JP7228824B2 - 抗プレキシンa1アゴニスト抗体 - Google Patents
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Description
[2] 3型セマフォリン様の活性を有する、[1]に記載の抗体。
[3] 3型セマフォリン様の活性がセマフォリン3A様の活性である、[2]に記載の抗体。
[4] 3型セマフォリン様の活性が樹状細胞の退縮又はグリオーマ細胞の退縮を促進させる活性である、[2]または[3]に記載の抗体。
[5] プレキシンA1のセマドメイン内のエピトープに特異的に結合する、[1]~[4]のいずれかに記載の抗体。
[6] 前記セマドメイン内のエピトープはセマドメインのC末端領域内のエピトープである、[5]に記載の抗体。
[7] C末端領域が配列番号3の残基461~514、又は配列番号52の残基459~512への結合である、[6]に記載の抗体。
[8] ヒトプレキシンA1及びマウスプレキシンA1に交叉する抗体である、[1]~[7]のいずれかに記載の抗体。
[9] モノクローナル抗体である、[1]~[8]のいずれかに記載の抗体。
[10] キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項[1]~[9]のいずれかに記載の抗体。
[11] Fab、scFv、F(ab′)2、一本鎖抗体または二重特異性抗体である、[1]~[10]のいずれかに記載の抗体。
[13] [1]~[11]のいずれかに記載の抗体と薬学的に許容される担体を混合する、医薬組成物の製造方法。
[14] 3型セマフォリンの量的または質的な機能低下が関連する疾患の予防および/または治療に用いられる、[12]に記載の医薬組成物。
[15] [1]~[11]のいずれかに記載の抗体又は[12]若しくは[14]に記載の医薬組成物と、3型セマフォリンの量的または質的な機能低下が関連する疾患の予防および/または治療を治療するために前記抗体又は医薬組成物を投与するための指示書を含むキット。
プレキシンA1は例えばヒトやマウスのプレキシンA1を用いることができるが、特にこれらに限定されるものでない。プレキシンA1のマウスのアミノ酸配列及び塩基配列は、例えばKameyama T et al. "Biochemical and biophysical research communications."Biochem Biophys Res Commun. 1996, 226(2), 524-9、 GenbankのAccession No. D86948、NCBI Reference Sequence NP_032907.1において公開されている。また、ヒトプレキシンA1のアミノ酸配列及び塩基配列は、例えばTamagnone L et al. Cell. 1999, 99(1), 71-80、GenbankのAccession No. X87832、NCBI Reference Sequence NP_115618.3、NCBI Reference Sequence NM_032242において公開されている。これらの配列情報をもとに容易にプレキシンA1をクローニングすることができる。使用の目的の範囲内において適宜プレキシンA1のアミノ酸配列又は塩基配列を改変して使用することができる。プレキシンA1のアミノ酸配列はヒトとマウスの間でよく保存されている。本明細書においては、プレキシンA1はPlexin-A1、PlexinA1、PlxnA1とも記載する。また、単にプレキシンA1と記載した場合、ヒト及び/又はマウスのプレキシンA1を意味し、他の因子(例えばセマフォリン3A)についても同様にヒト及び/又はマウスを意味する。
抗プレキシンA1アゴニスト抗体とは、例えばプレキシンA1タンパク質に特異的に結合し、プレキシンA1を介したシグナル伝達活性を有する抗体を意味し、3型セマフォリン様の活性を有する抗体を挙げることができる。
抗プレキシンA1アンタゴニスト抗体とは、例えばプレキシンA1タンパク質に特異的に結合し、プレキシンA1を介したシグナル伝達活性を妨げる又は減弱する抗体を意味し、3型セマフォリン様の活性を妨げる又は減弱する抗体を挙げることができ、好ましくはセマフォリン3A様の活性を妨げる又は減弱する抗体である。抗プレキシンA1アゴニスト抗体として、例えば細胞形態の退縮を阻害する抗体であり、さらには樹状細胞又はグリオーマ細胞の細胞形態の退縮を阻害する抗体である。
セマフォリンは、現在までに20種類を超えるメンバーが同定されており、Semaドメインと呼ばれる500程度のアミノ酸からなる領域をファミリーで共有し保存していることを特徴としている。Semaドメインに続くC末端側の構造の違いから8つのサブクラスに分類されている。3型セマフォリンとしてはSema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3Fが知られており、本明細書おいては3型セマフォリンにはSema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D、Sema3E、Sema3Fが含まれ得るが、好ましくはSema3A(セマフォリン3A)である。
セマフォリン3Aは、例えばヒトやマウスのセマフォリン3Aを用いることができるが、特にこれらに限定されるものでない。セマフォリン3Aのヒトのアミノ酸配列は、例えばNCBI Reference Sequence NP_006071.1において公開されている。またセマフォリン3Aのマウスのアミノ酸配列は、例えばNP_033178.2において公開されている。これらの配列情報をもとに容易にセマフォリン3Aをクローニングすることができる。使用の目的の範囲内において適宜セマフォリン3Aのアミノ酸配列を改変して使用することができる。本明細書においては、セマフォリン3AはSema3Aとも記載する。
セマドメインは、通常、ヒトプレキシンA1においては配列番号3の51位~487位、マウスプレキシンA1においては配列番号52の49位~485位、マウスプレキシンA2においては配列番号53の50位~483位である。尚、本明細書においてセマドメインはsema domainとも記載する。
3型セマフォリン様の活性の好ましい一つの例であるセマフォリン3A様の活性とは具体的には例えば以下の活性を意味する。細胞の形態(例えば、樹状細胞の細胞形態)を退縮させる活性、樹状細胞の所属リンパ節へ移動を促進する活性(米国特許公開第2012/0322085号)、破骨細胞の分化を抑制する活性、骨芽細胞の分化を促進する活性(Hayashi M et al., Nature, 2012, 485, 69-74)、神経伸長阻害活性(米国特許第7642362号)が挙げられる。本発明のアゴニスト抗体は3型セマフォリン様の活性のうち少なくとも1つを有するものであればよく、例えば細胞形態の退縮を促進するものであり、また例えば樹状細胞又はグリオーマ細胞の細胞形態の退縮を促進するものである。また、アンタゴニスト抗体は3型セマフォリン様の活性のうち、少なくとも1つを阻害するものであればよく、例えば細胞形態の退縮を阻害するものであり、また例えば樹状細胞又はグリオーマ細胞の細胞形態の退縮を阻害するものである。
Sema3Aは、神経細胞の神経成長円錐を退縮させ軸索の伸長を抑制することや、樹状細胞が微小リンパ管を通過する過程において樹状細胞の形態の退縮を誘導することにより樹状細胞移動を制御することなど、様々な細胞に対して退縮活性を示すことで、神経回路網の形成や免疫反応を含む多彩な生体反応を制御している。
各種腫瘍細胞、HUVECを含む内皮細胞、脊髄後根神経節(DRG)ニューロンおよび樹状細胞などの細胞を96 well cell cultureプレートに播種し、数時間~1日間培養することで細胞を接着させる。次に、Sema3Aを添加しさらに30分から数時間程度37℃、CO2 5%のインキュベーター中で培養する。この際に比較対照としてSema3Aを添加しないウェルを設定する。その後、顕微鏡観察またはArrayScan(登録商標)等のハイコンテントスクリーニング用細胞イメージアナライザーを用いて細胞形態を撮影し、画像解析用ソフトウェア(Cellomics-vHCSTM:Scanなど)によって細胞形態の変化を数値化する。
各種腫瘍細胞、HUVECを含む内皮細胞、脊髄後根神経節(DRG)ニューロンおよび樹状細胞などの細胞を、ウェルの底面に電極を集積した組織培養E-プレートに播種し、数時間~1日間培養することで細胞を接着させる。次に、Sema3Aを添加しさらに数分間から数時間程度37℃、CO2 5%のインキュベーター中で培養する。この際に比較対照としてSema3Aを添加しないウェルを設定する。細胞形態や接着性の変化をCELLigence(登録商標)により電気的インピーダンスとして検出する。この電気的インピーダンスはxCELLigence(登録商標)の解析用ソフトウェアであるRTCA ソフトウェア(登録商標)を用いて検出され、セル・インデックス(CI)と呼ばれる無単位のパラメーターとして創出され、または、現在の細胞状態とのCIの相対的変化からノーマライズド・セル・インデックスと呼ばれる無単位のパラメーターも算出される。このNormalized CI値をSema3Aの非添加時と添加時で比較することによってSema3Aの細胞形態退縮誘導活性を測定する。細胞形態の退縮とは、Sema3A添加時においてSema3A非添加時と比べて、CI値が減少したことをいい、好ましくは1%以上、5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、50%以上、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上減少したことをいう。
Sema3Aは樹状細胞上のPlexin-A1およびNeuropilin-1のヘテロ受容体複合体に作用しアクトミオシン収縮を誘導する活性を示し、細胞形態の変化を誘導することで微小リンパ管細胞間隙の通過を制御している。
Sema3Aは破骨細胞や骨芽細胞の発現する受容体を介して破骨細胞の分化に抑制的に作用すると同時に、骨芽細胞の活性化に促進的に働くことで骨保護作用の活性を示すことが報告されている。
活性の測定としては多様な方法が存在するが、例えばその一例として、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(Tartrate-resistant acid phosphatase;TRAP)染色により評価される。具体的には、骨髄細胞をM-CSFを含むα-MEM培地で48時間以上培養し、骨髄単球/マクロファージ前駆細胞を調製する。RANKLを添加した培地に交換して数日間培養を継続する。Sema3Aの評価のためには、Sema3Aを添加した培地に交換し、10~12時間後にRANKLを添加して数日間培養を継続する。数日おきに培地を交換し、破骨細胞の形成が確認されたら、TRAP染色及び核染色を行う。Sema3Aを添加した細胞の染色画像を顕微鏡やArrayScan(登録商標)等のハイコンテントスクリーニング用細胞イメージアナライザーを用いて取得し、Sema3Aを添加していない細胞の染色像と比較することで、Sema3Aの破骨細胞分化抑制活性を測定する。具体的には、ウェル当たりのTRAP陽性細胞の数、あるいはTRAP陽性かつ多核細胞の数を計測し比較する。
活性の測定方法としては多様な方法が存在するが、例えばその例として、アルカリホスファターゼ(Alkaline Phosphatase;ALP)染色やALP活性測定、石灰化の検出によって評価される。具体的には、頭蓋冠細胞やMC3T3-E1細胞をコラーゲンコートされたプレートに播種し、アスコルビン酸とβ-グリセロリン酸を含むα-MEM培地で培養する。Sema3Aの評価のためには、培地にSema3Aを添加して培養する。数日おきに培地を交換し、培養終了後にALP染色を行って顕微鏡で画像を取得するか、またはそのALP活性を吸光度法を用いて測定する。また、石灰化の検出にはAlizarin red染色を行う。Sema3Aを添加した細胞の染色画像を顕微鏡を用いて取得し、Sema3Aを添加していない細胞の染色像と比較することで、Sema3Aの骨芽細胞活性化作用を評価する。具体的には、顕微鏡で染色後の細胞を撮影し、ALP染色やAlizarin red染色の強度を視覚的に比較して活性の有無を判断する。
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、抗体誘導体及び抗体修飾物であってもよい(Miller K et al., J Immunol., 2003, 170(9), 4854-61)。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラであってもよく、または他の種由来であってもよい。本明細書中に開示される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgDおよびIgA)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、任意の種(例えば、ヒト、マウスまたはウサギ)由来であり得る。尚、「抗体」、「免疫グロブリン」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われる。
(a)配列番号:23、24、25(hPANL#240のH鎖CDR)に記載のH鎖CDR1、2,3のアミノ酸配列及び配列番号:26、27、28(hPANL#240のL鎖CDR)に記載のL鎖CDR1、2,3のアミノ酸配列を含む抗体。
(b)配列番号:29、30、31(359B2-2-3-6のH鎖CDR)に記載のH鎖CDR1、2,3のアミノ酸配列及び配列番号:32、33、34(359B2-2-3-6のL鎖CDR)に記載のL鎖CDR1、2,3のアミノ酸配列を含む抗体。
(a)配列番号:21(hPANL#240のH鎖可変領域)に記載のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号:22(hPANL#240のL鎖可変領域)に記載のL鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
(b)配列番号:35(359B2-2-3-6のH鎖可変領域に記載のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号:36(359B2-2-3-6のL鎖可変領域)に記載のL鎖可変領域のアミノ酸配列を含む抗体。
(a)配列番号:9(hPANL#240のH鎖)に記載のH鎖のアミノ酸配列及び配列番号:10(hPANL#240のL鎖)に記載のL鎖のアミノ酸配列を含む抗体。
(b)配列番号:11(359B2-2-3-6のH鎖に記載のH鎖のアミノ酸配列及び配列番号:12(359B2-2-3-6のL鎖)に記載のL鎖のアミノ酸配列を含む抗体。
別の実施態様は前記核酸が組み込まれたベクターである。
さらに別の実施態様は、前記ベクターで形質転換された宿主細胞である。
さらに別の実施態様は、前記細胞を培養することにより、前記抗体を製造する方法である。
さらに別の実施態様は、前記製造方法で製造された抗体である。
本発明の抗プレキシンA1アゴニスト抗体は、プレキシンA1と結合することにより3型セマフォリン様の活性を示すため、3型セマフォリン、好ましくはSema3Aの量的あるいは質的な機能低下が関連する疾患を治療、予防するのに有用である。特に、乾癬およびアトピー性皮膚炎の掻痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症、関節リウマチや全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患、炎症性疾患、および腫瘍などをはじめとする様々な疾患を治療、予防するのに有用である。
本発明はまた、本発明の抗プレキシンA1アゴニスト抗体を含有する医薬組成物を提供する。本発明の抗プレキシンA1アゴニスト抗体は、上記の通り、3型セマフォリン、好ましくはSema3Aの量的あるいは質的な機能低下が関連する疾患(例えば乾癬およびアトピー性皮膚炎の掻痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症、関節リウマチや全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患、炎症性疾患、および腫瘍)の治療・予防剤として有用である。また、本発明の抗プレキシンA1アゴニスト抗体を医薬組成物として用いる場合には、人に対する抗原性などの点からヒト抗体、ヒト化抗体であることが好ましい。
本発明は、少なくとも本発明の抗プレキシンA1アゴニスト抗体もしくは医薬組成物を含む、3型セマフォリン、好ましくはSema3Aの量的あるいは質的な機能低下が関連する疾患を予防および/または治療するためのキットを提供する。特に、抗プレキシンA1アゴニスト抗体もしくは医薬組成物を含む、乾癬およびアトピー性皮膚炎の掻痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症、関節リウマチや全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患、炎症性疾患、および腫瘍を予防および/または治療するためのキットを提供する。該キットには、その他、注射筒、注射針、薬学的に許容される媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
また、本発明は、3型セマフォリン、好ましくはSema3Aの量的あるいは質的な機能低下が関連する疾患の予防および/または治療のための、本発明の抗プレキシンA1アゴニスト抗体または医薬組成物に関する。特に、乾癬およびアトピー性皮膚炎の掻痒、アレルギー性鼻炎、骨粗鬆症、関節リウマチや全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患、炎症性疾患、および腫瘍の予防および/または治療のための、抗プレキシンA1アゴニスト抗体、または医薬組成物に関する。
マウスセマフォリン3Aタンパク質は、NCBI Reference Sequence NP_033178.2の配列を基に遺伝子合成を行い、プロテアーゼ認識サイトのアルギニン残基(552番目、555番目、758番目、760番目、761番目)をアラニンに変換した。シグナルペプチド(N末端から20番目のアラニンまで)を人工シグナルペプチドHMM+38(配列番号7)に置換し、該人工シグナルペプチドと21番目のアスパラギンの間に、グルタミン酸-アスパラギン酸-アルギニンのスペーサー介してHisタグ配列を挿入した。さらに、C末端は771番目のセリンと772番目のバリンを欠失させた。作製したマウスセマフォリン3Aリコンビナントタンパク質のアミノ酸配列を配列番号1に示した。作製した遺伝子は発現ベクターに組み込みInvitrogen社FreeStyle293細胞に導入して発現させ、培養上清からセマフォリン3Aタンパク質をHisTrap excel(GE Healthcare社)を用いたAffinity精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
樹状細胞の細胞形態収縮におけるセマフォリン3Aタンパク質の作用を評価するために、マウス骨髄由来樹状細胞を用いた退縮アッセイ(collapse assay)を実施した。退縮アッセイは、以下の方法により行なった。
単回膜貫通タンパク質であるヒトプレキシンA1(hPlexinA1)の細胞外領域を以下のように調製した。NCBI Reference Sequence NP_115618.3(配列番号3)のアミノ酸配列をもとに合成されたhPlexinA1遺伝子から、膜貫通領域と予想される1245番目のアラニン以降を除去し、代わりにFLAGタグ配列(配列番号5)を付加した。さらに1-26番目までのシグナルペプチド(配列番号6)を人工シグナルペプチドHMM+38(配列番号7)に置換した。作製されたhPlexinA1(配列番号4)をコードする遺伝子を動物細胞用発現ベクターに組み込み、293Fectin (Invitorgen)を用いてFreeStyle293細胞(Invitorgen)に導入した。このとき、目的遺伝子の発現効率の向上のため、EBNA1(配列番号8)を発現する遺伝子を同時に導入した。前述の手順に従って遺伝子導入された細胞を37℃、8% CO2で6日間培養し、目的のタンパク質を培養上清中に分泌させた。
可溶型マウスPlexinA1タンパク質は、NCBI Reference Sequence NP_032907.1(配列番号52)の細胞外ドメインまでのアミノ酸配列を元に設計し、シグナルペプチド(N末端から24番目のイソロイシンまで)を人工シグナルペプチドHMM+38(配列番号7)に置換し、C末端にはFLAGタグ配列(配列番号5)を挿入した。作製したアミノ酸配列を(配列番号16)に示した。作製した遺伝子は発現ベクターに組み込みInvitrogen社FreeStyle293細胞に導入して発現させ、培養上清から可溶型マウスPlexinA1タンパク質を抗FLAG M2抗体 アフィニティーゲル(Sigma-Aldrich社)を用いたAffinity精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
以下の方法でウサギに免疫を行い、抗マウスPlexinA1抗体を作製した。
ウサギへの免疫は、初回は完全フロイントアジュバント(CFA)に含ませた可溶型マウスPlexinA1タンパク質もしくは可溶型ヒトPlexinA1タンパク質を皮内に合計100μg注射した。その後、可溶型マウスPlexinA1タンパク質もしくは可溶型ヒトPlexinA1タンパク質を各回50μgずつ1週間以上の間隔を空けて、不完全フロイントアジュバント(IFA)に含ませて2回以上の追加免疫を行った。
上記で得られた抗体は、以下の手順でセルELISAに供された。まず、384ウェルプレートを準備し、マウスPlexinA1発現Ba/F3細胞、Ba/F3細胞(実施例11参照)をそれぞれ別のウェルの底面に捕捉した。当該プレートの各ウェルをPBSで洗浄した後、調製した抗体を20μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。その後、各ウェルを0.05% Tween20-PBSで洗浄し、2% FBS-PBSで10000倍希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(Betyl, A120-101P)を20uL/wellずつ添加し、室温で1時間静置した。当該プレートの各ウェルを0.05% Tween20-PBSで洗浄後、基質液(ABTS peroxidase substrate system)を20μL/wellずつ分注し、室温で1時間発色させた後、Molecular Device社製SpectraMaxにて405nmの吸光度を測定することによって、マウスPlexinA1への結合を確認した。
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型としてPCR法により抗体重鎖可変領域および抗体軽鎖可変領域の遺伝子ライブラリを増幅した。
構築したファージディスプレイ用ファージミドを保持した大腸菌からファージ産生を行った。ファージ産生を行った大腸菌の培養液に2.5M NaCl/10%PEGを添加することによって、沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによりファージライブラリ液を得た。次に、ファージライブラリ液にBSAおよびCaCl2を添加することによって終濃度4% BSA, 1.2 mM カルシウムイオンとなるよう調製した。パンニング方法としては、一般的な方法である磁気ビーズに固定化した抗原を用いたパンニング方法を参照した(J. Immunol. Methods., (2008) 332 (1-2), 2-9、J. Immunol. Methods., (2001) 247 (1-2),191-203、Biotechnol. Prog., (2002) 18(2) 212-20、Mol. Cell Proteomics, (2003) 2 (2), 61-9)。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)もしくはStreptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)を用いた。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol., (2002) 178, 133-145)に従って、ファージ含有培養上清を回収した。
3回目のパンニング時に回収した大腸菌から、NucleoBond Xtra Midi Plus (MACHEREY-NAGEL, 740412.50)によってファージミドの抽出を行った。その後、制限酵素処理によって抗体の可変領域部分を切出し、EF1プロモーターとEBNA1の複製開始点であるOriPを保持するベクターに抗体定常領域が導入されているカセットベクターに、ライゲーションを行った。ライゲーション産物を用いて、大腸菌DH5α(TOYOBO, DNA-903)を形質転換し、得られたシングルコロニーから動物細胞発現用の完全長抗体プラスミドの抽出を行った。
抗原発現細胞株は以下の方法で構築した。CAGプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を保持するpCXND3ベクターに、シグナルペプチドをHMM+38(配列番号7)に置換したヒトPlexinA1(NCBI Reference Sequence NP_115618.3)又はマウスPlexinA1(NCBI Reference Sequence NP_032907.1)の膜貫通領域までの部分(ヒト1300番目まで、マウス1290番目まで)を、C末側にMycタグ(配列番号51)を融合させたタンパク質として発現するようにコンストラクトしたcDNAを挿入したプラスミドを作製した。作製したヒトPlexinA1のアミノ酸配列を配列番号15、マウスPlexinA1のアミノ酸配列を配列番号37にそれぞれ示す。
実施例10で得られた抗体上清は、以下の手順でセルELISAに供された。まず、384ウェルプレートを準備し、ヒトPlexinA1およびマウスPlexinA1発現Ba/F3細胞をそれぞれ別のウェルの底面に捕捉した。当該プレートの各ウェルをPBSで洗浄した後、調製した抗体上清を20μL/wellで添加し、室温で1時間静置した。その後、各ウェルを1M Hepes (pH7.4)で洗浄し、TBSで5000倍希釈したHRP標識抗ヒトIgG抗体(Invitrogen, AHI0304)を20μL/wellずつ添加、室温で1時間静置した。当該プレートの各ウェルを1M Hepes (pH7.4)で洗浄後、基質液(ABTS peroxidase substrate system)を20μL/wellずつ分注し、室温で1時間発色させた後、Molecular Device社製SpectraMaxにて405nmの吸光度を測定することによって、ヒトPlexinA1への結合およびマウスPlexinA1への結合を確認した。
実施例12で選抜したhPANL#359について、当業者公知の方法でアフィニティーマチュレーションを行った。具体的には、(Biochemical and Biophysical Research Communications, (2000), 275, 2, 553-557)などを参照し、当該抗体の軽鎖部分をヒト軽鎖ライブラリで置換したライブラリを新たに作製後、ビオチン標識ヒトPlexinA1に対して2回パンニング操作を実施した。得られた大腸菌のシングルコロニーから、ファージ含有培養上清を回収し、前述の方法と同様にファージELISAを実施した。
実施例13で調製した抗体培養上清を用い、ヒトPlexinA1への結合能の確認を、Octet RED384 (ForteBIO)を用いて行った。具体的には、Protein G Biosensor (ForteBIO)に1.25 μg/mLに希釈した抗体培養上清を固相化し、続いてヒトPlexinA1をアプライし、バイオセンサーに固相された抗体と抗原との結合レスポンスを測定した。
当該抗体の重鎖可変領域部分を特異的なプライマーで増幅し、マウスの重鎖定常領域断片とともに、制限酵素により線状化された動物細胞発現用ベクターにIn-Fusion HD cloning kit(タカラバイオ)を用いてクローニングした。hPANL#240、359B2-2-3-6、PXB693、PXB727についてはマウスIgG2a由来の重鎖定常領域を、PXB361bについてはマウスIgG1由来の重鎖定常領域を用いた。
実施例15で作製した5種類のマウスキメラ抗体(PXB361b-mFc、PXB693-mFc、PXB727-mFc、hPANL#240-mFc、359B2-2-3-6-mFc)について、どの2抗体の組み合わせにおいても、抗原であるマウスPlexinA1に競合せずに結合できるか否かを、Octet RED 384 (ForteBIO)を用いて検証した。競合パターンの検証により、5種類のマウスキメラ化抗体をエピトープによってグルーピングすることが可能となる。一般的なエピトープビニングの手法を参照して実施した(mAbs (2012) 5:2, 270-278)。
ヒト細胞におけるセマフォリン3Aタンパク質の作用を評価するために、xCELLigence system(ACEA社)を用いたアッセイを実施した。xCELLigence systemでは専用のプレート底面に配置されたマクロ電極と細胞接着面に生じる電気抵抗値から、形態変化や遊走等を評価できるシステムである。アッセイは、以下の方法により行なった。
実施例2に記載のマウスセマフォリン3A依存性マウス骨髄由来樹状細胞退縮アッセイ系を用いて、作製した抗マウスPlexinA1抗体および抗ヒト/マウスPlexinA1抗体の活性を評価した。具体的には、FBSおよびマウスGM-CSFを含有したRPMI1640培地にてマウス骨髄由来樹状細胞を2×104細胞/wellにて96ウェルプレートに播種し37℃で12~24時間培養した。抗マウスPlexinA1抗体および抗ヒト/マウスPlexinA1抗体、コントロールとして同じアイソタイプの抗KLH抗体およびマウスセマフォリン3Aを10%のFBS含有RPMI1640培地で適切な濃度に希釈し、細胞培養液に添加し37℃で5時間培養した。次に、実施例2に記載の方法によって樹状細胞の細胞形態の退縮を数値化し評価した。結果を図8に示した。抗マウスPlexinA1抗体(PXB693-mFc, PXB727-mFc)および抗ヒト/マウスPlexinA1抗体(359B2-2-3-6-mFc)は、濃度依存的に樹状細胞の退縮を促進し、セマフォリン3Aのシグナルと同様の活性を示すことが確認された。
実施例17に記載のxCELLigence systemによるヒトセマフォリン3A活性測定系を用いて、作製した抗ヒト/マウスPlexinA1抗体の活性を評価した。U87-MG細胞を、xCELLigence system専用plateであるE-plate 96(ACEA社)に1×104細胞/wellの濃度で播き、37℃で12-24時間培養した。抗ヒト/マウスPlexinA1抗体及びコントロールとして同じアイソタイプの抗KLH抗体を5%FBS含有EMEM培地で適切な濃度に希釈し、ウェルに添加して1時間後の各ウェルのCell index値を測定した。結果を図9に示した。抗ヒト/マウスPlexinA1抗体(hPANL#240, 359B2-2-3-6)は、濃度依存的にCell indexを低下させ、セマフォリン3Aのシグナルと同様の活性を示すことが確認された。
マウスPlexinA1 sema domainタンパク質遺伝子は、NCBI Reference Sequence NP_032907.1の配列を基にシグナルペプチド(N末端から24番目のイソロイシンまで)を人工シグナルペプチドHMM+38(配列番号7)に置換し、512番目のセリンの後にFLAGタグ(配列番号5)と終始コドンを付加した配列をコードするよう設計し、遺伝子合成にて作製した。アミノ酸配列を配列番号38に示した。作製した遺伝子は発現ベクターに組み込みInvitrogen社FreeStyle293細胞に導入して発現させ、培養上清からマウスPlexinA1 sema domainタンパク質を抗FLAG M2抗体アフィニティーゲル(Sigma-Aldrich社)を用いたAffinity精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
マウスPlexinA2 sema domainタンパク質遺伝子は、NCBI Reference Sequence NP_032908.2の配列(配列番号53)を基に、シグナルペプチド(N末端から31番目のグリシンまで)を人工シグナルペプチドHMM+38(配列番号7)に置換し、510番目のセリンの後にFLAGタグ(配列番号5)と終始コドンを付加した配列をコードするよう設計し、遺伝子合成にて作製した。アミノ酸配列を配列番号39に示した。作製した遺伝子は発現ベクターに組み込みInvitrogen社FreeStyle293細胞に導入して発現させ、培養上清からマウスPlexinA2 sema domainタンパク質を抗FLAG M2抗体アフィニティーゲル(Sigma-Aldrich社)を用いたAffinity精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
マウスPlexinA1/A2 sema domainキメラタンパク質遺伝子は、NCBI Reference SequenceNP_032907.1の配列を基にシグナルペプチド(N末端から24番目のイソロイシンまで)を人工シグナルペプチドHMM+38(配列番号7)に置換し、マウスPlexinA1 sema domainタンパク質の458番目のイソロイシン以降の配列に、マウスPlexinA2 sema domainタンパク質の459番目のアルギニンから510番目のセリンの配列とFLAGタグ(配列番号5)および終始コドンを付加した配列をコードするよう設計し、遺伝子合成にて作製した。アミノ酸配列を配列番号40に示した。作製した遺伝子は発現ベクターに組み込みInvitrogen社FreeStyle293細胞に導入して発現させ、培養上清からマウスPlexinA1/A2 sema domainタンパク質を抗FLAG M2抗体 アフィニティーゲル(Sigma-Aldrich社)を用いたAffinity精製とゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。
実施例15で作製したマウスキメラ抗体PXB693-mFc(マウスIgG2a)、PXB727-mFc(マウスIgG2a)、PXB361b-mFc(マウスIgG1)、およびそれぞれのアイソタイプのKLH抗体をProtein G固定化磁気ビーズに結合させたのち、実施例20~22で調製したタンパク質溶液と反応させた。反応後磁気ビーズを回収し、4倍希釈した試料用緩衝液(3-メルカプト-1,2-プロパンジオール含有、和光純薬)を添加して加熱処理を行った。3種類のマウスPlexinA1 sema domainタンパク質と、ビーズから遊離したタンパク質をSDS-PAGEで展開し、PVDF膜に転写後iBind Western System (Life Technologies)を用いてアルカリフォスファターゼ標識抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich社)と反応させた後、BCIP-NBT溶液キット(ナカライテスク)を用いて目的タンパク質を検出した。ウェスタンブロットの結果を図10に示す。この結果、アゴニスト抗体(PXB693-mFc,PXB727-mFc)は、PlexinA1のアミノ酸配列のうち、図11の下線部に示す領域を認識することが明らかとなった。この領域は、図12に示したヒトPlexinA1 sema domainの下線部の領域に相当する。下線部におけるヒトPlexinA1 sema domainとマウスPlexinA1 sema domainの相同性は相当高いため、これまでのデータから、本発明の抗ヒトプレキシンA1アゴニスト抗体はヒトプレキシンA1の下線部内に存在するエピトープに結合することでアゴニストとしての作用・効果を発揮していると考えられる。尚、実施例20~22に記載を参照して、ヒトPlexinA1 sema domainリコンビナントタンパク質、ヒトPlexinA2 sema domainリコンビナントタンパク質及びヒトPlexinA1/A2 sema domainキメラタンパク質を作成し、実施例23に記載の方法でhPANL#240、359B2-2-3-6が結合する領域を確認することが出来る。
配列番号2:ヒトセマフォリン3Aリコンビナントタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:ヒトプレキシンA1のアミノ酸配列(NCBI Reference Sequence NP_115618.3)
配列番号4:ヒトプレキシンA1リコンビナントタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:FLAGタグ配列
配列番号6:ヒトプレキシンA1のシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号7:人工シグナルペプチドHMM+38のアミノ酸配列
配列番号8:EBNA1のアミノ酸配列
配列番号9:ヒトマウス交叉性PlexinA1抗体hPANL#240のH鎖のアミノ酸配列
配列番号10:ヒトマウス交叉性PlexinA1抗体hPANL#240のL鎖のアミノ酸配列
配列番号11:ヒトマウス交叉性PlexinA1抗体359B2-2-3-6のH鎖のアミノ酸配列
配列番号12:ヒトマウス交叉性PlexinA1抗体359B2-2-3-6のL鎖のアミノ酸配列
配列番号13:マウスキメラ化ヒトマウス交叉性PlexinA1抗体hPANL#240-mFcのH鎖のアミノ酸配列
配列番号14:マウスキメラ化ヒトマウス交叉性PlexinA1抗体359B2-2-3-6-mFcのH鎖のアミノ酸配列
配列番号15:ヒトプレキシンA1リコンビナントタンパク質のアミノ酸配列
配列番号16:可溶型マウスPlexinA1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号17:ウサギ抗体H鎖定常領域配列
配列番号18:ウサギ抗体L鎖定常領域配列
配列番号19:抗マウスPlexinA1抗体PXB361bのH鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号20:抗マウスPlexinA1抗体PXB361bのL鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号21:hPANL#240のH鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号22:hPANL#240のL鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号23:hPANL#240のH鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号24:hPANL#240のH鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号25:hPANL#240のH鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号26:hPANL#240のL鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号27:hPANL#240のL鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号28:hPANL#240のL鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号29:359B2-2-3-6のH鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号30:359B2-2-3-6のH鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号31:359B2-2-3-6のH鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号32:359B2-2-3-6のL鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号33:359B2-2-3-6のL鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号34:359B2-2-3-6のL鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号35:359B2-2-3-6のH鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号36:359B2-2-3-6のL鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号37:マウスプレキシンA1リコンビナントタンパク質のアミノ酸配列
配列番号38:マウスPlexinA1 sema domainリコンビナントタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:マウスPlexinA2 sema domainリコンビナントタンパク質のアミノ酸配列
配列番号40:マウスPlexinA1/A2 sema domainキメラタンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:抗マウスPlexinA1抗体PXB693のH鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号42:抗マウスPlexinA1抗体PXB693のL鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号43:抗マウスPlexinA1抗体PXB727のH鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号44:抗マウスPlexinA1抗体PXB727のL鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号45:マウスキメラ化抗マウスPlexinA1抗体PXB693のH鎖のアミノ酸配列
配列番号46:マウスキメラ化抗マウスPlexinA1抗体PXB693のL鎖のアミノ酸配列
配列番号47:マウスキメラ化抗マウスPlexinA1抗体PXB727のH鎖のアミノ酸配列
配列番号48:マウスキメラ化抗マウスPlexinA1抗体PXB727のL鎖のアミノ酸配列
配列番号49:マウスキメラ化抗マウスPlexinA1抗体PXB361bのH鎖のアミノ酸配列
配列番号50:マウスキメラ化抗マウスPlexinA1抗体PXB361bのL鎖のアミノ酸配列
配列番号51:Mycタグ配列
配列番号52:マウスPlexinA1のアミノ酸配列(NCBI Reference Sequence NP_032907.1)
配列番号53:マウスPlexinA2のアミノ酸配列(NCBI Reference Sequence NP_032908.2)
Claims (14)
- 以下の群から選択される抗プレキシンA1アゴニスト抗体。
(a)配列番号23、24、25のH鎖CDR1、2、3のアミノ酸配列及び配列番号26、27、28のL鎖CDR1、2、3のアミノ酸配列を含んでなる抗体、
(b)配列番号41のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号42のL鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる抗体、及び、
(c)配列番号43のH鎖可変領域のアミノ酸配列及び配列番号44のL鎖可変領域のアミノ酸配列を含んでなる抗体。 - 3型セマフォリン様の活性を有する、請求項1に記載の抗体。
- 前記3型セマフォリン様の活性がセマフォリン3A様の活性である、請求項2に記載の抗体。
- 前記3型セマフォリン様の活性が樹状細胞の退縮又はグリオーマ細胞の退縮を促進させる活性である、請求項2または3に記載の抗体。
- プレキシンA1のセマドメイン内のエピトープに特異的に結合する、請求項1~4のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記セマドメイン内のエピトープは配列番号3の残基461~514、又は配列番号52の残基459~512の領域内のエピトープである、請求項5に記載の抗体。
- ヒトプレキシンA1及びマウスプレキシンA1に交叉する、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1~7のいずれか一項に記載の抗体。
- キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項1~8のいずれか一項に記載の抗体。
- Fab、scFv、F(ab’)2、一本鎖抗体または二重特異性抗体である、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容される担体を混合する、医薬組成物の製造方法。
- 3型セマフォリンの量的または質的な機能低下が関連する疾患の予防および/または治療に用いられる、請求項11に記載の医薬組成物。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項11若しくは13に記載の医薬組成物と、3型セマフォリンの量的または質的な機能低下が関連する疾患の予防および/または治療を治療するために前記抗体又は医薬組成物を投与するための指示書を含むキット。
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