게 되고, 이러한 변화의 정도를 측정함으로써 냄새 물질을 정량할 수 있다. 그러나, fura-2 AM과 같은 형광물질을 이용하는 방법은 광학적 분석에 따른 값비싼 형광물질을 이용해야 하며 고가의 형광 측정기로 측정해야 하는 단점이 있다. 또한, 세포 내부로 형광물질을 이동시킨 후 측정해야 하므로 복잡하고, 세포 내부로의 형광물질의 이동 정도에 편차가 발생하여 측정 오차가 발생되어 문제가 된다.
이에, 본 발명자들은 재조합에 의해 후각 수용체 단백질이 발현된 포유류 세포를 이용하여 냄새분자를 검출하고자 할 때, 종래의 형광물질을 이용하여 Ca2+ 이온을 측정하는 대신 보다 경제적이면서도 정확하게 측정하기 위한 방법을 연구한 결과 Ca2+ 이온을 전기적으로 측정하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 후각 수용체 단백질 발현 세포의 냄새 물질에 대한 반응을 전기적으로 측정할 수 있는, 냄새 물질 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
양이온 교환막 및 제 1 전극에 의해 한정되고, 냄새 물질 및 칼슘 이온과 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해(lysis)시키기 위한 세포 반응 챔버;
상기 양이온 교환막 및 음이온 교환막에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 칼슘 이온 농축 챔버;
상기 음이온 교환막 및 제 2 전극에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 제 2 전극 챔버; 및
전기투석을 위해 상기 제 1 전극에 (+)의 전압, 제 2 전극에 (-)의 전압을 인가하기 위한 전압 제공부를 포함하는 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은
본 발명에 따른 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 배양하는 단계;
상기 세포 반응 챔버에 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물을 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포와 반응시키는 단계;
상기 세포 반응 챔버에서 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 물질을 제거하는 단계;
상기 세포 반응 챔버에 증류수를 부가하고 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계;
전압 제공부로부터 제 1 전극에 (+)의 전압, 제 2 전극에 (-)의 전압을 인가하여, 세포 반응 챔버 내의 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버로 이동시키는 단계; 및
칼슘 이온 농축 챔버의 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 냄새 물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 냄새 물질 검출 방법은 또한,
배양된 후각 수용체 단백질 발현 세포를 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물을 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포와 반응시키는 단계;
상기 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 물질을 제거하는 단계;
상기 후각 수용체 단백질 발현 세포를 본 발명에 따른 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버에 부가하는 단계;
상기 세포 반응 챔버에 증류수를 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계;
전압 제공부로부터 제 1 전극에 (+)의 전압, 제 2 전극에 (-)의 전압을 인가하여, 세포 반응 챔버 내의 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버로 이동시키는 단계; 및
칼슘 이온 농축 챔버의 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 이루어질 수 있다.
이하, 도면을 참조하면서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 후각 수용체 단백질 발현 세포의 냄새 물질에 대한 반응을 전기적으로 측정할 수 있는, 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서에 이용되는 전기투석장치의 일 구현예를 도시한 측면도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 냄새물질 검출용 바이오센서에 이용되는 전기투석장치는 양이온 교환막(cation exchange membrane; 107; C) 및 제 1 전극(104)에 의해 한정되고, 냄새 물질 및 칼슘 이온과 함께 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해(lysis)시키 위한 세포 반응 챔버(101); 상기 양이온 교환막(107; C) 및 음이온 교환막(anion exchange memebrane; 108; A)에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 칼슘 이온 농축 챔버(102); 상기 음이온 교환막(108; A) 및 제 2 전극(105)에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 제 2 전극 챔버(103); 및 전기투석을 위해 상기 제 1 전극(104)에 (+)의 전압, 제 2 전극(105)에 (-)의 전압을 인가하기 위한 전압 제공부(106)를 포함한다.
상기 세포 반응 챔버(101)는 냄새 분자 및 칼슘 이온과 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해(lysis)시키기 위한 부분으로서, 양이온 교환막(107; C) 및 제 1 전극(104)에 의해 한정된다. 후각 수용체 단백질 발현 세포와 냄새 분자 및 칼슘 이온의 반응은 직접 상기 세포 반응 챔버(101)에서 이루어질 수 도 있고, 다른 곳에서 후각 수용체 단백질 발현 세포와 냄새 물질 및 칼슘 이온을 반응시킨 다음 반응된 후각 수용체 단백질 발현 세포만을 세포 반응 챔버(101)에 도입할 수 있다.
세포 반응 챔버(101)에서 냄새 분자 및 칼슘 이온과 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포를 증류수 부가에 의해 용해(lysis)하면, 후각 수용체 단백질 발현 세포 내로 유입된 칼슘 이온이 다른 세포내 물질과 함께 외부로 방출되고, 이러한 칼슘 이온은 전압 제공부(106)로부터 제 1 전극에 (+)의 전압, 제 2 전극에 (-)의 전압을 인가하게 되면, 세포 반응 챔버(101)를 한정하는 양이온 교환막(C; 107)을 통해 칼슘 이온 농축 챔버(102)로 이동하게 되고, 칼슘 이온 농축 챔버(102)를 한정하는 음이온 교환막(108; A)은 일단 유입된 칼슘 이온을 투과시키지 않는다. 따라서, 칼슘 이온 농축 챔버(102)에 칼슘 이온이 농축되게 된다. 이때 전압인가로 인해, 상기 증류수 부가에 의한 용해가 미처 이루어지지 않는 세포의 용해가 더욱 가속화 되어 세포내의 칼슘이 거의 완전히 외부로 방출될 수 있다.
칼슘 이온 농축 챔버(102)는 앞서 설명한 바와 같이, 상기 양이온 교환막(107; C) 및 음이온 교환막(108; A)에 의해 한정되는 부위이고, 전기투석 시 세포 반응 챔버(101)에 존재하는 칼슘 이온이 양이온 교환막(107; C)을 통해 이동하여 농축되는 부위이다. 칼슘 이온 농축 챔버(102)는 전기 투석을 위해 이온 교환 매질을 수용한다. 상기 양이온 교환막(107; C)은 양이온은 통과시키지만 음이온 통과에는 100%에 가까운 저항을 나타내는 막이고, 반대로 음이온 교환막(108; A)은 음이온은 통과시키지만 양이온 통과에는 100%에 가까운 저항을 나타내는 막이다. 상기 양이온 교환막(107; C) 및 음이온 교환막(108; A)은 당업계에 잘 알려져 있으 며, 당업자가 용이하게 이를 구입하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 양이온 교환막(107; C)은 강산 교환막(strong acid exchange memebrane; -SO3-Na+ 포함; Nafion사) 또는 약산 교환막(weak acid exchange membrane; -COO-Na+ 포함)일 수 있고, 상기 음이온 교환막(108; A)은 강염기 교환막(strong base exchange membrane; N+(CH3)Cl- 포함) 또는 약염기 교환막(weak base exchange membrane; N(CH3)2 포함)일 수 있다.
제 2 전극 챔버(103)는 상기 음이온 교환막 및 제 2 전극에 의해 한정되는 부위이고, 전기 투석을 위해 이온 교환 매질을 수용한다.
상기 제 1 전극(104) 및 제 2 전극(105)은 각각 백금, 금, 구리, 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 칼슘 이온 농축 챔버(102) 및 제 2 전극 챔버(103)에 수용되는 상기 이온 교환 매질은 전해질 수용액인 것이 바람직하다. 그 전해질의 종류는 특별히 한정되지는 않으며, 당업자가 용이하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 전해질로는 염화칼륨, 염화나트륨 등과 같이 Ca2+ 측정에 영향을 주지 않는 모든 전해질이 이용될 수 있다.
상기 전압 제공부(106)은 제 1 전극 및 제 2 전극에 전압을 인가하기 위한 것이며, 제 1 전극에는 (+)의 전압, 제 2 전극에는 (-)의 전압이 인가되도록 배치한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 냄새 물질을 검출하는 방법은 a) 본 발명에 따른 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 배양하는 단계; b) 상기 세포 반응 챔버에 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물을 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포와 반응시키는 단계; c) 상기 세포 반응 챔버에서 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 물질을 제거하는 단계; d) 상기 세포 반응 챔버에 증류수를 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계; e) 전압 제공부로부터 제 1 전극에 (+)의 전압, 제 2 전극에 (-)의 전압을 인가하여, 세포 반응 챔버 내의 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버로 이동시키는 단계; 및 f) 칼슘 이온 농축 챔버의 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
도 2a 내지 도 2d는 본 발명에 따른 냄새 물질을 검출하는 방법의 원리를 나타낸 개념도이다. 본 발명에 따른 냄새 물질을 검출하는 방법을 도 2a 내지 도 2d를 참고하여 설명하도록 한다.
우선 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버(101)에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 배양한다. 후각 수용체 단백질 발현 세포는 종래의 공지된 방법에 따라 포유류 세포에 후각 수용체 단백질 유전자를 재조합하여 제조할 수 있으며, 이러한 후각 수용체 단백질 발현 세포의 제조는 예를 들어Hwi Jin Ko et al., Piezoelectric olfactory biosensor: ligand specificity and dose-dependence of an olfactory receptor expressed in a heterologous cell system, Biosensors and Bioelectronics 20(2005) 1327-1332에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 후각 수용체 단백질 발현 세포는 해당 세포에 적절한 배양 배지를 이용하여 배양하며, 예를 들어 10% 우태아혈청이 보강된 DMEM(Dulbeccos modified Eaglers medium )(Nacalai Tesque) 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세포 반응 챔버(101)에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 배양한 후에는, 검출하고자 하는 냄새 물질을 칼슘 이온 화합물과 함께 세포 반응 챔버(101)에 부가한다. 여기에서, 칼슘 이온 화합물이란 세포 반응 챔버에 부가 시 칼슘 이온이 해리될 수 있는 임의의 화합물을 의미하며, 예를 들어 염화칼슘 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물을 세포 반응 챔버(101)에 부가할 경우 후각 수용체 단백질 발현 세포에 나타나는 현상을 도 2a에 나타내었다. 부가된 냄새 분자가 후각 수용체 단백질 발현 세포의 후각 수용체에 결합하면, 세포 내부의 cAMP의 증가가 일어나고 이것에 의해 CNG-채널이 열리고 세포 외부에서 Ca2+ 이온이 세포 내부로 유입된다. 이러한 현상은 부가된 냄새 분자의 양에 비례하여 일어나, 내부 칼슘 이온의 양의 증가는 냄새 분자의 양에 비례하게 된다. 그리하여, 세포 반응 챔버(101) 내에 냄새 분자 및 칼슘 이온 화합물을 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포와 반응시키면, 후각 수용체 단백질 발현 세포 내부에 냄새 물질의 양에 비례하여 칼슘 이온 화합물이 축적된다.
세포 반응 챔버(101) 내에서 후각 수용체 단백질 발현 세포가 냄새 분자 및 칼슘 이온 화합물과 충분히 반응한 후에는, 세포 반응 챔버(101) 내에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 제외한 모든 물질을 제거하여 후각 수용체 단백질 발현 세포만을 남겨둔다. 세포 반응 챔버(101) 내에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 제외한 모든 물질을 제거한 상태를 도 2b에 나타내었다. 이러한 작업은 냄새 물질에 반응하여 후각 수용체 단백질 발현 세포의 내부에 실제로 유입된 칼슘 이온의 양만을 정확하게 측정하기 위한 것이다. 이러한 작업에 의해, 상기 세포 외부에 존재하는 칼슘이온이나 양이온을 모두 제거할 수 있으며, 냄새 물질에 대해 반응하여 후각 수용체 단백질 발현 세포 내로 유입된 칼슘 이온의 양을 이후의 단계에서 정확하게 측정할 수 있다.
세포 반응 챔버(101) 내에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 제외한 모든 물질을 제거하기 위해서, 후각 수용체 단백질 발현 세포를 세척하는 과정을 수행할 수 있다. 이러한 세척 과정에서는 후각 수용체 단백질 발현 세포 내부의 칼슘 이온이 소실되지 않도록 하기 위해 세포의 파괴가 일어나지 않도록 하여야 하며, 그러기 위해서는 세척 용액이 후각 수용체 단백질 발현세포와 거의 등장을 유지하여야 한다. 이러한 세척용액은 후각 수용체 단백질 발현세포의 파괴 및 이후의 칼슘 농도 측정 시 영향을 주지 않는 것이라면 어느 것이든 가능하며, 예를 들어 0.1~0.5 M의 수크로오스 수용액이 이용될 수 있다.
세포 반응 챔버(101)에서 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 물질을 제거한 다음에는, 세포 반응 챔버(101)에 증류수를 부가함으로써 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계를 수행한다. 증류수를 부가하는 이유는 순수한 물이 아닌 양이온 물질이 혼입된 물이 부가된다면 이후에 후각 수용체 단백질 발현 세포의 내부에 유입된 칼슘 이온의 양을 측정하는데 오차가 발생될 수 있기 때문이다. 세포 반응 챔버에 증류수가 부가되면, 후각 수용체 단백질 발현 세포는 삼투압에 의해 세포막의 파괴되고 세포 내부의 내용물이 모두 외부로 유출되게 된다. 이러한 현상을 도 2c에 나타내었다. 증류수의 부가에 의해 후각 수용체 단백질 발현 세포의 용해는 거의 100%에 가깝게 이루어지나, 미처 용해되지 못한 부분은 이후의 단계에서 실시하게 되는 전기 투석에 의해 후각 수용체 단백질 발현 세포의 용해가 100% 이루어질 수 있다. 후각 수용체 단백질 발현 세포의 완전한 용해는 후각 수용체 단백질 발현 세포 내부에 유입된 칼슘 이온 농도의 정확한 측정을 위해 필수적이다.
그 다음에는, 전압 제공부(106)로부터 제 1 전극(104)에 (+)의 전압, 제 2 전극(105)에 (-)의 전압을 인가하여, 전기투석에 의해 세포 반응 챔버(101) 내의 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버(102)로 이동시키는 단계를 수행한다. 전압 제공부(106)로부터 제 1 전극(104)에 양의 전압을 인가하고, 제 2 전극(105)에 음의 전압을 인가하면 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서의 내부의 모든 챔버(101, 102, 103) 내에 존재하는 양이온은 제 1 전극(104)으로부터 제 2 전극(105) 방향으로만 이동하게 되고, 음이온은 제 2 전극(105)으로부터 제 1 전극(104) 방향으로만 이동하게 된다. 그리하여, 본 발명에 따른 바이오센서의 내부에 존재하는 칼슘 이온은 양이온 교환막(107; C)을 통해 칼슘 이온 농축 챔버(102)로 이동할 수 있다. 그러나, 일단 양이온 교환막(107; C)을 통해 칼슘 이온 농축 챔버(102)에 유입된 칼슘이온은 양이온에 대해 거의 100% 저항하는 음이온 교환막(108; A)의 존재에 의해 더 이상 제 2 전극(105) 방향으로 이동할 수 없게 되며, 결국 칼슘 이온이 칼슘 이온 농축 챔버(102)에 농축된다. 그리하여, 세포 반응 챔버(101)에는 이전 단계에서의 후각 수용체 단백질 발현 세포의 용해에 의해 생성된 세포 잔해물이 남게 된다. 이와 같이, 전압 인가에 의한 양이온 교환막(107; C)에 의한 전기 투석에 의해, 세포 반응 챔버(101)의 칼슘이온이 칼슘이온 농축 챔버(102)로 농축되고, 세포 반응 챔버(101) 내에는 세포 잔해물이 남게되는 현상을 도 2d에 나타내었다. 이러한 전기 투석에 의해 칼슘 이온울 칼슘 이온 농축 챔버(102)로 농축하는 과정을 수행하지 않고, 세포 반응 챔버(101) 내에서의 칼슘 이온의 증가량을 측정하는 방법을 이용할 수도 있으나, 그러한 경우 칼슘 이온이 농축되지 않은 상태에서 측정이 이루어져 감도가 떨어지고, 세포 잔해물이 제거되지 않은 상태에서 측정하면 세포 잔해물로 인한 노이즈의 발생으로 칼슘 이온 농도의 작은 변화량은 감지할 수 없어 문제가 된다.
상기 단계에서 수행하는 전기 투석은 상기한 바와 같이 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버(102)로 이동시키는 역할을 수행하기도 하지만, 상기 증류수의 부가 에 의해 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계에서 미처 용해되지 않고 남아있던 세포를 전기 투석 시 가해진 전압에 의해 완벽히 용해시켜 세포 내부의 칼슘을 충분히 방출하도록 하는 역할을 수행하기도 한다.
그 다음에는, 칼슘 이온 농축 챔버(102)에 농축된 칼슘 이온의 농도를 측정 함으로써 냄새 물질의 검출을 수행한다. 측정된 칼슘 이온의 농도가 높을수록 냄새물질의 양이 많음을 의미하게 되므로, 측정된 칼슘이온의 농도로부터 냄새 물질의 정량이 가능하다. 칼슘 이온 농축 챔버(102)에 농축된 칼슘 이온의 농도를 측정하기 위해, 칼슘 이온만을 선택적으로 측정할 수 있는 Ca2+ 선택적 전극을 이용하거나, 칼슘 이온 농축 챔버에 농축된 칼슘 이온의 농도를 측정하기 위해 이온의 농도를 측정하는 통상적인 방법이 이용될 수도 있다. Ca2+ 선택적 전극으로는 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid )와 같은 리간드가 전극에 코팅된 전극이 이용될 수 있다. 칼슘 이온을 선택적으로 측정하지 않고, 이온의 농도를 통상적인 방법으로 측정함으로써 칼슘 이온 농도의 변화를 측정할 수 있으며, 예를 들어 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 진동수의 변화에 따른 컨덕턴스를 측정함으로써 가능하다.
후각 수용체 단백질 발현 세포 내에는 상기 냄새 물질과의 반응에 의해 외부에서 유입된 칼슘 이온 이외에도 세포가 원래 가지고 있던 고유의 칼슘이온이 포함되어 있을 뿐만 아니라, 칼슘 이온이 아닌 다른 양이온 또한 포함되어 있다. 그리하여, 이러한 세포 고유의 칼슘 이온 또는 다른 양이온 또한 상기 양이온 교환막(107; C)을 통해 칼슘 농축 챔버(102)로 이동하게 되며, 이후에 칼슘 이온 농도 측정 시 세포 고유의 칼슘 이온 또는 다른 양이온에 의해 오차가 발생된다. 그러나, 이러한 칼슘 이온 농도 측정의 오차는 냄새 물질만을 부가하지 않은 대조군에서의 양이온 농도 또는 칼슘 이온 농도를 측정하고, 그 값을 실험군의 양이온 농도 또는 칼슘 이온 농도에서 차감함으로써 보정될 수 있다.
앞서 설명한 방법과 같이, 본 발명에 따른 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서를 이용하여 냄새 물질을 검출하는 방법은 후각 수용체 단백질 발현 세포를 배양하고, 그 세포를 냄새 물질과 칼슘 이온 화합물과 함께 반응시킨 다음, 그 세포만을 남기고 다른 물질을 제거하는 과정을 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버(101) 내에서 수행할 수도 있으나, 냄새 물질 검출용 바이오센서 이외의 다른 실험 용기에서 수행하여 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물과의 반응이 모두 완료된 후각 수용체 단백질 발현 세포를 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버(101)에 도입한 다음, 그 이후의 단계를 상기 방법과 동일한 방법을 수행함으로써 냄새 물질을 검출할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따른 전기투석장치를 이용한 냄새 물질 검출용 바이오센서가 칼슘 농도의 변화를 높은 감도로 측정될 수 있는지에 대해 확인하였다. 그 결과, 전기 투석을 수행하지 않아 세포 잔해물이 제거되지 않은 상태에서 칼슘 이온 농도를 측정한 경우에는 28 μM 이상의 칼슘 이온 농도를 구별할 수 있었으나(도 5 참조), 전기 투석을 수행함으로써 칼슘 이온 농축 챔버에 칼슘 이온을 이동시켜 세포 잔해물을 제거한 경우에는 7 μM의 칼슘 이온 농도를 구별할 수 있었다(도 4 참조). 따라서, 본 발명에 따른 전기 투석에 의한 냄새물질 검출용 바이오센서를 이용하면 매우 높은 감도로 냄새 물질에 의한 후각 수용체 단백질 발현 세포의 칼슘 이온 농도의 변화를 감지할 수 있을 것으로 기대된다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1. 염화 칼슘 수용액의 컨덕턴스의 측정
먼저 컨덕턴스 변화로 측정 가능한 염화 칼슘 농도를 가늠하기 위해 실험을 진행하였다. 증류수를 이용하여 0.7 μM, 1.53 μM, 7 μM, 및 28 μM의 농도의 염화 칼슘 용액을 제조하였다. 제조한 다양한 농도의 염화칼슘 수용액에 대해 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 진동수의 변화에 따른 컨덕턴스를 측정하였다. 그 측정 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 결과에 따르면, 염화칼슘 수용액은 7 μM 농도 이상에서 컨덕턴스 측정에 의해 구별이 가능한 것으로 확인되었다.
2. 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오 센서를 이용한 칼슘 이온의 검출
본 실시예에 따른 냄새 물질 검출용 바이오 센서의 전기 투석 장치는 도 1에 도시되어 있다. 양이온 교환막으로서 -SO3-Na+ 기를 포함하는 막을 사용하였고, 음이온 교환막으로서 N+(CH3)Cl-기를 포함하는 막을 사용하였다. 또한, 제 1 전극 및 제 2 전극으로서 모두 백금을 이용하였다. 칼슘 이온 농축 챔버 및 제 2 전극 챔 버에는 이온 교환 매질로서는 700 μM의 염화칼륨 수용액을 채웠다.
우선 본 발명에 따른 전기 투석 장치가 냄새분자의 예측 지표로 사용되는 칼슘의 농도를 효과적으로 측정할 수 있는지를 확인하기 위해 HEK293 세포(H.J. Ko, T.H. Park, Biosensors and Bioelectronics 20(2005) 1327-1332)를 세포 반응 챔버에 7.7 x 108/mL 의 농도로 접종하고 72 시간 동안 배양 하였다. 그런 다음, 세포 반응 챔버 내의 세포만을 남겨두고 다른 모든 물질은 제거하였다. 그런 다음, 증류수를 가하여 세포를 용해시킨 다음 염화칼슘을 7 μM이 되도록 부가하였다. 전압 제공부로부터 제 1 전극에는 (+)의 전압, 제 2 전극에는 (-)의 전압을 0.5 V의 크기로 인가하여 전기 투석을 5 분간 수행하여, 칼슘 이온 농축 챔버에 칼슘 이온을 농축시켰다. 그런 다음 칼슘 이온 농축 챔버 내의 용액에 대해 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 진동수의 변화에 따른 컨덕턴스를 측정하였다. 상기 방법에서 염화 칼슘을 부가하지 않고, 상기 방법과 동일한 과정을 수행한 것을 대조군으로 하였다. 각각의 실험군 및 대조군은 3 회 반복하였다. 컨덕턴스의 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 결과에 따르면, 7 μM의 염화칼슘을 부가한 실험군은 염화칼슘을 부가하지 않은 대조군에 비해 컨덕턴스 측정에 의해 명확히 구별이 가능한 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서는 매우 높은 감도로 세포 내에서 변화하는 칼슘이온의 양을 검출할 수 있음을 확인하였다.
비교예 1
상기 실시예 1에서, 세포 반응 챔버에 가하는 염화칼슘의 농도를 1.58 μM, 7 μM, 및 28 μM로 하고, 전기 투석을 실시하지 않고, 세포 반응 챔버에서 직접 Impedance/Gain-Phase Analyzer(AMETEK®)을 이용하여 진동수의 변화에 따른 컨덕턴스를 측정하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 칼슘 이온을 검출하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 결과에 따르면, 28 μM의 농도로 염화칼슘을 부가한 실험군의 경우만이 염화칼슘을 부가하지 않은 대조군에 비해 컨덕턴스 측정에 의해 명확히 구별이 가능한 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터 본 발명에서와 같이 전기투석에 의해 세포 잔해물을 제거하고 칼슘이온을 농축한 후 세포상에서 변화한 칼슘의 농도를 측정하는 것이 전기 투석하지 않고 세포 잔여물이 존재하는 상황에서 칼슘이온을 측정하는 것 보다 훨씬 칼슘이온 측정에 효과적임을 확인하였으며, 이러한 결과로부터 향후 냄새 물질에 의해 세포 내에서 변화하는 칼슘이온의 양을 높은 감도로 검출할 때 효과적으로 응용될 수 있음을 알 수 있다.
상기 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서 및 그 바이오센서를 이용하면, 냄새 물질에 의해 변화하는 후각 수용체 발현 세포 내의 칼슘 이온 농도의 변화를 값비싼 형광염료 및 형광측정기를 이용하지 않고 전기투석에 의해 높은 감도로 측정할 수 있다.

Claims (10)

  1. 양이온 교환막 및 제 1 전극에 의해 한정되고, 냄새 물질 및 칼슘 이온과 반응한 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해(lysis)시키 위한 세포 반응 챔버;
    상기 양이온 교환막 및 음이온 교환막에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 칼슘 이온 농축 챔버;
    상기 음이온 교환막 및 제 2 전극에 의해 한정되고 이온 교환 매질을 수용하는 제 2 전극 챔버; 및
    전기투석을 위해 상기 제 1 전극에는 (+)의 전압, 제 2 전극에는 (-)의 전압을 인가하기 위한 전압 제공부를 포함하는 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 전극 및 제 2 전극은 각각 백금, 구리, 및 팔라듐으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 이온 교환 매질은 전해질 수용액인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 전해질 수용액은 염화칼륨 또는 염화나트륨의 수용액인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  5. 제1항에 따른 전기 투석에 의한 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버에서 후각 수용체 단백질 발현 세포를 배양하는 단계;
    상기 세포 반응 챔버에 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물을 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포와 반응시키는 단계;
    상기 세포 반응 챔버에서 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 물질을 제거하는 단계;
    상기 세포 반응 챔버에 증류수를 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계;
    전압 제공부로부터 제 1 전극에는 (+)의 전압, 제 2 전극에는 (-)의 전압을 인가하여, 세포 반응 챔버 내의 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버로 이동시키는 단계; 및
    칼슘 이온 농축 챔버의 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 냄새 물질 검출 방법.
  6. 배양된 후각 수용체 단백질 발현 세포를 냄새 물질 및 칼슘 이온 화합물과 반응시키는 단계;
    상기 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 물질을 제거하는 단계;
    상기 후각 수용체 단백질 발현 세포를 청구항 제1항에 따른 냄새 물질 검출용 바이오센서의 세포 반응 챔버에 부가하는 단계;
    상기 세포 반응 챔버에 증류수를 부가하여 후각 수용체 단백질 발현 세포를 용해시키는 단계;
    전압 제공부로부터 제 1 전극에는 (+)의 전압, 제 2 전극에는 (-)의 전압을 인가하여, 세포 반응 챔버 내의 칼슘 이온을 칼슘 이온 농축 챔버로 이동시키는 단계; 및
    칼슘 이온 농축 챔버의 칼슘 이온의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 냄새 물질 검출 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 칼슘 이온 화합물은 염화칼슘인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 후각 수용체 단백질 발현 세포 이외의 모든 물질을 제거하기 위해 후각 수용체 단백질 발현 세포를 세척 용액으로 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세척 용액은 0.1 ~ 0.5 M 의 수크로오스 수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 인가되는 전압은 0.1 내지 1 V인 것을 특징으로 하는 방법.
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