CN112166184A - 使用泊洛沙姆优化nk-92细胞的生长 - Google Patents
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Abstract
本文提供了使用含有非离子表面活性剂的生长培养基培养
细胞的方法，从而使细胞培养物相比于已在不含非离子表面活性剂的对照培养基中培养的对照
Description
相关申请
本申请要求于2018年5月22日提交的美国临时申请号62/674,723的优先权。出于所有目的，通过引用将该分案申请的全部内容并入本文。
背景技术
天然杀伤细胞(NK)是细胞毒性淋巴细胞，其构成先天免疫系统的主要组成部分。通常代表约10-15％的循环淋巴细胞的NK细胞结合并杀死包括被病毒感染的细胞和许多恶性细胞在内的靶细胞，对抗原而言非特异性地且无需预先免疫致敏。Herberman等，Science214:24(1981)。通过诱导细胞裂解来杀死靶细胞。用于该目的NK细胞从受试者的血液的外周血淋巴细胞(“PBL”)级分中分离出，在细胞培养中扩增以获得足够数量的细胞，然后将其重新注入受试者中。NK细胞在体外疗法和体内疗法中都显示出了一定的疗效。然而，由于并非所有的NK细胞都具有细胞溶解作用，并且这样的疗法对所治疗的患者具有特异性，因此这样的疗法变得复杂。
尽管
细胞具有巨大的治疗潜力，但大规模生长的
细胞一直是限制了这些细胞的治疗应用的一个挑战。特别是，扩增通常伴随着培养物的沉淀物和絮凝物的显著增加，这种现象通常被称为“结块”。这些大尺寸的沉淀物会导致许多不良后果，包括缓慢的细胞生长、低细胞存活率和不正确的细胞计数，从而可能导致错误的剂量配方。细胞培养物中的结块也可能导致离心中细胞床的紊乱，从而导致细胞收获过程中的低细胞回收率和不一致的对肿瘤靶细胞的细胞毒性。
发明内容
本文提供了使用含有非离子型表面活性剂的生长培养基培养
细胞的方法，其中
细胞培养物相比于已在不含非离子表面活性剂的对照培养基中培养的对照
细胞具有减少的结块。生长培养基包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂，例如泊洛沙姆188。可修饰
细胞以使其表达一种或多种转基因，例如，可修饰
细胞以使其表达细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。本文还提供了细胞培养物，其包含
细胞和包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基。
本文提供了一种培养
细胞的方法，其包括在包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基中培养所述
细胞，其中
细胞培养物相比于已在不含所述非离子表面活性剂的对照培养基中培养的对照
细胞具有减少的结块。任选地，所述
细胞维持了与所述对照
细胞基本相同的细胞毒性。另外，所述细胞培养物在含非离子表面活性剂泊洛沙姆188时基本不结块。任选地，在肉眼能够观察到添加剂的视觉益处之前，将所述细胞在至少2升的培养基中培养。
用于培养
细胞的培养基可包含0.025％至0.06％的泊洛沙姆188，例如0.05％的泊洛沙姆188。任选地，所述
细胞培养物与对照细胞培养物相比具有减少的细胞聚集体。在一些情况下，所述细胞聚集体的百分比的减少为至少40％。任选地，所述
细胞培养物在培养3天后具有少于6％的细胞聚集体。
通过使用本文公开的方法培养的
细胞可具有至少80％的存活率。它们可维持与对照培养物中的
细胞基本相同的细胞毒性。
细胞可包含细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
本文还提供了一种减少培养基中的絮凝物的方法，所述方法包括向所述培养基中添加0.025％至0.9％的非离子表面活性剂，其中所述培养基与不含所述非离子表面活性剂的对照培养物相比具有减少的絮凝物。
本文还提供了一种细胞培养物，其包含
细胞和包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基，其中所述细胞培养物与对照培养物相比具有减少的结块，所述对照培养物包含
细胞和不含非离子表面活性剂的培养基。在一些情况下，所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。任选地，所述
细胞已被培养了至少3天。任选地，所述细胞培养物基本没有结块。任选地，所述
细胞维持了与所述对照培养物中的NK-92细胞基本相同的细胞毒性。任选地，权利要求14所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含0.025％至0.06％的泊洛沙姆188。所述
细胞可包含细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。任选地，所述细胞培养物的体积为至少2升，例如为至少10升。
上文的概述和下文的详述是示例性和说明性的，并且旨在提供对本发明公开内容的进一步说明。本发明的其他的目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
附图说明
通过结合附图并参照以下公开内容将更容易地理解本发明的目的、特征和优点。
图1显示了在不存在泊洛沙姆188(普兰尼克F-68(Pluronic F-68))的情况下在WAVE生物反应器中扩增
细胞的第一示意图。观察到了结块和低细胞存活率。
图2显示了在不存在泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的情况下在WAVE生物反应器中扩增
细胞的第二示意图和结果。观察到了结块和低细胞存活率。
图3显示了在存在0.05％的泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的情况下在WAVE生物反应器中扩增
细胞的示意图。所述培养物没有结块。
图4显示了在不存在泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的情况下在WAVE生物反应器中扩增aNKTM细胞的第一示意图。观察到了结块。
图5显示了在不存在泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的情况下在WAVE生物反应器中扩增aNKTM细胞的第二示意图。观察到了结块。
图6显示了在存在0.05％泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的情况下在WAVE生物反应器中扩增aNKTM细胞的示意图。培养物没有结块。
图7显示了在不存在或存在多种滴定的泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)的情况下在WAVE生物反应器中扩增
细胞的示意图。
培养物中的结块随着泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)浓度的增加而减少。
图8A和8B显示了在不存在泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)(图8A)和存在0.05％的泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)(图8B)的情况下来自WAVE生物反应器的
细胞的NC-200图谱。
图9A和9B显示了在不存在泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)(图9A)和存在0.05％的泊洛沙姆188(普兰尼克F-68)(图9B)的情况下，来自WAVE生物反应器的aNKTM细胞的NC-200图谱。
图10显示了在不存在泊洛沙姆188的情况下在WAVE袋中生长的
细胞的图片，在其中观察到了结块。
具体实施方式
本文提供了使用可减少结块的生长培养基培养
细胞的方法。在一些情况下，在生长培养基中培养
细胞，并且细胞基本没有细胞团块。生长培养基包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂，例如泊洛沙姆188。可修饰
细胞以使其表达一种或多种转基因，例如细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。本文还提供了
细胞培养物，其包含
细胞和包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基。
术语
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的意思相同的含义。
在本说明书和随后的权利要求书中，将引用许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
本文所使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而无意于进行任何限制。除非上下文另外明确指出，本文所使用的单数形式“一个/一种(a/an)”，“所述”也意图包括复数形式。因此，例如，对“天然杀伤细胞”的引用包括多个天然杀伤细胞。
所有数字标识，例如pH值、温度、时间、浓度、含量和分子量，包括范围，均为近似值，在适当情况下以0.1或1.0为增量进行(+)或(-)的变化。将被理解的是，尽管并没有总是被明确指出，但是所有数字标识之前都可以有术语“约”。本公开中的所有浓度是体积/体积浓度。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地识别为充分描述，并且可以将相同范围分解为至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地被分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解的是，所有语言，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等，均包括所列举的数字，并且指代可随后被细分为上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，所述范围包括每个单独的成分。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，依此类推。
还将被理解的是，尽管并没有总是被明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情况能或不能发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及所述事件或情况没有发生的实例。
为了本发明的目的，除非另有说明，术语
或“NK92”旨在表示原始的
细胞系和
细胞系，
细胞的
和已经修饰的
细胞(例如，通过对外源基因的引入)。美国专利号7,618,817、8,034,332、8,313,943、9,181,322、9,150,636和公开的美国申请号10/008955描述了
细胞及其示例性和非限制性的修饰，其全部内容通过引用并入本文，包括野生型
-CD16、
-CD16-γ、
-CD16-ζ、
-CD16(F176V)、
MI和
CI。
细胞是本领域普通技术人员已知的，本领域技术人员可从NantKwest公司容易地获得此类细胞。
如本文所用，术语“aNKTM细胞”是指亲代
细胞。aNKTM细胞的生长依赖于IL-2。
如本文所用，术语“细胞”是指已经工程化以表达Fc受体的
细胞。
如本文所用，术语“
细胞”是指已经工程化以表达对癌特异性抗原、癌相关抗原或肿瘤特异性抗原具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)的
细胞。在一些实施方式中，肿瘤特异性抗原是HER-2，例如人HER-2，并且这些
细胞在本公开中被称为HER2.
细胞。
术语“Fc受体”是指在某些细胞(例如自然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质，其通过结合至被称为Fc区的抗体的一部分而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的Fc区与细胞的Fc受体(FcR)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)来刺激细胞的吞噬或细胞毒性活性。根据FcR识别的抗体类型对FcR进行分类。例如，Fc-γ受体(FcγR)与IgG类抗体结合。FcγRIII-A(也被称为CD16)是与IgG抗体结合并激活ADCC的低亲和力Fc受体。FcγRIII-A通常在NK细胞上被发现。
细胞不表达FcγRIII-A。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达，以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对在感兴趣的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，将表达CAR的
细胞靶向至细胞表面表达某些抗原的细胞。可以工程化scFv结构域以使其识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后修饰核苷酸结构。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可在聚合后被进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子两者。除非另有说明或要求，否则多核苷酸既包括双链形式和已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个两者。
如本文所用，术语“表达”是指基因产物的产生。术语“瞬时”当指向表达时，其意为未将多核苷酸引入所述细胞的基因组中。
术语“细胞因子(cytokine/cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白细胞介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。在优选的实施方式中，细胞因子为IL-2。
如本文所用，术语“结块”是指肉眼可见的细胞结块的存在。细胞结块的直径通常为1-15厘米，例如2-10厘米、2-8厘米、1-3厘米、2-6厘米或6-8厘米。图10显示了肉眼可见的细胞结块的说明性实例。一般而言，细胞培养物的结块程度随着所述细胞培养物体积的增加而增加，这通常发生在扩增过程中。
如本文所用，术语“减少的结块”或“减少的细胞结块”是指细胞培养物中的细胞结块的数目、大小或两者都减少的现象。例如，细胞培养物中的细胞结块数目可与使用提供的方法的对照细胞培养物相比减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
术语“基本没有结块”是指肉眼看不到细胞结块的培养条件。
如本文所用，术语“细胞聚集体”是指细胞培养物中五个或更多个细胞的聚集体。细胞聚集体通常在肉眼下不可见，但是可以借助诸如显微镜的装置来观察。细胞聚集体的减少是指所述细胞培养物中细胞聚集体数目与对照细胞培养物相比至少40％的减少。任选地，提供的方法导致了所述细胞培养物中细胞聚集体数目与对照细胞培养物相比至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的减少。
如本文所用，术语“絮凝物”是指在不存在细胞的情况下培养基成分的聚集。絮凝物通常也是肉眼可见的，并且其直径通常可以为0.01-1厘米(例如0.02-0.8厘米)、0.05-0.5厘米(例如0.1-0.5厘米)。
如本文所用，术语“减少的絮凝物”是指所述培养基中的絮凝物的数量、大小或两者都减少的现象。例如，所述培养基中的絮凝物数量可与使用提供的方法的对照细胞培养物相比减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
如本文所用，术语“基本相同的细胞毒性”是指从细胞毒性测定得到的两次测量之间的差异不超过15％、不超过10％、不超过8％或不超过5％。
如本文所用，术语“细胞毒性”在被用于描述效应细胞(例如NK细胞)的活性时，涉及通过多种生物、生化或生物物理机制中的任一种杀死靶细胞。
培养基
本文提供的是一种包含可以减少或防止结块的非离子表面活性剂的培养基。所述非离子表面活性剂可以控制细胞培养物中的切应力，也可以用于减少搅拌培养物中的泡沫并减少细胞对培养容器的附着。
合适的非离子表面活性剂包括泊洛沙姆。泊洛沙姆是由一个聚氧丙烯的中心疏水链与两个与其侧接的聚氧乙烯的亲水链而组成的非离子型三嵌段共聚物。泊洛沙姆也以商品名synperonic、普兰尼克(pluronic)和kolliphor闻名。可从Sigma-Aldrich或ThermoFisher Scientific购得泊洛沙姆188溶液。当从Thermo Fisher Scientific获得时，泊洛沙姆188被称为普兰尼克F-68(Pluronic F-68)。泊洛沙姆188通常以10％的浓度商业提供。
所述非离子表面活性剂，例如泊洛沙姆188，可以0.025至0.9％(例如0.025至0.06％)、0.04至0.06％或0.03至0.05％的含量存在。优选地，所述非离子表面活性剂以0.05％存在。
为了从
细胞生产足够量的生物产物，需要将细胞培养物按比例放大至相对大的体积，例如，所述细胞培养物的体积可以为至少2升、至少3升、至少4升或至少5升。在一些情况下，
细胞可在适合用于生物反应器的大体积培养容器中生长。如前所述，大体积的细胞培养通常伴随着细胞培养物中结块的显著增加，即细胞沉淀和聚集。在没有泊洛沙姆188的情况下，当在20升的WAVE袋中按比例放大2升的WAVE袋培养物时，沉淀会在24小时内形成(如实施例1和表1所示)。令人惊奇的是，将泊洛沙姆188添加到细胞培养物中，包括大体积的培养物中，可以大大减少细胞培养中的结块。向
细胞培养物中添加泊洛沙姆188不会对细胞生长、细胞存活率、表型、细胞毒性和ADCC活性产生不利影响。因此，本公开还提供了一种培养
细胞的方法，其包括在包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基中培养所述
细胞，其中
细胞培相比于已在不含非离子表面活性剂的对照培养基中培养的对照
细胞具有减少的结块，并且
细胞具有与对照
细胞基本相同的细胞毒性。
本申请的发明人还观察到，即使在不存在细胞的情况下，细胞培养基也可以形成肉眼可见的絮凝物。这些絮凝物的直径通常为0.01-1厘米(例如0.02-0.8厘米)、0.05-0.5厘米(例如0.1-0.5厘米)，并且，向培养基中引入0.025％至0.9％的泊洛沙姆188可以减少培养基中絮凝物的数量。
培养
细胞的方法
如上所述，将非离子表面活性剂添加至生长培养基可以减少结块。任选地，将非离子表面活性剂添加至生长培养可以减少至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少88％、至少90％或至少95％的结块。
在细胞培养物中使用所非离子表面活性剂，例如泊洛沙姆188，还可以减少NK-92细胞聚集体至与不含非离子表面活性剂的对照细胞培养物相比显著的程度。在一些情况下，它可能会使培养物中细胞聚集体的百分比减少至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些情况下，在含有泊洛沙姆188的培养基中生长的NK-92细胞在至少1升的培养体积中生长一个生长期后，其细胞聚集体可能少于15％、少于10％、少于7％、少于6％。在一些情况下，生长期为1-7天，例如2天、3天、5天或7天。
为了扩增
细胞培养物，通常将小瓶解冻并将其培养在标准细胞培养容器(例如T75培养瓶)中，直到细胞恢复。然后将细胞转移到具有更大体积的容器(例如通常小于0.45升的G-Rex培养瓶)中以扩增细胞数量。然后将扩增的细胞转移至更大的容器(例如WAVE细胞培养袋)中。可以使用泵或重力进料进行细胞的转移。
任选地，通过使用被无菌地连接到扩增过程结束的培养容器的连续离心机来收集如此产生的
细胞。可收集细胞并将细胞用于多种应用中。
可以通过本领域众所周知的方法，例如使用Klingemann等(CancerImmunol.Immunother.33:395-397(1991))描述的步骤的51Cr释放测定法(Gong等，Leukemia,Apr；8(4):652-658(1994))，来评估产生的
细胞的细胞毒性，其靶向和杀死异常细胞(例如病毒感染和致瘤细胞)的能力。可以基于释放的51Cr量，计算比细胞毒性(specific cytotoxicity)的百分比。参见美国专利号US20020068044。
或者，可以使用钙黄绿素释放测定法评估所述产生的
细胞的直接细胞毒性。例如，可以将
细胞(在测定法中被称为效应子)与钙黄绿素负载的靶细胞(在测定法中被称为靶标)混合。孵育一段时间后，可以例如通过荧光板读数器评估从靶细胞释放的钙黄绿素。测定中使用的效应子与靶标比率可以变化，任选地，效应子与靶标比率可以为20：1、15：1、10：1、8：1或5：1；优选地，效应子：靶标比率为10：1。已在包含泊洛沙姆188(例如浓度在0.025％至0.9％之间)的培养基中生长的
细胞维持了与已在除存在泊洛沙姆188之外其他相同的培养基中生长的
细胞相当的细胞毒性。靶细胞可以是表达可被
细胞识别的MHC分子的任何细胞，例如K562细胞。
可以评估
细胞(例如
细胞)的抗体依赖的细胞毒性。测量
细胞的ADCC的方法与上述测量直接细胞毒性的方法类似，不同之处在于，添加了可以识别靶细胞的抗体。所述NK细胞的Fc受体识别与细胞结合的抗体，并触发溶细胞反应并杀死所述靶细胞。在一个说明性实例中，可以将细胞与Rituxan(种抗体)和Ramos(靶细胞)一起孵育，并且，如上所述，可以通过释放靶细胞的内部组分(例如51Cr或钙黄绿素)来测量Ramos细胞的杀死。
已在包含0.025％-0.9％的非离子表面活性剂(例如泊洛沙姆188)的培养基中生长的
细胞可以显示出与已在不含所述非离子表面活性剂的培养基中生长的
细胞基本相同的细胞毒性。
已在包含0.025％-0.9％的非离子表面活性剂(例如泊洛沙姆188)的培养基中生长的
细胞通常具有出色的存活率，例如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的存活率。可以使用本领域众所周知的方法(例如基于台盼蓝的染色方法或NC-200细胞计数器)来确定所述
细胞的存活率。
细胞培养物
本公开还提供了一种细胞培养物，其包含
细胞和包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基，其中
细胞与对照培养物相比具有减少的结块，对照培养物包含
细胞和不含非离子表面活性剂的培养基。
任选地，细胞培养物与不含非离子表面活性剂的对照细胞培养物相比可具有减少的结块，且减少量为至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少88％、至少90％或至少95％。
任选地，
细胞已在培养基中被培养了至少3天、至少5天、至少7天或至少10天。任选地，细胞培养物的体积为至少2升、至少5升、至少10升、至少15升、例如25升。任选地，所述
细胞培养物基本没有结块。
任选地，非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。任选地，细胞培养物包含0.025％至0.9％(例如0.03％至0.8％)或0.04％至0.6％的泊洛沙姆188；优选地，存在0.05％的所述泊洛沙姆188。
可使用本文公开的方法培养的
细胞包括aNKTM细胞、
细胞、
细胞和
细胞，下面将对其进行进一步的描述。
发现
细胞系表现出CD56bright，CD2，CD7，CD11a，CD28，CD45和CD54表面标志物。此外，它不显示CD1，CD3，CD4，CD5，CD8，CD10，CD14，CD16，CD19，CD20，CD23和CD34标志物。
细胞在培养中的生长取决于重组白细胞介素2(rIL-2)的存在，低至1IU/mL的剂量足以维持增殖。IL-7和IL-12不支持长期生长，其他测试的细胞因子(包括IL-1α、IL-6、肿瘤坏死因子α、干扰素α和干扰素γ)也不支持长期生长。
甚至在低效应子/靶标(E：T)比率1：1的情况下仍具有很高的细胞毒性。Gong等，同上。
细胞被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)中，其名称为CRL-2407。
迄今为止，对内源性NK细胞的研究表明，IL-2(1000IU/mL)对于运输过程中NK细胞的激活至关重要，但是不必将细胞维持在37℃和5％的二氧化碳中。Koepsell等，Transfusion 53：398-403(2013)。
修饰的
细胞是已知的，包括但不限于，例如在美国专利号7,618,817、8,034,332和8,313,943，美国专利申请公开号2013/0040386中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文，例如野生型
-CD16、
-CD16-γ、
-CD16-ζ、
-CD16(F157V)、
mi和
ci。
尽管
细胞保留了几乎所有与NK细胞相关的激活性受体和溶细胞途径，但它们在它们的细胞表面上不表达CD16。CD16是一种Fc受体，可识别并结合抗体的Fc部分以激活NK细胞以产生抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。由于缺少CD16受体，
细胞无法通过ADCC机制裂解靶细胞，因此无法增强内源或外源抗体(即利妥昔单抗和赫赛汀)的抗肿瘤作用。
对内源性NK细胞的研究表明，IL-2(1000 IU/mL)对于运输过程中NK细胞的激活至关重要，但是不必将细胞维持在37℃和5％的二氧化碳中。Koepsell等，Transfusion 53：398-403(2013)。但是，内源性NK细胞与
细胞有显著差异，很大程度上是因为它们的来源不同：
是癌症衍生的细胞系，而内源性NK细胞是从供体(或所述患者)中收获的并进行处理以注入患者体内。内源性NK细胞制备是异源细胞群，而
细胞是同质克隆细胞系。
细胞易于在培养物中增殖，同时保持细胞毒性，而内源性NK细胞则不然。另外，内源性NK细胞异质群体不会以高密度聚集。此外，内源性NK细胞表达Fc受体，包括
细胞不表达的CD-16受体。
Fc受体
Fc受体结合抗体的Fc部分。几种Fc受体是已知的，并且根据它们优选的配体、亲和力、表达和与抗体结合后的作用而不同。
表1.说明性Fc受体
在一些实施方式中，修饰
细胞以在细胞表面上表达Fc受体蛋白。
在一些实施方式中，Fc受体是人CD16。在SEQ ID NO：2中显示编码CD16的代表性氨基酸序列。在SEQ ID NO：1中显示编码CD16的代表性多核苷酸序列。可以在SwissProt数据库中找到CD16的完整序列，其在所述数据库中的收录号为P08637。在一些实施方式中，通过引入编码CD16多肽的多核苷酸来修饰
细胞，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包含信号肽)的天然存在的CD16的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性，所述天然存在的CD16在全长CD16的第176位具有苯丙氨酸。在一些实施方式中，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)的天然存在的CD16的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性，所述天然存在的CD16在第176位具有缬氨酸。
同源多核苷酸序列包括那些编码多肽序列的序列，所述多肽序列编码CD16变体。在一些实施方式中，同源CD16多核苷酸的长度可以是约150至约700、约750或约800个多核苷酸，尽管具有多于700至800个多核苷酸的CD16变体在本公开的范围内。
在其他实例中，具有改变CD16氨基酸序列的多态性的cDNA序列被用于修饰
细胞，例如，在CD16基因中表现出基因多态性的个体之间的等位基因变异。在其他实例中，来自具有与人CD16的序列不同的多核苷酸序列的其他物种的CD16基因被用于修饰
细胞。
在实例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行位点定点诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。
只要人CD16多肽的氨基酸序列中的保守置换(其中一种类别的一个氨基酸被相同类别的另一个氨基酸替代)没有实质性地改变所述多肽的活性，该保守置换就落入所公开的CD16变体的范围内。保守置换是本领域技术人员众所周知的。影响(1)多肽主链结构(例如β-折叠或α-螺旋构象)，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点的侧链的大部分的非保守置换可以修饰CD16多肽的功能或免疫学特性。非保守置换需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将置换引入保守置换位点或更优选地引入非保守位点。
在一些实施方式中，CD16多肽变体的长度为至少200个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施方式中，CD16多肽变体的长度为至少225个氨基酸，并且与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。
在一些实施方式中，编码CD16多肽的核酸可以编码CD16融合蛋白。CD16融合多肽包括与非CD16多肽融合的CD16的任何部分或整个CD16。在一些实施方式中，可以产生融合多肽，其中异源多肽序列与CD16的C末端融合或位于CD16的内部。通常，至多约30％的CD16胞质结构域可被替换。这样的修饰可增强表达或增强细胞毒性(例如ADCC响应性)。在其他实例中，嵌合蛋白，例如来自其他淋巴细胞激活性受体的结构域(包括但不限于Ig-a、Ig-B、CD3-e、CD3-d、DAP-12和DAP-10)，替换了CD16胞质结构域的一部分。
可以通过常规技术合成融合基因，所述常规技术包括自动化的DNA合成仪和使用锚定引物的PCR扩增，所述所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，随后可以对所述互补的突出端进行退火和重新扩增以生成嵌合基因序列(Ausubel，2002)。许多载体是可商购的，所述载体有助于将CD16框内亚克隆到融合部分。
嵌合抗原受体
如本文所述，将
细胞进一步工程化以在细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。任选地，CAR对肿瘤特异性抗原具有特异性。通过U.S.2013/0189268、WO 1999024566A1、U.S.7,098,008和WO 2000020460 A1中的非限制性实例描述了肿瘤特异性抗原，其各自的全部内容通过引用并入本文。肿瘤特异性抗原包括但不限于NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19和CD33。可在表1中找到其他与非限制性的肿瘤相关抗原和与之相关的恶性肿瘤。
表1：肿瘤特异性抗原和相关的恶性肿瘤
在一些实施方式中，CAR靶向CD19、CD33或CSPG-4。
在实例中，使用本领域已知的方法(例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变)来制备变体多肽。可以在克隆的DNA上进行位点定点诱变(Carter，1986；Zoller和Smith，1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等，1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel，2002；Sambrook和Russell，2001)。
任选地，所述CAR靶向与特定癌症类型相关的抗原。任选地，所述癌症选自白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞白血病(包括髓母细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红血球性白血病))和慢性白血病(例如慢性粒细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤(例如霍奇金病和非霍奇金病)，多发性骨髓瘤，沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)，重链疾病，实体瘤(包括但不限于肉瘤和癌瘤(例如纤维肉瘤、粘肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑血管瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
在一些实施方式中，使编码CAR的多核苷酸突变以改变编码CAR的氨基酸序列，而不改变CAR的功能。例如，可以在以上公开的CAR中进行导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换的多核苷酸置换。可以如例如专利公开号WO 2014039523、US 20140242701、US20140274909、US 20130280285和WO 2014099671中工程化CAR，其各自的全部内容通过引用并入本文。任选地，所述CAR是CD19 CAR、CD33 CAR或CSPG-4CAR。
其他修饰-细胞因子
在一些实施方式中，将表达FcR的
细胞进一步修饰以表达至少一种细胞因子和自杀基因。在特定的实施方式中，至少一种细胞因子是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在优选的实施方式中，细胞因子是人IL-2。在SEQ ID NO：3中显示代表性的编码IL-2的核酸，以及在SEQ ID NO：4中显示IL-2的代表性多肽。在一些实施方式中，所述IL-2是靶向内质网的变体。
在一个实施方式中，表达IL-2含有将IL-2引导至所述内质网的信号序列。虽然不受理论束缚，但是将IL-2引导至内质网允许IL-2以足以自分泌激活的水平表达，但不会在细胞外释放IL-2。参见Konstantinidis等，“Targeting IL-2 to the endoplasmicreticulum confines autocrine growth stimulation to 
cells”Exp.Hematol.2005 Feb；33(2):159-64。可以(例如通过自杀基因的存在)阻止表达FcR的
细胞的持续激活。
其他修饰-自杀基因
术语“自杀基因”是允许对细胞的阴性选择的基因。自杀基因被用作安全系统，其允许通过引入选择剂杀死表达所述基因的细胞。如果重组基因引起导致细胞生长不受控制的突变，这是期望的。已经鉴定出许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌(Escherichia coli)gpt基因和大肠杆菌(E.coli)Deo基因(另参见，例如Yazawa K,FisherW E,Brunicardi F C:Current progress in suicide gene therapy for cancer.WorldJ.Surg.2002年7月；26(7):783-9)。如本文所用，自杀基因在
细胞中具有活性。通常，自杀基因编码对细胞没有不良影响的蛋白质，但是在存在特定化合物的情况下会杀死所述细胞。因此，自杀基因通常是系统的一部分。
在一个实施方式中，自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦(ganciclovir)杀死表达TK蛋白的细胞。
在另一个实施方式中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase)，其在存在5-氟胞嘧啶的情况下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等，“Cytosine deaminaseadenoviral vector and5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells:a potential purgingmethod for autologous transplantation.”Blood 1998年7月15日；92(2)：672-82。
在另一个实施方式中，自杀基因是在存在异环磷酰胺或环磷酰胺的情况下有毒的细胞色素P450。参见例如，Touati等，“A suicide gene therapy combining theimprovement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of ananti-tumor immune response.”Curr Gene Ther.2014；14(3):236-46。
在另一个实施方式中，自杀基因是iCas9。Di Stasi,(2011)“Inducibleapoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.”N Engl J Med 365:1673–1683。另参见Morgan,“Live and Let Die:A New Suicide Gene Therapy Moves tothe Clinic”Molecular Therapy(2012)；20:11–13。所述iCas9蛋白在存在小分子API903的情况下诱导凋亡。API903是在临床研究中已被证明具有良好的耐受性并已在过继细胞疗法的背景下被使用的生物惰性小分子。
在一个实施方式中，在向患者施用之前，对经修饰的
细胞进行辐照。例如在美国专利号8,034,332中描述了
细胞的辐照，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，辐照未经工程化以表达自杀基因的经修饰的
细胞。
转基因表达
可通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如，CD19.CAR和CD16)工程化成表达载体。可以将转基因工程化到相同的表达载体或不同的表达载体中。在优选的实施方式中，将转基因工程化到相同的载体中。
在一些实施方式中，载体允许将转基因引入细胞的基因组中。在一些实施方式中，载体具有正选择标志物。正选择标志物包括在会杀死不表达所述基因的细胞的条件下允许细胞生长的任何基因。非限制性实例包括抗生素抗性，例如遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。
可以使用任何数量的载体来表达Fc受体和/或CAR。在一些实施方式中，载体是质粒。在一个实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等。
可使用本领域已知的任何转染方法(包括但不限于感染、电穿孔、脂转染、核转染或“基因枪”)将转基因引入
细胞中。
公开的是材料、组合物和组分，所述材料、组合物和组分可以用于所公开的方法和组合物，可以与所公开的方法和组合物结合使用，可用于制备所公开的方法和组合物，或是所公开方法与组合物的产物。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解的是，虽然在公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时可能没有明确地公开这些化合物的各个单独的和集体的组合和排列中的每一个的具体引用，但是本文特别考虑并描述了每一个。例如，如果公开并讨论了一种方法，并且讨论了可以对包括所述方法在内的许多分子进行的许多修饰，则所述方法的每种组合和排列以及可能的修饰都被特别考虑，除非存在特别的相反指示。同样地，也特别考虑并公开了这些的任何子集或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所述公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果可以执行多种附加步骤，则应理解的是，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开的方法中的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，以及每个这样的组合或子集都被特别考虑并应该被认为是公开的。
实施方式
本文公开的方法和组合物包括以下示例性实施方式。
实施方式1。一种培养
细胞的方法，其包括在包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基中培养所述
细胞，其中
细胞培养物相比于已在不含所述非离子表面活性剂的对照培养基中培养的对照
细胞具有减少的结块。
实施方式2。实施方式1所述的方法，其中所述
细胞维持了与所述对照
细胞基本相同的细胞毒性。
实施方式3。实施方式1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物基本没有结块。
实施方式4。实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞在至少2升的培养基中培养。
实施方式5。实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。
实施方式6。实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述培养基包含0.025％至0.06％的泊洛沙姆188。
实施方式7。实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述培养基包含0.05％的泊洛沙姆188。
实施方式8。实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述
细胞培养物与对照细胞培养物相比具有减少的细胞聚集体。
实施方式9。实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞聚集体的百分比的减少为至少40％。
实施方式10。实施方式1-9中任一项所述的方法，其中所述
细胞培养物在培养3天后具有少于6％的细胞聚集体。
实施方式11。实施方式1-10中任一项所述的方法，其中所述
细胞具有至少80％的存活率。
实施方式12。实施方式1-11中任一项所述的方法，其中所述
细胞包含细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
实施方式13。一种减少培养基中的絮凝物的方法，所述方法包括向所述培养基中添加0.025％至0.9％的非离子表面活性剂，其中所述培养基与不含所述非离子表面活性剂的对照培养物相比具有减少的絮凝物。
实施方式14。一种细胞培养物，其包含
细胞和包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基，其中所述细胞培养物与对照培养物相比具有减少的结块，所述对照培养物包含NK-92细胞和不含非离子表面活性剂的培养基。
实施方式15。实施方式14所述的细胞培养物，其中所述
细胞已被培养了至少3天。
实施方式16。实施方式14-15中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本没有结块。
实施方式17。实施方式14-16中任一项所述的细胞培养物，其中所述
细胞维持了与所述对照培养物中的NK-92细胞基本相同的细胞毒性。
实施方式18。实施方式14-17中任一项所述的细胞培养物，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。
实施方式19。实施方式14-18中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含0.025％至0.06％的泊洛沙姆188。
实施方式20。实施方式14-19中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含0.05％的泊洛沙姆188。
实施方式21。实施方式14-20中任一项所述的细胞培养物，其中所述
细胞包含细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
实施方式22。实施方式14-21中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积为至少2升。
实施方式23。实施方式14-22中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积为至少10升。
实施例
以下实施例仅用于说明目的，不应被理解为限制。本领域技术人员可以使用将类似地允许他们成功地执行以下实施例的多种替代技术和程序。
实施例1：普兰尼克(Pluronic)F-68减少了
细胞培养物中的结块
(clumping)
在一项参照研究中，将来自G-Rex培养瓶的
细胞接种到两个单独的2升的WAVE袋中(即细胞lot#D0917C186和细胞lot#D0917C187)。两天后，合并来自所述两个WAVE袋的细胞以接种20升的WAVE袋(10升的工作体积)。一天后，在所述20升的WAVE袋D1217C197中观察到了白色沉淀和絮凝物(flocculant)(图10)，并且细胞的存活率小于50％。当在20升培养中扩增培养物的同时建立D1217C199以作为备用培养物；也观察到了沉淀和絮凝物，并且细胞存活率小于90％。参见图1。这表明所述过程是不可按比例被缩放的，扩增随后被终止。
在另一项参照研究中，在第0天，将来自G-Rex培养瓶的
细胞接种到两个单独的2升的WAVE袋中。在第3天，合并来自所述两个WAVE的细胞以接种10升的WAVE袋和2升的WAVE袋。在第6天，使用来自10升的WAVE袋的细胞接种20升的WAVE袋。在10升的WAVE袋中观察到了白色沉淀和絮凝物。细胞生长减慢并且存活率小于80％。在转移到20升的袋中后，沉淀物的尺寸变大。终止了WAVE培养(WAVE Culture)。这也表明该过程是不可按比例被缩放的。参见图2。
作为一个工作实施例，在存在0.05％的普兰尼克F-68(以10％的溶液(Cat#24040-032)从Thermo Fisher Scientific购得)的情况下，将来自G-Rex培养瓶的
细胞接种到两个单独的2升的WAVE袋中。在第0天，合并来自所述两个WAVE袋的细胞以接种10升的WAVE袋(5升的工作体积)。在第4天，使用来自10升的WAVE袋的细胞接种两个20升的WAVE袋。通过不同日子的连续离心收集来自所述两个20L WAVE袋的细胞。本研究中所有WAVE培养物均包含0.05％的普朗尼克F-68。结果表明，在整个研究过程中，在两个WAVE生物反应器中均未观察到沉淀。
如表1中总结的这些研究的结果表明，0.05％的普兰尼克F-68能够防止
培养物形成结块，因此可以通过向
培养物中添加0.05％的普兰尼克F-68来扩增所述培养物。参见图3。
实施例2：普兰尼克F-68减少了aNKTM细胞培养物中的结块
用aNKTM细胞培养物进行了类似的实验。在一项参照研究中，在第0天将来自G-Rex培养瓶的aNKTM细胞接种到两个单独的2升的WAVE袋中。合并来自所述两个WAVE的细胞以接种20升的WAVE袋(10升的工作体积)和10升的WAVE袋(5升的工作体积)。尽管在所述细胞培养物中有结块，但仍然在第3天通过连续离心收集来自20升的袋的细胞。三天后，在20升的WAVE袋中观察到了白色沉淀和絮凝物。由于更大的沉淀物和约75％的低细胞存活率，终止了10升的WAVE培养。参见图4。
在另一项参照研究中，在第0天将来自搅拌式生物反应器的aNKTM细胞接种到两个单独的2升的WAVE袋中。由于存活率降低至<50％，所以终止了在20升的WAVE袋中的培养。在第5天，合并来自两个2升的WAVE的细胞以接种两个单独的10升的WAVE袋。在第10天，将来自10升的WAVE袋的细胞接种到50升的袋中。尽管在所述细胞培养物中有结块，仍然在第14天通过连续离心收集所述50升的袋的细胞。在20升的WAVE袋中观察到了白色沉淀和絮凝物。细胞生长减少，因此终止了扩增。这表明WAVE培养物(WAVE Culture)有很多沉淀，并且该过程是不可按比例被缩放的。参见图5。
作为一个工作实施例，在第0天在存在0.05％的普兰尼克F-68的情况下，将来自G-Rex培养瓶的aNKTM细胞接种到两个单独的2-升的WAVE袋中。在第5天，合并来自所述两个生物反应器的细胞以接种10升的WAVE袋。将来自10升的袋的细胞转移到两个单独的20升的WAVE袋中。在第14天，通过连续离心收集来自所述两个袋的细胞。在所述两个WAVE袋中均未观察到沉淀。参见图6。在WAVE生物反应器lot#F0517C412中生长的细胞显示出了针对K562靶细胞的有效活性(参见表3)。
如表2中总结的这些研究的结果表明，在存在0.05％的普兰尼克F-68的情况下，可以扩增
培养物而不在所述培养物中产生结块。
实施例3：已在含有普兰尼克F-68的培养基中培养的
细胞的细胞毒性
测试了在存在普兰尼克F-68的情况下在20升的WAVE袋中培养的haNK细胞的样品(lot#E1217C313)的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。还同时测试了未用普兰尼克F-68处理的来自扩增前的培养瓶的参照样品。在存在Rituxan抗体的情况下，以10：1的效应子：靶标的比率将样品或参照样品与钙黄绿素负载的靶细胞Ramos细胞混合。孵育3小时后，通过荧光酶标仪测量钙黄绿素的释放。细胞毒性表示为钙黄绿素释放的百分比。对每个样品进行三次重复测试，其结果列于表3中。
类似地，测试了在存在普兰尼克F-68的情况下在20升的WAVE袋中培养的aNKTM细胞的样品(Lot#F0517C412)的细胞毒性。还同时测试了未用普兰尼克F-68处理的来自扩增前的培养瓶的参照样品。以10：1的效应子：靶标的比率将样品或参照样品与钙黄绿素负载的靶细胞K562细胞混合。孵育3小时后，通过荧光酶标仪评估钙黄绿素的释放。细胞毒性表示为钙黄绿素释放的百分比。对每个样品进行三次重复测试，其结果列于表3中。
如表3中所示，结果表明用普兰尼克F-68处理的细胞的细胞毒性与未用普兰尼克F-68处理的细胞的细胞毒性基本相同，这表明向生长培养基中添加普兰尼克F-68不会对
细胞的细胞毒性产生不利影响。
实施例4：鉴定防止
细胞培养中结块所需的普兰尼克F-68的最低有效浓
度
这个实施例描述了旨在鉴定防止结块所需的普兰尼克F-68的最低有效浓度的研究。将普兰尼克F-68分别以0％、0.0125％、0.025％和0.05％的浓度添加到WAVE生物反应器中的haNK细胞培养物中。在不具有或具有0.125％的普兰尼克F-68的培养物中观察到了结块。在具有0.025％的普兰尼克F-68的培养物中仍然观察到了数量减少的结块。值得注意的是，添加0.05％的普兰尼克F-68完全防止了结块和混浊。参见图7。由于浑浊的外观，终止了WAVE培养物中的两种(0％和0.0125％的普兰尼克F-68)，而其他的两种培养物分别在10升的袋中扩增了5天。使用NC-200细胞计数器分析了细胞，表4显示了细胞聚集体的百分比。
实施例5使用NC-200细胞计数器来评估普兰尼克F-68对
细胞存活率的
影响
使用NC-200细胞计数器评估了在不存在或存在普兰尼克F-68的情况下在WAVE生物反应器中扩增的
细胞的健康状况和存活率。如图8A中所示，不具有普兰尼克F-68的培养物的吖啶橙图谱中出现了多个峰，这表明培养物不健康。细胞存活率为70.2％，以及具有五个或更多细胞的聚集体中的细胞占样品中总细胞的17％。相反，在含有0.05％的普兰尼克F-68的培养物中仅观察到了一个单峰，这表明所述细胞是健康的。另外，细胞存活率增加到了94.9％，并且如仅为2％的具有五个或更多细胞的聚集体中的细胞的百分比所示(图8B)，细胞基本没有结块。添加普兰尼克F-68使结块减少了88％。
使用NK-200细胞计数器对在不存在或存在普兰尼克F-68的情况下在WAVE生物反应器中扩增的aNKTM细胞进行了类似的研究。与
细胞一样，在不含有普兰尼克F-68的培养物的吖啶橙图谱中出现了多个峰，这表明培养物不健康。细胞存活率为88.1％，以及32％的细胞在具有五个或更多细胞的聚集体中。参见图9A。相反，在含有0.05％的普兰尼克F-68的培养物中仅观察到一个单峰，这表明细胞是健康的。另外，细胞存活率提高到了96.8％，细胞聚集体的百分比降低到仅3％(图9B)–90％的降低。
应当理解的是，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将提出基于其的多种修改或改变，这些修改或改变将被包括在本申请的精神和范围之内以及所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文。
非正式序列表
SEQ ID NO：1高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A核酸序列(全长形式)。
ATGTGGCA GCTGCTGCTG CCTACAGCTC TCCTGCTGCT GGTGTCCGCC GGCATGAGAACCGAGGATCT GCCTAAGGCC GTGGTGTTCC TGGAACCCCA GTGGTACAGA GTGCTGGAAA AGGACAGCGTGACCCTGAAG TGCCAGGGCG CCTACAGCCC CGAGGACAAT AGCACCCAGT GGTTCCACAA CGAGAGCCTGATCAGCAGCC AGGCCAGCAG CTACTTCATCGACGCCGCCA CCGTGGACGA CAGCGGCGAG TATAGATGCCAGACCAACCT GAGCACCCTGAGCGACCCCG TGCAGCTGGA AGTGCACATC GGATGGCTGC TGCTGCAGGCCCCCAGATGGGTGTTCAAAG AAGAGGACCC CATCCACCTG AGATGCCACT CTTGGAAGAACACCGCCCTGCACAAAGTGA CCTACCTGCA GAACGGCAAG GGCAGAAAGT ACTTCCACCA CAACAGCGACTTCTACATCC CCAAGGCCAC CCTGAAGGAC TCCGGCTCCT ACTTCTGCAG AGGCCTCGTGGGCAGCAAGAACGTGTCCAG CGAGACAGTG AACATCACCA TCACCCAGGG CCTGGCCGTGTCTACCATCA GCAGCTTTTTCCCACCCGGC TACCAGGTGT CCTTCTGCCT CGTGATGGTGCTGCTGTTCG CCGTGGACAC CGGCCTGTACTTCAGCGTGA AAACAAACAT CAGAAGCAGCACCCGGGACT GGAAGGACCA CAAGTTCAAG TGGCGGAAGGACCCCCAGGA CAAGTGA
SEQ ID NO：2高亲和力变体免疫球蛋白γFc区受体III-A氨基酸序列(全长形式)。以下划线标记第176位的Val。
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala GlyMet Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr ArgVal Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu AspAsn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser TyrPhe Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn LeuSer Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu GlnAla Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser TrpLys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys TyrPhe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly SerTyr Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn IleThr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly TyrGln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu TyrPhe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys PheLys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
SEQ ID NO：3 ER IL-2核酸序列
ATGTACCGGATG CAGCTGCTGA GCTGTATCGC CCTGTCTCTG GCCCTCGTGA CCAACAGCGCCCCTACCAGC AGCAGCACCA AGAAAACCCA GCTGCAGCTG GAACATCTGC TGCTGGACCTGCAGATGATCCTGAACGGCA TCAACAACTA CAAGAACCCC AAGCTGACCC GGATGCTGACCTTCAAGTTC TACATGCCCAAGAAGGCCAC CGAACTGAAA CATCTGCAGT GCCTGGAAGAGGAACTGAAG CCCCTGGAAG AAGTGCTGAACCTGGCCCAG AGCAAGAACT TCCACCTGAGGCCCAGGGAC CTGATCAGCA ACATCAACGT GATCGTGCTGGAACTGAAAG GCAGCGAGACAACCTTCATG TGCGAGTACG CCGACGAGAC AGCTACCATC GTGGAATTTCTGAACCGGTGGATCACCTTC TGCCAGAGCA TCATCAGCAC CCTGACCGGC TCCGAGAAGG ACGAGCTGTGA
SEQ ID NO：4 ER IL-2(ER保留信号以下划线标记)氨基酸序列
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu ValThr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu HisLeu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro LysLeu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu LysHis Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu AlaGln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val IleVal Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu ThrAla Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile SerThr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu
Claims (23)
1.一种培养NK-
细胞的方法，其包括在包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基中培养所述NK-
细胞，其中NK-
细胞培养物相比于已在不含所述非离子表面活性剂的对照培养基中培养的对照NK-
细胞具有减少的结块。
2.权利要求1所述的方法，其中所述NK-
细胞维持了与所述对照NK-
细胞基本相同的细胞毒性。
3.权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物基本没有结块。
4.权利要求1所述的方法，其中所述细胞在至少2升的培养基中培养。
5.权利要求1所述的方法，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。
6.权利要求5所述的方法，其中所述培养基包含0.025％至0.06％的泊洛沙姆188。
7.权利要求5所述的方法，其中所述培养基包含0.05％的泊洛沙姆188。
8.权利要求1所述的方法，其中所述NK-
细胞培养物与对照细胞培养物相比具有减少的细胞聚集体。
9.权利要求8所述的方法，其中所述细胞聚集体的百分比的减少为至少40％。
10.权利要求8所述的方法，其中所述NK-
细胞培养物在培养3天后具有少于6％的细胞聚集体。
11.权利要求1所述的方法，其中所述NK-
细胞具有至少80％的存活率。
12.权利要求1所述的方法，其中所述NK-
细胞包含细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
13.一种减少培养基中的絮凝剂的方法，所述方法包括向所述培养基中添加0.025％至0.9％的非离子表面活性剂，其中所述培养基与不含所述非离子表面活性剂的对照培养物相比具有减少的絮凝剂。
14.一种细胞培养物，其包含NK-
细胞和包含0.025％至0.9％的非离子表面活性剂的培养基，其中所述细胞培养物与对照培养物相比具有减少的结块，所述对照培养物包含NK-92细胞和不含非离子表面活性剂的培养基。
15.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述NK-
细胞已被培养了至少3天。
16.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物基本没有结块。
17.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述NK-
细胞维持了与所述对照培养物中的NK-92细胞基本相同的细胞毒性。
18.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述非离子表面活性剂是泊洛沙姆188。
19.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含0.025％至0.06％的泊洛沙姆188。
20.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含0.05％的泊洛沙姆188。
21.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述NK-
细胞包含细胞因子、Fc受体、嵌合抗原受体或其组合。
22.权利要求14所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积为至少2升。
23.权利要求22所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物的体积为至少10升。
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