KR20210011978A

KR20210011978A - 폴록사머를 사용한 nk-92 세포 성장의 최적화

Info

Publication number: KR20210011978A
Application number: KR1020207036562A
Authority: KR
Inventors: 샤닌 베세트; 디엠치 응위엔; 시예드 라자 알리; 만주 사세나
Original assignee: 난트케이웨스트, 인크.
Priority date: 2018-05-22
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2021-02-02
Also published as: IL278384A; EP3797155A1; US20210363484A1; EP3797155B1; IL278384B2; WO2019226649A1; JP7208262B2; CN112166184A; CA3098471A1; CA3098471C; DK3797155T3; KR20230146128A; IL278384B1; JP2021524743A; ES2925553T3; KR102587512B1; AU2019272583B2; AU2019272583A1

Abstract

세포 배양물이 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배지에서 배양된 대조군 NK-92^® 세포와 비교하여 감소된 응괴를 갖도록 비-이온성 계면활성제를 함유하는 성장 배지를 사용하여 NK-92^® 세포를 배양하는 방법이 본원에 제공된다. 성장 배지는 0.025 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188을 포함한다.

Description

폴록사머를 사용한 NK-92 세포 성장의 최적화

관련 출원

본 출원은 2018년 5월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/674,723을 우선권 주장한다. 상기 가출원의 전문은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

자연 살해 (NK) 세포는 선천 면역계의 주요 구성성분을 구성하는 세포독성 림프구이다. 일반적으로 순환하는 림프구의 약 10-15%에 해당하는 NK 세포는 바이러스-감염된 세포 및 많은 악성 세포를 포함하는 표적화된 세포를 항원과 관련하여 비특이적으로 및 사전 면역 감작 없이 결합하고 사멸시킨다. 문헌 [Herberman et al., Science 214:24 (1981)]. 표적화된 세포의 사멸은 세포 용해를 유도함으로써 발생한다. 이 목적으로 사용되는 NK 세포는 대상체로부터의 혈액의 말초 혈액 림프구 ("PBL") 분획으로부터 단리되고, 충분한 수의 세포를 얻기 위해 세포 배양물에서 확장된 후, 대상체에게 재주입된다. NK 세포는 생체외 요법 및 생체내 치료 둘 다에서 다소 효과적인 것으로 제시된 바 있다. 그러나, 이러한 요법은 모든 NK 세포가 세포용해성이 아니며 요법이 치료된 환자에 대해 특이적이라는 사실 때문에 복잡하다.

NK-92^® 세포는 이전에 특정 암 치료에서 치료제로 평가되었다. NK 세포와 달리, NK-92^®는 세포용해성 암 세포주이며, 이는 비호지킨 림프종을 앓는 대상체의 혈액에서 발견된 후 생체외에서 불멸화되었다. NK-92^® 세포에는 정상 NK 세포에 의해 디스플레이되는 주요 억제성 수용체가 결여되지만, 대부분의 활성화 수용체를 유지한다. 그러나, NK-92^® 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고 인간에서 허용되지 않는 면역 거부 반응을 유도하지도 않는다. NK-92^® 세포주의 특징화는, 예를 들어, WO 1998/49268 및 미국 특허 번호 8,034,332에 개시되어 있다.

NK-92^® 세포는 엄청난 치료 잠재력을 갖고 있지만, NK-92^® 세포를 대규모로 성장시키는 것이 도전과제이며, 이는 이들 세포의 치료적 적용을 제한한다. 특히, 확장은 흔히 "응괴"라고 하는 현상인 배양 침전물 및 응집물의 상당한 증가를 종종 동반한다. 이들 큰 크기의 침전물은 느린 세포 성장, 낮은 세포 생존력 및 부정확한 세포 계수를 포함하여 많은 원치않는 결과를 초래하며, 이는 잘못된 투여 제형을 초래할 수 있다. 세포 배양물의 응괴는 또한 원심분리에서 세포층의 교란을 초래할 수 있으며, 이는 세포 수확 동안 불량한 세포 회수, 및 종양 표적 세포에 대한 일관되지 않은 세포 세포독성을 초래한다.

비-이온성 계면활성제를 함유하는 성장 배지를 사용하여 NK-92^® 세포를 배양하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 NK-92^® 세포는 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배지에서 배양된 대조군 NK-92^® 세포와 비교하여 감소된 응괴를 갖는다. 성장 배지는 0.025 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188을 포함한다. NK-92^® 세포는 하나 이상의 트랜스진을 발현하도록 변형될 수 있으며, 예를 들어, NK-92^® 세포는 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 발현하도록 변형될 수 있다. NK-92^® 세포 및 0.025%-0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 NK-92^® 세포 배양물이 또한 본원에 제공된다.

0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지에서 NK-92^® 세포를 배양하는 것을 포함하는, NK-92^® 세포를 배양하는 방법으로서, 여기서 NK-92^® 세포 배양물은 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배지에서 배양된 대조군 NK-92^® 세포와 비교하여 감소된 응괴를 갖는 것인 방법이 본원에 제공된다. 임의적으로, NK-92^® 세포는 대조군 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지하였다. 추가적으로, 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없으며, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188이다. 임의적으로, 첨가제의 시각적 이점이 육안으로 관찰될 수 있기 전에 세포는 적어도 2 리터의 배양 배지에서 배양된다.

NK-92^® 세포를 배양하기 위한 배양 배지는 0.025% 내지 0.06%의 폴록사머 188, 예를 들어, 0.05% 폴록사머 188을 포함할 수 있다. 임의적으로, NK-92^® 세포 배양물은 대조군 배양물과 비교하여 감소된 세포 집합체를 갖는다. 일부 경우에, 세포 집합체의 백분율의 감소는 적어도 40%이다. 임의적으로, NK-92^® 세포 배양물은 배양 3일 후 6% 미만의 세포 집합체를 갖는다.

본원에 개시된 방법을 사용하여 배양된 NK-92^® 세포는 적어도 80%의 생존력을 가질 수 있다. 이는 대조군 배양물에서의 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지할 수 있다. NK-92^® 세포는 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

배양 배지에서 응집물을 감소시키는 방법으로서, 배양 배지에 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응집물을 갖는 것인 방법이 또한 본원에 제공된다.

NK-92^® 세포 및 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물이 또한 본원에 제공되며, 여기서 세포 배양물은 NK-92^® 세포 및 비-이온성 계면활성제가 결여된 배지를 포함하는 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응괴를 갖는다. 일부 경우에, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188이다. 임의적으로, NK-92^® 세포는 적어도 3일 동안 배양되었다. 임의적으로, 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없다. 임의적으로, NK-92^® 세포는 대조군 배양물에서의 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지한다. 임의적으로, 청구항 14의 세포 배양물로서, 여기서 세포 배양물은 0.025% 내지 0.06%, 예를 들어, 0.05%의 폴록사머 188을 포함한다. NK-92^® 세포는 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 임의적으로, 세포 배양물은 적어도 2 리터, 예를 들어, 적어도 10 리터의 부피를 갖는다.

전술한 일반적인 설명 및 하기 상세한 설명은 예시적이고 설명적이며, 본 개시내용의 추가 설명을 제공하려는 것이다. 다른 목적, 장점 및 신규 특징은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다.

목적, 특징 및 장점은 첨부된 도면과 함께 고려될 때 하기 개시내용을 참조하면 더 쉽게 이해될 것이다.
도 1은 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 부재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 haNK^® 세포 확장의 제1 개략도를 제시한다. 응괴 및 낮은 세포 생존력이 관찰되었다.
도 2는 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 부재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 haNK^® 세포 확장의 제2 개략도 및 결과를 제시한다. 응괴 및 낮은 세포 생존력이 관찰되었다.
도 3은 0.05% 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 존재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 haNK^® 세포 확장의 개략도를 제시한다. 배양물에는 응괴가 없었다.
도 4는 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 부재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 aNK™ 세포 확장의 제1 개략도를 나타낸다. 응괴가 관찰되었다.
도 5는 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 부재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 aNK™ 세포 확장의 제2 개략도를 제시한다. 응괴가 관찰되었다.
도 6은 0.05% 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 존재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 aNK™ 세포 확장의 개략도를 제시한다. 배양물에는 응괴가 없었다.
도 7은 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 다양한 적정의 부재 또는 존재 하의 WAVE 바이오리액터에서의 haNK^® 세포 확장의 개략도를 제시한다. 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 농도가 증가함에 따라 haNK^® 배양물에서 응괴가 감소되었다.
도 8a 및 8b는 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 부재 (도 8a) 및 0.05% 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 존재 (도 8b) 하의 WAVE 바이오리액터로부터의 haNK^® 세포의 NC-200 프로파일을 제시한다.
도 9a 및 9b는 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 부재 (도 9a) 및 0.05% 폴록사머 188 (플루로닉 F-68)의 존재 (도 9b) 하의 WAVE 바이오리액터로부터의 aNK™ 세포의 NC-200 프로파일을 제시한다.
도 10은 폴록사머 188의 부재 하에 WAVE 백에서 성장된 NK-92^® 세포의 사진을 제시하며, 여기서 응괴가 관찰되었다.

응괴를 감소시킬 수 있는 성장 배지를 사용하여 NK-92^® 세포를 배양하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 경우에, NK-92^® 세포는 성장 배지에서 배양되고, 세포에는 세포 응괴가 실질적으로 없다. 성장 배지는 0.025 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188을 포함한다. NK-92^® 세포는 하나 이상의 트랜스진, 예를 들어, 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 발현하도록 변형될 수 있다. NK-92^® 세포 및 0.025%-0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 NK-92^® 세포 배양물이 또한 본원에 제공된다.

용어

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서 및 하기 청구범위에서, 하기 의미를 갖도록 정의될 수 있는 수많은 용어가 참조될 것이다:

본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 그러므로, 예를 들어, "자연 살해 세포"에 대한 언급은 복수의 자연 살해 세포들을 포함한다.

모든 수치 지정, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 양 및 분자량 (범위 포함)은 적절한 경우에 0.1 또는 1.0의 증분으로 (+) 또는 (-) 변화하는 근사치이다. 항상 명백하게 언급되는 것은 아니지만, 모든 수치 지정 앞에 용어 "약"이 올 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용에서 모든 농도는 부피/부피 농도이다.

관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 특히 서면 설명을 제공하는 것과 관련하여, 임의의 및 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 그의 하위범위의 조합을 포함한다. 나열된 임의의 범위는 동일한 범위를 적어도 동등한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나누어 충분히 설명하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 논의된 각 범위는 하위 3분의 1, 중위 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 쉽게 나눌 수 있다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 모든 표현, 예컨대 "최대", "적어도", "보다 큰", "미만" 등은 인용된 숫자를 포함하고, 상기 논의된 바와 같이 후속적으로 하위범위로 나눌 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 범위는 각 개별 구성원을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 1-3개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 세포를 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 세포를 갖는 그룹 등을 지칭한다.

또한, 항상 명백하게 언급되는 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시일 뿐이며 그의 등가물이 관련 기술분야에 공지되어 있음을 이해해야 한다.

"임의적인" 또는 "임의적으로"는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하며, 그 기재는 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다.

본 발명의 목적을 위해 및 달리 명시되지 않는 한, 용어 "NK-92^®" 또는 "NK92^®"는 원래 NK-92^® 세포주 뿐만 아니라 NK-92^® 세포주, NK-92^® 세포의 클론, 및 변형된 NK-92^® 세포 (예를 들어, 외인성 유전자의 도입에 의해)를 지칭하는 것으로 의도된다. NK-92^® 세포 및 그의 예시적인 및 비제한적인 변형은 미국 특허 번호 7,618,817; 8,034,332; 8,313,943; 9,181,322; 9,150,636; 및 공개된 미국 출원 번호 10/008,955에 기재되어 있으며 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 야생형 NK-92^®, NK-92^®-CD16, NK-92^®-CD16-γ, NK-92^®-CD16-ζ, NK-92^®-CD16(F176V), NK-92^®MI, 및 NK-92^®CI를 포함한다. NK-92^® 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 이러한 세포는 난트케이웨스트, 인크.(NantKwest, Inc.)로부터 쉽게 입수가능하다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "aNK™ 세포"는 모 NK-92 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "haNK^® 세포"는 Fc 수용체를 발현하도록 조작된 NK-92^® 세포를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "taNK^® 세포"는 암 특이적 항원, 암 연관 항원 또는 종양 특이적 항원에 대한 친화도를 갖는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 조작된 NK-92^® 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 종양 특이적 항원은 HER-2, 예를 들어, 인간 HER-2이고, 이들 NK-92^® 세포는 본 개시내용에서 HER2.taNK^® 세포로 지칭된다.

용어 "Fc 수용체"는 Fc 영역으로 공지된 항체의 일부에 결합함으로써 면역 세포의 보호 기능에 기여하는 특정 세포 (예를 들어, 자연 살해 세포)의 표면에서 발견되는 단백질을 지칭한다. 세포의 Fc 수용체 (FcR)에 대한 항체의 Fc 영역의 결합은 항체-매개 식균작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 통해 세포의 식균작용성 또는 세포독성 활성을 자극한다. FcR은 이들이 인식하는 항체의 유형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 (FcγR)는 항체의 IgG 클래스에 결합한다. FcγRIII-A (CD16이라고도 함)는 IgG 항체에 결합하고 ADCC를 활성화시키는 낮은 친화도 Fc 수용체이다. FcγRIII-A는 전형적으로 NK 세포에서 발견된다. NK-92^® 세포는 FcγRIII-A를 발현하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항원 수용체" (CAR)는 세포내 신호전달 도메인에 융합된 세포외 항원-결합 도메인을 지칭한다. CAR은 T 세포 또는 NK 세포에서 발현되어 세포독성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 세포외 항원-결합 도메인은 관심있는 세포에서 발견되는 항원에 특이적인 scFv이다. CAR-발현 NK-92^® 세포는 scFv 도메인의 특이성에 기초하여 세포 표면에서 특정 항원을 발현하는 세포를 표적화한다. scFv 도메인은 종양-특이적 항원을 포함하는 임의의 항원을 인식하도록 조작될 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되며, 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예컨대 표지화 구성성분과의 접합에 의해 중합 후 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자를 모두 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥 형태 및 이중-가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되어 있거나 예측되는 2개의 상보적 단일-가닥 형태 각각을 둘 다 포함한다.

용어 "발현"은 유전자 산물의 생산을 지칭한다. 발현과 관련하여 용어 "일시적"은 폴리뉴클레오티드가 세포의 게놈에 혼입되지 않음을 의미한다.

용어 "시토카인" 또는 "시토카인들"은 면역계의 세포에 영향을 미치는 일반적인 클래스의 생물학적 분자를 지칭한다. 예시적인 시토카인은 인터페론 및 인터류킨 (IL), 특히 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 시토카인은 IL-2이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "응괴"는 육안으로 볼 수 있는 세포 덩어리의 존재를 지칭한다. 세포 덩어리는 전형적으로 1-15 cm, 예를 들어, 2-10 cm, 2-8 cm, 1-3 cm, 2-6 cm, 또는 6-8 cm의 직경을 갖는다. 가시적인 세포 덩어리의 예시적인 예는 도 10에 제시되어 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 부피가 증가함에 따라 세포 배양물의 응괴 정도가 증가하며, 이는 전형적으로 확장 동안 발생한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "감소된 응괴" 또는 "감소된 세포 응괴"는 세포 배양물에서 세포 덩어리의 수, 크기 또는 둘 다가 감소되는 현상을 지칭한다. 예를 들어, 세포 배양물에서 세포 덩어리의 수는 제공된 방법을 사용하여 대조군 세포 배양물과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%만큼 감소될 수 있다.

용어 "응괴가 실질적으로 없는"은 세포 응괴가 육안으로 보이지 않는 배양 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포 집합체"는 세포 배양물에서 5개 이상의 세포의 집합체를 지칭한다. 세포 집합체는 전형적으로 육안으로 보이지 않지만, 장치, 예컨대 현미경의 도움으로 볼 수 있다. 세포 집합체의 감소는 대조군 세포 배양물과 비교하여 세포 배양물에서 세포 집합체의 수의 적어도 40% 감소를 지칭한다. 임의적으로, 제공된 방법은 대조군 세포 배양물과 비교하여 세포 집합체의 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99%의 감소를 초래한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "응집물"은 세포의 부재 하의 배양 배지 구성성분의 집합을 지칭한다. 응집물은 전형적으로 또한 육안으로 볼 수 있으며, 전형적으로 0.01-1 cm, 예를 들어, 0.02-0.8 cm, 0.05-0.5 cm, 예를 들어, 0.1-0.5 cm의 직경을 가질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "감소된 응집물"은 배지에서 응집물의 수, 크기 또는 둘 다가 감소되는 현상을 지칭한다. 예를 들어, 배양 배지에서 응집물의 수는 제공된 방법을 사용하여 대조군 배양 배지와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%만큼 감소될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한 세포독성"은 세포독성 검정으로부터의 두 측정치가 서로 15% 이하, 10% 이하, 8% 이하 또는 5% 이하 상이한 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성"은 이펙터 세포, 예컨대 NK 세포의 활성을 설명하기 위해 사용될 때, 다양한 생물학적, 생화학적 또는 생물물리적 메카니즘 중 임의의 것에 의한 표적 세포의 사멸과 관련된다.

배양 배지

응괴를 감소시키거나 방지할 수 있는 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지가 본원에 제공된다. 비-이온성 계면활성제는 세포 배양물에서 전단력을 제어할 수 있으며, 또한 교반된 배양물에서 거품발생을 감소시키고 배양 용기에 대한 세포 부착을 감소시키는데 사용될 수 있다.

적합한 비-이온성 계면활성제는 폴록사머를 포함한다. 폴록사머는 폴리옥시에틸렌의 2개의 친수성 쇄에 의해 플랭킹된 폴리옥시프로필렌의 중심 소수성 쇄로 구성된 비-이온성 삼블록 공중합체이다. 폴록사머는 상품명 신퍼로닉, 플루로닉 및 콜리포어로도 공지되어 있다. 폴록사머 188 용액은, 예를 들어, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 또는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)에서 시판된다. 폴록사머 188은 써모 피셔 사이언티픽에서 얻을 때 플루로닉 F-68로 지칭된다. 폴록사머 188은 전형적으로 10%의 농도로 상업적으로 제공된다.

비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188은 0.025 내지 0.9%, 예를 들어, 0.025% 내지 0.06%, 0.04% 내지 0.06%, 또는 0.03 내지 0.05%의 양으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-이온성 계면활성제는 0.05%로 존재한다.

충분한 양으로 NK-92^® 세포로부터 생물학적 산물을 생산하기 위해, 세포 배양물은 상대적으로 큰 부피로 스케일 업될 필요가 있으며, 예를 들어, 세포 배양물의 부피는 적어도 2 리터, 적어도 3 리터, 적어도 4 리터, 또는 적어도 5 리터일 수 있다. 일부 경우에, NK-92^® 세포는 바이오리액터에서 사용되기에 적합한 큰-부피 배양 용기에서 성장될 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 큰-부피 세포 배양물은 종종 세포 배양물에서 응괴, 즉 세포 침전 및 집합의 유의한 증가를 동반한다. 폴록사머 188의 부재 하에, 2-리터 WAVE 백 배양물이 20-리터 WAVE 백에서 스케일 업될 경우, 24시간 이내에 침전이 형성될 수 있다 (실시예 1 및 표 1에 예시된 바와 같음). 큰 부피를 갖는 배양물을 포함하는 세포 배양물에 폴록사머 188을 첨가하는 것은 놀랍게도 세포 배양물에서 응괴를 유의하게 감소시킬 수 있다. NK-92^® 세포 배양물에 폴록사머 188을 첨가하는 것은 세포 성장, 세포 생존력, 표현형, 세포독성 및 ADCC 활성에 유해한 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 개시내용은 또한 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지에서 NK-92^® 세포를 배양하는 것을 포함하는, NK-92^® 세포를 배양하는 방법으로서, 여기서 NK-92^® 세포는 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배지에서 배양된 대조군 NK-92^® 세포와 비교하여 감소된 응괴를 갖고, NK-92^® 세포는 대조군 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 갖는 것인 방법을 제공한다.

본 출원의 발명자들은 또한 세포의 부재 하에서도 세포 배양 배지가 육안으로 볼 수 있는 응집물을 형성할 수 있음을 관찰하였다. 이들 응집물은 전형적으로 0.01-1 cm, 예를 들어, 0.02-0.8 cm, 0.05-0.5 cm, 예를 들어, 0.1-0.5 cm의 직경을 갖고, 배지에 0.025% 내지 0.9%의 폴록사머 188을 도입하는 것은 배지에서 응집물의 수를 감소시킬 수 있다.

NK-92^® 세포를 배양하는 방법

NK-92^® 세포는 수많은 성장 배지에서 배양될 수 있으며, 그 중 일부는 시판되며, 예를 들어, 3H 바이오메디칼(3H Biomedical, 스웨덴 웁살라)로부터의 인간 NK 세포 배양 배지 또는 얼바인 사이언티픽(Irvine Scientific, 미국 캘리포니아주 얼바인)으로부터의 프라임(Prime) XV 배지이다. 응괴를 최소화하기 위해, 배양물은 폴록사머 188을 포함할 수 있다. 임의적으로, 배양 배지는 또한 시토카인, 인간 혈청 알부민, 아미노산 보충제 또는 이들의 조합을 함유한다. 적합한 시토카인은 IL-2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하나의 예시적인 예에서, aNK 세포는 아미노산이 보충제로서 첨가된 0.05% 플루로닉 F-68 및 450 IU/mL의 IL-2를 포함하는 성장 배지에서 배양될 수 있다. 또 다른 예시적인 예에서, haNK^® 세포는 0.05% 플루로닉 F-68을 포함하는 성장 배지에서 배양될 수 있다. 또 다른 예에서, taNK^® 세포는 0.05% 플루로닉 F-68 및 500 IU/mL의 IL-2를 포함하는 성장 배지에서 배양될 수 있다. 또 다른 예에서, t-haNK^® 세포는 0.05-0.1% 플루로닉 F-68을 포함하는 성장 배지에서 배양될 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 성장 배지에 비-이온성 계면활성제를 첨가하는 것은 응괴를 감소시킬 수 있다. 임의적으로, 성장 배지에 비-이온성 계면활성제를 첨가하는 것은 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 88%, 적어도 90% 또는 적어도 95%만큼 응괴를 감소시킬 수 있다.

세포 배양물에서 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188을 사용하는 것은 또한 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 세포 배양물과 비교하여 NK-92 세포 집합체를 유의한 정도로 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 이는 배양물에서 세포 집합체의 백분율을 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 폴록사머 188을 함유하는 배양 배지에서 성장한 NK-92 세포는 성장 기간 동안 적어도 1 리터의 배양 부피에서 성장 후 15% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 6% 미만의 세포 집합체를 가질 수 있다. 일부 경우에, 성장 기간은 1-7일, 예를 들어, 2일, 3일, 5일, 또는 7일이다.

NK-92^® 세포 배양물을 확장하기 위해, 전형적으로 바이알을 해동하고, 세포를 회수할 때까지 표준 세포 배양 용기, 예를 들어, T75 플라스크에서 배양한다. 그 후, 세포 수를 확장하기 위해 더 큰 부피를 갖는 용기, 예를 들어, 전형적으로 0.45 리터 미만인 G-Rex 플라스크로 세포를 전달한다. 그 후, 확장된 세포를 훨씬 더 큰 용기, 예를 들어, WAVE 세포 배양물 백으로 전달한다. 세포의 전달은 펌프 또는 중력 공급기를 사용하여 수행될 수 있다.

임의적으로, 이렇게 생산된 NK-92^® 세포는 확장 과정이 끝날 때 배양 용기에 무균적으로 부착된 연속 원심분리기를 사용하여 수확될 수 있다. 세포를 수집하고 제품 제형 및 다양한 적용에 사용할 수 있다.

생산된 NK-92^® 세포의 세포독성, 비정상 세포, 예컨대 바이러스 감염된 및 종양형성 세포를 표적화하고 사멸시키는 능력은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 문헌 [Klingemann et al. (Cancer Immunol. Immunother. 33:395-397 (1991))]에 기재된 절차를 사용하는 ⁵¹Cr 방출 검정 (Gong et al. (1994))에 의해 평가될 수 있다. 특이적 세포독성의 백분율은 방출된 ⁵¹Cr의 양을 기준으로 계산될 수 있다. 특허 공개 번호 US20020068044를 참조한다.

대안적으로, 생산된 NK-92^® 세포의 세포독성은 또한 칼세인 방출 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, NK-92^® 세포 (검정에서 이펙터라고 함)는 칼세인 로딩된 표적 세포 (검정에서 표적이라고 함)와 특정 비로 혼합될 수 있다. 일정 기간 동안 인큐베이션 후, 표적 세포로부터의 칼세인 방출은, 예를 들어, 형광 플레이트 판독기에 의해 평가될 수 있다. 검정에서 사용되는 이펙터 및 표적의 비은 다양할 수 있으며, 임의적으로 이펙터:표적 비은 20:1, 15:1, 10:1, 8:1, 또는 5:1일 수 있으며; 바람직하게는 이펙터:표적 비은 10:1이다. 폴록사머 188을, 예를 들어, 0.025% 내지 0.9%의 농도로 포함하는 배지에서 성장된 NK-^® 세포는 폴록사머 188의 존재를 제외하고는 동일한 배지에서 성장된 NK-92^® 세포와 필적하는 세포독성을 유지한다. 표적 세포는 NK-92^® 세포에 의해 인식될 수 있는 MHC 분자를 발현하는 임의의 세포, 예를 들어, K562 세포일 수 있다.

NK-92^® 세포, 예를 들어, haNK^® 세포의 항체 의존성 세포독성을 평가할 수 있다. NK-92^® 세포의 ADCC를 측정하는 방법은 표적 세포를 인식할 수 있는 항체를 첨가한 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같은 직접적인 세포독성을 측정하는 방법과 유사하다. NK 세포의 Fc 수용체는 세포-결합 항체를 인식하고 세포용해 반응을 촉발하고 표적 세포를 사멸시킨다. 하나의 예시적인 예에서, haNK^® 세포는 리툭산(Rituxan) (항체) 및 라모스(Ramos) (표적 세포)와 함께 인큐베이션될 수 있고, 라모스 세포의 사멸은 상기 기재된 바와 같이 표적 세포의 내부 구성성분, 예를 들어, ⁵¹Cr 또는 칼세인의 방출에 의해 측정될 수 있다.

0.025%-0.9%의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188을 포함하는 배양 배지에서 성장된 NK-92^® 세포는 비-이온성 계면활성제가 결여된 배양 배지에서 성장된 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 나타낼 수 있다.

0.025%-0.9%의 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, 폴록사머 188을 포함하는 배양 배지에서 성장된 NK-92^® 세포는 전형적으로 우수한 생존력, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 생존력을 갖는다. NK-92^® 세포의 생존력은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 트립판 블루-기반 염색 방법 또는 NC-200 세포 계수기를 사용하여 결정될 수 있다.

세포 배양물

본 개시내용은 또한 NK-92^® 세포 및 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 제공하며, 여기서 NK-92^® 세포는 NK-92^® 세포 및 비-이온성 계면활성제가 결여된 배지를 포함하는 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응괴를 갖는다.

임의적으로, 세포 배양물은 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 세포 배양물과 비교하여 감소된 응괴를 가질 수 있으며, 감소는 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 88%, 적어도 90% 또는 적어도 95%이다.

임의적으로, NK-92^® 세포는 적어도 3일, 적어도 5일, 적어도 7일, 또는 적어도 10일 동안 배양 배지에서 배양되었다. 임의적으로, 세포 배양물은 적어도 2 리터, 적어도 5 리터, 적어도 10 리터, 적어도 15 리터, 예를 들어, 25 리터의 부피를 갖는다. 임의적으로, NK-92^® 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없다.

임의적으로, 비-이온성 계면활성제는 폴록사머 188이다. 임의적으로 세포 배양물은 0.025% 내지 0.9%, 예를 들어, 0.03% 내지 0.8%, 또는 0.04% 내지 0.6%의 폴록사머 188을 포함하며; 바람직하게는, 폴록사머 188은 0.05%로 존재한다.

NK-92 ^® 세포

본원에 개시된 방법을 사용하여 배양될 수 있는 NK-92^® 세포는 하기에 추가로 설명되는 aNK™ 세포, haNK^® 세포, taNK^® 세포 및 t-haNK^® 세포를 포함한다.

NK-92^® 세포주는 인터류킨 2 (IL-2)의 존재 하에 증식하는 것으로 밝혀진 고유한 세포주이다. 문헌 [Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994)]. 이들 세포는 다양한 암에 대해 높은 세포용해 활성을 갖는다. NK-92^® 세포주는 확장 후 예측가능한 수율로 광범위한 항종양 세포독성을 갖는 동종 암성 NK 세포 집단이다. I상 임상 시험에서 그의 안전성 프로파일이 확인되었다. NK-92^®는 비호지킨 림프종을 앓는 대상체의 혈액에서 발견된 후 생체외에서 불멸화되었다. NK-92^® 세포는 NK 세포로부터 유래되지만, 정상 NK 세포에 의해 디스플레이되는 주요 억제성 수용체가 결여된 반면, 대부분의 활성화 수용체를 유지한다. 그러나, NK-92^® 세포는 정상 세포를 공격하지도 않고 인간에서 허용되지 않는 면역 거부 반응을 유도하지도 않는다. NK-92^® 세포주의 특징화는 WO 1998/49268 및 미국 특허 출원 공개 번호 2002-0068044에 개시되어 있다.

NK-92^® 세포주는 CD56^bright, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45 및 CD54 표면 마커를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이는 CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 및 CD34 마커를 디스플레이하지 않는다. 배양에서 NK-92^® 세포의 성장은 재조합 인터류킨 2 (rIL-2)의 존재에 의존적이며, 1 IU/mL의 낮은 용량으로 증식을 유지하는데 충분하다. IL-7 및 IL-12는 장기간 성장을 지원하지도 않고 IL-1α, IL-6, 종양 괴사 인자 α, 인터페론 α 및 인터페론 γ를 포함하는 시험된 다른 시토카인을 지원하지도 않는다. NK-92^®는 1:1의 낮은 이펙터:표적 (E:T) 비에서도 높은 세포독성을 갖는다. 상기 문헌 [Gong, et al.]. NK-92^® 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)에 명칭 CRL-2407로 기탁되어 있다.

지금까지는, 내인성 NK 세포에 대한 연구는 IL-2 (1000 IU/mL)가 선적 동안 NK 세포 활성화에 중요하지만 세포를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 유지할 필요는 없음을 나타내었다. 문헌 [Koepsell, et al., Transfusion 53:398-403 (2013)].

변형된 NK-92^® 세포는 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,618,817, 8,034,332, 및 8,313,943, 미국 특허 출원 공개 번호 2013/0040386 (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것들, 예컨대 야생형 NK-92^®, NK-92^®-CD16, NK-92^®-CD16-γ, NK-92^®-CD16-ζ, NK-92^®-CD16(F157V), NK-92^®mi 및 NK-92^®ci를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

NK-92^® 세포는 NK 세포와 연관된 거의 모든 활성화 수용체 및 세포용해 경로를 보유하지만, 이들 세포 표면 상에 CD16을 발현하지 않는다. CD16은 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 위해 NK 세포를 활성화시키기 위해 항체의 Fc 부분을 인식하고 결합하는 Fc 수용체이다. CD16 수용체의 부재로 인해, NK-92^® 세포는 ADCC 메카니즘을 통해 표적 세포를 용해시킬 수 없으며, 이와 같이 내인성 또는 외인성 항체 (즉, 리툭시맙(Rituximab) 및 허셉틴(Herceptin))의 항종양 효과를 강화시킬 수 없다.

내인성 NK 세포에 대한 연구는 IL-2 (1000 IU/mL)가 선적 동안 NK 세포 활성화에 중요하지만 세포를 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 유지할 필요는 없음을 나타내었다. 문헌 [Koepsell, et al., Transfusion 53:398-403 (2013)]. 그러나, 내인성 NK 세포는 별개의 기원 때문에 큰 부분에서 NK-92^® 세포와 유의하게 상이하며: NK-92^®는 암-유래 세포주인 반면, 내인성 NK 세포는 공여자 (또는 환자)로부터 수확되고 환자에게 주입하기 위해 프로세싱된다. 내인성 NK 세포 제제는 이종 세포 집단인 반면, NK-92^® 세포는 동종 클론 세포주이다. NK-92^® 세포는 세포독성을 유지하면서 배양에서 쉽게 증식하는 반면, 내인성 NK 세포는 그렇지 않다. 또한, NK 세포의 내인성 이종 집단은 높은 밀도로 집합하지 않는다. 또한, 내인성 NK 세포는 NK-92^® 세포에 의해 발현되지 않는 CD-16 수용체를 포함하는 Fc 수용체를 발현한다.

Fc 수용체

Fc 수용체는 항체의 Fc 부분에 결합한다. 여러 Fc 수용체가 공지되어 있으며, 바람직한 리간드, 친화도, 발현 및 항체에의 결합 후 효과에 따라 상이하다.

표 1. 예시적인 Fc 수용체

일부 실시양태에서 NK-92^® 세포는 세포 표면에서 Fc 수용체 단백질을 발현하도록 변형된다.

일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 CD16이다. CD16을 코딩하는 대표적인 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제시되어 있다. CD16을 코딩하는 대표적인 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 제시되어 있다. CD16의 완전 서열은 SwissProt 데이터베이스에서 항목 P08637로 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, NK-92^® 세포는 CD16 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 변형되며, 이는 전장 CD16의 위치 176에서 페닐알라닌을 갖는 전장 자연 발생 CD16 (신호 펩티드 포함)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70% 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CD16 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 위치 176에서 발린을 갖는 전장 자연 발생 CD16 (신호 펩티드 포함)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70% 폴리뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다.

상동성 폴리뉴클레오티드 서열은 CD16의 변이체를 코딩하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 CD16 폴리뉴클레오티드는 길이가 약 150 내지 약 700, 약 750 또는 약 800개의 폴리뉴클레오티드일 수 있지만, 700개 초과 내지 800개의 폴리뉴클레오티드를 갖는 CD16 변이체가 본 개시내용의 범주 내에 있다.

다른 예에서, CD16 아미노산 서열을 변화시키는 다형성을 갖는 cDNA 서열, 예컨대, 예를 들어, CD16 유전자에서 유전적 다형성을 나타내는 개체 간의 대립유전자 변이는 NK-92^® 세포를 변형시키는데 사용된다. 다른 예에서, 인간 CD16의 서열과 상이한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 다른 종으로부터의 CD16 유전자는 NK-92^® 세포를 변형시키는데 사용된다.

예에서, 변이체 폴리펩티드는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개 (부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이유발을 사용하여 제조된다. 부위 지정 돌연변이유발 (Carter, 1986; Zoller and Smith, 1987), 카세트 돌연변이유발, 제한 선택 돌연변이유발 (Wells et al., 1985) 또는 기타 공지된 기술을 클로닝된 DNA에서 수행하여 CD16 변이체를 생산할 수 있다 (Ausubel, 2002; Sambrook and Russell, 2001).

인간 CD16 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 보존적 치환 (이에 의해 한 클래스의 아미노산이 동일한 클래스의 또 다른 아미노산으로 대체됨)은, 치환이 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 한, 개시된 CD16 변이체의 범주 내에 속한다. 보존적 치환은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. (1) 폴리펩티드 백본의 구조, 예컨대 β-시트 또는 α-나선 형태, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위의 측쇄의 벌크에 영향을 미치는 비-보존적 치환은 CD16 폴리펩티드 기능 또는 면역학적 동일성을 변형시킬 수 있다. 비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반한다. 치환은 보존적 치환 부위 또는 보다 바람직하게는 비-보존된 부위에 도입될 수 있다.

일부 실시양태에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 길이가 적어도 200개 아미노산이고, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, CD16 폴리펩티드 변이체는 길이가 적어도 225개 아미노산이고, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2에 대해 적어도 70% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일성을 갖는다.

일부 실시양태에서 CD16 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 CD16 융합 단백질을 코딩할 수 있다. CD16 융합 폴리펩티드는 CD16의 임의의 부분 또는 비-CD16 폴리펩티드와 융합된 전체 CD16을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이종 폴리펩티드 서열이 CD16의 C-말단에 융합되거나 CD16 내부에 위치된 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있다. 전형적으로, CD16 세포질 도메인의 최대 약 30%가 대체될 수 있다. 이러한 변형은 발현을 향상시키거나 세포독성 (예를 들어, ADCC 반응성)을 향상시킬 수 있다. 다른 예에서, 키메라 단백질, 예컨대 Ig-a, Ig-B, CD3-e, CD3-d, DAP-12 및 DAP-10을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 림프구 활성화 수용체로부터의 도메인은 CD16 세포질 도메인의 일부를 대체한다.

융합 유전자는 자동 DNA 합성기, 및 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 간의 상보적 오버행을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다 (Ausubel, 2002). 융합 모이어티에 대한 인-프레임에서 CD16 서브클로닝을 용이하게 하는 많은 벡터가 시판된다.

키메라 항원 수용체

본원에 기재된 바와 같이, NK-92^® 세포는 세포 표면에서 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 추가로 조작된다. 임의적으로, CAR은 종양-특이적 항원에 대해 특이적이다. 종양-특이적 항원은 비제한적인 예로서 US 2013/0189268; WO 1999024566 A1; US 7098008; 및 WO 2000020460 A1에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 종양-특이적 항원은 제한없이, NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19 및 CD33을 포함한다. 추가적인 비제한적 종양-연관 항원, 및 이와 연관된 악성종양은 표 1에서 찾을 수 있다.

표 1: 종양-특이적 항원 및 연관 악성종양

일부 실시양태에서, CAR은 CD19, CD33 또는 CSPG-4를 표적화한다.

임의적으로, CAR은 특정 암 유형과 연관된 항원을 표적화한다. 임의적으로, 암은 백혈병 (급성 백혈병 (예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병 (골수모구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병 포함)) 및 만성 백혈병 (예를 들어, 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성 다혈구증, 림프종 (예를 들어, 호지킨병 및 비호지킨병), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고형 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CAR의 기능을 변경하지 않고 CAR을 코딩하는 아미노산 서열을 변경하도록 돌연변이된다. 예를 들어, "비-필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유발하는 폴리뉴클레오티드 치환은 상기 개시된 CAR에서 이루어질 수 있다. CAR은, 예를 들어, 특허 공개 번호 WO 2014039523; US 20140242701; US 20140274909; US 20130280285; 및 WO 2014099671 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 조작될 수 있다. 임의적으로, CAR은 CD19 CAR, CD33 CAR 또는 CSPG-4 CAR이다.

추가 변형 - 시토카인

NK-92^® 세포의 세포독성은 시토카인 (예를 들어, 인터류킨-2 (IL-2))의 존재에 의존적이다. 상업적 규모의 배양에서 NK-92^® 세포를 유지하고 확장하는데 필요한 외인적으로 첨가된 IL-2를 사용하는 비용은 상당하다. NK92^® 세포의 활성화를 지속하기에 충분한 양으로 인간 대상체에게 IL-2를 투여하는 것은 유해 부작용을 초래할 것이다.

일부 실시양태에서, FcR-발현 NK-92^® 세포는 적어도 하나의 시토카인 및 자살 유전자를 발현하도록 추가로 변형된다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 시토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 또는 그의 변이체이다. 바람직한 실시양태에서, 시토카인은 인간 IL-2이다. IL-2를 코딩하는 대표적인 핵산은 서열식별번호: 3에 제시되어 있고, IL-2의 대표적인 폴리펩티드는 서열식별번호: 4에 제시되어 있다. 특정 실시양태에서 IL-2는 내형질 세망으로 표적화된 변이체이다.

한 실시양태에서, IL-2는 IL-2를 내형질 세망으로 지정하는 신호 서열로 발현된다. 이론에 얽매이지 않지만, IL-2를 내형질 세망으로 지정하는 것은 IL-2를 세포외로 방출하지 않지만 자가분비 활성화에 충분한 수준으로 IL-2의 발현을 허용한다. 문헌 [Konstantinidis et al. "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92^® cells" Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64]을 참조한다. FcR-발현 NK-92^® 세포의 연속적인 활성화는, 예를 들어, 자살 유전자의 존재에 의해 방지될 수 있다.

추가 변형 - 자살 유전자

용어 "자살 유전자"는 세포의 음성 선택을 허용하는 것이다. 자살 유전자는 안전성 시스템으로 사용되어, 유전자를 발현하는 세포가 선택적 작용제의 도입에 의해 사멸되도록 한다. 이는 재조합 유전자가 비제어된 세포 성장을 유발하는 돌연변이를 초래하는 경우에 바람직하다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (TK) 유전자, 시토신 데아미나제 유전자, 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자, 니트로리덕타제 유전자, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) gpt 유전자, 및 이. 콜라이 Deo 유전자를 포함하여 수많은 자살 유전자 시스템이 확인되었다 (또한, 예를 들어, 문헌 [Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. 2002 July; 26(7):783-9] 참조). 본원에 사용된 바와 같은 자살 유전자는 NK-92^® 세포에서 활성이다. 전형적으로, 자살 유전자는 세포에 악영향을 미치지 않지만 특정 화합물의 존재 하에 세포를 사멸시킬 단백질을 코딩한다. 그러므로, 자살 유전자는 전형적으로 시스템의 일부이다.

한 실시양태에서, 자살 유전자는 티미딘 키나제 (TK) 유전자이다. TK 유전자는 야생형 또는 돌연변이체 TK 유전자 (예를 들어, tk30, tk75, sr39tk)일 수 있다. TK 단백질을 발현하는 세포는 간시클로버를 사용하여 사멸될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 자살 유전자는 5-플루오로시토신의 존재 하에 세포에 독성인 시토신 데아미나제이다. 문헌 [Garcia-Sanchez et al. "Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation." Blood 1998 Jul 15;92(2):672-82].

또 다른 실시양태에서, 자살 유전자는 이포스파미드 또는 시클로포스파미드의 존재 하에 독성인 시토크롬 P450이다. 예를 들어, 문헌 [Touati et al. "A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response." Curr Gene Ther. 2014;14(3):236-46]을 참조한다.

또 다른 실시양태에서, 자살 유전자는 iCas9이다. 문헌 [Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Engl J Med 365: 1673-1683]. 또한, 문헌 [Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13]을 참조한다. iCas9 단백질은 소분자 AP1903의 존재 하에 아폽토시스를 유도한다. AP1903은 생물학적으로 비활성인 소분자이며, 이는 임상 연구에서 내약성이 양호한 것으로 제시되었고, 입양 세포 요법의 맥락에서 사용되었다.

한 실시양태에서, 변형된 NK-92^® 세포는 환자에게 투여하기 전에 조사된다. NK-92^® 세포의 조사는, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,034,332에 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 한 실시양태에서, 자살 유전자를 발현하도록 조작되지 않은 변형된 NK-92^® 세포가 조사된다.

트랜스진 발현

트랜스진 (예를 들어, CD19 CAR 및 CD16)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 메카니즘에 의해 발현 벡터로 조작될 수 있다. 트랜스진은 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터로 조작될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 트랜스진은 동일한 벡터로 조작된다.

일부 실시양태에서, 벡터는 세포의 게놈으로의 트랜스진(들)의 혼입을 허용한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 양성 선택 마커를 갖는다. 양성 선택 마커는 유전자를 발현하지 않는 세포를 사멸시키는 조건 하에 세포가 성장할 수 있게 하는 임의의 유전자를 포함한다. 비제한적인 예는 항생제 내성, 예를 들어, 게네티신 (Tn5로부터의 Neo 유전자)을 포함한다.

임의의 수의 벡터가 Fc 수용체 및/또는 CAR을 발현하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드이다. 한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

트랜스진은 비제한적인 예로서, 감염, 전기천공, 리포펙션, 뉴클레오펙션 또는 "유전자-총"을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 형질감염 방법을 사용하여 NK-92^® 세포로 도입될 수 있다.

개시된 방법 및 조성물을 위해 사용될 수 있거나, 이와 함께 사용될 수 있거나, 이의 제조에 사용될 수 있거나, 그의 산물인 재료, 조성물 및 구성성분이 개시되어 있다. 이들 및 다른 재료는 본원에 개시되어 있으며, 이들 재료의 조합, 서브세트, 상호작용, 그룹 등이 개시될 때, 이들 화합물의 각각의 다양한 개별적 및 집합적 조합 및 순열에 대한 특정 언급은 명백하게 개시되지 않을 수 있음이 이해되며, 각각은 본원에서 구체적으로 고려되고 설명된다. 예를 들어, 방법이 개시되고 논의되고 방법을 포함하여 수많은 분자에 이루어질 수 있는 수많은 변형이 논의되는 경우, 방법의 각각 및 모든 조합 및 순열, 및 가능한 변형은 구체적으로 반대로 표시되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 마찬가지로, 이들의 임의의 서브세트 또는 조합이 또한 구체적으로 고려되고 개시되어 있다. 이 개념은 개시된 조성물을 사용하는 방법에서의 단계를 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 개시내용의 모든 측면에 적용된다. 그러므로, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 있는 경우, 이들 추가 단계 각각은 개시된 방법의 임의의 특정 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행될 수 있으며, 각각의 이러한 조합 또는 조합들의 서브세트는 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 고려되어야 하는 것으로 이해된다.

실시양태

본원에 개시된 방법 및 조성물은 하기의 예시적인 실시양태를 포함한다.

실시양태 1. 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지에서 NK-92^® 세포를 배양하는 것을 포함하는, NK-92^® 세포를 배양하는 방법으로서, 여기서 NK-92^® 세포 배양물은 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배지에서 배양된 대조군 NK-92^® 세포와 비교하여 감소된 응괴를 갖는 것인 방법.

실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, NK-92^® 세포가 대조군 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지한 것인 방법.

실시양태 3. 실시양태 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없는 것인 방법.

실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 세포가 적어도 2 리터의 배양 배지에서 배양되는 것인 방법.

실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 비-이온성 계면활성제가 폴록사머 188인 방법.

실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 0.025% 내지 0.06%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 방법.

실시양태 7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 배양 배지가 0.05%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 방법.

실시양태 8. 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, NK-92^® 세포 배양물이 대조군 세포 배양물과 비교하여 감소된 세포 집합체를 갖는 것인 방법.

실시양태 9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 세포 집합체의 백분율의 감소가 적어도 40%인 방법.

실시양태 10. 실시양태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, NK-92^® 세포 배양물이 배양 3일 후 6% 미만의 세포 집합체를 갖는 것인 방법.

실시양태 11. 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, NK-92^® 세포가 적어도 80%의 생존력을 갖는 것인 방법.

실시양태 12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, NK-92^® 세포가 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.

실시양태 13. 배양 배지에서 응집물을 감소시키는 방법으로서, 배양 배지에 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응집물을 갖는 것인 방법.

실시양태 14. NK-92^® 세포 및 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물로서, NK-92 세포 및 비-이온성 계면활성제가 결여된 배지를 포함하는 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응괴를 갖는 세포 배양물.

실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, NK-92^® 세포가 적어도 3일 동안 배양된 것인 세포 배양물.

실시양태 16. 실시양태 14 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없는 것인 세포 배양물.

실시양태 17. 실시양태 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, NK-92^® 세포가 대조군 배양물에서의 NK-92 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지한 것인 세포 배양물.

실시양태 18. 실시양태 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 비-이온성 계면활성제가 폴록사머 188인 세포 배양물.

실시양태 19. 실시양태 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 0.025% 내지 0.06%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 세포 배양물.

실시양태 20. 실시양태 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 0.05%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 세포 배양물.

실시양태 21. 실시양태 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, NK-92^® 세포가 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 세포 배양물.

실시양태 22. 실시양태 14 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 적어도 2 리터의 부피를 갖는 것인 세포 배양물.

실시양태 23. 실시양태 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 적어도 10 리터의 부피를 갖는 것인 세포 배양물.

실시예

하기 실시예는 단지 설명을 위한 것이며, 제한으로 해석되어서는 안된다. 하기 실시예를 성공적으로 수행하도록 유사하게 허용하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 다양한 대안적인 기술 및 절차가 있다.

실시예 1: 플루로닉 F-68은 haNK ^® 세포 배양물에서 응괴를 감소시켰다

한 참조 연구에서, G-Rex 플라스크로부터의 haNK^® 세포를 2개의 별도의 2-리터 WAVE 백 (즉, 세포 lot#D0917C186 및 세포 lot#D0917C187)에 접종하였다. 두 WAVE 백으로부터의 세포를 조합하여, 2일 후 20-리터 WAVE 백 (10 L 작업 부피)을 시딩하였다. 1일 후, 백색 침전 및 응집물이 20-리터 WAVE 백 D1217C197에서 관찰되었으며 (도 10), 세포의 생존력은 50% 미만이었다. 백업 배양으로 작용하도록 배양이 20-리터 배양에서 확장되었을 때 D1217C199를 동시에 설정하였으며; 침전 및 응집물이 또한 관찰되었으며, 세포 생존력은 90% 미만이었다. 도 1을 참조한다. 이는 프로세스가 확장가능하지 않고 그 후 확장이 종료되었음을 나타낸다.

또 다른 참조 연구에서, G-Rex 플라스크로부터의 haNK^® 세포를 0일차에 2개의 별도의 2-리터 WAVE 백에 접종하였다. 두 WAVE로부터의 세포를 조합하여, 3일차에 10-리터 WAVE 백 및 2-리터 WAVE 백을 시딩하였다. 10-리터 WAVE 백으로부터의 세포를 사용하여 6일차에 20-리터 WAVE 백에 접종하였다. 백색 침전 및 응집물이 10-리터 WAVE 백에서 관찰되었다. 세포 성장은 감소되었고, 생존력은 80% 미만이었다. 20-리터 백으로 전달 시, 침전물 크기가 더 크게 성장하였다. WAVE 배양이 종료되었다. 이는 또한 프로세스가 확장가능하지 않았음을 나타낸다. 도 2를 참조한다.

작업 실시예로서, G-Rex 플라스크로부터의 haNK^® 세포를 10% 용액 (Cat# 24040-032)으로서 써모 피셔 사이언티픽에서 구입한 0.05% 플루로닉 F-68의 존재 하에 2개의 별도의 2-리터 WAVE 백에 접종하였다. 두 WAVE 백으로부터의 세포를 조합하여 0일차에 10-리터 WAVE 백 (5L 작업 부피)을 시딩하였다. 10-리터 WAVE 백으로부터의 세포를 사용하여 4일차에 2개의 20-리터 WAVE 백을 접종하였다. 두 20L WAVE 백으로부터의 세포를 별도의 날에 연속 원심분리에 의해 수확하였다. 본 연구에서 모든 WAVE 배양물은 0.05% 플루로닉 F-68을 포함하였다. 결과는 연구 전반에 걸쳐 WAVE 바이오리액터에서 침전물이 관찰되지 않았음을 제시한다.

이들 연구의 결과는 표 1에 요약된 바와 같이, 0.05% 플루로닉 F-68이 haNK^® 배양물이 응괴를 형성하는 것을 방지할 수 있었고, 그러므로 0.05% 플루로닉 F-68을 배양물에 첨가함으로써 haNK^® 배양물을 확장할 수 있었음을 나타낸다. 도 3을 참조한다.

실시예 2: 플루로닉 F-68은 aNK™ 세포 배양물에서 응괴를 감소시켰다

aNK™ 세포 배양물로 유사한 실험을 수행하였다. 한 참조 연구에서, G-Rex 플라스크로부터의 aNK™ 세포를 0일차에 2개의 별도의 2-리터 WAVE 백에 접종하였다. 두 WAVE로부터의 세포를 조합하여, 20-리터 WAVE 백 (10L 작업 부피) 및 10-리터 WAVE 백 (5L 작업 부피)을 시딩하였다. 세포 배양물에서 응괴에도 불구하고 3일차에 연속 원심분리에 의해 20-리터 백으로부터의 세포를 수확하였다. 3일 후, 백색 침전 및 응집물이 20-리터 WAVE 백에서 관찰되었다. 10-리터 WAVE 배양은 더 큰 침전물 및 약 75%의 낮은 세포 생존력으로 인해 중지되었다. 도 4를 참조한다.

또 다른 참조 연구에서, 교반형-탱크 바이오리액터로부터의 aNK™ 세포를 0일차에 2개의 별도의 2-리터 WAVE 백에 접종하였다. <50%의 감소된 생존력으로 인해, 20-리터 WAVE 백에서 배양이 종료되었다. 두 2-리터 WAVE로부터의 세포를 조합하여, 5일차에 2개의 별도의 10-리터 WAVE 백을 시딩하였다. 10-리터 WAVE 백으로부터의 세포를 사용하여 10일차에 50-리터 백에 접종하였다. 세포 배양물에서 응괴에도 불구하고 14일차에 연속 원심분리에 의해 50-리터 백으로부터의 세포를 수확하였다. 백색 침전 및 응집물이 20-리터 WAVE 백에서 관찰되었다. 세포 성장이 감소하여 확장이 중지되었다. 이는 WAVE 배양물이 많은 침전을 갖고 프로세스가 확장가능하지 않았음을 나타낸다. 도 5를 참조한다.

작업 실시예로서, G-Rex 플라스크로부터의 aNK™ 세포를 0일차에 0.05% 플루로닉 F-68의 존재 하에 2개의 별도의 2-리터 WAVE 백에 접종하였다. 두 바이오리액터로부터의 세포를 조합하여 5일차에 10-리터 WAVE 백을 시딩하였다. 10-리터 백으로부터의 세포를 2개의 별도의 20-리터 WAVE 백으로 전달하였다. 14일차에 연속 원심분리를 사용하여 두 백으로부터의 세포를 수확하였다. WAVE 백 중 어느 것에서도 침전이 관찰되지 않았다. 도 6을 참조한다. WAVE 바이오리액터 Lot # F0517C412에서 성장된 세포는 K562 표적 세포에 대해 강력한 활성을 나타내었다 (표 3 참조).

이들 연구의 결과는 표 2에 요약된 바와 같이, 배양물에서 응괴의 발생 없이 0.05% 플루로닉 F-68의 존재 하에 haNK^® 배양물을 확장할 수 있었음을 나타낸다.

실시예 3: 플루로닉 F-68-함유 배지에서 배양된 NK-92 ^® 세포의 세포독성

플루로닉 F-68의 존재 하에 20-리터 WAVE 백에서 배양된 haNK 세포의 샘플 (Lot# E1217C313)을 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에 대해 시험하였다. 플루로닉 F-68로 처리되지 않은 확장 전 플라스크로부터의 참조 샘플을 또한 동시에 시험하였다. 샘플 또는 참조 샘플을 리툭산 항체의 존재 하에 10:1의 이펙터:표적 비로 칼세인-로딩된 표적 세포인 라모스 세포와 혼합하였다. 칼세인 방출을 3시간 인큐베이션 후 형광 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 세포독성은 칼세인 방출의 백분율로 표시하였다. 각 샘플을 삼중으로 시험하였으며, 결과는 표 3에 제시되어 있다.

유사하게, 플루로닉 F-68의 존재 하에 20-리터 WAVE 백에서 배양된 aNK™ 세포의 샘플 (Lot# F0517C412)을 세포독성에 대해 시험하였다. 플루로닉 F-68로 처리되지 않은 확장 전 플라스크로부터의 참조 샘플을 또한 동시에 시험하였다. 샘플 또는 참조 샘플을 10:1의 이펙터:표적 비로 칼세인-로딩된 표적 세포인 K562 세포와 혼합하였다. 칼세인 방출을 3시간 인큐베이션 후 형광 플레이트 판독기에 의해 평가하였다. 세포독성은 칼세인 방출의 백분율로 표시하였다. 각 샘플을 삼중으로 시험하였으며, 결과는 표 3에 제시되어 있다.

결과는 표 3에 제시된 바와 같이, 플루로닉 F-68로 처리된 세포의 세포독성이 그렇게 처리되지 않은 세포의 세포독성과 실질적으로 동일함을 나타내며, 플루로닉 F-68을 성장 배지에 첨가하는 것이 NK-92^® 세포의 세포독성에 유해한 영향을 미치지 않음을 시사한다.

실시예 4: NK-92 ^® 세포 배양물에서 응괴를 방지하는데 필요한 플루로닉 F-68의 최소 유효 농도의 확인

본 실시예는 응괴를 방지하는데 필요한 플루로닉 F-68의 최소 유효 농도를 확인하기 위해 수행된 연구를 설명한다. 플루로닉 F-68을 각각 0%, 0.0125%, 0.025% 및 0.05%의 농도로 WAVE 바이오리액터에서 haNK 세포 배양물에 첨가하였다. 플루로닉 F-68이 없는 배양물 또는 0.125% 플루로닉 F-68을 함유한 배양물에서 응괴가 관찰되었다. 감소된 양이긴 하지만 0.025% 플루로닉 F-68을 함유한 배양물에서 응괴가 여전히 또한 있었다. 특히, 0.05% 플루로닉 F-68의 첨가에 의해 응괴 및 혼탁이 완전히 방지되었다. 도 7을 참조한다. 혼탁한 외관으로 인해, WAVE 배양물 중 2개 (0% 및 0.0125% 플루로닉 F-68)는 종료되었지만, 나머지 2개의 배양물을 추가 5일 동안 별도의 10 L 백에서 확장하였다. NC-200 세포 계수기를 사용하여 세포를 분석하고, 세포 집합체의 백분율은 표 4에 제시되어 있다.

실시예 5. NC-200 세포 계수기를 사용한 NK-92 ^® 세포 생존력에 대한 플루로닉 F-68의 효과의 평가

WAVE 바이오리액터에서 플루로닉 F-68의 부재 또는 존재 하에 확장된 haNK^® 세포를 NC-200 세포 계수기를 사용하여 그의 건강 및 생존력에 대해 평가하였다. 도 8a에 제시된 바와 같이, 플루로닉 F-68을 갖지 않는 배양물로부터의 아크리딘 오렌지 플롯에 다중 피크가 나타났으며, 이는 배양물이 건강하지 않았음을 나타낸다. 세포 생존력은 70.2%였고, 5개 이상의 세포와 집합체를 이룬 세포는 샘플 중 총 세포의 17%를 차지한다. 대조적으로, 0.05% 플루로닉 F-68을 함유하는 배양물에서는 오직 단일 피크만이 관찰되었으며, 이는 세포가 건강하였음을 나타낸다. 또한, 세포 생존력은 94.9%로 증가하였으며, 5개 이상의 세포와 집합체를 이룬 세포의 백분율이 단지 2%에 불과하다는 점에서 알 수 있듯이, 세포에는 응괴가 실질적으로 없었다 (도 8b). 플루로닉 F-68의 첨가는 응괴를 88%만큼 감소시켰다.

NC-200 세포 계수기를 사용하여 WAVE 바이오리액터에서 플루로닉 F-68의 부재 또는 존재 하에 확장된 aNK™ 세포에 대해 유사한 연구를 수행하였다. haNK^® 세포와 마찬가지로, 플루로닉 F-68을 갖지 않는 배양물로부터의 아크리딘 오렌지 플롯에 다중 피크가 나타났으며, 이는 배양물이 건강하지 않았음을 나타낸다. 세포 생존력은 88.1%였고, 세포의 32%는 5개 이상의 세포와 집합체를 이루었다. 도 9a를 참조한다. 대조적으로, 0.05% 플루로닉 F-68을 함유하는 배양물에서는 오직 단일 피크만이 관찰되었으며, 이는 세포가 건강하였음을 나타낸다. 또한, 세포 생존력은 96.8%로 개선되었으며, 세포 집합체의 백분율은 단지 3%로 감소되었다 (도 9b) - 90%의 감소.

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비공식 서열 목록

서열식별번호: 1 고친화도 변이체 이뮤노글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-A 핵산 서열 (전장 형태).

서열식별번호: 2 고친화도 변이체 이뮤노글로불린 감마 Fc 영역 수용체 III-A 아미노산 서열 (전장 형태). 위치 176의 Val은 밑줄이 그어져 있다.

서열식별번호: 3 ER IL-2 핵산 서열

서열식별번호: 4 ER IL-2 (ER 체류 신호는 밑줄이 그어져 있음) 아미노산 서열

SEQUENCE LISTING <110> NANTKWEST, INC. <120> OPTIMIZATION OF NK-92 CELL GROWTH USING POLOXAMER <130> 104066-1140024-8710WO <140> PCT/US2019/033312 <141> 2019-05-21 <150> 62/674,723 <151> 2018-05-22 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtggcagc tgctgctgcc tacagctctc ctgctgctgg tgtccgccgg catgagaacc 60 gaggatctgc ctaaggccgt ggtgttcctg gaaccccagt ggtacagagt gctggaaaag 120 gacagcgtga ccctgaagtg ccagggcgcc tacagccccg aggacaatag cacccagtgg 180 ttccacaacg agagcctgat cagcagccag gccagcagct acttcatcga cgccgccacc 240 gtggacgaca gcggcgagta tagatgccag accaacctga gcaccctgag cgaccccgtg 300 cagctggaag tgcacatcgg atggctgctg ctgcaggccc ccagatgggt gttcaaagaa 360 gaggacccca tccacctgag atgccactct tggaagaaca ccgccctgca caaagtgacc 420 tacctgcaga acggcaaggg cagaaagtac ttccaccaca acagcgactt ctacatcccc 480 aaggccaccc tgaaggactc cggctcctac ttctgcagag gcctcgtggg cagcaagaac 540 gtgtccagcg agacagtgaa catcaccatc acccagggcc tggccgtgtc taccatcagc 600 agctttttcc cacccggcta ccaggtgtcc ttctgcctcg tgatggtgct gctgttcgcc 660 gtggacaccg gcctgtactt cagcgtgaaa acaaacatca gaagcagcac ccgggactgg 720 aaggaccaca agttcaagtg gcggaaggac ccccaggaca agtga 765 <210> 2 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 3 <211> 483 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtaccgga tgcagctgct gagctgtatc gccctgtctc tggccctcgt gaccaacagc 60 gcccctacca gcagcagcac caagaaaacc cagctgcagc tggaacatct gctgctggac 120 ctgcagatga tcctgaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac ccggatgctg 180 accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgaactga aacatctgca gtgcctggaa 240 gaggaactga agcccctgga agaagtgctg aacctggccc agagcaagaa cttccacctg 300 aggcccaggg acctgatcag caacatcaac gtgatcgtgc tggaactgaa aggcagcgag 360 acaaccttca tgtgcgagta cgccgacgag acagctacca tcgtggaatt tctgaaccgg 420 tggatcacct tctgccagag catcatcagc accctgaccg gctccgagaa ggacgagctg 480 tga 483 <210> 4 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu 20 25 30 Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu 65 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys 85 90 95 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 100 105 110 Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 125 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Gly Ser Glu Lys Asp Glu Leu 145 150 155 160

Claims

0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지에서 NK-92^® 세포를 배양하는 것을 포함하는, NK-92^® 세포를 배양하는 방법으로서, 여기서 NK-92^® 세포 배양물은 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배지에서 배양된 대조군 NK-92^® 세포와 비교하여 감소된 응괴를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, NK-92^® 세포가 대조군 NK-92^® 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지한 것인 방법.
제1항에 있어서, 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없는 것인 방법.
제1항에 있어서, 세포가 적어도 2 리터의 배양 배지에서 배양되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 비-이온성 계면활성제가 폴록사머 188인 방법.
제5항에 있어서, 배양 배지가 0.025% 내지 0.06%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 배양 배지가 0.05%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, NK-92^® 세포 배양물이 대조군 세포 배양물과 비교하여 감소된 세포 집합체를 갖는 것인 방법.
제8항에 있어서, 세포 집합체의 백분율의 감소가 적어도 40%인 방법.
제8항에 있어서, NK-92^® 세포 배양물이 배양 3일 후 6% 미만의 세포 집합체를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, NK-92^® 세포가 적어도 80%의 생존력을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, NK-92^® 세포가 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
배양 배지에서 응집물을 감소시키는 방법으로서, 배양 배지에 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 첨가하는 것을 포함하며, 여기서 배양 배지는 비-이온성 계면활성제가 결여된 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응집물을 갖는 것인 방법.
NK-92^® 세포 및 0.025% 내지 0.9%의 비-이온성 계면활성제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 세포 배양물로서, NK-92 세포 및 비-이온성 계면활성제가 결여된 배지를 포함하는 대조군 배양물과 비교하여 감소된 응괴를 갖는 세포 배양물.
제14항에 있어서, NK-92^® 세포가 적어도 3일 동안 배양된 것인 세포 배양물.
제14항에 있어서, 세포 배양물에는 응괴가 실질적으로 없는 것인 세포 배양물.
제14항에 있어서, NK-92^® 세포가 대조군 배양물에서의 NK-92 세포와 실질적으로 동일한 세포독성을 유지한 것인 세포 배양물.
제14항에 있어서, 비-이온성 계면활성제가 폴록사머 188인 세포 배양물.
제14항에 있어서, 세포 배양물이 0.025% 내지 0.06%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 세포 배양물.
제14항에 있어서, 세포 배양물이 0.05%의 폴록사머 188을 포함하는 것인 세포 배양물.
제14항에 있어서, NK-92^® 세포가 시토카인, Fc 수용체, 키메라 항원 수용체 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 세포 배양물.
제14항에 있어서, 세포 배양물이 적어도 2 리터의 부피를 갖는 것인 세포 배양물.
제22항에 있어서, 세포 배양물이 적어도 10 리터의 부피를 갖는 것인 세포 배양물.