JP7208262B2 - ポロキサマーを用いてnk-92細胞増殖を最適化する方法 - Google Patents
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-
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Description
本出願は、2018年5月22日に提出された米国特許仮出願第62/674,723号の優先権を主張する。全ての目的に関して、該仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系の主要構成要素を成す細胞傷害性リンパ球である。NK細胞は一般に、循環リンパ球の約10~15%を占め、抗原に関して非特異的にかつ事前の免疫感作なしに、ウイルス感染細胞および多くの悪性細胞を含む標的細胞に結合しかつそれらを死滅させる。Herberman et al., Science 214:24(1981)(非特許文献1)。標的細胞の死滅は細胞溶解を誘導することによって生じる。この目的で用いられるNK細胞は、対象由来の血液の末梢血リンパ球(「PBL」)画分から単離され、十分な数の細胞を得るために細胞培養中で増大され、次いで、対象内に再注入される。NK細胞は、エクスビボ療法およびインビボ処置の両方においてある程度有効であることが示されている。しかしながら、そのような療法は、全てのNK細胞が細胞溶解性ではなく、療法は処置された患者に特有なものであるという事実によって複雑になる。
本明細書において、非イオン性界面活性剤を含む増殖培地を用いて、NK-92(登録商標)細胞を培養する方法が提供され、ここで該NK-92(登録商標)細胞は、該非イオン性界面活性剤を欠く対照培地において培養された対照NK-92(登録商標)細胞と比較して、集塊形成を減少させている。増殖培地は、0.025~0.9%の非イオン性界面活性剤、たとえばポロキサマー188を含む。NK-92(登録商標)細胞は、1つまたは複数のトランスジーンを発現するように改変され得、たとえば、NK-92(登録商標)細胞は、サイトカイン、Fc受容体、キメラ抗原受容体、またはそれらの組み合わせを発現するように改変されることができる。また、本明細書において、NK-92(登録商標)細胞と、0.025%~0.9%の非イオン性界面活性剤を含む培養培地とを含む、NK-92(登録商標)細胞培養物が、提供される。
本明細書において、集塊形成を減少させることができる増殖培地を用いて、NK-92(登録商標)細胞を培養する方法が提供される。いくつかの場合において、NK-92(登録商標)細胞は、増殖培地において培養され、かつ該細胞は、細胞集塊形成を実質的に有さない。増殖培地は、0.025~0.9%の非イオン性界面活性剤、たとえばポロキサマー188を含む。NK-92(登録商標)細胞は、1つまたは複数のトランスジーンを、たとえば、サイトカイン、Fc受容体、キメラ抗原受容体、またはそれらの組み合わせを、発現するように改変され得る。また、本明細書において、NK-92(登録商標)細胞と、0.025%~0.9%の非イオン性界面活性剤を含む培養培地とを含む、NK-92(登録商標)細胞培養物が、提供される。
特に他で定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書において、非イオン性界面活性剤を含む培養培地であって、集塊形成を減少させることができる、または防止することができる培養培地が、提供される。非イオン性界面活性剤は、細胞培養物において剪断力を制御することができる、そしてまた、撹拌される培養物において発泡を減少させるために、および培養容器への細胞の結合を減少させるために、使用されることができる。
NK-92(登録商標)細胞は、多数の増殖培地において培養されることができ、かつそのうちのいくつかは市販されており、たとえば、3H Biomedical(Uppsala, Sweden)からのhuman NK cell culture medium、またはIrvine Scientific(Irvine, CA, USA)からのPrime XV mediumである。集塊形成を最小限にするため、培養物はポロキサマー188を含み得る。任意で、培養培地はまた、サイトカイン、ヒト血清アルブミン、アミノ酸補足物、またはそれらの組み合わせを含む。適したサイトカインは、限定するものではないが、IL-2を含む。説明用の一例において、aNK細胞は、補足物として添加されたアミノ酸とともに、0.05% プルロニックF-68および450 IU/mLのIL-2を含む増殖培地において、培養され得る。別の説明用の例において、haNK(登録商標)細胞は、0.05% プルロニックF-68を含む増殖培地において培養され得る。さらなる別の例において、taNK(登録商標)細胞は、0.05% プルロニックF-68、および500 IU/mLのIL-2を含む増殖培地において培養され得る。さらなる別の例において、t-haNK(登録商標)細胞は、0.05~0.1% プルロニックF-68を含む増殖培地において培養され得る。
本開示はまた、NK-92(登録商標)細胞と、0.025%~0.9%の非イオン性界面活性剤を含む培養培地とを含む、細胞培養物を提供し、ここで該NK-92(登録商標)細胞は、NK-92(登録商標)細胞と、該非イオン性界面活性剤を欠く培地とを含む対照培養物と比較して、集塊形成を減少させている。
本明細書において開示される方法を用いて培養され得るNK-92(登録商標)細胞は、aNK(商標)細胞、haNK(登録商標)細胞、taNK(登録商標)細胞、およびt-haNK(登録商標)細胞を含み、以下においてさらに記述される。
Fc受容体は抗体のFc部分に結合する。いくつかのFc受容体が知られており、それらは、その好ましいリガンド、親和性、発現、および抗体への結合後の効果によって相違する。
本明細書に記載される場合、NK-92(登録商標)細胞は、細胞表面上にキメラ抗原受容体(CAR)を発現するようにさらに操作される。任意で、CARは腫瘍特異的抗原に特異的である。腫瘍特異的抗原は、それらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、US 2013/0189268;WO 1999024566 A1;US 7098008;およびWO 2000020460 A1に、非限定的な例として、記載される。腫瘍特異的抗原には、限定するものではないが、NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19およびCD33が含まれる。さらなる非限定的な腫瘍関連抗原、およびそれに関連する悪性腫瘍は表1に見出すことができる。
NK-92(登録商標)細胞の細胞傷害性は、サイトカイン(例えば、インターロイキン-2 (IL-2))の存在に依存する。商業規模の培養でNK-92(登録商標)細胞を維持しかつ増大させるために必要とされるIL-2を外部から加えて使用するには、かなりのコストがかかる。NK92(登録商標)細胞の活性化を継続するのに十分な量でのヒト対象へのIL-2の投与は有害な副作用を引き起こすおそれがある。
用語「自殺遺伝子」は、細胞の負の選択を可能にするものである。自殺遺伝子は安全システムとして用いられ、該遺伝子を発現する細胞を選択剤の導入によって死滅させることができる。これは、組換え遺伝子が制御不能な細胞増殖につながる突然変異を引き起こす場合に望ましい。いくつかの自殺遺伝子系が同定されており、それらには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌gpt遺伝子、および大腸菌Deo遺伝子が含まれる(さらに、例えば、Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. 2002 July; 26(7):783-9を参照)。本明細書で用いる場合、自殺遺伝子はNK-92(登録商標)細胞において活性がある。典型的には、自殺遺伝子は、細胞に対して悪影響を有さないが、特定の化合物の存在下で細胞を死滅させる、タンパク質をコードする。したがって、自殺遺伝子は典型的には系の一部である。
トランスジーン(例えば、CD19 CARおよびCD16)は、当業者に公知の任意の機序によって発現ベクター内に操作され得る。トランスジーンは同じ発現ベクターまたは異なる発現ベクター内に操作され得る。好ましい態様において、トランスジーンは同じベクター内に操作される。
本明細書において開示される方法および組成物は、以下の例示的な態様を含む。
態様1. 0.025%~0.9%の非イオン性界面活性剤を含む培養培地においてNK-92(登録商標)細胞を培養する段階を含む、NK-92(登録商標)細胞を培養する方法であって、該NK-92(登録商標)細胞培養物が、該非イオン性界面活性剤を欠く対照培地において培養された対照NK-92(登録商標)細胞と比較して、集塊形成を減少させている、前記方法。
態様2. NK-92(登録商標)細胞が、対照NK-92(登録商標)細胞と実質的に同じ細胞傷害性を維持した、態様1の方法。
態様3. 細胞培養物が集塊形成を実質的に有さない、態様1~2のいずれかの方法。
態様4. 細胞が、少なくとも2リットルの培養培地において培養される、態様1~3のいずれかの方法。
態様5. 非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー188である、態様1~4のいずれかの方法。
態様6. 培養培地が、0.025%~0.06%のポロキサマー188を含む、態様1~5のいずれかの方法。
態様7. 培養培地が、0.05%のポロキサマー188を含む、態様1~6のいずれかの方法。
態様8. NK-92(登録商標)細胞培養物が、対照細胞培養物と比較して、細胞凝集体を減少させている、態様1~7のいずれかの方法。
態様9. 細胞凝集体の減少のパーセンテージが、少なくとも40%である、態様1~8のいずれかの方法。
態様10. NK-92(登録商標)細胞培養物が、3日間の培養後に6%未満の細胞凝集体を有する、態様1~9のいずれかの方法。
態様11. NK-92(登録商標)細胞が、少なくとも80%の生存率を有する、態様1~10のいずれかの方法。
態様12. NK-92(登録商標)細胞が、サイトカイン、Fc受容体、キメラ抗原受容体、またはそれらの組み合わせを含む、態様1~11のいずれかの方法。
態様13. 0.025%~0.9%の非イオン性界面活性剤を培養培地に添加する段階を含む、該培養培地において凝集物を減少させる方法であって、該培養培地が、該非イオン性界面活性剤を欠く対照培養物と比較して、凝集物を減少させている、前記方法。
態様14. NK-92(登録商標)細胞と、0.025%~0.9%の非イオン性界面活性剤を含む培養培地とを含む、細胞培養物であって、該細胞培養物が、NK-92細胞と、該非イオン性界面活性剤を欠く培地とを含む対照培養物と比較して、集塊形成を減少させている、細胞培養物。
態様15. NK-92(登録商標)細胞が、少なくとも3日間培養されている、態様14の細胞培養物。
態様16. 細胞培養物が集塊形成を実質的に有さない、態様14~15のいずれかの細胞培養物。
態様17. NK-92(登録商標)細胞が、対照培養物におけるNK-92細胞と実質的に同じ細胞傷害性を維持した、態様14~16のいずれかの細胞培養物。
態様18. 非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー188である、態様14~17のいずれかの細胞培養物。
態様19. 0.025%~0.06%のポロキサマー188を含む、態様14~18のいずれかの細胞培養物。
態様20. 0.05%のポロキサマー188を含む、態様14~19のいずれかの細胞培養物。
態様21. NK-92(登録商標)細胞が、サイトカイン、Fc受容体、キメラ抗原受容体、またはそれらの組み合わせを含む、態様14~20のいずれかの細胞培養物。
態様22. 少なくとも2リットルの体積を有する、態様14~21のいずれかの細胞培養物。
態様23. 少なくとも10リットルの体積を有する、態様14~22のいずれかの細胞培養物。
参照用の1つの試験において、G-RexフラスコからのhaNK(登録商標)細胞を2つの別々の2リットルWAVEバッグ中に接種した(すなわち、細胞ロット番号D0917C186、および細胞ロット番号D0917C187)。両方のWAVEバッグからの細胞を2日後に組み合わせて、20リットルWAVEバッグ(10Lの作業容量)に播種した。1日後、白い沈殿、および凝集物が、20リットルWAVEバッグD1217C197において観察され(図10)、そして細胞の生存率は50%未満であった。D1217C199は、培養物が20リットル培養物に増大された際に、バックアップ培養物として用いるために、同時にセットアップされた;沈殿および凝集物もまた観察された、そして細胞生存率は90%未満であった。図1を参照されたい。これは、プロセスがスケーラブルではないこと、および増大をその後終了させたことを示す。
類似の実験が、aNK(商標)細胞培養物を用いて実施された。参照用の1つの試験において、G-RexフラスコからのaNK(商標)細胞を第0日に2つの別々の2リットルWAVEバッグに接種した。両方のWAVEからの細胞を組み合わせて、20リットルWAVEバッグ(10Lの作業容量)、および10リットルWAVEバッグ(5Lの作業容量)に播種した。20リットルバッグからの細胞は、細胞培養物において集塊形成していたものの、第3日に、連続遠心分離によって採取された。白い沈殿、および凝集物が、3日後に、20リットルWAVEバッグにおいて観察された。10リットルWAVE培養物は、より大量の沈殿物、および約75%という低い細胞生存率のために、停止させた。図4を参照されたい。
プルロニックF-68の存在下で、20リットルWAVEバッグにおいて培養されたhaNK細胞の試料(ロット番号E1217C313)は、抗体依存性細胞傷害(ADCC)に関して試験された。プルロニックF-68で処理されていない、増大の前のフラスコからの参照試料もまた、同時に試験された。試料、または参照試料は、リツキサン抗体の存在下で、カルセインがロードされた、標的細胞であるRamos細胞と、10:1のエフェクター:標的比で混合された。カルセイン放出は、3時間のインキュベーション後に、蛍光プレートリーダーによって測定された。細胞傷害性は、カルセイン放出のパーセンテージとして表された。各試料は3連で試験された、そして結果は表3に示される。
この実施例は、集塊形成を防止するために必要なプルロニックF-68の最小有効濃度を同定するために実施された試験を記述する。プルロニックF-68は、WAVEバイオリアクターにおけるhaNK細胞培養物へと、それぞれ0%、0.0125%、0.025%、および0.05%の濃度で添加された。集塊形成は、プルロニックF-68無しであるか、または0.125% プルロニックF-68を有する培養物において、観察された。集塊形成はまた、0.025% プルロニックF-68を有する培養物において、減少した量ではあったが、依然として存在した。注目すべきことに、集塊形成および濁りは、0.05% プルロニックF-68の添加によって完全に防止された。図7を参照されたい。濁った外観のため、WAVE培養物のうちの2つ(0%、および0.0125% プルロニックF-68)は終了させた、一方で、他の2つの培養物は、別々の10 Lバッグにおいて、さらに5日間増大させた。細胞はNC-200セルカウンターを用いて分析された、そして細胞凝集体のパーセンテージは表4に示される。
プルロニックF-68の非存在下または存在下でWAVEバイオリアクターにおいて増大されたhaNK(登録商標)細胞は、それらの健全性および生存率に関して、NC-200セルカウンターを用いて評価された。図8Aに示されるように、複数のピークが、プルロニックF-68を有さない培養物からのアクリジンオレンジプロットにおいて現れた、これは、培養物が不健全であったことを示す。細胞生存率は70.2%であった、そして5個以上の細胞を有する凝集体中にあった細胞は、試料における全細胞の17%を占める。対照的に、0.05% プルロニックF-68を含む培養物においては、単一のピークのみが観察された、これは、細胞が健全であったことを示す。加えて、5個以上の細胞を有する凝集体中の、細胞のパーセンテージが、わずか2%であったことによって示されるように、細胞生存率は94.9%にまで増加し、そして細胞は、集塊形成を実質的に有さなかった(図8B)。プルロニックF-68の添加は、集塊形成を88%減少させた。
Claims (21)
- 0.025%~0.9%のポロキサマー188を含む培養培地においてNK-92細胞を培養する段階を含む、NK-92細胞を培養する方法であって、該NK-92細胞培養物が、該ポロキサマー188を欠く対照培地において培養された対照NK-92細胞と比較して、集塊形成を減少させている、前記方法。
- NK-92細胞が、対照NK-92細胞と同じ細胞傷害性を維持した、請求項1に記載の方法。
- 細胞培養物が集塊形成を有さない、請求項1に記載の方法。
- 細胞が、少なくとも2リットルの培養培地において培養される、請求項1に記載の方法。
- 培養培地が、0.025%~0.06%のポロキサマー188を含む、請求項1に記載の方法。
- 培養培地が、0.05%のポロキサマー188を含む、請求項1に記載の方法。
- NK-92細胞培養物が、対照細胞培養物と比較して、細胞凝集体を減少させている、請求項1に記載の方法。
- 細胞凝集体の減少のパーセンテージが、少なくとも40%である、請求項7に記載の方法。
- NK-92細胞培養物が、3日間の培養後に6%未満の細胞凝集体を有する、請求項7に記載の方法。
- NK-92細胞が、少なくとも80%の生存率を有する、請求項1に記載の方法。
- NK-92細胞が、サイトカイン、Fc受容体、キメラ抗原受容体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 0.025%~0.9%のポロキサマー188を、NK-92細胞を培養する培養培地に添加する段階を含む、該培養培地において凝集物を減少させる方法であって、該培養培地が、該ポロキサマー188を欠く対照培養物と比較して、凝集物を減少させている、前記方法。
- NK-92細胞と、0.025%~0.9%のポロキサマー188を含む培養培地とを含む、細胞培養物であって、該細胞培養物が、NK-92細胞と、該ポロキサマー188を欠く培地とを含む対照培養物と比較して、集塊形成を減少させている、細胞培養物。
- NK-92細胞が、少なくとも3日間培養されている、請求項13に記載の細胞培養物。
- 細胞培養物が集塊形成を有さない、請求項13に記載の細胞培養物。
- NK-92細胞が、対照培養物におけるNK-92細胞と同じ細胞傷害性を維持した、請求項13に記載の細胞培養物。
- 0.025%~0.06%のポロキサマー188を含む、請求項13に記載の細胞培養物。
- 0.05%のポロキサマー188を含む、請求項13に記載の細胞培養物。
- NK-92細胞が、サイトカイン、Fc受容体、キメラ抗原受容体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項13に記載の細胞培養物。
- 少なくとも2リットルの体積を有する、請求項13に記載の細胞培養物。
- 少なくとも10リットルの体積を有する、請求項20に記載の細胞培養物。
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