ES2925553T3 - Optimización del crecimiento de células NK-92 mediante el uso de poloxámero - Google Patents
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Abstract
En el presente documento se proporcionan métodos para cultivar células NK-92® usando medios de crecimiento que contienen un tensioactivo no iónico de modo que el cultivo celular haya reducido la formación de grumos en comparación con las células NK-92® de control que han sido cultivadas en un medio de control que carece del agente no iónico. tensioactivo iónico. El medio de cultivo comprende del 0,025 al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Optimización del crecimiento de células NK-92 mediante el uso de poloxámero
Solicitud relacionada
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/674,723, presentada el 22 de mayo de 2018.
Antecedentes de la invención
Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos que constituyen un componente principal del sistema inmunitario innato. Las células NK, que generalmente representan aproximadamente del 10-15 % de los linfocitos circulantes, se unen y eliminan las células diana, que incluyen las células infectadas por virus y muchas células malignas, de forma no específica con respecto al antígeno y sin sensibilización inmunitaria previa. Herberman y otros, Science 214:24 (1981). La eliminación de las células diana ocurre por la inducción de la lisis celular. Las células NK que se usan para este fin se aíslan de la fracción de linfocitos de sangre periférica ("PBL") de la sangre del sujeto, se expanden en cultivo de células con el fin de obtener un número suficiente de células y luego se reinfunden en el sujeto. Se ha demostrado que las células NK son algo efectivas tanto en la terapia ex vivo como en el tratamiento in vivo. Sin embargo, dicha terapia se complica por el hecho de que no todas las células NK son citolíticas y la terapia es específica para el paciente tratado.
Las células NK-92® se han evaluado previamente como un agente terapéutico en el tratamiento de determinados tipos de cáncer. A diferencia de las células NK, NK-92® es una línea celular citolítica de cáncer, que se descubrió en la sangre de un sujeto que padecía un linfoma no Hodgkins y luego se inmortalizó ex-vivo. Las células NK-92® carecen de los principales receptores inhibitorios que presentan las células NK normales, pero retienen la mayoría de los receptores activadores. Sin embargo, las células NK-92®, no atacan a las células normales ni provocan una respuesta de rechazo inmunitario inaceptable en humanos. La caracterización de la línea celular NK-92® se describe, por ejemplo, en el documento WO 1998/49268 y la patente de Estados Unidos núm. 8,034,332. Tam y otros (Cytotherapy 2003;5(3):259-72) describe un protocolo que permite una expansión >200 veces de células NK-92® dentro de un período de 2-2,5 semanas bajo estándares GMP, en calidad y cantidad adecuada para la inmunoterapia adoptiva clínica.
Aunque las células NK-92® tienen un enorme potencial terapéutico, el crecimiento de las células NK-92® a gran escala ha sido un desafío, lo que limita las aplicaciones terapéuticas de estas células. En particular, la expansión es a menudo acompañada de aumentos significativos en los precipitados y floculantes del cultivo, un fenómeno comúnmente denominado como "aglutinación". Estos precipitados de gran tamaño provocan muchas consecuencias no deseadas, que incluyen el crecimiento celular lento, la viabilidad celular baja y el recuento inexacto de células, lo que puede dar como resultado una formulación de dosificación incorrecta. La formación de agrupamientos en el cultivo de células también puede dar como resultado la alteración del lecho celular en la centrifugación, lo que conduce a una recuperación celular deficiente durante la recolección de células y una citotoxicidad celular inconsistente contra las células tumorales diana.
Breve resumen
En la presente descripción se proporcionan métodos para cultivar las células NK-92® mediante el uso de un medio de crecimiento que contiene un tensioactivo no iónico, en donde las células NK-92® han reducido la formación de agrupamientos en comparación con el control de células NK-92® que han sido cultivadas en un medio de control que carece del tensioactivo no iónico. El medio de cultivo comprende del 0,025 al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188. Las células NK-92® pueden modificarse para expresar uno o más transgenes, por ejemplo, las células NK-92® pueden modificarse para expresar una citocina, un receptor Fc, un receptor de antígeno quimérico o sus combinaciones. También se proporcionan en la presente descripción cultivos celulares NK-92® que comprenden las células NK-92® y un medio de cultivo que comprende 0,025 %-0,9 % del tensioactivo no iónico. En la presente descripción se proporciona un método para cultivar células NK-92® que comprenden cultivar las células NK-92® en un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, en donde el cultivo de células de NK-92® redujo la formación de agrupamientos en comparación con el control de células NK-92® que han sido cultivadas en un medio de control que carece del tensioactivo no iónico. Opcionalmente, las células NK-92® mantuvieron sustancialmente la misma citotoxicidad que el control de células NK-92®. Adicionalmente, el cultivo de células está sustancialmente libre de agrupamientos con el tensioactivo no iónico Poloxámero 188. Opcionalmente, las células se cultivan en al menos 2 litros de medio de cultivo antes de que se puedan observar a simple vista los beneficios visuales del aditivo.
El medio de cultivo para cultivar las células NK-92® puede comprender de 0,025 % a 0,06 % de Poloxámero 188, por ejemplo, 0,05 % de Poloxámero 188. Opcionalmente el cultivo de células de NK-92® tiene agregados celulares reducidos en comparación con un cultivo de control. En algunos casos, la reducción del porcentaje de agregados
celulares es de al menos un 40 %. Opcionalmente, el cultivo de células de NK-92® tiene menos del 6 % de agregados celulares después de 3 días de cultivo.
Las células NK-92® cultivadas mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción pueden tener una viabilidad de al menos un 80 %. Pueden mantener sustancialmente la misma citotoxicidad que las células NK-92® en el cultivo de control. Las células NK-92® pueden comprender una citocina, un receptor Fc, un receptor de antígeno quimérico o sus combinaciones.
También se proporciona en la presente descripción un método para reducir los floculantes en un medio de cultivo, el método comprende agregar al medio de cultivo del 0,025 % al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, en donde el medio de cultivo tiene floculantes reducidos en comparación con el cultivo de control que carece del tensioactivo no iónicos. También se proporciona en la presente descripción un cultivo de células que comprende las células NK-92® y un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % del tensioactivo no iónico, en donde el cultivo de células tiene una agrupamientos reducidos en comparación con el cultivo de control que comprende las células NK-92® y un medio que carece del tensioactivo no iónico. En algunos casos, el tensioactivo no iónico es Poloxámero 188. Opcionalmente, las células NK-92® se cultivaron durante al menos 3 días. Opcionalmente, el cultivo de células está sustancialmente libre de agrupamientos. Opcionalmente, las células NK-92® mantienen sustancialmente la misma citotoxicidad que las células NK-92® en un cultivo de control. Opcionalmente, el cultivo de células de la de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el cultivo de células comprende del 0,025 % al 0,06 %, por ejemplo, el 0,05 % del Poloxámero 188. Las células NK-92® pueden comprender una citocina, un receptor Fc, un receptor de antígeno quimérico o sus combinaciones. Opcionalmente, el cultivo de células tiene un volumen de al menos 2 litros, por ejemplo, al menos 10 litros.
La descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son ilustrativas y explicativas y están destinadas a proporcionar una explicación adicional de la descripción. Otros objetos, ventajas y características novedosas serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.
Breve descripción de las figuras
Los objetos, características y ventajas se apreciarán más fácilmente con referencia a la siguiente descripción cuando se considere junto con las figuras adjuntas.
La Figura 1 muestra un primer plan esquemático de expansión de las células haNK® en un Biorreactor WAVE en la ausencia de Poloxámero 188 (Pluronic F-68). Se observaron agrupamientos y baja viabilidad celular.
La Figura 2 muestra un segundo plan esquemático de expansión de las células haNK® en un Biorreactor WAVE en la ausencia de Poloxámero 188 (Pluronic F-68) y resultados. Se observaron agrupamientos y baja viabilidad celular.
La Figura 3 muestra un plan esquemático de expansión de las células haNK® en un Biorreactor WAVE en la presencia de 0,05 % de Poloxámero 188 (Pluronic F-68). El cultivo estaba libre de agrupamientos.
La Figura 4 muestra un primer plan esquemático de expansión de las células aNK™ en un Biorreactor WAVE en la ausencia de Poloxámero 188 (Pluronic F-68). Se observaron agrupamientos.
La Figura 5 muestra un segundo plan esquemático de expansión de las células aNK™ en un Biorreactor WAVE en la ausencia de Poloxámero 188 (Pluronic F-68). Se observaron agrupamientos.
La Figura 6 muestra un plan esquemático de expansión de las células aNK™ en un Biorreactor WAVE en la presencia de 0,05 % de Poloxámero 188 (Pluronic F-68). El cultivo estaba libre de agrupamientos.
La Figura 7 muestra un plan esquemático de expansión de las células haNK® en un Biorreactor WAVE en la ausencia o presencia de varias titulaciones de Poloxámero 188 (Pluronic F-68). la formación de agrupamientos en los cultivos haNK® se redujeron a medida que aumentaba la concentración de Poloxámero 188 (Pluronic F-68).
Las Figuras 8Ay 8B muestran los perfiles NC-200 de las células haNK® de un Biorreactor WAVE en la ausencia de Poloxámero 188 (Pluronic F-68) (Figura 8A) y en presencia de 0,05 % de Poloxámero 188 (Pluronic F-68) (Figura 8B).
Las Figuras 9A y 9B muestran los perfiles NC-200 de las células aNK™ de un Biorreactor WAVE en la ausencia de Poloxámero 188 (Pluronic F-68) (Figura 9A) y en presencia de Poloxámero 188 al 0,05 % (Pluronic F-68) (Figura 9B).
La Figura 10 muestra una imagen de las células cultivadas NK-92® en las bolsas WAVE en la ausencia de Poloxámero 188, donde se observaron agolpamientos.
Descripción detallada de la invención
En la presente descripción se proporcionan métodos para cultivar las células NK-92® mediante el uso de medios de crecimiento que pueden reducen la formación de agolpamientos. En algunos casos, la células NK-92® se cultivan en un medio de crecimiento y las células están sustancialmente libres de agrupamientos celulares. El medio de cultivo comprende del 0,025 al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188. Las células NK-92® pueden modificarse para expresar uno o más transgenes, por ejemplo, una citocina, un receptor Fc, un receptor de antígeno quimérico o sus combinaciones. También se proporcionan en la presente descripción cultivos celulares NK-92® que comprenden las células NK-92® y un medio de cultivo que comprende 0,025 %-0,9 % del tensioactivo no iónico.
Terminología
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica.
En esta descripción y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que se definirán para tener los siguientes significados:
La terminología usada en la presente descripción es solo con el objetivo de describir las modalidades particulares y no pretende ser limitante. Como se usa en la presente descripción, las formas singulares "un", "uno(a)" y "el(la)" se pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto claramente lo indique de cualquier otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula asesina natural" incluye una pluralidad de células asesinas naturales.
Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración, cantidades y peso molecular, incluidos los intervalos, son aproximaciones que varían (+) o (-) por incrementos de 0,1 o 1,0, según corresponda. Debe entenderse, aunque no siempre se establezca explícitamente, que todas las designaciones numéricas pueden estar precedidas por el término "aproximadamente". Todas las concentraciones en esta descripción son concentraciones volumen/volumen.
Como comprenderá un experto en la técnica, para cualquiera y todos los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos descritos en la presente descripción abarcan también cualquiera y todos los subintervalos posibles y sus combinaciones de subintervalos. Cualquier intervalo enumerado se puede reconocer fácilmente como suficientemente descriptivo y que permite que el mismo intervalo se divida en al menos dos mitades iguales, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc. Como un ejemplo no limitante, cada intervalo discutido en la presente descripción puede descomponerse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. Como también comprenderá un experto en la técnica todo lenguaje tal como "hasta", "al menos", "superior", "inferior", y similares incluyen el número citado y se refieren a intervalos que pueden ser subsecuentemente divididos en subintervalos como se discutió anteriormente. Finalmente, como comprenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada miembro individual. Así, por ejemplo, un grupo que tiene 1-3 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, o 3 células. De manera similar, un grupo que tiene 1-5 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, 3, 4 o 5 células, etcétera.
Debe comprenderse también, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos en la presente descripción son meramente ilustrativos y que los equivalentes de estos se conocen en la técnica.
"Opcional" u "opcionalmente" significan que el suceso o circunstancia descrita subsecuentemente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos donde el evento o circunstancia ocurre y casos en los que no.
Para los fines de esta invención y a menos que se indique de cualquier otra manera, el término "NK-92®" o "NK92®' pretende referirse a las líneas celulares NK-92 originales®, así como también las líneas celulares NK-92®, clones de las células NK-92® y las células NK-92® que han sido modificadas (por ejemplo, mediante la introducción de genes exógenos). Las células NK-92® y sus modificaciones ilustrativas y no limitantes de se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 7,618,817; 8,034,332; 8,313,943; 9,181,322; 9,150,636; y publicadas en la solicitud de Estados Unidos núm. 10/008,955, e incluyen el tipo silvestre NK-92®, NK-92®-CD16, NK-92®-CD16-y, NK-92®-CD16-5, NK-92®-CD16(F176V), NK-92®MI, y NK-92®CI. Las células NK-92® son conocidas por los expertos en la técnica, para quienes dichas células están fácilmente disponibles de NantKwest, Inc.
Como se usa en la presente descripción, el término "células aNK™" se refiere a las células NK-92 parentales.
Como se usa en la presente descripción, el término "células haNK™" se refiere a las células NK-92® que se modificaron para expresar el receptor Fc.
Como se usa en la presente descripción, el término "células tank®" se refiere a las células NK-92® que se modificaron para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) con afinidad por un antígeno específico del cáncer, un antígeno asociado al cáncer o un antígeno específico del tumor. En algunas modalidades, el antígeno específico del tumor es HER-2, por ejemplo, HER-2 humano, y estas células NK-92® se refiere como células HER2.taNK® en esta descripción.
El término "receptor Fc" se refiere a una proteína que se encuentra en la superficie de ciertas células (por ejemplo, las células asesinas naturales) que contribuyen a las funciones protectoras de las células inmunitarias al unirse a parte de un anticuerpo conocido como región Fc. La unión de la región Fc de un anticuerpo al receptor Fc (FcR) de una célula estimula la actividad fagocítica o citotóxica de una célula mediante fagocitosis mediada por anticuerpos o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los FcR se clasifican según el tipo de anticuerpo que reconocen. Por ejemplo, los receptores Fc-gamma (FcyR) se unen a la clase de anticuerpos IgG. FcyRIII-A (también llamado CD16) es un receptor Fc de baja afinidad que se une a los anticuerpos IgG y activa la ADCC. Los FcyRIII-A se encuentran típicamente en las células NK. Las células NK-92® no expresan FcyRIII-A. El término "receptor de antígeno quimérico" (CAR), como se usa en la presente descripción, se refiere a un dominio de unión a antígeno extracelular que se fusiona con un dominio de señalización intracelular. Los CAR se pueden expresar en células T o células NK para aumentar la citotoxicidad. En general, el dominio de unión a antígeno extracelular es un scFv que es específico para un antígeno que se encuentra en una célula de interés. Una célula NK-92 que expresa CAR® se dirige a células que expresan ciertos antígenos en la superficie celular, en función de la especificidad del dominio scFv. El dominio scFv se puede modificar para que reconozca cualquier antígeno, incluidos los antígenos específicos de tumores.
Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o sus análogos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, etiqueta EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomal, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, las modificaciones a la estructura del nucleótido pueden realizarse antes o después del ensamblaje del polinucleótido. La secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido se puede modificar además después de la polimerización, tal como mediante la conjugación con un componente que marca. El término también se refiere a moléculas de cadena doble y sencilla. A menos que de cualquier otra manera se especifique o requiera, un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias conocidas o previstas para fabricar la forma bicatenaria.
El término "expresión" se refiere a la producción de un producto génico. El término "transitorio" cuando se refiere a la expresión significa que un polinucleótido no se incorpora al genoma de la célula.
El término "citoquina" o "citocinas" se refiere a la clase general de moléculas biológicas que afectan a las células del sistema inmunitario. Los citocinas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, interferones e interleucinas (IL), en particular IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21. En modalidades preferidas, la citoquina es IL-2.
Como se usa en la presente descripción, el término "agrupamiento" se refiere a la presencia de grupos de células que son visibles a simple vista. Un grupo de células tiene típicamente un diámetro de 1-15 cm, por ejemplo, de 2-10 cm, de 2-8 cm, de 1-3 cm, de 2-6 cm o de 6-8 cm. Los ejemplos ilustrativos de grupos de células visibles se muestran en la figura 10. En general, el grado de agrupamiento del cultivo de células aumenta a medida que aumenta el volumen del cultivo de células, lo que ocurre típicamente durante la expansión.
Como se usa en la presente descripción, el término "agrupamiento reducido" o "agrupamiento de células reducido" se refiere al fenómeno de que se reduce el número, el tamaño o ambos de los grupos de células en el cultivo de células. Por ejemplo, el número de grupos de células en un cultivo de células se puede reducir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % en comparación con un cultivo de células de control mediante el uso de los métodos proporcionados.
El término "sustancialmente libre de agolpamientos" se refiere a la condición de cultivo en la que no se aprecian agrupamientos de células a simple vista.
Como se usa en la presente descripción, el término "agregado celular" se refiere a un agregado de cinco o más células en un cultivo de células. Los agregados celulares típicamente no son visibles a simple vista, pero pueden verse con la ayuda de un dispositivo, como un microscopio. Una reducción en los agregados celulares se refiere a una reducción de al menos un 40 % en el número de agregados celulares en el cultivo de células en comparación con un cultivo de células de control. Opcionalmente, los métodos que se proporcionan dan como resultado una
reducción de al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de los agregados celulares comparados a un cultivo de células de control.
Como se usa en la presente, el término "floculante" se refiere a una agregación de componentes del medio de cultivo en ausencia de células. Un floculante típicamente también es visible a simple vista y normalmente puede tener un diámetro de 0,01-1 cm, por ejemplo, 0,02-0,8 cm, 0,05-0,5 cm, por ejemplo, 0,1-0,5 cm.
Como se usa en la presente descripción, el término "floculantes reducidos" se refiere al fenómeno de que se reduce el número, el tamaño o ambos de los floculantes en el medio. Por ejemplo, la cantidad de floculantes en un medio de cultivo se puede reducir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % en comparación con un medio de cultivo de control mediante el uso de los métodos proporcionados.
Tal como se usa en la presente descripción, el término "sustancialmente la misma citotoxicidad" se refiere a que las dos mediciones de un ensayo de citotoxicidad no son diferentes en más del 15 %, en no más del 10 %, en no más del 8 % o en no más del 5 % entre sí.
Como se usa en la presente descripción, los términos citotóxicos cuando se usan para describir la actividad de células efectoras tales como las células NK, se relacionan con la destrucción de las células diana por cualquiera de una variedad de mecanismos biológicos, bioquímicos o biofísicos.
Medios de cultivo
En la presente descripción se proporciona un medio de cultivo que comprende un tensioactivo no iónico que puede reducir o evitar la formación de agrupamientos. El tensioactivo no iónico puede controlar las fuerzas de cizallamiento en cultivos celulares y también puede usarse para reducir la formación de espuma en cultivos agitados y reducir la unión celular al recipiente de cultivo.
Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen poloxámeros. Los poloxámeros son copolímeros tribloque no iónicos compuestos por una cadena hidrofóbica central de polioxipropileno flanqueada por dos cadenas hidrofílicas de polioxietileno. Los poloxámeros también se conocen con los nombres comerciales synperonics, pluronics y kolliphor. Las soluciones de Poloxámero 188 están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Sigma-Aldrich o Thermo Fisher Scientific. El Poloxámero 188 se denomina Pluronic F-68 cuando se obtiene de Thermo Fisher Scientific. El Poloxámero 188 típicamente se proporciona comercialmente a una concentración del 10 %.
El tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188, puede estar presente en una cantidad de 0,025 a 0,9 %, por ejemplo, 0,025 % a 0,06 %, 0,04 % a 0,06 % o 0,03 a 0,05 %. Preferentemente, el tensioactivo no iónico está presente al 0,05 %.
Con el fin de producir productos biológicos a partir de las células NK-92® en cantidades suficientes, los cultivos celulares deben ampliarse a un volumen relativamente grande, por ejemplo, el volumen del cultivo de células puede ser de al menos 2 litros, al menos 3 litros, al menos 4 litros o al menos 5 litros. En algunos casos, las células NK-92® se pueden cultivar en recipientes de cultivo de gran volumen que son adecuados para su uso en biorreactores. Como se indicó anteriormente, los cultivos celulares de gran volumen a menudo van acompañados de aumentos significativos en la formación de agrupamientos en el cultivo de células, es decir, precipitación y agregación celular. En ausencia de Poloxámero 188, cuando un cultivo en bolsa WAVE de 2 litros se amplía a una bolsa WAVE de 20 litros, se puede formar precipitación dentro de 24 horas (como se ilustra en el ejemplo 1 y la tabla 1). La adición de Poloxámero 188 a los cultivos celulares, incluidos los cultivos que tienen grandes volúmenes, sorprendentemente puede reducir significativamente la formación de agrupamientos en el cultivo de células. La adición de Poloxámero 188 a los cultivos celulares NK-92® no afectan negativamente el crecimiento celular, la viabilidad celular, el fenotipo, la citotoxicidad y la actividad ADCC. En consecuencia, la descripción también proporciona un método de cultivo de células NK-92® que comprenden el cultivo de células NK-92® en un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, en donde las células NK-92® redujeron la formación de agrupamientos en comparación con el control de células NK-92® que se cultivaron en un medio de control que carece del tensioactivo no iónico, y las células NK-92® tienen sustancialmente la misma citotoxicidad que las células control NK-92®.
Los inventores de esta solicitud también observaron que incluso en ausencia de células, los medios de cultivo de células pueden formar floculantes que son visibles a simple vista. Estos floculantes típicamente tienen un diámetro de 0,01-1 cm, por ejemplo, 0,02-0,8 cm, 0,05-0,5 cm, por ejemplo, 0,1-0,5 cm y la introducción de 0,025 % a 0,9 % de Poloxámero 188 en el medio puede reducir el número de floculantes en el medio.
Métodos de cultivo de las células NK-92®
Las células NK-92® se pueden cultivar en una serie de medios de crecimiento y algunos de los cuales están disponibles comercialmente, por ejemplo, medio de cultivo de células NK humanas de 3H Biomedical (Uppsala, Suecia) o medio Prime XV de Irvine Scientific (Irvine, CA, Estados Unidos). Para minimizar la formación de agrupamientos, el cultivo puede comprender Poloxámero 188. Opcionalmente, los medios de cultivo también
contienen citocinas, albúmina de suero humano, suplementos de aminoácidos o sus combinaciones. Las citocinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, IL-2. En un ejemplo ilustrativo, las células aNK se pueden cultivar en un medio de crecimiento que comprende Pluronic F-68 al 0,05 % y 450 UI/ml de IL-2, con aminoácidos adición como suplementos. En otro ejemplo ilustrativo, las células haNK® se pueden cultivar en un medio de crecimiento que comprende Pluronic F-68 al 0,05%. En otro ejemplo más, las células taNK® se pueden cultivar en un medio de crecimiento que comprende Pluronic F-68 al 0,05 % y 500 UI/ml de IL-2. En otro ejemplo más, las células t-haNK® se pueden cultivar en un medio de crecimiento que comprende 0,05-0,1% de Pluronic F-68.
Como se describió anteriormente, la adición del tensioactivo no iónico al medio de cultivo puede reducir la formación de agrupamientos. Opcionalmente, adicionar el tensioactivo no iónico al medio de cultivo puede reducir la formación de agrupamientos en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 88 %, al menos un 90 %, o al menos el 95 %.
El uso del tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188, en el cultivo de células también puede reducir los agregados de células NK-92 en un grado significativo en comparación con un cultivo de células de control que carece del tensioactivo no iónico. En algunos casos, puede reducir los porcentajes de agregados celulares en el cultivo en al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 %. En algunos casos, las células NK-92 que crecen en un medio de cultivo que contiene poloxámero 188 pueden tener menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 7 %, menos del 6 % de agregados celulares después de crecer en un volumen de cultivo de al menos 1 litro durante un período de crecimiento. En algunos casos, el período de crecimiento es de 1-7 días, por ejemplo, 2 días, 3 días, 5 días o 7 días.
Para ampliar el cultivo de células de NK-92®, típicamente se descongela un vial se descongela y se cultiva en un recipiente de cultivo de células estándar, por ejemplo, un matraz T75, hasta que las células se recuperan. Luego las células se transfieren a un recipiente que tiene un volumen mayor para ampliar el número de células, por ejemplo, un matraz G-Rex, que típicamente tiene menos de 0,45 litros. Luego las células expandidas se transfieren a un recipiente aún más grande, por ejemplo, una bolsa WAVE de cultivo de células. La transferencia de células puede realizarse con una bomba o alimentación por gravedad.
Opcionalmente, las células NK-92® así producidas pueden recolectarse mediante el uso de una centrífuga continua que se une asépticamente al recipiente de cultivo que se encuentra al final del proceso de expansión. Las células pueden recolectarse y usar para la formulación de productos y diversas aplicaciones.
La citotoxicidad de las células NK-92 producidas®, la capacidad de atacar y matar células aberrantes, como células tumorigénicas y infectadas por virus, puede evaluarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, un Ensayo de liberación de Cr 51 (Gong y otros (1994)) mediante el uso del procedimiento descrito por Klingemann y otros (Cancer Immunol. Immunother. 33:395-397 (1991))). El porcentaje de citotoxicidad específica puede calcularse en función de la cantidad de Cr 51. Consulte la publicación dela patente núm. US20020068044.
Alternativamente, la citotoxicidad de las células NK-92 producido® también pueden evaluarse mediante el uso de un ensayo de liberación de calceína. Por ejemplo, las células NK-92® (denominadas efectoras en el ensayo) se pueden mezclar con las células diana cargadas con calceína (denominadas diana en el ensayo) en determinadas proporciones. Después de la incubación durante un período de tiempo, la liberación de calceína de las células diana puede evaluarse, por ejemplo, mediante un lector de placas de fluorescencia. La proporción del efector y la diana que se usan en el ensayo puede variar, opcionalmente la relación efector:diana puede ser 20:1, 15:1, 10:1, 8:1 o 5:1; preferentemente, la relación efector:diana es 10:1. Las células NK-®las células que se han cultivado en medios que comprenden Poloxámero 188, por ejemplo, en concentraciones entre 0,025 % y 0,9 %, mantienen una citotoxicidad comparable a la de las células NK-92® que se han cultivado en medios que son idénticos salvo por la presencia del Poloxámero 188. Las células diana pueden ser cualquier célula que exprese moléculas MHC que puedan ser reconocidas por las células NK-92®, por ejemplo, las células K562.
La citotoxicidad dependiente de anticuerpos de las células NK-92®, por ejemplo, las células haNK®, puede evaluarse. Los métodos para medir la ADCC de las células NK-92® son similares a los métodos para medir la citotoxicidad directa como se describió anteriormente, excepto que se adiciona un anticuerpo que puede reconocer la célula diana. El receptor Fc de las células NK reconoce los anticuerpos unidos a la célula y desencadena una reacción citolítica y elimina las células diana. En un ejemplo ilustrativo, las células haNK® pueden incubarse con Rituxan (un anticuerpo) y Ramos (células diana) y la destrucción de las células Ramos se puede medir mediante la liberación de componentes internos de las células diana, por ejemplo, Cr 51 o calceína, como se describió anteriormente.
Las células NK-92® que se han cultivado en un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % del tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188, pueden demostrar sustancialmente la misma citotoxicidad que las células NK-92® que han crecido en un medio de cultivo que carece del tensioactivo no iónico.
Las células NK-92® que han crecido en un medio de cultivo que comprende 0,025 %-0,9 % del tensioactivo no iónico, por ejemplo, Poloxámero 188, típicamente tienen una viabilidad excelente, por ejemplo, una viabilidad de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90%, o al menos 95 %. La viabilidad de las células NK-92® se puede
determinar mediante el uso de métodos que se conocen bien en la técnica, por ejemplo, un método de tinción basado en azul de tripano o un contador de células NC-200.
Cultivo de células
Esta descripción también proporciona un cultivo de células que comprende las células NK-92® y un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % del tensioactivo no iónico, en donde las células NK-92® han reducido la formación de agolpamientos en comparación con el cultivo de control que comprende las células NK-92® y un medio que carece del tensioactivo no iónico.
Opcionalmente, el cultivo de células puede tener agrupamientos reducidos en comparación con un cultivo de células de control que carece del tensioactivo no iónico y la reducción es de al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 88 %, al menos 90 % o al menos 95 %.
Opcionalmente, las células NK-92® se han cultivado en el medio de cultivo durante al menos 3 días, al menos 5 días, al menos 7 días o al menos 10 días. Opcionalmente, el cultivo de células tiene un volumen de al menos 2 litros, al menos 5 litros, al menos 10 litros, al menos 15 litros, por ejemplo, 25 litros. Opcionalmente, el cultivo de células de NK-92® está sustancialmente libre de agrupamientos.
Opcionalmente, el tensioactivo no iónico es Poloxámero 188. Opcionalmente, el cultivo de células comprende del 0,025 % al 0,9 %, por ejemplo, del 0,03 % al 0,8 % o del 0,04 % al 0,6 % de Poloxámero 188; preferentemente, el Poloxámero 188 está presente al 0,05 %.
Células NK-92®
Las células NK-92® que se pueden cultivar mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción incluyen células aNK™, células haNK®, células taNK® y células t-haNK® que se describen en más detalle más abajo. La línea celular NK-92® es una línea celular única que se descubrió que prolifera en presencia de interleucina 2 (IL-2). Gong y otros, Leucemia 8:652-658 (1994). Estas células tienen una alta actividad citolítica contra una variedad de cánceres. La línea celular NK-92® es una población de células NK cancerosas homogéneas que tiene una amplia citotoxicidad antitumoral con un rendimiento predecible después de la expansión. Los ensayos clínicos de fase I han confirmado su perfil de seguridad. Las NK-92® se descubrieron en la sangre de un sujeto que padecía un linfoma no Hodgkins y luego inmortalizado ex vivo. Las células NK-92® se derivan de las células NK, pero carecen de los principales receptores inhibitorios que muestran las células NK normales, mientras que conservan la mayoría de los receptores activadores. Sin embargo, las células NK-92®, no atacan a las células normales ni provocan una respuesta de rechazo inmunitario inaceptable en humanos. La caracterización de la línea celular NK-92® se describe en el documento WO 1998/49268 y en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2002-0068044. La línea celular NK-92® se encuentra que exhibe CD56brillante, marcadores de superficie CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45 y CD54. Además, no presenta los marcadores CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 y CD34. Crecimiento de las células NK-92® en cultivo depende de la presencia de interleucina 2 recombinante (rIL-2), siendo suficiente una dosis tan baja como 1 UI/mL para mantener la proliferación. La IL-7 e IL-12 no soportan el crecimiento a largo plazo, ni tampoco otras citocinas evaluadas, incluidas IL-1a, IL-6, factor de necrosis tumoral a, interferón a e interferón y. NK-92® tiene una alta citotoxicidad incluso con una relación baja de efector:diana (E:T) de 1:1. Gong, y otros, supra. Las células NK-92® se depositan en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), designación CRL-2407.
Hasta ahora, los estudios sobre células NK endógenas han indicado que la IL-2 (1000 UI/mL) es crítica para la activación de las células NK durante el envío, pero que las células no necesitan mantenerse a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono. Koepsell, y otros, Transfusion 53:398-403 (2013).
Las células NK-92® modificadas se conocen e incluyen, pero no se limitan a, las descritas en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 7,618,817, 8,034,332, y 8,313,943, la publicación de la solicitud de la patente de Estados Unidos núm. 2013/0040386, tal como el tipo silvestre NK-92®, NK-92®-CD16, NK-92®-CD16-y, NK-92®-CD16-5, NK-9®2-CD16 (F157V), NK-92®mi y NK-92®ci.
Aunque las células NK-92® retienen casi todos los receptores de activación y las vías citolíticas asociadas con las células NK, no expresan CD16 en sus superficies celulares. CD16 es un receptor Fc que reconoce y se une a la porción Fc de un anticuerpo para activar las células NK para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Debido a la ausencia de receptores CD16, NK-92® las células no pueden lisar las células diana a través del mecanismo ADCC y, como tales, no pueden potenciar los efectos antitumorales de los anticuerpos endógenos o exógenos (es decir, Rituximab y Herceptin).
Los estudios sobre las células NK endógenas han indicado que la IL-2 (1000 UI/mL) es fundamental para la activación de las células NK durante el envío, pero que no es necesario mantener las células a 37 °C y al 5 % de
dióxido de carbono. Koepsell, y otros, Transfusión 53:398-403 (2013). Sin embargo, las células NK endógenas son significativamente diferentes de las células NK-92®, en gran parte debido a sus distintos orígenes: NK-92® es una línea celular derivada de cáncer, mientras que las células NK endógenas se recolectan de un donante (o del paciente) y se procesan para infundirlas a un paciente. Las preparaciones endógenas de células NK son poblaciones de células heterogéneas, mientras que las células NK-92® son una línea celular clonal homogénea. Las células NK-92® proliferan fácilmente en cultivo mientras mantienen la citotoxicidad, mientras que las células NK endógenas no lo hacen. Además, una población heterogénea endógena de células NK no se agrega a alta densidad. Además, las células NK endógenas expresan receptores Fc, incluidos los receptores CD-16 que no expresa las células NK-92®.
Receptores Fc
Los receptores Fc se unen a la porción Fc de los anticuerpos. Se conocen varios receptores Fc, y difieren de acuerdo con su ligando, afinidad, expresión y efecto preferidos tras la unión al anticuerpo.
Tabla 1: Ilustrativo del receptor Fc
'
N o m b re d e l A n t ic u e rp o A f in id a d D is t r ib u c ió n E fe c to d e s p u é s d e la
R e c e p to r p r in c ip a l p o r e l c e lu la r u n ió n d e l a n t ic u e rp o
d e l lig a n d o l ig a n d o
. i Fagocitosis ;
Macrófagos Activación celular
lgG1 e lgG 3 lAlta Neutrófilos Activación del estallido
F c y R l (C D 64) (K d ■ Eosinófilos respiratorio
" 1<T1J M ) Células dendríticas Inducción de la eliminación i
de microbios
1 ■....................................................
Macrófagos Fagocitosis i
Baja Neutrófilos
Degranulación (eosinófilos)
Eosinófilos :
FcyR lFA (C D 32) IgG (K d > Plaquetas
10~7 M ) Células de
Langerhans
..................... ’ |
No fagocitosis !
Baja Células B Inhibición de la actividad
F c y R IIB l (C D 32) Ig G 
celular
i Fagocitosis
Baja Macrófagos Inhibición de la actividad
F cy R IIB 2 (C D 32) IgG (K d > Neutrófilos celular
Eosinófilos
................................................ 10-7 M )
Inducción de citotoxicidad
Baja Células NK celular dependiente de j
F c y R IIIA (C D 16 a) Macrófagos anticuerpo (ADCC) ;
IgG (K d > (determinados tejidos) Inducción de liberación de j
10-6 M ) citoclnas por los macrófagos j
-
Eosinófilos
■ Macrófagos
Baja Neutrófilos
eliminación de 1 FcyRTITB (C D I6 b ) IgG (K d > Mastocitos Inducción de la
Células dendríticas microbios
10 ^ M ) foliculares
: .
■ Mastocitos
Eosinófilos ; :
Alta Basófilos Degranulación
F ceR I IgE (K d ~ Células de Langerhans Fagocitosis
10-lu M ) Monocitos
En algunas modalidades las células NK-92® se modifican para expresar una proteína receptora Fc en la superficie celular.
En algunas modalidades, el receptor Fc es CD16 humano. Una secuencia de aminoácidos representativa que codifica CD16 se muestra en SEQ ID NO:2. Una secuencia polinucleotídica representativa que codifica CD16 se muestra en SEQ ID NO: 1. Las secuencias completas de CD16 se pueden encontrar en la base de datos SwissProt como entrada P08637. En algunas modalidades, las células NK-92® se modifican mediante la introducción de un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 que tiene al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de polinucleótidos con una secuencia de polinucleótidos que codifica un CD16 natural de longitud completa, incluido el péptido señal, que tiene una fenilalanina en la posición 176 del CD16 de longitud completa. En algunas modalidades, un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 tiene al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de polinucleótidos con una secuencia de polinucleótidos que codifica un CD16 natural de longitud completa, incluido el péptido señal, que tiene una valina en la posición 176.
Las secuencias polinucleotídicas homólogas incluyen aquellas que codifican secuencias polipeptídicas que codifican variantes de CD16. En algunas modalidades, los polinucleótidos homólogos de CD16 pueden tener una longitud de aproximadamente 150 a aproximadamente 700, aproximadamente 750 o aproximadamente 800 polinucleótidos, aunque las variantes de CD16 que tienen más de 700 a 800 polinucleótidos están dentro del alcance de la descripción.
En otros ejemplos, las secuencias de ADNc que tienen polimorfismos que cambian las secuencias de aminoácidos de CD16 se usan para modificar las células NK-92®, como, por ejemplo, las variaciones alélicas entre individuos que presentan polimorfismos genéticos en los genes CD16. En otros ejemplos, los genes CD16 de otras especies que tienen una secuencia de polinucleótidos que difiere de la secuencia del CD16 humano se usan para modificar las células NK-92®.
En ejemplos, los polipéptidos variantes se fabrican mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), exploración de alanina y mutagénesis por PCR. Se puede realizar mutagénesis directa del sitio (Carter, 1986; Zoller y Smith, 1987), mutagénesis de casete, mutagénesis de selección de restricción (Wells y otros, 1985) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir variantes de CD16 (Ausubel, 2002; Sambrooky Russell, 2001).
Las sustituciones conservadas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido CD16 humano, de manera que un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido de la misma clase, entran dentro del alcance de las variantes de CD16 descritas siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad del polipéptido. Las sustituciones conservadas se conocen bien por los expertos en la técnica. Las sustituciones no conservadas que afectan (1) la estructura dela cadena principal polipeptídica, como una hoja p o una conformación helicoidal a, (2) la
carga, (3) la hidrofobicidad o (4) la mayor parte de la cadena lateral del sitio diana puede modificar la función del polipéptido CD16 o la identidad inmunológica. Las sustituciones no conservadas implican el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones pueden introducirse en sitios de sustitución conservados o con mayor preferencia en sitios no conservados.
En algunas modalidades, las variantes del polipéptido CD16 tienen al menos 200 aminoácidos de longitud y tienen al menos un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, o al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, las variantes del polipéptido CD16 tienen una longitud de al menos 225 aminoácidos y tienen al menos un 70 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, o al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2.
En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de CD16 puede codificar una proteína de fusión de CD16. Un polipéptido de fusión de CD16 incluye cualquier porción de CD16 o un CD16 completo fusionado con un polipéptido que no es CD16. En alguna modalidad, se puede crear un polipéptido de fusión en el que una secuencia polipeptídica heteróloga se fusiona con el extremo C-terminal de c D16 o se coloca internamente en el CD16. Típicamente, se puede reemplazar hasta aproximadamente el 30 % del dominio citoplasmático de CD16. Dicha modificación puede potenciar la expresión o potenciar la citotoxicidad (por ejemplo, la capacidad de respuesta de ADCC). En otros ejemplos, las proteínas quiméricas, como los dominios de otros receptores activadores de linfocitos, incluidos, entre otros, Ig-a, Ig-B, CD3-e, CD3-d, DAP-12 y DAP-10, reemplazan una parte del Dominio citoplasmático CD16.
Los genes de fusión se pueden sintetizar mediante técnicas convencionales, incluidos los sintetizadores de ADN automatizados y la amplificación por PCR mediante el uso de cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de genes consecutivos que subsecuentemente pueden reasociarse y reamplificarse para generar una secuencia de genes quiméricos (Ausubel, 2002). Muchos vectores están disponibles comercialmente que facilitan la subclonación de CD16 en el marco de un resto de fusión.
Receptor de Antígeno Quimérico
Como se describe en la presente descripción, las células NK-92® se modifican aún más para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) en la superficie celular. Opcionalmente, el CAR es específico para un antígeno específico de tumor. Los antígenos específicos de tumor se describen, a modo de ejemplo no limitante, en el documento de Estados Unidos 2013/0189268; en los documentos WO 1999024566 A1; Estados Unidos 7098008 ; y WO 2000020460 A1. Los antígenos específicos de tumor incluyen, entre otros, NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19 y CD33. En la tabla 1 se pueden encontrar antígenos asociados a tumores no limitantes adicionales y las neoplasias malignas asociadas con los mismos.
Tabla 1: Antí enos es ecíficos de tumores neo lasias mali nas asociadas
En algunas modalidades, CAR apunta a CD19, CD33 o CSPG-4.
En ejemplos, los polipéptidos variantes se fabrican mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), exploración de alanina y mutagénesis por PCR. Se puede realizar mutagénesis directa del sitio (Carter, 1986; Zoller y Smith, 1987), mutagénesis de casete, mutagénesis de selección de restricción (Wells y otros, 1985) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir variantes de CD16 (Ausubel, 2002; Sambrooky Russell, 2001).
Opcionalmente, el CAR se dirige a un antígeno asociado con un tipo de cáncer específico. Opcionalmente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia (que incluye las leucemias agudas [por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluidas las leucemias mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucémica)]) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica ) leucemia y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, tumores sólidos que incluyen, entre otros, sarcomas y carcinomas como el fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma basal carcinoma de células, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, sebáceo carcinoma de glándula s, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, pulmón de células pequeñas carcinoma, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
En algunas modalidades, un polinucleótido que codifica CAR se muta para alterar la secuencia de aminoácidos que codifica CAR sin alterar la función del CAR. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de polinucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en los CAR descritos anteriormente. Los CAR se pueden modificar como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de patentes núms. WO 2014039523; Estados Unidos 20140242701; Estados Unidos 20140274909; Estados Unidos 20130280285; y WO 2014099671. Opcionalmente, el CAR es un CAR CD19, un CAR CD33 o un CAR CSPG-4. Modificaciones Adicionales - Citocinas
La citotoxicidad de las células NK-92® depende de la presencia de citocinas (por ejemplo, interleucina-2 (IL-2). El costo de usar IL-2 agregada exógenamente necesaria para mantener y expandir las células NK-92® en cultivo a escala comercial es significativa. La administración de IL-2 a sujetos humanos en cantidad suficiente para continuar la activación de las células NK92® causaría efectos secundarios adversos.
En algunas modalidades, las células NK-92 que expresa FcR® se modifican adicionalmente para expresar al menos una citocina y un gen suicida. En modalidades específicas, al menos una citocina es IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 o una de sus variantes. En modalidades preferidas, la citoquina es IL-2 humana. Un ácido nucleico representativo que codifica IL-2 se muestra en la SEQ ID NO:3 y un polipéptido representativo de IL-2 se muestra en SEQ ID NO:4. En determinadas modalidades, la IL-2 es una variante que se dirige al retículo endoplásmico.
En una modalidad, la IL-2 se expresa con una secuencia señal que dirige la IL-2 al retículo endoplásmico. Sin estar ligado a la teoría, pero dirigir la IL-2 al retículo endoplásmico permite la expresión de IL-2 a niveles suficientes para la activación autocrina, pero sin liberar IL-2 extracelularmente. Ver Konstantinidis y otros "Dirigir la IL-2 al retículo endoplásmico limita la estimulación del crecimiento autocrino a las células NK-92®" Exp Hematol. Febrero 2005; 33(2):159-64. La activación continua de las células NK-92 que expresan FcR® puede prevenirse, por ejemplo, por la presencia del gen suicida.
Modificaciones adicionales - gen suicida
El término "gen suicida" es el que permite la selección negativa de las células. El gen suicida se usa como sistema de seguridad, lo que permite que las células que expresan el gen se eliminen mediante la introducción de un agente selectivo. Esto es conveniente en caso de que el gen recombinante provoque una mutación que provoque un crecimiento celular descontrolado. Se han identificado varios sistemas de genes suicidas, incluidos el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple, el gen de la citosina desaminasa, el gen de la timidina quinasa del virus de la varicela zoster, el gen de la nitroreductasa, el Escherichia coli el gen gpt y el Gen Deo de E. coli (ver también, por ejemplo, Yazawa K, Fisher WE, Brunicardi FC: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. 2002 July; 26(7):783-9). Como se usa en la presente descripción, el gen suicida está activo en las células NK-92®. Típicamente, el gen suicida codifica una proteína que no tiene ningún efecto adverso sobre la célula pero, en presencia de un compuesto específico, matará a la célula. Por lo tanto, el gen suicida es típicamente parte de un sistema.
En una modalidad, el gen suicida es el gen de la timidina quinasa (TK). El gen TK puede ser un gen TK de tipo salvaje o mutante (por ejemplo, tk30, tk75, sr39tk). Las células que expresan la proteína TK pueden destruirse mediante el uso de ganciclovir.
En otra modalidad, el gen suicida es la citosina desaminasa que es tóxica para las células en presencia de 5-fluorocitosina. García-Sánchez y otros "Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation." Blood 199815 de julio; 92 (2): 672-82.
En otra modalidad, el gen suicida es el citocromo P450 que es tóxico en presencia de ifosfamida o ciclofosfamida. Ver por ejemplo Tuati y otros "A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response." Curr Gene Ther. 2014;14(3):236-46.
En otra modalidad, el gen suicida es iCas9. Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Inglés J Med 365: 1673-1683. Ver también Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13. La proteína iCas9 induce la apoptosis en presencia de una molécula pequeña AP1903. AP1903 es una molécula pequeña biológicamente inerte, que ha demostrado ser bien tolerada en estudios clínicos y se ha usado en el contexto de la terapia celular adoptiva.
En una modalidad, las células NK-92 modificadas® se irradian antes de la administración al paciente. La irradiación de las células NK-92® se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 8,034,332. En una modalidad, las células NK-92 modificadas® que no se han modificado para expresar un gen suicida se irradian. Expresión transgénica
Los transgenes (por ejemplo, CD19 CAR y CD16) se pueden modificar en un vector de expresión mediante cualquier mecanismo conocido por los expertos en la técnica. Los transgenes pueden modificarse en el mismo vector de expresión o en un vector de expresión diferente. En modalidades preferidas, los transgenes se modifican en el mismo vector.
En algunas modalidades, el vector permite la incorporación de los transgenes en el genoma de la célula. En algunas modalidades, los vectores tienen un marcador de selección positivo. Los marcadores de selección positiva incluyen cualquier gen que permita que la célula crezca en condiciones que destruirían una célula que no expresa el gen. Los ejemplos no limitantes incluyen resistencia a antibióticos, por ejemplo, geneticina (gen Neo de Tn5).
Puede usarse cualquier número de vectores para expresar el receptor Fc y/o el CAR. En algunas modalidades, el vector es un plásmido. En una modalidad, el vector es un vector viral. Los vectores virales incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores virales del herpes simple, vectores virales de la viruela y otros.
Los transgenes se pueden introducir en las células NK-92® mediante el uso de cualquier método de transfección conocido en la técnica, que incluye, por medio de ejemplo no limitante, la infección, la electroporación, la lipofección, la nucleofección o la "pistola de genes".
Se describen los materiales, las composiciones y los componentes que pueden usarse para, pueden usarse junto con, pueden usarse en preparación para, o son productos de los métodos y composiciones descritos. Estos y otros materiales se describen en la presente descripción, y se entiende que cuando se describen combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etcétera, de estos materiales, aunque las referencias específicas de cada una de las variadas combinaciones colectivas y permutaciones de esos compuestos pueden no ser explícitamente descritas, cada una se contempla específicamente y se describe en la presente descripción. Por ejemplo, si se describe y analiza un método, y se analiza una serie de modificaciones que pueden realizarse a una serie de moléculas, que incluyen el método, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del método, y las modificaciones que son posibles, se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente lo contrario. Igualmente, cualquier subconjunto o sus combinaciones también se contemplan y describen específicamente. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta descripción, que incluyen, pero no se limitan a, las etapas en los métodos mediante el uso de las composiciones descritas. Por lo tanto, si existe una variedad de etapas adicionales que pueden realizarse, se entiende que cada una de las etapas adicionales puede realizarse con cualquier etapa específica del método o combinación de etapas del método de los métodos descritos, y que cada una de dichas combinaciones o subconjuntos de combinaciones se contempla específicamente y debe considerarse descrita.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos son solo para fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitaciones. Existe una variedad de técnicas y procedimientos alternativos disponibles para los expertos en la técnica que permitirían de manera similar realizar con éxito los ejemplos más abajo.
Ejemplo 1: Pluronic F-68 redujo la formación de agrupamientos en los cultivos celulares de haNK®
En un estudio de referencia, se inocularon células haNK® de matraces G-Rex en dos bolsas WAVE de 2 litros separadas (es decir, lote de células # D0917C186 y lote de células # D0917C187). Las células de ambas bolsas WAVE se combinaron para sembrar una bolsa WAVE de 20 litros (volumen de trabajo de 10 l) dos días después. Un día después, se observó precipitación blanca y floculantes en la bolsa WAVE D1217C197 de 20 litros (FIG. 10) y la viabilidad de las células fue inferior al 50 %. D1217C199 se configuró simultáneamente cuando el cultivo se expandió en el cultivo de 20 litros para servir como cultivo de respaldo; También se observaron precipitaciones y floculantes y la viabilidad celular fue inferior al 90 %. Ver Figura 1. Esto indica que el proceso no es escalable y luego se terminó la expansión.
En otro estudio de referencia, las células haNK® de matraces G-Rex se inocularon en dos bolsas WAVE separadas de 2 litros el día 0. Las células de ambas WAVE se combinaron para sembrar una bolsa WAVE de 10 litros y una bolsa WAVE de 2 litros el día 3. Se usaron células de bolsas WAVE de 10 litros para inocular una bolsa WAVE de 20 litros el día 6. Se observó precipitación blanca y floculantes en la bolsa WAVE de 10 litros. El crecimiento celular se redujo y la viabilidad fue inferior al 80 %. Tras la transferencia a una bolsa de 20 litros, el tamaño del precipitado aumentó. El cultivo WAVE se terminó. Esto también indicó que el proceso no era escalable. Ver Figura 2.
Como ejemplo de trabajo, se inocularon las células haNK® de matraces G-Rex en dos bolsas WAVE separadas de 2 litros en presencia de Pluronic F-68 al 0,05 %, adquirido de Thermo Fisher Scientific como una solución al 10 % (Cat# 24040-032). Las células de ambas bolsas WAVE se combinaron para sembrar una bolsa WAVE de 10 litros (volumen de trabajo de 5 L) el día 0. Se usaron células de bolsas WAVE de 10 litros para inocular dos bolsas WAVE de 20 litros el día 4. Las células de ambas bolsas WAVE de 20 L se recogieron mediante centrifugación continua en días separados. Todos los cultivos WAVE en este estudio comprendían 0,05 % de pluronic F-68. Los resultados muestran que no se observaron precipitados en ninguno de los biorreactores WAVE durante todo el estudio.
Los resultados de estos estudios, como se resume en la tabla 1, indican que Pluronic F-68 al 0,05 % pudo mantener el cultivo haNK® de la formación de agrupamientos y por lo tanto los cultivos haNK® se pueden expandir mediante la adición de 0,05 % de Pluronic F-68 al cultivo. Ver Figura 3.
Ejemplo 2: Pluronic F-68 redujo la formación de agolpamientos en los cultivos celulares de aNK™
Se realizaron experimentos similares con el cultivo de células de aNK™. En un estudio de referencia, las células aNK™ de matraces G-Rex se inocularon en dos bolsas WAVE separadas de 2 litros el día 0. Las células de ambos WAVE se combinaron para sembrar una bolsa WAVE de 20 litros (volumen de trabajo de 10 L) y una bolsa WAVE de 10 litros (volumen de trabajo de 5 L). Las células de una bolsa de 20 litros se recogieron mediante centrifugación continua el día 3 a pesar de la formación de agrupamientos en el cultivo de células. Se observaron precipitaciones blancas y floculantes en la bolsa WAVE de 20 litros tres días después. El cultivo WAVE de 10 litros se detuvo debido a los precipitados más grandes y la baja viabilidad celular de aproximadamente el 75 %. Ver Figura 4
En otro estudio de referencia, las células aNK™ del biorreactor de tanque agitado se inocularon en dos bolsas WAVE separadas de 2 litros el día 0. Debido a la reducción de la viabilidad <50 %, se terminó el cultivo en una bolsa WAVE de 20 litros. Las células de ambas WAVE de 2 litros se combinaron para sembrar dos bolsas WAVE de 10 litros separadas el día 5. Las células de la bolsa WAVE de 10 litros se usaron para la inoculación en una bolsa de 50 litros el día 10. Las células de una bolsa de 50 litros se recogieron mediante centrifugación continua el día 14 a pesar de la formación de agrupamientos en el cultivo de células. Se observó precipitación blanca y floculantes en la bolsa WAVE de 20 litros. Se redujo el crecimiento celular y, por lo tanto, se detuvo la expansión. Esto indica que el cultivo WAVE tuvo mucha precipitación y el proceso no era escalable. Ver Figura 5
Como ejemplo práctico, se inocularon células aNK™ de matraces G-Rex en dos bolsas WAVE separadas de 2 litros en presencia de Pluronic F-68 al 0,05 % el día 0. Las células de ambos biorreactores se combinaron para sembrar una bolsa WAVE de 10 litros el día 5. Las células de una bolsa de 10 litros se transfirieron a dos bolsas WAVE de 20 litros separadas. Las células de ambas bolsas se recolectaron mediante el uso de centrifugación continua el día 14. No se observó precipitación en ninguna de las bolsas WAVE. Ver Figura 6. Las células cultivadas en el lote del biorreactor WAVE # F0517C412 mostraron una potente actividad contra las células diana K562 (ver la Tabla 3). Los resultados de estos estudios, como se resume en la tabla 2, indican que los cultivos haNK® pueden expandirse en presencia de Pluronic F-68 al 0,05 % sin que ocurra formación de agrupamientos en el cultivo.
Ejemplo 3: Citotoxicidad de las células NK-92® que se cultivaron en medios que contienen Pluronic F-68
Una muestra de células haNK que se habían cultivado en bolsas WAVE de 20 litros en presencia de Pluronic F-68 (Lote# E1217C313) se analizó para determinar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC). También se analizó simultáneamente una muestra de referencia del matraz antes de la expansión, que no había sido tratada con Pluronic F-68. La muestra o la muestra de referencia se mezcló con células diana cargadas con calceína, células Ramos, en una relación efector:diana de 10:1 en presencia de anticuerpo Rituxan. La liberación de calceína se midió mediante un lector de placas de fluorescencia después de 3 horas de incubación. La citotoxicidad se expresó como porcentaje de liberación de calceína. Cada muestra se analizó por triplicado y los resultados se muestran en la Tabla 3,
De manera similar, se analizó la citotoxicidad de una muestra de células aNK™ que se habían cultivado en bolsas WAVE de 20 litros en presencia de Pluronic F-68 (Lote# F0517C412). También se analizó simultáneamente una muestra de referencia del matraz antes de la expansión, que no había sido tratada con Pluronic F-68. La muestra o la muestra de referencia se mezcló con células diana cargadas con calceína, células K562, en la relación efector: diana de 10:1. La liberación de calceína se evaluó mediante un lector de placas de fluorescencia después de 3 horas de incubación. La citotoxicidad se expresó como porcentaje de liberación de calceína. Cada muestra se evaluó por triplicado y los resultados se muestran en la Tabla 3.
Los resultados, como se muestran en la tabla 3, indican que la citotoxicidad de las células tratadas con Pluronic F-68 es sustancialmente la misma que la citotoxicidad de las no tratadas, lo que sugiere que aadicionar Pluronic F-68 a los medios de cultivo no afecta negativamente a la citotoxicidad de las células NK-92®.
Ejemplo 4: Identificar la concentración efectiva mínima de Pluronic F-68 necesaria para evitar la formación de agolpamientos en el cultivo de células NK-92®
Este ejemplo describe los estudios conducidos para identificar la concentración efectiva mínima de Pluronic F-68 necesaria para evitar la formación de agrupamientos. Se agregó Pluronic F-68 al cultivo de células haNK en el biorreactor WAVE en concentraciones de 0 %, 0,0125 %, 0,025 % y 0,05 %, respectivamente. Se observaron la formación de agrupamientos en cultivo sin Pluronic F-68 o con 0,125 %. la formación de agrupamientos todavía estaba también en cultivo con Pluronic F-68 al 0,025 %, aunque en una cantidad reducida. En particular, la formación de agrupamientos y la turbidez se evitaron por completo mediante la adición de Pluronic F-68 al 0,05 %. Ver Figura 7. Debido a la apariencia turbia, dos de los cultivos WAVE (0 % y 0,0125 % de Pluronic F-68) se terminaron mientras que los otros dos cultivos se expandieron en bolsas separadas de 10 L durante otros 5 días. Las células se analizaron mediante el uso de un contador de células NC-200 y los porcentajes de agregados celulares se muestran en la Tabla 4.
Ejemplo 5. Evaluar el efecto de Pluronic F-68 en la viabilidad celular de NK-92® mediante el uso de un contador de células NC-200
Las células haNK® que se habían expandido en la ausencia o presencia de Pluronic F-68 en un biorreactor WAVE se evaluaron en cuanto a su salud y viabilidad mediante el uso de un contador de células NC-200. Como se muestra en la figura 8A, aparecieron múltiples picos en un gráfico de naranja de acridina del cultivo que no tenía Pluronic F-68, lo que indica que el cultivo no estaba saludable. La viabilidad celular fue del 70,2 % y las células que estaban en agregados con cinco o más células representan el 17 % del total de células en la muestra. Por el contrario, solo se observó un único pico en los cultivos que contenían Pluronic F-68 al 0,05 %, lo que indica que las células estaban saludables. Además, la viabilidad celular aumentó hasta el 94,9 % y las células estaban sustancialmente libres de agrupamientos, como indica que el porcentaje de células en agregados con cinco o más células era sólo del 2 % (Figura 8B). La adición de Pluronic F-68 redujo la formación de agrupamientos en un 88 %.
Se realizaron estudios similares en las células aNK™ que se expandieron en la ausencia o presencia de Pluronic F-68 en un biorreactor WAVE mediante el uso de un contador de células NC-200. Al igual que con las células haNK®, se mostraron múltiples picos en un gráfico de naranja de acridina del cultivo que no tenía Pluronic F-68, lo que indica que el cultivo no estaba saludable. La viabilidad celular fue del 88,1 % y el 32 % de las células estaban en agregados con cinco o más células. Ver Figura 9A. Por el contrario, solo se observó un único pico en los cultivos que contenían Pluronic F-68 al 0,05 %, lo que indica que las células estaban saludables. Además, la viabilidad celular mejoró hasta el 96,8 % y el porcentaje de agregados celulares se redujo hasta el 3 % (Figura 9B), una reducción del 90 %.
Claims (15)
1. Un método de cultivo de células NK-92 que comprende cultivar las células NK-92 en un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, en donde el cultivo de células NK-92 tiene agolpamientos reducidos en comparación con las células NK-92 de control que se han cultivado en un medio de control que carece del tensioactivo no iónico.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las células NK-92 mantuvieron sustancialmente la misma citotoxicidad que las células NK-92 de control.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo de células está sustancialmente libre de agrupamientos.
4. El método de la reivindicación 1, en donde las células se cultivan en al menos 2 litros de medio de cultivo.
5. El método de la reivindicación 1, en 
donde el tensioactivo no iónico es Poloxámero 188.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el medio de cultivo comprende de 0,025 % a 0,06 % de Poloxámero 188.
7. El método de la reivindicación 5, en donde el medio de cultivo comprende 0,05 % del Poloxámero 188.
8. El método de la reivindicación 1, en donde el cultivo de células NK-92 tiene agregados celulares reducidos en comparación con un cultivo de células de control.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la reducción del porcentaje de agregados celulares es de al menos un 40 %.
10. El método de la reivindicación 8, en donde el cultivo de células NK-92 tiene menos del 6 % de agregados celulares después de 3 días de cultivo.
11. El método de la reivindicación 1, en donde las células NK-92 tienen una viabilidad de al menos el 80 %.
12. El método de la reivindicación 1, en donde las células NK-92 comprenden una citocina, un receptor Fc, un receptor de antígeno quimérico o una de sus combinaciones.
13. Un método para reducir los floculantes en el medio de un cultivo de células NK92, el método comprende agregar al medio de cultivo del 0,025 % al 0,9 % de un tensioactivo no iónico, en donde el medio de cultivo tiene floculantes reducidos en comparación con el cultivo de control que carece del tensioactivo no iónico.
14. Un cultivo de células que comprende las células NK-92 y un medio de cultivo que comprende del 0,025 % al 0,9 % del tensioactivo no iónico, en donde el cultivo de células tiene agrupamientos reducidos en comparación con el cultivo de control que comprende células NK-92 y un medio que carece del agente tensioactivo no iónico.
15. El cultivo de células de la reivindicación 14, en donde:
las células NK-92 se han cultivado durante al menos 3 días; o
el cultivo de células está sustancialmente libre de agrupamientos; o
las células NK-92 mantuvieron sustancialmente la misma citotoxicidad que las células NK-92 en el cultivo de control; o
el tensioactivo no iónico es Poloxámero 188; o
el cultivo de células comprende del 0,025 % al 0,06 % del Poloxámero 188; o
el cultivo de células comprende 0,05 % del Poloxámero 188; o
las células NK-92 comprenden una citocina, un receptor Fc, un receptor de antígeno quimérico, o una de sus combinaciones; o
el cultivo de células tiene un volumen de al menos 2 litros o al menos 10 litros.
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