JP7203438B2 - 体液中アンモニア定量用の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソーム - Google Patents

体液中アンモニア定量用の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソーム Download PDF

Info

Publication number
JP7203438B2
JP7203438B2 JP2020506727A JP2020506727A JP7203438B2 JP 7203438 B2 JP7203438 B2 JP 7203438B2 JP 2020506727 A JP2020506727 A JP 2020506727A JP 2020506727 A JP2020506727 A JP 2020506727A JP 7203438 B2 JP7203438 B2 JP 7203438B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ammonia
polymersome
sample
ratio
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020506727A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020533562A (ja
Inventor
ジャン－クリストフ・ルルー
シモン・マトゥーリ
オルハ・ヴォズニュク・ヴュルティンガー
Original Assignee
イーティーエイチ・チューリッヒ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by イーティーエイチ・チューリッヒ filed Critical イーティーエイチ・チューリッヒ
Publication of JP2020533562A publication Critical patent/JP2020533562A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7203438B2 publication Critical patent/JP7203438B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers
    • C08G81/02—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers at least one of the polymers being obtained by reactions involving only carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C08G81/024—Block or graft polymers containing sequences of polymers of C08C or C08F and of polymers of C08G
    • C08G81/025—Block or graft polymers containing sequences of polymers of C08C or C08F and of polymers of C08G containing polyether sequences
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/08—Simple coacervation, i.e. addition of highly hydrophilic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/12—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K5/00—Use of organic ingredients
    • C08K5/16—Nitrogen-containing compounds
    • C08K5/17—Amines; Quaternary ammonium compounds
    • C08K5/19—Quaternary ammonium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K5/00—Use of organic ingredients
    • C08K5/16—Nitrogen-containing compounds
    • C08K5/34—Heterocyclic compounds having nitrogen in the ring
    • C08K5/35—Heterocyclic compounds having nitrogen in the ring having also oxygen in the ring
    • C08K5/353—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08K—Use of inorganic or non-macromolecular organic substances as compounding ingredients
    • C08K5/00—Use of organic ingredients
    • C08K5/36—Sulfur-, selenium-, or tellurium-containing compounds
    • C08K5/41—Compounds containing sulfur bound to oxygen
    • C08K5/42—Sulfonic acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L25/00—Compositions of, homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by an aromatic carbocyclic ring; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L25/02—Homopolymers or copolymers of hydrocarbons
    • C08L25/04—Homopolymers or copolymers of styrene
    • C08L25/08—Copolymers of styrene
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L53/00—Compositions of block copolymers containing at least one sequence of a polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds; Compositions of derivatives of such polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L87/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds, obtained otherwise than by polymerisation reactions only involving unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • C08L87/005—Block or graft polymers not provided for in groups C08L1/00 - C08L85/04
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/12—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution
    • B01J13/125—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution by evaporation of the solvent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

本発明は、体液（例えば、血清、血漿、唾液）中のアンモニアを定量するための膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの組成物及び使用に関する。より詳細には、本発明は、例えば、肝性脳症などの疾患または症状を診断及びモニタリングするために、アンモニアを定量することに関する。
アンモニア（ＮＨ３）は、様々な疾患及び症状（例えば、肝機能障害（例として、肝硬変、急性肝不全、門脈体循環シャント、先天性アンモニア代謝異常に起因するもの）（Matoori and Leroux ADDR 2015; 90:55-68））を患っている患者または特定の治療を受けている患者に蓄積する神経毒性の内因性代謝産物である。また、アンモニアは、土や廃水といった環境においても蓄積することがある。
体液中のアンモニア
血中の高いアンモニアレベル（高アンモニア血症）は、肝性脳症（ＨＥ）、すなわち死に至ることがある急性徴候や慢性徴候を伴う重篤な神経精神症状に関わっている（Vilstrup et al. Hepatology 2014; 60:715-735）。硬変患者がＨＥに罹患する割合は高い（最大２０％）（Vilstrup et al. supra; Blachier et al. Journal of Hepatology 2013; 58:593-608）。この慢性疾患は通常、低度の症状（認知障害）から重篤な症状（高アンモニア血症性昏睡、一部の患者では致命的結果を伴う）に進行する（上掲のVilstrup et al.）。血漿アンモニアのカットオフ値は、成人の場合５０μＭであり、乳児の場合１００μＭである（上掲のMatoori and Leroux）。急性高アンモニア血症性が発症した場合には、血清アンモニアレベルが１．５ｍＭを超えると報告されている（Bergmann et al. Pediatrics 2014; 133:e1072-e1076）。
血中または血漿中のアンモニアを定量することは、ＨＥの初期診断及びＨＥ患者のフォローアップにおいて不可欠な要素である。ＨＥ患者の治療的介入（例えば、ラクツロース療法）への反応は、血漿アンモニアレベルの変化に基づいて概ね判定されている（上掲のVilstrup et al.）。さらに、高アンモニア血症に関わる特定の薬物治療（例えば、バルプロ酸療法）においても血漿アンモニアレベルが測定されている（上掲のVilstrup et al.）。
また、精液中のアンモニアレベルも精液の質及び低生殖能力と関連することがわかっている（Kim et al. 1998）。
唾液のアンモニアレベルは、口腔内でウレアーゼが媒介して尿素がアンモニアに分解することによって主に決まることから、血漿尿素を示す代替パラメータになり得るものである。例えば、慢性腎疾患を患う患者で口内アンモニアが定量されている。血漿尿素レベルは血液透析が上手く行われているかどうかを示す指標になって、介護者が透析終了時を判定することができるからである（Hibbard et al. Anal Chem 2013; 85: 12158-12165）。だが唾液のアンモニア濃度は比較的高いため、（約１ｍＭ～８ｍＭ、Chen et al. J Breath Res. 2014; 8:036003、図５）事前に希釈しなければ従来のアンモニア定量方法では評価することができない。現状では、多数の体液試料のアンモニアを測定することは困難になっている。試料中でアンモニアが発生する分解プロセスを抑制するために試料を低温で保管することが必要になる上、アンモニアの定量に使用できる方法がかなり限られているのである（Barsotti The Journal of Pediatrics 2001; 138: S11 -S20）。ベルトロー（Berthelot）反応は、フェノールと、アンモニアと、次亜塩素酸塩とのインドフェノール生成反応に基づくものであるが、その低選択性に起因して第１級アミン（例えば、アミノ酸、タンパク質など）に大きく影響される（図１）。このため、体液での使用が制限されている。酵素を用いたアンモニアアッセイ（例えば、RandoxアンモニアアッセイAM1015、Randox Laboratories社、スイス国シュヴィーツ）では、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡ（Ｄ）Ｐ＋への化学量論的酸化下でアンモニアとアルファ－ケトグルタレートとをＬ－グルタメートと水とに変換する。ＮＡＤ（Ｐ）ＨとＮＡＤ（Ｐ）＋の吸光度スペクトルは異なっているため、反応のターンオーバーを分光光度法により追跡することができ、アンモニア濃度を測定することができる。多くの市販されているグルタメートデヒドロゲナーゼを用いたアッセイでは、定量の上限が約１．２ｍＭである。しかし残念なことに、酵素を用いたアンモニアの定量方法は、様々な要因（例えば、脂質、亜鉛または鉄などの重金属、ＮＡＤ（Ｐ）ＨまたはＮＡＤ（Ｐ）－と反応する酵素、タンニン）の影響を受け、酵素反応の時間依存性が大きいため、信頼できる結果を得るには厳密なタイミング調整が必要になる（Seiden-Long et al., Clinical Biochemistry 2014; 47: 1116-1120）。これにより、ハイスループットの実験が困難になる。PocketChem（商標）BA血液アンモニア分析装置（Blood Ammonia Analyzer）は、毛細管血中のアンモニアをポイントオブケア検査するためのストリップ法システムである。試料がストリップに浸透すると、アルカリ化されてアンモニウムをアンモニアに変換する。続いてアンモニアは疎水性膜を通過し、指示薬ストリップにｐＨ変化をもたらす。そして、これを分光光度法により定量する。PocketChem（商標）BA血液アンモニアメーター（Blood Ammonia Meter）PA-4140は、負の固定バイアス及び比例バイアスを持ち、スループットが低く（１回の測定につき３分）、ならびに定量の上限値が低い（０．２８５ｍＭ）ことから、前臨床的及び臨床的に普及してはいない（Goggs et al. Veterinary Clinical Pathology 2008; 37: 198-206）。
他の試料
アンモニアは土や水に混在していることが多い（例えば、肥料または産業廃棄物にアンモニアが含まれることによる）（Mook et al. Desalination 2012; 285: 1 -13）。アンモニアは、アンモニウムイオン選択性電極を用いて定量するのが一般的である（上掲のMook et al.）。しかし、同一の電荷と同様のイオン半径とを持つカチオン（例えばカリウム）が、イオン選択性電極を用いた測定の妨げになる可能性がある。
よって、体液を含めた試料中のアンモニアを定量する代替手段が必要とされている。
本明細書は複数の文書を参照し、それらの文書の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、両親媒性ブロックコポリマーを含むポリマーソームと、試料（例えば、体液試料）中のアンモニアを定量するための該ポリマーソームの使用とを提供する。
本発明は、体液中のアンモニアを定量する（例えば、アンモニアの濃度を測定する）ための膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの組成物及び使用について説明するものである。例えば、本発明は、両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポリ（スチレン）－ｂ－ポリ（エチレンオキシド）（別称ＰＳ－ｂ－ＰＥＯであり、ポリ（スチレン）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）、ＰＳ－ｂ－ＰＥＧとしても知られる））で構成されたポリマーソームを使用する。
アンモニアの捕捉により生じるポリマーソームコアのｐＨ増加を、ｐＨ感受性色素（例えば、ピラニン（８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホネートの三ナトリウム塩、すなわちＨＰＴＳ三ナトリウム塩）、Lysosensor（商標）Yellow/Blueデキストランコンジュゲート、８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホネートの二ナトリウム塩（ＡＮＴＳ）、IRDye（商標）680RDカルボキシレートなど）を用いて定量する。
両親媒性ブロックコポリマーのポリ（スチレン）－ｂ－ポリ（エチレングリコール）（ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ）と酸性成分とから構成されるポリマーソーム（例えば、２０１７年８月１５日に出願された同時継続中のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５４９６６号を参照）を、体液中のアンモニア濃度を測定するのに使用した。ポリマーソームを調製するために、有機溶媒を用いた。かかるポリマーを適切な溶媒（例えば、ジクロロメタン）に溶かし、ｐＨ感受性色素を含んだ酸性溶液（例えば、クエン酸）または塩化ナトリウム溶液中に乳化させた。溶媒を除去した後、ポリマーソームを精製して、封入されなかった色素を除去し、また弱酸がある場合には弱酸を除去した。ポリマーソームを中性溶液または高ｐＨ溶液に曝露すると、アンモニアに対する取り込み特性を示した。本明細書では、バッファ中のアンモニアならびに天然の及びスパイクした血清、血漿、唾液、尿、汗、及び精液に含まれるアンモニアを定量できることを示すことによって、ポリマーソームの有効性を明らかにした（図３～図５、図７～図９）。
本発明のポリマーソームは、アンモニアの定量（あるいは間接的に、インビトロでアンモニア相当量（１以上のファクター）に換算することができる別のバイオマーカー（例えば、フェニルアラニンなどアミノ酸）の定量）に使用することができる。より具体的な実施形態では、本発明のポリマーソームを使用して、アンモニアに関連する疾患または障害（例えば、高アンモニア血症）の診断用として、またアンモニアに関連する疾患または障害を持つ患者のフォローアップ用として、さらに研究用途及び前臨床的用途用として、体液をアッセイすることができる。本発明の診断薬を、アンモニアの定量を必要とするインビトロ試験、前臨床的試験（例えば、動物試験）及び臨床試験に、ならびにルーチンの臨床行為におけるアンモニアの測定に使用することができる。アンモニアの測定は、アンモニアに関連する疾患もしくは障害の診断及びステージ分類に、ならびに高アンモニア血症性患者の抗高アンモニア血症治療に対する応答性評価に、または高アンモニア血症のリスクのある患者の予防措置に対する応答性評価に使用することができる。本発明はさらに、インビトロアッセイにおけるアンモニアの定量に、より具体的にはアンモニアの産生を阻害する化合物の同定に使用することができる。
本発明の膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、有利なことに、アンモニアに対して高い選択性を示すことができる（図６）。これは、以下の仮説に限定されるものではないが、高い疎水性のポリスチレン膜が持つ不透過性の性質に起因すると考えられる。検出範囲は広く、少なくとも約０．００５ｍＭ～約８ｍＭである（図２～図１３）。定量の上限が高く、高濃度のアンモニア試料を希釈する必要性を最低限減らす（場合によっては希釈を不要にする）ため、有利であると考えられる。
さらに、アンモニアのポリマーソームへの取り込みの動力学は高速であり、生理的ｐＨで２．５分間インキュベーションをした後には時間依存性がない（時間依存性が少ない）（図２）。これらの特徴により、同時に多数の試料を分析することが可能になる。
より具体的には、本発明の態様により、以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）ポリ（スチレン）（ＰＳ）とポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とのブロックコポリマーを含む膜であって、前記ＰＳ／ＰＥＯの分子量比が１．０より大きくかつ４．０より小さい膜、及び（ｂ）酸と少なくとも１つのｐＨ感受性色素とを封入するコア、を含む、ポリマーソーム。
（項目２）
前記ブロックコポリマーがジブロックコポリマーである、項目１に記載のポリマーソーム。
（項目３）
前記酸が、前記ポリマーソームが水和した場合に１～６．５、２～６．５、２～６、２～５．５、または３～５．５のｐＨをもたらす濃度である、項目１または項目２に記載のポリマーソーム。
（項目４）
前記酸が酸性水溶液内にある、項目１から項目３のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目５）
前記酸性水溶液内のｐＨが１～６．５、２～６．５、２～５．５、または３～５．５である、項目４に記載のポリマーソーム。
（項目６）
前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、（ｉ）ヒドロキシピレン、（ｉｉ）フェニルピリジルオキサゾール、（ｉｉｉ）アミノナフタレン、（ｉｖ）シアニン、または（ｖ）（ｉ）から（ｉｖ）のいずれか１つのｐＨ感受性蛍光誘導体を含む、項目１から項目５のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目７）
前記ｐＨ感受性色素が、８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホネート（ＨＰＴＳ）、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue、８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホネート（ＡＮＴＳ）、またはIRDye（商標）680RDカルボキシレートを含む、項目６に記載のポリマーソーム。
（項目８）
前記酸と前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素とが異なる分子である、項目１から項目７のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目９）
前記酸がヒドロキシ酸であり、最も好ましくはクエン酸である、項目１から項目８のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目１０）
前記酸と前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素とが同一の分子である、項目１から項目７のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目１１）
前記コポリマーを含有する有機溶媒と、前記酸及び少なくとも１つのｐＨ感受性色素を含有する水相とを混合することを含む方法で調製される、項目１から項目１０のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目１２）
前記有機溶媒が水不混和性であるか、または部分的に水混和性である、項目１１に記載のポリマーソーム。
（項目１３）
前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性蛍光色素である、項目１から項目１２のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目１４）
前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性吸光色素である、項目１から項目１２のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目１５）
項目１から項目１４のいずれか１項目で定義されるポリマーソームを作製する方法であって、
（ａ）コポリマー含有有機相を形成するために、ＰＳとＰＥＯとの前記ブロックコポリマーを、有機溶媒に、好ましくは水不混和性または部分的に水混和性の有機溶媒に溶解することと、
（ｂ）前記ポリマーソームを形成するために、前記コポリマー含有有機溶媒相と、前記酸及び少なくとも１つのｐＨ感受性色素を含む水相とを混合することと、
（ｃ）封入されていない前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素及び有機溶媒を除去することと、を含む、方法。
（項目１６）
前記水相が０．２ｍＭ～１００ｍＭの酸を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目１５または項目１６で定義される方法によって調製されたポリマーソーム。
（項目１８）
ポリマーソームのコアがアンモニアをさらに封入している、項目１から項目１４、及び項目１７のいずれか１項目に記載のポリマーソーム。
（項目１９）
項目１から項目１４、及び項目１７のいずれか１項目で定義されるポリマーソームと、少なくとも１つの賦形剤とを含む、組成物。
（項目２０）
前記少なくとも１つの賦形剤が、防腐剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、酸化防止剤、またはこれらのうちの少なくとも２つの組み合わせを含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記組成物が液体形態または固体形態である、項目１９または項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
項目１９または項目２０で定義される組成物を固体形態で含む、ストリップ。
（項目２３）
液体試料中のアンモニアの定量に使用するための、項目１から項目１４、及び項目１７のいずれか１項目に記載のポリマーソーム、または項目１９から項目２１のいずれか１項目に記載の組成物、または項目２２に記載のストリップ。
（項目２４）
前記試料が対象由来の体液を含む、項目２３に記載の使用のためのポリマーソーム、組成物、またはストリップ。
（項目２５）
前記試料がバッファをさらに含む、項目２４に記載の使用のためのポリマーソーム、組成物、またはストリップ。
（項目２６）
前記対象が（ｉ）アンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症に罹患しているか、（ｉｉ）アンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症に罹患している疑いがある、もしくは罹患する可能性があるか、または（ｉｉｉ）抗高アンモニア血症の治療もしくは抗フェニルケトン尿症の治療を受けている、項目２４に記載の使用のためのポリマーソーム、組成物、またはストリップ。
（項目２７）
試料のアンモニア濃度を算出するための、項目１から項目１４、及び項目１７のいずれか１項目に定義されるポリマーソーム、項目１９から項目２１のいずれか１項目に記載の組成物、または項目２２に記載のストリップを使用する方法であって、
（ａ）前記ポリマーソーム、組成物、またはストリップと、前記試料とを接触させることと、
（ｂ）前記ポリマーソーム含有試料もしくは前記組成物含有試料、または前記試料含有ストリップにおける少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性を測定することと、
（ｃ）前記少なくとも１つｐＨ依存性分光特性を使用し標準曲線に照合することによって、前記試料のアンモニア濃度を算出することと、を含む方法。
（項目２８）
前記ｐＨ依存性分光特性がｐＨ依存性吸光度であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ依存性吸光色素であり、前記標準曲線が吸光度標準曲線である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ｐＨ依存性分光特性がｐＨ依存性蛍光強度であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性蛍光色素であり、前記標準曲線が蛍光標準曲線である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
項目２７に記載の方法であって、（ｂ）が、少なくとも１つの分光特性比を算出するために、前記ポリマーソーム含有試料もしくは前記組成物含有試料または前記試料含有ストリップにおいて、少なくとも１つのｐＨ非依存性分光特性または少なくとも１つのさらなるｐＨ依存性分光特性を測定することをさらに含み、（ｃ）が、前記少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性比を使用し分光特性比の標準曲線に照合することによって、前記ポリマーソーム含有試料もしくは前記組成物含有試料または前記試料含有ストリップのアンモニア濃度を算出する、方法。
（項目３１）
前記少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性及び前記少なくとも１つのｐＨ非依存性分光特性が、同一のｐＨ感受性色素から得られる、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記分光特性が吸光度であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性吸光色素である、項目３０または項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記分光特性が蛍光であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性蛍光色素である、項目３０または項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記ポリマーソームコア内のｐＨが２～６．５である、項目２７から項目３３のいずれか１項目に記載の方法。
（項目３５）
前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、ヒドロキシピレン、またはその誘導体のうちの１つを含む、項目２７から項目３４のいずれか１項目に記載の方法。
（項目３６）
前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホネート（ＨＰＴＳ）を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、ピリジルフェニルオキサゾール、もしくはその誘導体のうちの１つ、アミノナフタレン、もしくはその誘導体のうちの１つ、またはシアニン、もしくはその誘導体のうちの１つを含む、項目２７から項目３４のいずれか１項目に記載の方法。
（項目３８）
前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue、ＡＮＴＳ、またはIRDye（商標）680RDカルボキシレートを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記試料が対象由来の体液試料を含む、項目２７から項目３８のいずれか１項目に記載の方法。
（項目４０）
前記体液が血液試料もしくは血液画分試料、唾液試料、または精液試料である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記体液がフェニルアラニンアンモニアリアーゼで前処理された、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
（ｉ）前記対象におけるアンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症の診断であって、前記試料のアンモニア濃度が基準アンモニア濃度よりも高いことが、前記対象がアンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症に罹患していることを示す診断用であるか、または（ｉｉ）抗高アンモニア血症もしくは抗フェニルケトン尿症の治療効果のモニタリングであって、前記試料のアンモニア濃度が基準アンモニア濃度よりも低いことが、前記抗高アンモニア血症もしくは抗フェニルケトン尿症の治療が効果的であることを示すモニタリング用である、項目４０または項目４１に記載の方法。
（項目４３）
試料のアンモニア濃度を算出するキットであって、（ａ）項目１から項目１４、及び項目１７のいずれか１項目で定義されるポリマーソーム、項目１９から項目２１のいずれか１項目で定義される組成物、または項目２２に記載のストリップ、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ポリマーソームを水和するための溶液、（ｉｉ）前記ポリマーソームの外相及び／もしくはアッセイする前記試料のｐＨを調整するためのバッファ、（ｉｉｉ）アッセイする前記試料を希釈するための希釈剤、（ｉｖ）蛍光標準曲線及び／もしくは吸光度標準曲線、（ｖ）既知のアンモニア濃度の１つもしくは複数の溶液、または（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）のうちの少なくとも２つの組み合わせ、を含む、キット。
本発明の他の目的、利点、及び特徴は、添付の図面を参照して例示の目的でのみ提供される、以下の特定の実施形態の限定的ではない説明を読むことにより明らかになるであろう。
ベルトロー反応によるアンモニア定量にＬ－リシンが及ぼす影響を示す図である。Ｌ－リシンが存在することにより、ベルトロー反応で算出したアンモニア濃度が過小評価となる。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるピラニン含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度比を示す図である。ピラニン含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、緩衝液におけるアンモニア濃度の関数となる。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 ヒト血清における蛍光ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるアンモニアの定量と市販の酵素アンモニアアッセイによる定量とを比較した図である。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト血清中のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ポリマーソームアッセイに対してはｎ＝３、酵素キットに対してはｎ＝８）。 ヒト血漿における蛍光ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるアンモニアの定量と市販の酵素アンモニアアッセイによる定量とを比較した図である。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト血漿中のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 ヒト唾液における蛍光ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるアンモニアの定量と市販の酵素アンモニアアッセイによる定量とを比較した図である。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト唾液中のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを用いたアンモニア定量にＬ－リシンが及ぼす影響を示す図である。最大１５ｍＭのＬ－リシン（すなわち、通常の血漿濃度の１００倍）に至るまでアンモニア濃度の測定に影響を与えていない。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 ヒト尿における蛍光ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるアンモニアの定量と市販の酵素アンモニアアッセイによる定量とを比較した図である。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト尿中のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 ヒト汗における蛍光ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるアンモニアの定量と市販の酵素アンモニアアッセイによる定量とを比較した図である。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト汗中のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 ヒト精液における蛍光ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるアンモニアの定量と市販の酵素アンモニアアッセイによる定量とを比較した図である。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト精液中のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるデキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比を示す図である。デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、緩衝液におけるアンモニア濃度の関数となる。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるＡＮＴＳ含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比を示す図である。ＡＮＴＳ含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、緩衝液におけるアンモニア濃度の関数となる。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるIRDye（商標）680RD含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度を示す図である。IRDye（商標）680RD含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度は、緩衝液におけるアンモニア濃度の関数となる。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度においてポリマーソームコア内に酸が添加されていない状態でのピラニン含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比を示す図である。ポリマーソームコア内に酸が添加されていない状態でのピラニン含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、緩衝液におけるアンモニア濃度の関数となる。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液におけるピラニン含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム（ＰＳ／ＰＥＯ比は約１．２～約３）によるアンモニア定量結果を示す。ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム（ＰＳ／ＰＥＯ比は約１．２～約３．０）は、リン酸緩衝液のアンモニアを定量することができた。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。 リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるピラニン含有ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの吸光度比を示す図である。結果を平均値及び標準偏差として示した（ｎ＝３）。
本発明は、体液中のアンモニアを定量するための膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームと、該ポリマーソームを含む組成物と、該ポリマーソームを作製するプロセスと、これらのポリマーソーム及び組成物の使用とを包含するものである。
ポリマーソーム
ポリマーソームは小胞であり、その二重膜は合成コポリマーから構築される。ポリマーソームの平均直径はレーザー回折で測定されており、５０ｎｍ～１００μｍまたはそれ以上の範囲であるが、特定の実施形態では１００ｎｍ～４０μｍの範囲である。本発明の評価用ポリマーソームは平均直径が１００ｎｍ～４０μｍでありアンモニアを効果的に封入することができたが、直径が４０μｍを超えるポリマーソームが同様の効果を持たないと言える根拠は何もない。
本発明のポリマーソームは両親媒性ブロックコポリマーを含み、有機溶媒を用いて調製される。
本発明の作用機序は、ポリマーソーム膜を貫通するｐＨ勾配に基づくものである。水性ポリマーソームコアに含まれる酸性剤は、本発明で使用する種々の液体試料（例えば、体液試料）における試料のｐＨ（例えば生理的ｐＨ）またはバッファを添加した後の試料のｐＨとは異なるｐＨ（より低いｐＨ）を有する。ヒト血液及びその液体画分のｐＨは通例、７．３５～７．４５であり、唾液のｐＨは６．７～７．４であり（Baliga et al J Indian Soc Periodontol. 2013; 17:461-465）、尿のｐＨは４．５～７．５であり（Maalouf et al. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 2007; 2:883-888）、汗のｐＨは４．５～７であり（Oncescu et al. Lab Chip 2013; 13:3232-3238）、精液のｐＨは７．２～８．０である（Haugen et al. International Journal of Andrology 1998;21 :105-108）。他の哺乳動物もこれらの範囲と同様の範囲を有する。したがって、アンモニアは、ポリマーソームの疎水性ポリマー膜を荷電されていない状態で通過して拡散した後、内側の囲われた部分でプロトン化（イオン化）されて（例えば、アンモニアの場合にはアンモニウムとして）トラップされ得る。アンモニアは、そのままの状態の試料（例えば、体液）またはバッファで希釈された試料のｐＨでは主にプロトン化された状態であるが、イオン化されていない状態のアンモニアも少量存在する。この少量の画分はポリマーソーム内に拡散し、ポリマーソームの内側にプロトン化された状態でトラップされ得る。アンモニア分子のプロトン化によりプロトンを消費することで、ポリマーソームコア内部のｐＨを上昇させる。アンモニア／アンモニウムの平衡状態は外相で迅速に再構築され（すなわち、アンモニア画分を再構築するためにアンモニウムが脱プロトン化され）、さらなるアンモニア分子を生じ、これがポリマーソームコアに拡散し得る。分光特性（蛍光強度または吸光度）は、ポリマーソームコア内のｐＨ感受性色素のｐＨ依存性波長において、コア内のアンモニア濃度の上昇に伴い変化することになる。
「アンモニアを定量する膜貫通ｐＨ勾配」という特性は、本明細書で使用される場合、本発明のポリマーソームが、試料（例えば、体液試料）に希釈されているアンモニア（それ自体がバッファに希釈されている場合もある）を可溶状態にとどめる機能を意味する。
ブロックコポリマー
「ポリマー」とは、連結したモノマー単位を含む高分子である。モノマー単位は単一の種類からなっていてもよく（ホモポリマー）、様々な種類からなっていてもよい（コポリマー）。単一の種類の２つ以上の連続したモノマー（ブロック）が別の種類の２つ以上のモノマー（他のブロック）と共有結合して構成されているコポリマーをブロックコポリマーと称する。例えば、２種類のブロックが共有結合して構成されているコポリマーをジブロックと称し、３種類のブロックで構成されている場合にはトリブロックと称する。ブロックコポリマーは、その作製に使用する特定の合成法により異なる末端基を含み得る。
本発明のポリマーソームはブロックコポリマーを含む。特定の実施形態では、本発明のコポリマーは、ジブロックコポリマーまたはトリブロックコポリマーである。これらのブロックコポリマーは両親媒性であり、少なくとも２種類のポリマー、すなわち芳香族高疎水性ポリマー（例えば、ポリ（スチレン））と、親水性の非荷電非生物分解性ポリマーとから形成されている。さらに特定の実施形態では、ブロックコポリマーは、ジブロックコポリマー（例えば、ポリ（スチレン）－ｂ－ポリ（エチレンオキシド）（ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ））またはトリブロックコポリマー（例えば、ＰＥＯ－ｂ－ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ（すなわち、ＰＳＰＥＯブロックコポリマー））である。
「両親媒性」コポリマーとは、親水性（水溶性）基と疎水性（非水溶性）基の両方を含むものである。
用語「非生物分解性」は、本明細書で使用される場合、液体試料（例えば、体液試料）の状態で非加水分解性である（例えば、ｐＨ、酵素、または他の手段によって分解されにくい）ことを意味する。
疎水性非荷電ポリマー
特定の実施形態では、本発明のコポリマーにおいて使用される疎水性非荷電ポリマーは、ポリ（エチルエチレン）（－（ＣＨ２－ＣＨ（Ｃ２Ｈ５））ｎ－、すなわち－（Ｃ４Ｈ８）ｎ－）、またはポリ（スチレン）（－（ＣＨ２－ＣＨ（Ｐｈ）ｎ）－、すなわち－（ＣＨ２－ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ｎ）－もしくは－（Ｃ８Ｈ８）ｎ－）である。特定の実施形態では、疎水性非荷電ポリマーはポリ（スチレン）（ＰＳ）である。本発明で使用するポリ（スチレン）は、非置換スチレンモノマー及び／または置換もしくは官能化されたスチレンモノマーを含んでいてもよい。別途具体的に定義されない限り、用語「ポリ（スチレン）」は、非置換スチレンモノマーのみか、置換スチレンモノマーと非置換スチレンモノマーとの混合物か、または置換スチレンモノマーのみかを含むポリ（スチレン）を称するのに、総称して本明細書で用いられている。スチレンモノマーの１つまたは複数の置換基は、該モノマーのフェニル基に及び／もしくは該フェニル基が結合している炭素に対する置換基を含んでいてもよく、ならびに／または該フェニルと多環誘導体（例えば、Ｃ３～Ｃ６のアリール及び／またはＣ３～Ｃ６のシクロアルキルを含む二環系、三環系など）を形成していてもよい。置換基の候補として、アルキル（Ｃ１～Ｃ７（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７、より具体的にはＣ１、Ｃ２、またはＣ３）、アリール（Ｃ３～Ｃ６）、Ｃ３～Ｃ８のシクロアルキル、アリールアルキル、アセトキシル、アルコキシル（メトキシル、エトキシル、プロパノキシル、ブトキシルなど）、ハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆなど）、アミン、アミド、アルキルアミン、ＮＯ２が挙げられる。置換基はそれ自体が置換され得る。置換スチレンモノマーとして、以下に限定されないが、アセトキシスチレン、ベンズヒドリルスチレン、ベンジルオキシメトキシスチレン、ブロモスチレン（２－、３－、４－、またはアルファ）、クロロスチレン（２－、３－、４－、またはアルファ）、フルオロスチレン（２－、３－、４－、またはアルファ）、ｔｅｒｔ－ブトキシスチレン、ｔｅｒｔ－ブチルスチレン、クロロメチルスチレン、ジクロロスチレン、ジフルオロスチレン、ジメトキシスチレン、ジメチルスチレン、ジメチルビニルベンジルアミン、ジフェニルメチルペンテン、（ジフェニルホスフィノ）スチレン、エトキシスチレン、イソプロペニルアニリン、イソプロペニル－α，α－ジメチルベンジルイソシアネート、［Ｎ－（メチルアミノエチル）アミノメチル］スチレン、メチルスチレン、ニトロスチレン、ペンタフルオロフェニル、４－ビニル安息香酸、ペンタフルオロスチレン、（トリフルオロメチル）スチレン（２－、３－、または４－）、トリメチルスチレン、ビニルアニリン（３－または４－）、ビニルアニソール、ビニル安息香酸（３－、４－）、ビニルベンジルクロリド、（ビニルベンジル）トリメチルアンモニウムビニルビフェニル、４－ビニルベンゾシクロブテン（４－、など）、ビニルアントラセン（９－、など）、２－ビニルナフタレン、ビニルビフェニル（３－、４－、など）といったものが挙げられる。一実施形態において、ＰＳは少なくとも１つの置換スチレンモノマーを含む。置換基は非イオン性基（例えば、メチルブチル基またはｔｅｒｔ－ブチル基）であり得る。特定の実施形態では、置換スチレンモノマーはアルカリスチレン（例えばメチルスチレン）またはｔｅｒｔ－ブチルスチレンである。別の特定の実施形態では、ポリ（スチレン）のスチレンモノマーは置換されていない。
親水性非荷電ポリマー
本発明のブロックコポリマーにおいてポリ（スチレン）と合わせて使用され得る親水性非荷電ポリマーとして、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（メチルオキサゾリン）、及びオリゴエチレングリコールアルキルアクリレートのポリマー類が挙げられる。特定の実施形態では、親水性非荷電ポリマーはポリ（エチレンオキシド）である。
本発明で使用するポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）は、以下の一般式：（－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－、すなわち－（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ－）を有し、非置換エチレンオキシドモノマー、及び置換または官能化エチレンオキシドモノマーを含む。別途具体的に定義されない限り、用語「ポリ（エチレンオキシド）」またはＰＥＯは、非置換エチレンオキシドモノマーのみか、置換エチレンオキシドモノマーと非置換エチレンオキシドモノマーとの混合物か、または置換エチレンオキシドモノマーのみかを含むＰＥＯを称するのに、総称して本明細書で用いられている。一実施形態において、ＰＥＯは少なくとも１つの置換エチレンオキシドモノマーを含む。別の実施形態では、エチレンオキシドモノマーは置換されていない。
ポリマーの割合
ＰＳブロックとＰＥＯブロック（例えば、ジブロックＰＳ－ｂ－ＰＥＯまたはトリブロックＰＥＯ－ｂ－ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ）の分子量は、二重層の構造及び安定性が保たれる限り様々な値であり得る。発明者らは、安定なＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームが、１．０超かつ４未満の間のＰＳ／ＰＥＯ数平均分子量比になることを見いだした（例えば、実施例２～実施例１６を参照）。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．９以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．９未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．９未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．９未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．９未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．８以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．８未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．８未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．８未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．８未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．７以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．７未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．７未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．７未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．７未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．６以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．６未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．６未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．６未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．６未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．５以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．５未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．５未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．５未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．５未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．４以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．４未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．３以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．２以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．２未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．２未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．２未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．２未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約３．２以下である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３．１未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３．１未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３．１未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３．１未満である。特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ３未満である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．９以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ約２．９以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ約２．９以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．９以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．９以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．８以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１以上かつ約２．８以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．２以上かつ約２．８以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．８以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．８以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．７以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．７以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．７以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．７以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．７以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．６以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．６以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．６以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．６以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．６以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．５以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．５以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．５以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．５以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．５以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．４以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．４以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．４以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．４以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．４以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．３以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．３以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．３以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．３以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．３以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．２以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．２以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．２以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．２以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．２以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．１以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．１以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．１以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．１以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．１以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１超かつ約２．０以下である。別の特定の実施形態では、該比は約１．１超かつ約２．０以下である。特定の実施形態では、該比は約１．２と約２．０以下の間である。特定の実施形態では、該比は約１．３以上かつ約２．０以下である。特定の実施形態では、該比は約１．４以上かつ約２．０以下である。
上記記載の一般性を制限するものではないが、約４００ｇ／ｍｏｌ～２０，０００ｇ／ｍｏｌの間の分子量を有するＰＥＯが本発明に包含される。しかしながら、出願人らは、より大きい分子量のＰＥＯを本発明に効果的に使用することができないと考える根拠を何ら有するわけではない。ポリマーの分子量は小さいほど操作しやすいと考えられる。ＰＥＯの分子量は通例、１０００ｇ／ｍｏｌ～５０００ｇ／ｍｏｌの間である。ＰＳ分子量は上述の比を満たすように選択される。本発明によれば、ＰＥＯの分子量が例えば約２０，０００ｇ／ｍｏｌである場合、ＰＳの分子量は約８０，０００ｇ／ｍｏｌ未満である。
疎水性非荷電ポリマー＋親水性非荷電ポリマーから構成されるポリマーソーム（ジブロックコポリマーまたはトリブロックコポリマー（例えばＰＳ－ｂ－ＰＥＯコポリマーまたはＰＥＯ－ｂ－ＰＳ－ｂ－ＰＥＯコポリマー））の特性
以下の仮説に限定されるものではないが、小胞膜における高疎水性ポリマー（例えば、パイスタッキイング相互作用を生じさせる芳香族（例えばＰＳ））の強い相互作用が、液体試料（例えば、血清、血漿、及び唾液などの体液試料）に対する耐性をもたらし、かつアンモニアに対する選択性（すなわち、アンモニアに対する選択的透過性かつ他の多くの生体化合物に対する低透過性）をもたらすと考えられる。これは膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームが、種々の複雑な生理学的な環境や第１級アミンのＬ－リシンが過剰な状況においてもアンモニアを定量する機能を保持することによって明らかにされている（実施例３～実施例９を参照）。特定の実施形態では、該ポリマーソームのポリマープロックは非生物分解性である。
ポリマーソームの調製方法
コポリマーの調製
任意の既知のコポリマー作製方法を用いることができる。本明細書に記載の実施例で使用するコポリマーは、Advanced Polymer Materials社（カナダ国ドーヴァル）から購入したもの（ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ）（実施例２～実施例１１、実施例１４を参照）であるか、または合成したもの（実施例１２～実施例１６を参照）である。
ポリマーソームの調製
コポリマーを有機溶媒に溶解して有機相を形成し、その有機相を、酸性水溶液（例えば、ｐＨ感受性色素、及び任意選択的に、ｐＨ感受性色素の濃度が十分高くない場合にはクエン酸などのさらなる酸）（水相）と混合する。この混合工程は種々の手法を用いて行うことができる。例えば、水中油型（ｏ／ｗ）エマルション（すなわち酸性水溶液（すなわち水相）中にポリマー含有有機溶媒相（すなわち油相）がある状態）、逆相蒸発法、ナノ沈殿法、またはダブルエマルション法を用いて、ポリマー含有有機相と水相とを混合することができる。
用語「ｐＨ感受性色素」は、本明細書で使用される場合、分光特性が媒体のｐＨに依存する色素を意味する。詳細には、ｐＨ感受性吸光色素及びｐＨ感受性蛍光色素を含む。本発明の方法はポリマーソームコアのｐＨ変化を測定することに基づいているため、全てのｐＨ感受性色素が本発明に包含される。
用語「吸光色素」は、本明細書で使用される場合、特定の紫外波長、可視波長、及び／または近赤外波長で照射された場合に、それらの波長を吸収する色素を意味する。用語「ｐＨ感受性吸光色素」は、本明細書で使用される場合、吸光スペクトルが媒体のｐＨに応じて変化する色素を意味する。本発明のｐＨ感受性吸光色素として、以下に限定されないが、ＨＰＴＳまたはその塩（例えば、ＨＰＴＳカリウム塩またはＨＰＴＳ三ナトリウム塩）、トリアリールメタン色素（例えば、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、クレゾールレッド、クロロフェノールレッド、フェノールレッド、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、チモールブルー、ブロモチモールブルー）、アゾ色素（例えば、メチルオレンジ、メチルレッド、エリオクロムブラックＴ、コンゴーレッド）、ニトロフェノール色素（例えば、２，４－ジニトロフェノール）、アントラキノン色素（例えば、アリザリン）、及び以下の「ｐＨ感受性蛍光色素」に列挙した色素が挙げられる。
ｐＨ感受性吸光色素は少なくとも１つのｐＨ非依存性（等吸収）波長をさらに含むことができ、その波長での吸光度値はｐＨに依存しておらず、その値を用いてｐＨ依存性波長の吸光度値を正規化することができる。ｐＨ感受性吸光色素は、さらに別のｐＨ依存性波長の吸光値に対して正規化され得る（実施例１６を参照）。
用語「蛍光色素」は、本明細書で使用される場合、特定の紫外波長、可視波長、及び／または近赤外波長で照射された場合に蛍光強度を生じさせる色素を意味し、適切な濃度でその色素が溶解している溶液において蛍光強度が生じるかまたは変わることになる。用語「ｐＨ感受性蛍光色素」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つのｐＨ依存性（励起または放射）波長を含む蛍光色素を意味する。
ｐＨ感受性蛍光色素は、少なくとも１つのｐＨ非依存性（等吸収）（励起または放射）波長であって、該波長の蛍光強度がｐＨ非依存性であり、ｐＨ依存性（励起または放射）波長での蛍光強度を正規化するのに使用可能な波長をさらに含み得る。本発明のｐＨ感受性蛍光色素として、以下に限定されないが、ＨＰＴＳまたはその塩（例えば、ＨＰＴＳ三カリウム塩またはＨＰＴＳ三ナトリウム塩）などのヒドロキシピレン及びその誘導体、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blueなどのフェニルピリジルオキサゾール及びその誘導体、ナフタレン誘導体（例えば、ＡＮＴＳまたはその塩（例えば二ナトリウム塩または二カリウム塩）などのアミノナフタレン及びその誘導体）、IRDye（商標）680RDなどのシアニン及びその誘導体、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン及びその誘導体（例として、カルボキシフルオセインナトリウム）、ローダミンＢ及びその誘導体）、クマリン誘導体、スクアライン（squaraine）誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、インドリニウム誘導体（（Ｅ）－６－ヒドロキシ－５－スルホ－４－（２－（１，３，３－トリメチル－３Ｈ－インドール－１－イウム－２－イル）ビニル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－キサンテン－７－スルホネート、（Ｅ）－２－（２－（６－ヒドロキシ－７－（モルホリノメチル）－２，４ａ－ジヒドロ－１Ｈ－キサンテン－３－イル）ビニル）－３，３－ジメチル－１－プロピル－３Ｈ－インドール－１－イウムヨウ化物、（Ｅ）－２－（２－（７－（ベンゾ［ｄ］チアゾール－２－イル）－６－ヒドロキシ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－キサンテン－４－イル）ビニル）－３，３－ジメチル－１－（３－スルホネートプロピル）－３Ｈ－インドール－１－イウム－５－スルホネート）、ならびにテトラピロール誘導体が挙げられる。注目すべきこととして、IRDye（商標）680RDなどの近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素を直接用いて、細胞を含む体液試料、例えば血液（すなわち全血）などをアッセイすることができる（つまり、蛍光アッセイの前に液体試料から細胞（例えば赤血球）を取り除く必要がない）。各色素は特定のｐＨ依存性蛍光（励起または放射）強度プロファイルを有しており、ポリマーソームコアのｐＨは、ｐＨの変化に対して色素の感度が最も高くなる（すなわち、色素の蛍光（励起または放射）強度スペクトルが最も強いｐＨ依存性を示す）ｐＨ範囲に調整される。特定の実施形態では、そのポリマーコアのｐＨは約２～６．５の間である。さらなる特定の実施形態では、そのポリマーコアのｐＨは約２～５．５の間である。
２種類以上の色素が使用され得る。例えば、以下に限定されないが、少なくとも１つのｐＨ依存性波長を有するがｐＨ非依存性波長を有さないｐＨ感受性蛍光色素を、少なくとも１つのｐＨ非依存性波長（例えば、較正目的用）を有する別の色素と組み合わせることができる。
ポリマーソームコア内のｐＨ感受性色素の濃度は、適切な吸光強度または蛍光強度が生じるように選択される。ポリマーソームコアのｐＨ及びｐＨ感受性酸性色素（例えば、蛍光色素）の濃度は、別途酸を用いない場合には、ポリマーソームコアのアンモニア濃度に応じてｐＨ依存性蛍光強度の連続的な変化が示されるように選択される。ｐＨ感受性色素の濃度は通例、約０．００２ｍＭ～約２００ｍＭの範囲である。ｐＨ感受性蛍光色素を用いる特定の実施形態では、濃度範囲は約０．００２ｍＭ～約２００ｍＭである。本明細書で開示する実施例において、濃度範囲は約０．０１ｍＭ（LysoSensor（商標）Yellow/Blueデキストラン１０，０００ＭＷ）～約１０ｍＭ（ピラニン及びＡＮＴＳ）である。水中油型（ｏ／ｗ）エマルション方法では、ポリマー含有有機溶媒と酸性水相（ｐＨ感受性色素を含有）とを、超音波処理を用いてエマルションを形成するのに十分な時間混合する。以下の実施例では、水相を有機溶媒で３０分間攪拌しながら飽和させた後にポリマー含有有機溶媒相を加えた。続いて、ポリマー含有有機溶媒相を酸含有水相に超音波処理を用いて氷浴で（超音波処理により発生する熱を低減させるため）加えた。機械操作パラメータは、振幅７０、サイクル０．７５（ＵＰ２００Ｈ、２００Ｗ、２４ｋＨｚ、Hielscher Ultrasound TechnologyソノトロードＳ１使用）で３分間、または振幅１０（３．１ｍｍソノトロード、Fisher Scientific Model 705 Sonic Dismembrator（商標）、７００Ｗ、５０／６０Ｈｚ、Fisher Scientific社）で２分間である。エマルションを作製するために、当該技術分野で既知の任意の方法を使用することができる。エマルションの作製に適切な超音波処理使用法ならびに超音波処理パラメータ及び時間は、用いるエマルション手法によって定まることになる。エマルションは、本発明の調製方法において安定である必要はない。
逆相蒸発法では、ポリマー含有有機溶媒とｐＨ感受性色素とを含む２相のシステムを、必要な場合には酸含有水相を加えて超音波処理して、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションを形成する。外相を、粘性ゲル様状態が形成されるまで減圧下で蒸発させる。ポリマーソームはゲル状態が崩壊する際に生じる（Krack et al. J. Am. Chem. Soc. 2008; 130:7315-7320）。続いて、溶媒と封入されなかった色素とを除去する。
ナノ沈殿法では、ポリマーを適切な有機溶媒に溶解し、そこにｐＨ感受性色素と、必要な場合には追加の酸含有水とを徐々に加える。あるいは、有機相を水相に添加してもよい。続いて、溶媒と封入されなかった色素とを除去する。
ダブルエマルション法では、ポリマーソームは、内部相にｐＨ感受性色素及び必要な場合には追加の酸含有水と、中間相にポリマー含有完全水不混和性または部分的水不混和性の有機溶媒と、外相に水とを含む、ｗ／ｏ／ｗダブルエマルションで生じる。続いて、溶媒と封入されなかった色素とを除去する。
外相または外部相のｐＨ（例えば、中性ｐＨ及び塩基性ｐＨ）と組成物（バッファ無（すなわち、血清または血漿などの自然に緩衝化された生理的溶液中のポリマーソーム含有溶液を希釈していない状態）またはバッファ有）とを様々に変えることもできる。外相のｐＨを増加させることで、アンモニア／アンモニウムの平衡状態においてアンモニアの割合が増加するため、取り込み動力学をさらに加速すると考えられる。
ポリマーソームの外相または外部相で使用される及び／もしくはアッセイする体液試料に添加される「バッファ」は、本明細書で使用される場合、ｐＨを安定化させるためか、またはｐＨを増加してアッセイする試料でアンモニウムをさらに脱プロトン化させる（すなわち、アンモニア量を増やす）ために用いて、その結果ポリマーソームでのアンモニアの拡散速度を増加させるものである。ｐＨの安定化には任意の中性バッファまたはアルカリ性バッファが適しており、ｐＨの増加には任意のアルカリ性バッファが適していると考えられる。より詳細には、バッファは、以下に限定されないが、リン酸、ホウ酸、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、イミダゾール、炭酸水素、及び炭酸の塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンであり得る。
外相のバッファ濃度または評価試料（例えば、体液）に添加されるバッファ濃度は、結果として生じる溶液のｐＨがポリマーソームコアｐＨに対して十分なｐＨ勾配を生じさせる適正値を確保するように選択され、これは色素のｐＨプロファイルに依存する。濃度範囲は通例、約２ｍＭ～約１５０ｍＭである。特定の実施形態では、濃度範囲は約２ｍＭ～約６０ｍＭであるか、または約４ｍＭ～約５０ｍＭである。
外相のバッファまたは評価試料（例えば、体液）に添加されるバッファのｐＨは、外相と内相の間に十分なｐＨ勾配を与え、適正な動力学プロファイルを確保するように選択される。ｐＨ範囲は典型的にはｐＨ７～ｐＨ１０である。特定の実施形態では、ｐＨは約７．４（すなわち、アンモニア標準曲線の作製に使用するＰＢＳバッファのｐＨ）である（実施例２～実施例１６を参照）。別の特定の実施形態では、全てのアッセイ試料のｐＨが、比較を可能にするために、アンモニア標準またはフェニルアラニン標準と同じｐＨに調整されている（実施例２～実施例１６を参照）。さらに別の特定の実施形態では、ｐＨ７．４の緩衝化された外部相を有するポリマーソームを、ｐＨ８．５のフェニルアラニンアッセイ試料及びｐＨ８．５のフェニルアラニン標準曲線試料に添加した後も、分散液のｐＨを約７．４としている（実施例１５を参照）。しかし、標準試料または評価試料をポリマーソーム分散液と混合する際にｐＨを調整する場合、評価試料と標準試料のｐＨが同一である必要はなく、ポリマーソーム分散液の外相の緩衝能によってｐＨが決まる及び／またはバッファを追加して分散液のｐＨが決まることもある。特定の実施形態では、ポリマーソーム分散液と、アッセイ試料、及び必要な場合には追加のバッファとを混合することで得られる分散液の外相のｐＨは、ポリマーソーム分散液と、アンモニア標準液またはフェニルアラニン標準液、及び必要な場合には追加のバッファとを混合することで得られる分散液の外相のｐＨと同一になるように調整されて、比較できるようにする。以下に限定されるものではないが、血液試料及び血液画分試料をアッセイするのにｐＨ７．４を用いると、試料のｐＨと一致しているため、ｐＨに依存したアーチファクトが生じ得るリスクを抑えるという点においても有利である。ポリマーソームコアとアッセイ試料との間に、試料固有の緩衝能によって十分なｐＨ勾配が形成できる場合、バッファを外から外相に加えなくてもよい。
用語「十分な勾配」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１ｐＨ単位の差であると一般的に理解されており、好ましい実施形態では、コアとアッセイ試料との間で、少なくとも１ｐＨ単位、好ましくは２ｐＨ単位の差である（例えば、試料のｐＨは６以上かつコアのｐＨは５以下であり、好ましくは試料のｐＨは７以上かつコアのｐＨは５以下である）。典型的には、アッセイ試料のｐＨは、元来約７～約１０であるか、または約７～約１０になるように調整されている（バッファを直接添加するか、または緩衝化された外相と共にポリマーソームを添加することによって調整する）。
調製プロセスで用いられる有機溶媒は、任意の既知の手法を用いてポリマーソームから除去される。以下に限定されないが、大気圧未満の圧力、熱、ろ過、クロスフローろ過、透析、またはこれらの方法の組み合わせを適用して、溶媒を除去することができる。
有機溶媒を除去した後、ポリマーソームを精製して、封入されていないｐＨ感受性色素の量を減らし、かつ必要に応じて外相のｐＨを調整する。任意の既知の手法を用いて、封入されていないｐＨ感受性色素をポリマーソーム分散液から除去する。以下に限定にされないが、（クロスフロー）ろ過、遠心分離（例えば、遠心ろ過）、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル透過クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー）、透析、またはこれらの方法の組み合わせを用いて、封入されていないｐＨ感受性色素を除去することができる。
続いて、精製されたポリマーソーム分散液をそのままの状態（ポリマーソームの外側及び内側が酸性水溶液の状態、または外側の酸性溶液をさらに高いｐＨの溶液、例えばｐＨ７～ｐＨ１０の溶液で交換した後の状態）で、さらには従来の薬剤乾燥手順（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥）を用いて乾燥した状態で、及び／または診断用ストリップに組み込んだ状態で用いることができる。全てのこうした形態（そのままの形態、精製した形態、及び／または乾燥した形態）で、ポリマーソームコアはｐＨ感受性色素を含み、任意選択的に、例えば、該色素がアッセイ試料に十分なｐＨ勾配を生じさせるのに要する濃度ではない場合に、ポリマーソームコアはさらに酸を含む。酸及び／またはｐＨ感受性色素は、アッセイ試料（例えば体液）（バッファを追加した状態または追加していない状態）と混合すると、ポリマーソームに膜貫通ｐＨ勾配を生じさせる。こうして形成された本発明のポリマーソームは塩（すなわちナトリウム、カリウム、またはカルシウムなどの対イオンで部分的に脱プロトン化された酸）をさらに含んでいてもよく、該塩はポリマーソーム調製中に添加されてコアのｐＨ及び／または容量オスモル濃度を調整することができ、また、ポリマーソームの水和形態ではポリマーソームはさらに水を含んでいる。特定の実施形態では、コアは防腐剤をさらに含んでいてもよく、防腐剤はポリマーソーム調製中に添加されて、例えばコアのｐＨが比較的高い（例えばｐＨ５．５以上）場合に、コア内で微生物が増殖するのを防ぐことができる。本発明の方法で使用した後に、コアはアンモニアをさらに含んでいてもよい。特定の実施形態によると、ポリマーソームコアの内容物は少なくとも１つのｐＨ感受性色素を含み得るか、それからなり得る。他の実施形態では、コアは少なくとも１つの酸をさらに含み得る。他の実施形態では、コアは少なくとも１つの塩をさらに含み得る。他の実施形態では、コアは水をさらに含み得る。他の実施形態では、コアは少なくとも１つの防腐剤をさらに含み得る。他の実施形態では、コアはアンモニアをさらに含み得る。さらに他の実施形態では、ポリマーソームコアの内容物は、（ａ）少なくとも１つのｐＨ感受性色素と、（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの酸、（ｉｉ）少なくとも１つの塩、（ｉｉｉ）水、（ｉｖ）少なくとも１つの防腐剤、（ｖ）アンモニア、または（ｖｉ）（ｉ）～（ｖ）のうちの少なくとも２つの組み合わせとからなり得る。
ポリマーソームが水和している（すなわち、水溶性酸性コアを含む）場合、コアのｐＨは通例、約１～６．５の間（１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、または６．５）である。特定の実施形態では、コアのｐＨは、約１～約６．５、約１～約６、約１～約５．５、約１～約４．５、約１～約４、約１．５～約５、約１．５～約４．５、約１．５～約４、約２～約６．５、約２～約６、約２～約５．５、約２～約５、約２～約４．５、約２～約４、約２．５～約６．５、約２．５～約６、約２．５～約５．５、約２．５～約５、約２．５～約４．５、約２．５～約４、約３～約６．５、約３～約６、約３～約５．５、約３～約５、約３～約４．５、及び約３～約４である。
本発明のポリマーソームの安定性を得るのに必須なことではないが、ポリマーソーム膜は架橋していてもよい。例えば、架橋剤の二塩化ｐ－キシリレン、１，４－ビス－クロロメチルジフェニル、モノクロロジメチルエーテル、ジメチルホルマール、トリス－（クロロメチル）－メシチレン、またはｐ，ｐ’－ビス－クロロメチル－１，４－ジフェニルブタンを用いたフリーデル－クラフツ反応を用いて、ポリ（スチレン）を架橋することができる（Davankov and Tsyurupa, Reactive Polymers 1990; 13:27-42）。
溶媒
本発明で用いる溶媒でコポリマーを溶解し、続いてポリマー含有溶媒を酸性水相と混合する。混合工程（例えばｏ／ｗエマルション）の間、ポリマーの微細分散液が水相で形成される。混合した後、溶媒を除去して（例えば蒸発させて）、ポリマーソームの安定性を確実に維持する（例えば、溶媒が膜を可塑化することでポリマーソームの透過性がより高くなる可能性がある）。
約２％～約４０％（ｖ／ｖ）の溶媒相／水相比率となる濃度を使用することができる。特定の実施形態では、溶媒相／水相比率は約５％～３０％（ｖ／ｖ）である。別の特定の実施形態では、溶媒相／水相比率は約５％～２０％（ｖ／ｖ）である。別の特定の実施形態では、溶媒相／水相比率は約５％～１５％（ｖ／ｖ）である。別の特定の実施形態では、溶媒相／水相比率は約１０％（ｖ／ｖ）である。特定の実施形態では、得られたエマルション中の溶媒相／水相比率は約９％（ｖ／ｖ）である。特定の実施形態では、溶媒は有機溶媒である。
以下に限定されないが、溶媒は、塩素化溶媒（例えば、ジクロロメタン（実施例２～１６を参照）またはクロロホルム）、芳香族溶媒もしくは芳香族溶媒誘導体（例えば、トルエンなどのアレーンまたはアレーン誘導体）、脂肪族溶媒もしくは脂肪族溶媒誘導体（例えば、ヘキサン、１－ヘキサノール）、ケトンもしくはケトン誘導体（例えば、２－ヘキサノン）、エーテルもしくはエーテル誘導体（例えば、ジエチルエーテル）、またはそれらの混合物（例えば、ｏ／ｗエマルション、ｗ／ｏ／ｗダブルエマルション、または逆相蒸発手法を用いる場合）であり得る。
特定の実施形態では、ｏ／ｗエマルションを用いてポリマー含有有機相と水相とを混合する場合、本発明に有用な溶媒は、水不混和性の有機溶媒または部分的に水不混和性の有機溶媒である。以下に限定されないが、こうした溶媒には、例えば、ジクロロメタン（実施例２～１６を参照）、クロロホルム、芳香族溶媒もしくは芳香族溶媒誘導体（例えば、トルエンなどのアレーンまたはアレーン誘導体）、脂肪族溶媒もしくは脂肪族溶媒誘導体（例えば、ヘキサン、１－ヘキサノール）、ケトンもしくはケトン誘導体（例えば、２－ヘキサノン）、エーテルもしくはエーテル誘導体（例えば、ジエチルエーテル）、またはそれらの混合物が挙げられる。
酸及び酸性溶液
特定の実施形態では、ｐＨ感受性色素は膜貫通ｐＨ勾配をつけることを促す酸である。十分な高濃度（例えば１０ｍＭのピラニン）の弱酸ｐＨ感受性色素は、酸を追加することなく用いることができると考えられる（実施例１３を参照）。以下に限定されないが、ｐＨ感受性色素ＨＰＴＳ（例えば、ピラニン）は、例えば、約ｐＨ５．５（すなわちｐＫａ値７．２未満で約１．７ｐＨ単位（Kano and Fendler BBA Biomembranes 1978; 509:289-299））で緩衝し、これによってさらに酸を追加することなくアンモニアの検出ができるようになる。特定の実施形態では、使用する酸は、アンモニア測定に最適なｐＨ感受性色素ではない（実施例２～実施例１２、実施例１４～実施例１６を参照）。用語「弱酸」は、本明細書で使用される場合、ｐＫａ値が３．５以上の弱酸、及びｐＫａ値が－０．３５以上である中程度の強酸を意味する（Mortimer and Mueller, Chemie, 12ndedition, Thieme, 2015）。
ポリマーソームコアに封入される酸は、以下に限定されないが、（ｉ）クエン酸、イソクエン酸、リンゴ酸、酒石酸、もしくは乳酸などのヒドロキシ酸、（ｉｉ）短鎖脂肪酸（例えば、酢酸）もしくは不飽和酸（例えば、ソルビン酸）などの脂肪族系酸、（ｉｉｉ）ウロン酸などの糖酸、（ｉｖ）マロン酸などのジカルボン酸、（ｖ）プロパン－１，２，３－トリカルボン酸もしくはアコニット酸などのトリカルボン酸、（ｖｉ）１，２，３，４－ブタンテトラカルボン酸などのテトラカルボン酸、（ｖｉｉ）１，２，３，４，５－ペンタンペンタカルボン酸などのペンタカルボン酸、（ｖｉｉｉ）ポリ（アクリル酸）もしくはポリ（メタクリル酸）などの重合ポリ（カルボン酸）、（ｉｘ）エチレンジアミン四酢酸などのポリアミノカルボン酸、（ｘ）グルタミン酸もしくはアスパラギン酸などのアミノ酸、（ｘｉ）硝酸、硫酸、ハロゲン化水素などの無機酸、（ｘｉｉ）安息香酸などの芳香族カルボン酸、（ｘｉｉｉ）以下に限定されないがヒドロキシピレン及びその誘導体（例えば、ピラニン、別称ＨＰＴＳ三ナトリウム塩）、フェニルピリジルオキサゾール及びその誘導体（例えば、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue）、アミノナフタレン及びその誘導体（例えば、ＡＮＴＳ）、シアニン及びその誘導体（例えば、IRDye（商標）680RD）、トリアリールメタン色素（例えば、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、クレゾールレッド、クロロフェノールレッド、フェノールレッド、フェノールフタレイン、チモールブルー、ブロモチモールブルー）、アゾ色素（例えば、メチルレッド、エリオクロムブラックＴ）、ニトロフェノール色素（例えば、２，４－ジニトロフェノール）、アントラキノン色素（例えば、アリザリン）のなどの酸性ｐＨ感受性色素、または（ｘｉｖ）これらのうちの少なくとも２つの組み合わせである。特定の実施形態ではクエン酸が用いられ、別の特定の実施形態ではＨＰＴＳが用いられる。精製後の色素漏出を低減するために、ポリマーコンジュゲートｐＨ感受性色素（例えば、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue、デキストランコンジュゲートフルオレセインイソチオシアネート、メトキシポリ（エチレンオキシド）コンジュゲートフルオレセイン、デキストランコンジュゲートローダミンＢ）を使用するのが有利であると考えられる。その場合、以下に限定されないが、デキストラン、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、またはポリ（ビニルアルコール）などの任意の水溶性ポリマーを色素とコンジュゲートすることができる。
上記に列挙した酸のうちの一部は、特定の用量で特定の薬理活性を有する場合があるが、本発明に記載のポリマーソームの特定の実施形態で用いる封入された酸は、薬理機能またはイメージング機能を直接果たすことを目的にしているのではなく、膜貫通ｐＨ勾配を形成するために、また酸がｐＨ感受性色素の場合にはコア内のアンモニアによるｐＨ変化を検出するためにのみ使用される。本発明は、上記の酸のいずれか１つの使用を、特定の薬理活性を保有するか否かに関わらず包含する。しかしながら、本発明の特定の実施形態または態様によれば、酸は、上記の酸のいずれか以外、抗生物質、抗癌剤、降圧剤、抗真菌剤、抗不安剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗ウイルス剤、または脂質降下剤として知られる酸ではない可能性がある。
特定の実施形態では、本方法で使用する酸の濃度は０．１ｍＭ～１００ｍＭの間で様々な値を取り、オスモル濃度は５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～７００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの間になり得る。クエン酸を使用する場合、オスモル濃度１５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～６００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇで、約０．５ｍＭ～５０ｍＭの間のクエン酸溶液を使用するのが最も好ましい。別の特定の実施形態では、オスモル濃度は１００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～７５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。別の特定の実施形態では、オスモル濃度は１００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～７００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。別の特定の実施形態では、オスモル濃度は１１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ～７００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。アッセイの感度に影響を及ぼさないように酸の濃度を選択し、使用する酸がｐＨ感受性色素でもある場合には、信頼性の高い蛍光測定または吸光測定を可能にするように酸濃度を選択する。
コア内の酸は、ポリマーソームが水和した場合に、１～６．８のｐＨ、さらに特定の実施形態では１～６．５、２～６のｐＨをもたらす濃度である。特定の実施形態では、約５．５のｐＨを用いる。別の特定の実施形態では、約３．０のｐＨを用いる。さらに別の特定の実施形態では、約２．０のｐＨを用いる。
使用方法
本発明は、種々の試料のアンモニアを定量するために、本発明の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームを用いる方法を包含する。該方法は、少なくとも約０．００５ｍＭと同程度に低い濃度のアンモニア、及び少なくとも８ｍＭと同程度に高い濃度のアンモニアを検出することができる。
特定の実施形態では、評価試料の正確なアンモニア濃度を以下の方法により測定することができる。
一つの方法によれば、試料と本発明のポリマーソーム（すなわちｐＨ感受性色素を含むポリマーソーム）とを（またはポリマーソームを含む組成物もしくはストリップとを）接触させ、ポリマーソーム含有試料、組成物含有試料、または試料含有ストリップの少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性を測定することにより、該試料のアンモニア濃度を評価することができる。続いて、測定した分光特性と、既知のアンモニア濃度の標準曲線の同一ｐＨ依存性波長における分光特性（すなわち、吸光強度または蛍光強度）とを比較することによって、該試料のアンモニア濃度を算出することができる。標準曲線は、アッセイで使用する特定条件下で得られる「対応基準分光特性」を、前もって各固有のアンモニア濃度で測定することによって作成する。より詳細には、同一の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームのコア内において、酸がある場合には、コア内の特定のｐＨで、未知のアンモニア量を含む試料のアッセイに用いる濃度と同一の酸濃度を含み、ポリマーソームの外側及び内側に各固有のアンモニア濃度を含む状態で、同一のｐＨ依存性波長にて同一のｐＨ感受性色素が与える分光特性を測定する。「標準曲線」は、それぞれの条件下で全ての評価アンモニア濃度について測定した対応基準分光特性の集合に対して、数学的にカーブフィッティングすることにより得られる曲線である。標準曲線を作成するために用いた評価アンモニア濃度の数は少なくとも１つである（すなわち、標準曲線が一定の範囲で直線的であれば、１つの濃度でも十分であると考えられる）。
用語「分光特性」は、本明細書で使用される場合、約１０ｎｍ～２０００ｎｍの電磁スペクトル、すなわち、スペクトルの紫外領域（約１０ｎｍ～３９０ｎｍ）、可視領域（約３９０ｎｍ～７００ｎｍ）、及び近赤外領域（ＮＩＲ、約７００ｎｍ～２０００ｎｍ）における吸光強度または蛍光強度を意味する。
用語「標準曲線」は、本明細書で使用される場合、用語「吸光度標準曲線」及び「蛍光標準曲線」を包含するのに用いられる総称的用語である。
一方「分光特性比」は、ｐＨ依存性波長における色素の分光特性を、ｐＨ非依存性波長または別のｐＨ依存性波長における同一の色素または異なる色素の分光特性に対して正規化することによって算出することができる。使用する色素がｐＨ非依存性波長を持たない場合、ｐＨ非依存性波長を持つ別の色素を基準として用いて該比を計算することができる。次いで、試料で算出した分光特性比を、同一の波長において各アンモニア濃度に対して算出した普遍的基準分光特性比から得られた普遍的分光比標準曲線と比較することができるため、アッセイ条件の各特定の集合に対する別の標準曲線の取得を不要にすることができる。当然のことながら、具体的なアッセイ条件に対して測定及び計算した対応基準分光特性比から得られた特定の分光特性比の標準曲線（「特定分光特性比標準曲線」）は、最適な精度を持つように作成することができる。
用語「普遍的基準分光特性比」は、本明細書で使用される場合、膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームのコア内において、特定のｐＨ下で特定の酸濃度を含み、ポリマーソームの外側及び内側にアンモニア濃度を含む状態で、ｐＨ依存性波長及びｐＨ非依存性波長（または別のｐＨ依存性波長）にてｐＨ感受性色素が与える分光特性比を意味する。「普遍的分光特性比標準曲線」は、全ての評価アンモニア濃度についてそれぞれの条件下で算出した普遍的基準分光特性比の集合に対して、数学的にカーブフィッティングすることにより得られる曲線である。標準曲線を作成するために用いた評価アンモニア濃度の数は少なくとも１つである（すなわち、標準曲線が一定の範囲で直線的であれば、１つの濃度でも十分であると考えられる）。
用語「分光特性比標準曲線」は、本明細書で使用される場合、用語「特定分光特性比標準曲線」及び「普遍的分光特性比標準曲線」を包含するのに用いられる総称的用語である。用語「特定分光特性比標準曲線」及び「普遍的分光特性比標準曲線」は、本明細書で使用される場合、「特定蛍光強度比標準曲線」及び「特定吸光度比標準曲線」と、「普遍的蛍光強度比標準曲線」及び「普遍的吸光度比標準曲線」とを参照するのに用いられる総称的用語である。
用語「ｐＨ依存性波長」及び「ｐＨ非依存性波長」は、本明細書で使用される場合、用語「ｐＨ依存性蛍光波長」及び「ｐＨ依存性吸光波長」と、「ｐＨ非依存性蛍光波長」及び「ｐＨ非依存性吸光波長」とをそれぞれ包含するのに用いられる総称的用語である。
用語「ｐＨ依存性分光特性」及び「ｐＨ非依存性分光特性」は、本明細書で使用される場合、用語「ｐＨ依存性蛍光強度」及び「ｐＨ依存性吸光度」と、「ｐＨ非依存性蛍光強度」及び「ｐＨ非依存性吸光度」とをそれぞれ包含するのに用いられる総称的用語である。
用語「分光特性比」は、本明細書で使用される場合、用語「蛍光強度比」及び「吸光度比」を包含するのに用いられる総称的用語である。
より具体的には、上記の分光法は蛍光法または比色法であり得る。こうした方法は、以下でさらに定義されるであろう。
蛍光法
一つの方法によれば、試料のアンモニア濃度を、既知のアンモニア濃度の蛍光強度標準曲線における同一の放射波長及び励起波長での蛍光強度を参照することによって算出することができる。蛍光強度標準曲線は、アッセイで使用する特定条件下で得られる「対応基準蛍光強度」を、前もって各固有のアンモニア濃度で測定することによって作成する。より詳細には、同一の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームのコア内において、酸がある場合には、コア内の特定のｐＨで、未知のアンモニア量を含む試料のアッセイに用いる濃度と同一の酸濃度を含み、ポリマーソームの外側及び内側に各固有のアンモニア濃度を含む状態で、同一のｐＨ依存性励起波長または放射波長にて同一のｐＨ感受性蛍光色素が発する蛍光を測定する。「蛍光強度標準曲線」は、それぞれの条件下で全ての評価アンモニア濃度について測定した対応基準蛍光強度の集合に対して、数学的にカーブフィッティングすることにより得られる曲線である。標準曲線を作成するために用いた評価アンモニア濃度の数は少なくとも１つである（すなわち、標準曲線が一定の範囲で直線的であれば、１つの濃度でも十分であると考えられる）。
一方「蛍光強度比」は、ｐＨ依存性（放射または励起）波長における色素の蛍光強度を、ｐＨ非依存性（等吸収）（放射または励起）波長における同一の色素または異なる色素の蛍光強度に対して正規化することによって算出することができる。使用する色素がｐＨ非依存性波長を持たない場合、ｐＨ非依存性波長を持つ別の色素を基準として用いて該比を計算することができる。次いで、試料で算出した蛍光強度比を、同一の波長において各アンモニア濃度に対して算出した普遍的基準蛍光強度比から得られた普遍的蛍光強度比標準曲線と比較することができるため、アッセイ条件の各特定の集合に対する別の蛍光強度標準曲線の取得を不要にすることができる。当然のことながら、具体的なアッセイ条件に対して測定及び計算した対応基準蛍光強度比から得られた特定の蛍光強度比の標準曲線（「特定蛍光強度比標準曲線」）は、最適な精度を持つように作成することができる。
用語「普遍的基準蛍光強度比」は、本明細書で使用される場合、膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームのコア内において、特定のｐＨ下で特定の酸濃度を含み、ポリマーソームの外側及び内側にアンモニア濃度を含む状態で、液体中にてｐＨ依存性（放射または励起）波長及びｐＨ非依存性（放射または励起）波長でｐＨ感受性蛍光色素が与える蛍光強度比を意味する。「普遍的蛍光強度比標準曲線」は、それぞれの条件下で全ての評価アンモニア濃度について算出した普遍的基準蛍光強度比の集合に対して、数学的にカーブフィッティングすることにより得られる曲線である。標準曲線を作成するために用いた評価アンモニア濃度の数は少なくとも１つである（すなわち、標準曲線が一定の範囲で直線的であれば、１つの濃度でも十分であると考えられる）。
用語「蛍光標準曲線」は、本明細書で使用される場合、用語「蛍光強度標準曲線」及び「蛍光強度比標準曲線」を包含するのに用いられる総称的用語である。用語「蛍光強度比標準曲線」は、本明細書で使用される場合、用語「特定蛍光強度比標準曲線」及び「普遍的蛍光強度比標準曲線」を包含するのに用いられる総称的用語である。
用語「ｐＨ依存性励起波長」及び「ｐＨ非依存性励起波長」は、本明細書で使用される場合、ある励起波長の励起により、特定の放射波長でｐＨ依存性蛍光強度及びｐＨ非依存性蛍光強度をそれぞれもたらす励起波長を意味する。用語「ｐＨ依存性放射波長」及び「ｐＨ非依存性放射波長」は、本明細書で使用される場合、特定の励起波長で励起された場合に、ｐＨ依存性蛍光強度及びｐＨ非依存性蛍光強度をそれぞれ示す放射波長を意味する。用語「ｐＨ依存性蛍光波長」は、本明細書で使用される場合、ｐＨ依存性放射波長またはｐＨ依存性励起波長を意味する。用語「ｐＨ非依存性蛍光波長」は、本明細書で使用される場合、ｐＨ非依存性放射波長またはｐＨ非依存性励起波長を意味する。
用語「ｐＨ依存性蛍光強度」は、本明細書で使用される場合、ｐＨ依存性放射波長もしくはｐＨ依存性励起波長で生じる蛍光強度か、またはｐＨ依存性放射波長及びｐＨ依存性励起波長で生じる蛍光強度を意味する。用語「ｐＨ非依存性蛍光強度」は、本明細書で使用される場合、ｐＨ非依存性放射波長及びｐＨ非依存性励起波長で生じる蛍光強度を意味する。
蛍光強度の選択は、色素供給元から示された通りに、または種々のｐＨ値での放射スペクトル及び励起スペクトルを記録し、ｐＨ依存性蛍光波長及びｐＨ非依存性蛍光波長を特定することによって行う。
比色法
別の方法によると、アンモニア濃度を、既知のアンモニア濃度の吸光度標準曲線における同一の紫外波長または可視光波長または近赤外波長での吸光度を参照することによって算出することができる。吸光度標準曲線は、アッセイで使用する特定条件下で得られる「対応基準吸光度」を、前もって各固有のアンモニア濃度で測定することによって作成する。より詳細には、同一の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームのコア内において、酸がある場合には、コア内の特定のｐＨで、未知のアンモニア量を含む試料のアッセイに用いる濃度と同一の酸濃度を含み、ポリマーソームの外側及び内側に各固有のアンモニア濃度を含む状態で、同一のｐＨ依存性可視光波長で同一のｐＨ感受性吸光色素の吸光度を測定する。「吸光度標準曲線」は、それぞれの条件下で全ての評価アンモニア濃度について測定された対応基準吸光度値の集合に対して、数学的にカーブフィッティングすることにより得られる曲線である。標準曲線を作成するために用いた評価アンモニア濃度の数は少なくとも１つである（すなわち、標準曲線が一定の範囲で直線的であれば、１つの濃度でも十分であると考えられる）。
用語「ｐＨ依存性吸光波長」は、本明細書で使用される場合、電磁スペクトルの紫外領域（約１０ｎｍ～３９０ｎｍ）、可視領域（３９０ｎｍ～７００ｎｍ）、または近赤外領域（約７００ｎｍ～２０００ｎｍ）の光を、媒体のｐＨに応じて色素が吸収する波長を表すのに用いられる。吸光波長の選択は、色素供給元から示された通りに、または種々のｐＨ値での吸光スペクトルを記録し、ｐＨ依存性吸光波長及びｐＨ非依存性吸光波長を特定することによって行う。
用語「ｐＨ依存性吸光度」及び「ｐＨ非依存性吸光度」は、本明細書で使用される場合、ｐＨ依存性吸光波長及びｐＨ非依存性吸光波長それぞれにおける吸光度を意味する。
従来の実験室用またはポータブルの分光光度計（例えば、比色法には標準分光光度計、または蛍光法には蛍光分光光度計）とプレートリーダーとを用いて、本発明による吸光度または蛍光を測定することができる。
本発明に従ってアンモニア（または間接的にフェニルアラニン）含有量のアッセイをすることができる「試料」は、本明細書で使用される場合、以下に限定されないが、体液試料などの生体試料、土試料、廃水試料、または単なるバッファを含めた、アンモニアまたはフェニルアラニンを含有することができる試料であり得る。該試料は、元来液体であっても、水溶液を添加した後に液体になってもよい（例えば土試料）。バッファ及び／または酵素（例えば、個々にｐＨ安定化またはｐＨ調整、及びアンモニア生成酵素反応に使用）を任意選択的に加えることによって、該試料（元来液体であるか、水溶液を添加した後に液体になったもの）をさらに調整してもよい。特定の実施形態によれば、該試料は生体試料（例えば、体液）を含み得るか、またはそれからなり得る。他の実施形態では、該試料は水溶液をさらに含み得る。他の実施形態では、該試料は少なくとも１つのバッファをさらに含み得る。他の実施形態では、該試料は少なくとも１つの酵素（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）をさらに含み得る。さらに他の実施形態では、該試料は、（ａ）生体試料（例えば、体液）と、（ｂ）（ｉ）水溶液、（ｉｉ）少なくとも１つのバッファ、（ｉｉｉ）酵素（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ）、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のうちの少なくとも２つの組み合わせとからなり得る。ポリマーソームと混合する前に、試料溶液からフェニルアラニンアンモニアリアーゼを除去する必要はないか、または除去しても有用ではない。
試料中のポリマーソームのインキュベーション時間は、サンプルの性質によって様々になり得る。生体試料では、タンパク質の分解を回避するようにインキュベーション時間を適正に制限する。本明細書に示すように、生体試料において、２分程度の短い時間から最大１５分までのインキュベーション時間の後、信頼性の高い分光特性（すなわち、蛍光強度及び／または吸光度）の読み取りをすることができる（図２を参照）。非生体試料、すなわち単なるバッファでは、アンモニアを蒸発させない程度であればインキュベーション時間を増やすことができる。
用語「体液」は、本明細書で使用される場合、脊椎動物由来の任意の液体を意味する。特定の実施形態では、体液は哺乳動物由来の液体を意味する。体液には、以下に限定されないが、血液（本発明の蛍光法または吸光法に近赤外色素が使用される場合にはそのままの状態、または例えばフィルタで赤血球を除去した後の状態）、血液画分（例えば、血清、血漿）、唾液、尿、汗、精液、腹腔液、腹水由来の液、及び脳脊髄液が含まれる。一部の体液は、対象の情報（例えば、対象における疾患もしくは症状の存在もしくは存在の徴候、治療もしくは予防措置の有効性もしくは無効性、または薬剤投与による副作用の発生）を与え得る特定のアンモニアレベルまたは特定のアミノ酸レベルを含み得る。以下の実施例では、特定の体液を、比較用の市販のアンモニアアッセイキットの測定範囲になるように選択したファクターで希釈した。
したがって、アッセイ試料が体液試料である実施形態では、定量方法は、特定の疾患または症状（例えば、アンモニアに関連する疾患もしくは障害、または特定のアミノ酸のレベル増加によって特徴付けられる疾患（例えば、フェニルケトン尿症））を診断するために使用することができる。さらに特定の実施形態では、疾患または症状が高アンモニア血症であり、定量方法は、特定の高アンモニア血症誘発治療（例えば、バルプロ酸療法）において、その症状を診断／検出／モニタリングするために使用することができる。他の実施形態では、定量方法は、抗高アンモニア血症治療（例えば、血液透析）または抗フェニルケトン尿症治療（例えば、フェニルアラニンの少ない食事療法）の有効性をモニタリングするために使用することができる。
「アンモニア関連疾患または障害」には、本明細書で使用される場合、高アンモニア血症（例えば、肝機能障害による誘発またはバルプロ酸療法による誘発）、肝性脳症、肝硬変、急性肝不全、慢性肝炎の急性増悪、門脈体循環バイパス、門脈体循環シャント、薬剤誘発高アンモニア血症、肝アンモニア代謝の先天性欠陥（一次的高アンモニア血症）、肝アンモニア代謝に影響を与える先天性欠陥（二次的高アンモニア血症）、慢性腎疾患、及びアンモニアに関連する生殖能力の低下が含まれる。血液及びその画分（血清、血漿）は、ほとんどのアンモニアに関連する疾患または障害に対する体液試料として用いることができる。唾液は慢性腎疾患に対する体液試料として用いることができ、精液はアンモニアに関連した生殖能力の低下に対する体液試料として用いることができる。
対象の体液におけるアミノ酸レベルの増加により、特定の疾患の特性が明らかになる。例えば、フェニルケトン尿症を患う対象は、血中のフェニルアラニンレベルが増加している。フェニルケトン尿症は、先天性代謝異常であり、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）レベルが低下することで、アミノ酸フェニルアラニンの代謝を低下させて、フェニルアラニンの血中レベルの増加を招くものである（van Spronsen et al. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017; 5:743-756）。こうしたアミノ酸の異常レベルを、まずアンモニア産生酵素（例えば、フェニルアラニンに対してはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ）と合わせて試料をインキュベーションし、本発明のアンモニア定量方法を用いてアミノ酸レベルを間接的に算出することによって、間接的に定量することができる。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．２４）は、Ｌ－フェニルアラニンをアンモニア及びトランス桂皮酸に変換する反応を触媒化する酵素である。
用語「対象」は、本明細書で使用される場合、体液試料中に、本発明の方法で定量できると考えられるアンモニアレベルまたはアミノ酸レベルを有し得る対象を意味する。対象は脊椎動物を意味し、特定の実施形態では哺乳動物を意味し、さらに特定の実施形態ではヒトを意味する。本発明のポリマーソームまたは組成物を前臨床研究、または獣医学用途にも用いることができ、ペットまたは他の動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマなどのペット、及びウシ、魚、ブタ、家禽など）に用いることができる。
特定の実施形態では、対象はアンモニアに関連する疾患もしくは障害、またはフェニルケトン尿症を有する。別の実施形態では、対象は、抗高アンモニア血症治療（例えば、血液透析、リポソーム担持腹膜透析）または抗フェニルケトン尿症治療（例えば、フェニルアラニンの少ない食事療法）を受けている。
別の特定の実施形態では、対象はアンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症に罹患している疑いがあるか、または罹患する可能性がある。こうした対象には、以下に限定されないが、例えば、尿素サイクル異常症、肝性脳症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏症またはテトラヒドロビオプテリン欠乏症に罹患している患者、及び高アンモニア血症誘発剤（例えば、Ｌ－アスパラギナーゼ、バルプロ酸）で治療を受けている患者が含まれる。
したがって、特定の実施形態では、体液試料はこうした対象のいずれか由来であり得る。
「基準アンモニア濃度」は、実施するアッセイの種類に応じて、特定の体液試料における所定の濃度アンモニア基準レベル、すなわち、対象由来の初期における対応試料で測定された対応アンモニア濃度（例えば、該方法を使用して抗高アンモニア血症治療もしくは抗フェニルケトン尿症治療の有効性をモニタリングする場合、または高アンモニア血症誘発治療の影響をモニタリングする場合）、特定の疾患もしくは症状（例えば、アンモニアに関連する疾患もしくは障害またはフェニルケトン尿症）にかかりにくいことがわかっている及び／または特定の疾患もしくは症状（例えば、アンモニアに関連する疾患もしくは障害またはフェニルケトン尿症）に罹患していないことがわかっている１対象または複数の対象の対応生体液体で測定されたアンモニア濃度（例えば、該方法を使用して特定の疾患または症状（例えば、アンモニアに関連する疾患もしくは障害またはフェニルケトン尿症）を診断する場合）から選択することができる。別の実施形態では、基準アンモニア濃度は、複数の試料（例えば、複数の健康な対象由来の試料または特定の疾患もしくは症状（例えば、アンモニアに関連する疾患もしくは障害またはフェニルケトン尿症）に罹患している複数の対象由来の試料）におけるアンモニア濃度の測定後に求めた平均または中央値である。
用語「高アンモニア血症誘発治療」は、本明細書で使用される場合、高アンモニア血症をもたらす可能性があるか、または高アンモニア血症が副作用として報告されている治療を意味する。高アンモニア血症誘発治療は、以下に限定されないが、バルプロ酸療法及びＬ－アスパラギナーゼ治療を指す（Ando et al. Biopsychosoc Med. 2017; 11:19; Strickler et al. Leuk Lymphoma 2017）。
用語「抗高アンモニア血症治療」は、本明細書で使用される場合、体液中のアンモニアレベルを減らすことを目的とする、任意の薬理学的な治療的介入（例えば、フェニル酪酸ナトリウム（Buphenyl（登録商標））、グリセロールフェニル酪酸（Ravicti（登録商標））、フェニル酢酸ナトリウム及び安息香酸ナトリウム（Ucephan（登録商標）、Ammonul（登録商標））、カルグルミン酸（Carbaglu（登録商標））、非吸収性二糖ラクツロースの投与、リファキシミン（例えば、Xifaxan（商標））、球状炭素吸着剤（AST-120、Kremezin（登録商標））、ならびに／または膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの投与（例えば、２０１７年８月１５日に出願された同時継続中のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１７／０５４９６６号を参照）、上掲のMatoori and Leroux））、及び／または非薬理学的な治療的介入（例えば、血液透析）を意味する。また、この用語は、体液中のアンモニアレベルの増加を防ぐことを目的とする任意の予防措置（例えば、ラクツロース及び／またはリファキシミンの予防的投与、ＨＥ患者における特発性細菌性腹膜炎または消化管出血の管理、上掲のVilstrup et al.）も意味する。用語「抗フェニルケトン尿症治療」は、本明細書で使用される場合、体液中のフェニルアラニンレベルを減らすことを目的とする任意の薬理学的な治療的介入（例えば、テトラヒドロビオプテリン、上掲のvan Spronsen et al.）もしくは非薬理学的な治療的介入（例えば、フェニルアラニンの少ない食事療法、上掲のvan Spronsen et al.）を意味するか、または体液中のフェニルアラニンレベルの増加を防ぐことを目的とする任意の予防措置（例えば、フェニルアラニンの少ない食事療法、上掲のvan Spronsen et al）を意味する。
アッセイ試料が土試料または廃水試料である特定の実施形態では、定量方法は、これらの基材のアンモニアの汚染を定量する（例えばその濃度を測定する）のに用いることができる（例えば、アンモニアを含む肥料または工業廃棄物で廃水が汚染されている場合）。
組成物
ポリマーソームを、アッセイ試料（例えばアンモニア濃度測定用）に、異なる形態で、例えば水性媒体（例えば、水）に分散されている状態（場合によっては賦形剤、例えば防腐剤と合わせた状態）で、またはその乾燥形態（例えばストリップに付着させた状態）で混合することができる。
本発明のポリマーソームは、液体形態（例えば、液体懸濁液）でも、固体形態（例えば、使用前に溶解させる粉末または診断用ストリップに付着させる粉末）でもよい。
本発明はまた、診断試薬の調製におけるポリマーソーム及び／または組成物の使用に関する。
本発明の組成物は１つ以上の賦形剤を含むことができ、賦形剤として、限定されないが、防腐剤（例えば、アジドナトリウム、ソルビン酸／ソルビン酸塩類、安息香酸／安息香酸塩類、パラベン類）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸及びその塩類、エリソルビン酸及びその塩類）、及び／または塩類が挙げられる。ポリマーソームが乾燥形態である場合、ポリマーソームは、凍結保護物質、及び／または凍結乾燥保護剤（トレハロース、サッカロース、及びスクロースなどの糖類、ならびにポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類）、及び／または膨張剤（例えば、糖類、セルロース誘導体）とさらに合わせて製剤化される場合がある。ポリマーソームはストリップ（例えば、診断用ストリップ）に組み込まれる場合もある。こうしたストリップの支持体は、例えば、高分子（紙、膜、プラスチック）または無機のスキャフォールドであり得る。
キット
本発明の範囲内には、キットであって、（ａ）本発明のポリマーソーム、組成物、及び／またはストリップの少なくとも１種類、ならびに（ｂ）（ｉ）該ポリマーソームを水和するための溶液（使用する前）、（ｉｉ）外相及び／もしくはアッセイ試料（例えば、血液または血液画分などの体液試料（例えば血清、血漿、唾液、尿、涙、精液）といった試料）のｐＨ（及び／または容量オスモル濃度）を調整するバッファ、（ｉｉｉ）アッセイ試料（例えば、土試料）を希釈するための希釈剤、（ｉｖ）蛍光標準曲線（例えば、蛍光強度標準曲線及び／または蛍光強度比標準曲線）及び／もしくは吸光度標準曲線、（ｖ）既知のアンモニア濃度の１つもしくは複数の溶液（基準アンモニア溶液）、または（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）のうちの少なくとも２つの組み合わせ、を含むキットと、その使用（例えば、アンモニアの定量用または特定の疾患もしくは症状（例えば、ＨＥまたはフェニルケトン尿症などのアンモニアに関連する疾患または症状）の診断用）のための説明書とが含まれる。キットは、少なくとも１つの追加の（診断用）試薬、及び／または本発明によるポリマーソームの１つもしくは複数のさらなる種類をさらに含み得る。キットは通例、キットの内容物の好ましい使用目的を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上もしくはキットに添付されて提供される、または別途キットに付随する任意の文書または記録物を含む。キットは、１つ以上の容器、試薬、投与デバイスをさらに含んでもよい。
量
定量（例えば、濃度の測定）方法及び診断方法に使用される本発明のポリマーソームまたはその組成物の量は、多くの要因に依存することになり、それらの要因としてポリマーソームコアｐＨ、ポリマーソームコアｐＨ感受性色素濃度、ポリマーソームコア酸濃度、ポリマーソームコア容量オスモル濃度、外相アンモニア濃度、外相ｐＨ、及び外相容量オスモル濃度が挙げられる。本発明のポリマーソームまたはその組成物の量は、試料（例えば、体液試料、土、廃水、またはバッファ溶液）中のアンモニアを効果的に定量する量となる。特定の実施形態では、液体形態でのポリマーソームのモル濃度は、以下に限定されないが、１００ｎＭ～１００ｍＭの範囲であると推定される。別の特定の実施形態では、そのポリマーの質量濃度で表されるポリマーソーム濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの間である。
本発明は、本明細書に記載の溶媒、ｐＨ感受性色素、及び場合によっては酸または酸性溶液を用いて、上述の有機相と水相との混合技術で調製された、本明細書に記載のポリマーソームまたはポリマーソームを含む組成物を、本明細書に記載の割合で任意に組み合わせたものを包含する。
本発明を説明する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」、「ｔｈｅ」、ならびに同様の指示対象の使用は（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）、本明細書で別段の指示のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。
「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含有する（containing）」という用語は、別段の記載がない限り、限定しない用語（すなわち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示のない限り、単に範囲内の各々の値を個別に表す簡略方法として機能することを意図するに過ぎず、各々の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に含まれる。該範囲内の値の全て部分集合も、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に含まれる。
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別段の指示のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。
本明細書で提供されている任意及び全ての例、または例示的な用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより明解にすることを意図しており、別段の主張がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠である任意の非請求要素を示していると解釈されるべきではない。
本明細書では、用語「約」はその通常の意味を有する。実施形態では、その用語は限定された数値のプラス１０％またはマイナス１０％を意味し得る。本明細書では、用語「およそ」はその通常の意味を有する。実施形態では、その用語は限定された数値のプラス１０％またはマイナス１０％を意味し得る。
別段の定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されている意味と同様の意味を有する。
本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに詳細に説明される。
実施例１
ベルトロー反応によるアンモニア定量にＬ－リシンが及ぼす影響
実験作業：Ｌ－リシン１５ｍＭを含まない０．３ｍＭのアンモニア及びＬ－リシン１５ｍＭを含む０．３ｍＭのアンモニアのリン酸緩衝食塩水溶液（リン酸二水素カリウム１ｍＭ、リン酸水素ナトリウム３ｍＭ、塩化ナトリウム１５５ｍＭ）ｐＨ７．４を、ベルトロー試薬（既製のアルカリ性の次亜塩素酸塩溶液及びフェノールニトロプルシド溶液、両溶液共Sigma-Aldrich Chemie社（スイス国ブフス）より入手）と共に室温で２５分間インキュベーションした。溶液の吸光度を分光光度計を用いて６３６ｎｍで測定した。Ｌ－リシンが存在することにより、ベルトロー反応で算出したアンモニア濃度が過小評価となる。結果を図１に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例２
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度比に基づく標準曲線
ポリマーソーム調製：ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを水中油型（ｏ／ｗ）エマルション法を用いて作製した。より詳細には、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯ３０ｍｇ（約１．４のＰＳ／ＰＥＯ比、ＰＳ（２７７０）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）、Advanced Polymer Materials社）を１００μＬの有機溶媒（ジクロロメタン）に溶解した。ポリマー有機溶媒溶液（ポリマー含有有機溶媒相、すなわち油相）を、１０ｍＭのピラニン（酸性水相）を含む、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇのオスモル濃度、ｐＨ５．５の１ｍＭクエン酸溶液１ｍＬに、氷浴で超音波処理しながら添加し、９％（ｖ／ｖ）の溶媒／水相比を有するエマルションを形成した。有機溶媒をロータリーエバポレーターを用いて、４０℃にて７００ｍｂａｒで少なくとも５分間蒸発させた。このプロセスの段階で、ポリマーソームの内側及び外側にはクエン酸と蛍光色素とがある。封入されていない蛍光色素を除去するため、かつ外側のバッファ相をｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、リン酸二水素カリウム１ｍＭ、リン酸水素ナトリウム３ｍＭ、塩化ナトリウム１５５ｍＭ）と交換するため、ポリマーソーム分散液を架橋デキストランゲルろ過カラム上で精製した（排除限界５０００ｇ／ｍｏｌ）。得られたポリマーソームはｐＨ５．５のクエン酸溶液と蛍光色素とを封入していた。蛍光色素の濃度を、４１３ｎｍで励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度を蛍光分光光度計で測定することにより定量した。
アンモニアの定量：ピラニン含有ポリマーソーム（０．０５７ｍＭのピラニン濃度に標準化済）を、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～２ｍＭ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ溶液と共に室温でインキュベーションした。異なる時点（２．５分、５分、１０分、及び１５分）で、４５５ｎｍ（ｐＨ依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度と、４１３ｎｍ（ｐＨ非依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、バッファのアンモニア濃度と相関する。結果を図２に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例３
ヒト血清におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム及び市販の酵素アンモニアアッセイによるアンモニアの定量
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例２に記載の通りに作製し、精製したが、クエン酸濃度を５ｍＭに変更し、カラムを用いた精製手順において外相に変更を加えた（ｐＨ７．４、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇのリン酸緩衝液５０ｍＭ）。
アンモニアの定量：ピラニン含有ポリマーソーム（０．０１６ｍＭのピラニン濃度に標準化済）を、市販のヒト血清、０．１ｍＭのアンモニアをスパイクしたヒト血清、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～０．５ｍＭ）を含むＰＢＳ溶液と共に室温でインキュベーションした。１０分後、４５５ｎｍ（ｐＨ依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度と、４１３ｎｍ（ｐＨ非依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。血清のアンモニア濃度とアンモニアをスパイクした血清のアンモニア濃度とを、アンモニア標準の蛍光強度比から得られた線形回帰曲線（蛍光強度比標準曲線）を用いて比較することにより算出した。さらに、同じ溶液を酵素アンモニアキット（Randox Ammonia Assay AM1015、Randox Laboratories社）を用いて、メーカーの指示書に従って分析したが、プレートリーダーで９６ウェルプレートを測定できるようにするために、示された容量の３０％のみを用いるという変更を加えた。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト血清中のアンモニアを定量することができた。結果を図３に示し、平均値及び標準偏差として示している（ポリマーソームアッセイに対してはｎ＝３、酵素キットに対してはｎ＝８）。
実施例４
ヒト血漿におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム及び市販の酵素アンモニアアッセイによるアンモニアの定量
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを実施例３に記載した通りに作製し、精製した。
アンモニアの定量：実施例３に記載の通り、市販のヒト血漿のアンモニア濃度を、ピラニン含有ポリマーソームと酵素アンモニアキットとにより定量した。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト血漿中のアンモニアを定量することができた。結果を図４に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例５
ヒト唾液におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム及び市販の酵素アンモニアアッセイによるアンモニアの定量
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを実施例３に記載した通りに作製し、精製した。
アンモニアの定量：市販のヒト唾液のアンモニア濃度を、ピラニン含有ポリマーソームと酵素アンモニアキットを用いて実施例３に記載の通りに定量したが、ピラニン濃度を０．０１７ｍＭに変更し、スパイク済及びスパイク無の体液調製液に変更を加えた（ＰＢＳで１：１０（ｖ／ｖ）に希釈、及び０．１ｍＭアンモニアをスパイク）。最終的に、結果を希釈ファクターで乗じた。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト唾液中のアンモニアを定量することができた。結果を図５に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例６
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを用いたアンモニア定量にＬ－リシンが及ぼす影響
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを実施例２に記載した通りに作製し、精製した。
アンモニアの定量：ピラニン含有ポリマーソーム（０．０５４ｍＭのピラニン濃度に標準化済）を、０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、及び１５ｍＭのＬ－リシンを含むｐＨ７．４の０．１ｍＭアンモニア含有ＰＢＳ溶液で、ならびにアンモニア標準ＰＢＳ溶液（０ｍＭ～０．５ｍＭ）中で、室温にてインキュベートした。１０分後、４５５ｎｍ（ｐＨ依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度と、４１３ｎｍ（ｐＨ非依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。Ｌ－リシンを含まないアンモニア溶液とＬ－リシンをスパイクしたアンモニア溶液のアンモニア濃度を、アンモニア標準の蛍光強度比から得られた線形回帰曲線（蛍光強度比標準曲線）を用いて比較することにより算出した。
最大１５ｍＭのＬ－リシン（すなわち、通常の血漿濃度の１００倍、Aldred et al. J Autism Dev Disord. 2003; 33:93-97）まで、蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームで測定したアンモニア濃度が影響を受けていない。結果を図６に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例７
ヒト尿におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム及び市販の酵素アンモニアアッセイによるアンモニアの定量
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを実施例３に記載した通りに作製し、精製した。
アンモニアの定量：市販のヒト尿のアンモニア濃度を、ピラニン含有ポリマーソームと酵素アンモニアキットを用いて、実施例５に記載の通りに定量したが、スパイク済及びスパイク無の体液調製液に変更を加えた（ＰＢＳで１：１００（ｖ／ｖ）に希釈、及び０．１ｍＭアンモニアをスパイク）。最終的に、結果を希釈ファクターで乗じた。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト尿中のアンモニアを定量することができた。結果を図７に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例８
ヒト汗におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム及び市販の酵素アンモニアアッセイによるアンモニアの定量
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを実施例３に記載した通りに作製し、精製した。
アンモニアの定量：市販のヒト汗のアンモニア濃度を、ピラニン含有ポリマーソームと酵素アンモニアキットを用いて、実施例３に記載の通りに定量したが、スパイク済及びスパイク無の体液調製液に変更を加えた（ＰＢＳで１：１０（ｖ／ｖ）に希釈、及び０．１ｍＭアンモニアをスパイク）。最終的に、結果を希釈ファクターで乗じた。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト汗中のアンモニアを定量することができた。結果を図８に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例９
ヒト精液におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム及び市販の酵素アンモニアアッセイによるアンモニアの定量
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを実施例３に記載した通りに作製し、精製した。
アンモニアの定量：市販のヒト精液のアンモニア濃度を、ピラニン含有ポリマーソームと酵素アンモニアキットを用いて、実施例３に記載の通りに定量したが、スパイク済及びスパイク無の体液調製液に変更を加えた（ＰＢＳで１：１００（ｖ／ｖ）に希釈、及び０．１ｍＭアンモニアをスパイク）。最終的に、結果を希釈ファクターで乗じた。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、酵素キットと同様に、天然の及びスパイクしたヒト精液中のアンモニアを定量することができた。結果を図９に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例１０
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるデキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度比に基づく標準曲線
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、蛍光色素に変更を加えて（デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue１０，０００ｇ／ｍｏｌ）濃度０．０１ｍＭとし、クエン酸溶液のｐＨを２．０に変更した。
アンモニアの定量：デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue含有ポリマーソーム（０．００１２ｍＭのデキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue濃度に標準化）を、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～０．２５ｍＭ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ溶液と共に室温でインキュベーションした。１０分後、３６０ｎｍ（ｐＨ依存性放射波長）で励起された５４０ｎｍでの蛍光放射強度と、３６０ｎｍ（ｐＨ非依存性放射波長）で励起された４８５ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。
デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、バッファのアンモニア濃度と相関する。結果を図１０に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例１１
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるＡＮＴＳ含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度比に基づく標準曲線
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物に変更を加え（約１．８のＰＳ／ＰＥＯ比、ＰＳ（３５７０）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）、Advanced Polymer Materials社）、蛍光色素に変更を加えて（８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸、二ナトリウム塩、ＡＮＴＳ）濃度１０ｍＭとし、クエン酸溶液のｐＨを２．０に変更した。
アンモニアの定量：ＡＮＴＳ含有ポリマーソーム（０．００８ｍＭのＡＮＴＳ濃度に標準化済）を、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～０．５ｍＭ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ溶液と共に室温でインキュベーションした。１０分後、３６８ｎｍ（ｐＨ依存性励起波長）で励起された５２０ｎｍでの蛍光放射強度と、３０８ｎｍ（ｐＨ非依存性励起波長）で励起された５２０ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。
ＡＮＴＳ含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、バッファのアンモニア濃度と相関する。結果を図１１に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例１２
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるIRDye（商標）680RDカルボキシレート含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度に基づく標準曲線
ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）のポリマー合成：ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）を原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）により合成した。モノメチルＰＥＯ（２０００）を、乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中で２－ブロモプロピオニルブロミドと反応させることによりＡＴＲＰマクロ開始剤に変換し、さらにスチレンをバルクで重合させた。簡潔に述べると、ＡＴＲＰマクロ開始剤を、触媒としての臭化銅（ＣｕＢｒ）及びリガンドとしての４，４’－ジノイル－２，２’－ジピリジルと共に、加熱乾燥したシュレンクフラスコに入れた。シュレンクフラスコを真空にしアルゴンガスを再充填することを数回繰り返して、酸素を除去した。別のフラスコでスチレンにアルゴンガスを少なくとも１時間バブリングすることによってスチレンから酸素を除去し、それをシュレンクフラスコに入れた。次に混合物を１１５℃に１６時間加熱し、茶色の生成物の溶液をＴＨＦ溶解し、塩基性アルミナカラムでろ過し、ヘキサンで２回沈殿させた。沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させた。モノマー／開始剤の供給比を５０とした。ＰＳ／ＰＥＯ組成物を核磁気共鳴スペクトル法により特定した。
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物に変更を加え（約１．９のＰＳ／ＰＥＯ比、ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００））、蛍光色素に変更を加えて（IRDye（商標）680RDカルボキシレート）濃度０．０４ｍＭとし、クエン酸溶液の濃度を２０ｍＭ、ｐＨを３．０に変更し、定量手順を変更した（ジメチルホルムアミドで１：２０（ｖ／ｖ）に希釈し、ＵＶ分光光度計を用いて２７１ｎｍで吸光度を測定し、ジメチルホルムアミド中のＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）標準曲線と比較してＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー濃度を定量）。
アンモニアの定量：IRDye（商標）680RDカルボキシレート含有ポリマーソーム（０．７３ｍｇ／ｍＬのＰＳ－ｂ－ＰＥＯ濃度に標準化済）を、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～０．６２５ｍＭ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ溶液と共に室温でインキュベーションした。１０分後、６６６ｎｍで励起された６９６ｎｍでの蛍光放射強度を蛍光分光光度計を用いて測定した。
IRDye（商標）680RDカルボキシレート含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度は、バッファのアンモニア濃度と相関する。結果を図１２に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝４）。
実施例１３
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度における、ポリマーソームコアに酸が追加されていないピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度比に基づく標準曲線
ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）のポリマー合成：ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）を実施例１２の通りに合成した。
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、クエン酸溶液の替わりに塩化ナトリウム０．９％（ｍ／Ｖ）溶液を用い、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物に変更を加えた（約１．９のＰＳ／ＰＥＯ比、ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００））。したがって、コア内の唯一の酸は蛍光色素であった。
アンモニアの定量：アンモニアを実施例２に記載された通りに定量したが、ピラニン濃度（０．０１７ｍＭ）、インキュベーション時間（１０分）、アンモニア濃度範囲（０ｍＭ～８ｍＭ）に変更を加えた。
ポリマーソームコアに酸が追加されていないピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの蛍光強度比は、バッファのアンモニア濃度と相関する。結果をｌｏｇ－ｌｏｇプロットとして図１３に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例１４
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度における、変更を加えたＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物を含むピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの蛍光強度比
ＰＳ（２４００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）のポリマー合成：ＰＳ（２４００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）をＡＴＲＰにより合成した。モノメチルＰＥＯ（２０００）を、乾燥ＴＨＦ中で２－ブロモイソブチリルブロミドと反応させることによりＡＴＲＰマクロ開始剤に変換し、さらにスチレンをバルクで重合させた。簡潔に述べると、ＡＴＲＰマクロ開始剤を、触媒としてのＣｕＢｒ及びリガンドとしての４，４’－ジノイル－２，２’－ジピリジルと共に、加熱乾燥したシュレンクフラスコに入れた。シュレンクフラスコを真空にしアルゴンガスを再充填することを数回繰り返して、酸素を除去した。別のフラスコでスチレンにアルゴンガスを少なくとも１時間バブリングすることによってスチレンから酸素を除去し、それをシュレンクフラスコに入れた。次に混合物を１１５℃に３時間加熱し、茶色の生成物の溶液をＴＨＦに溶解し、塩基性アルミナカラムでろ過し、ヘキサンで２回沈殿させた。沈殿物をろ過し、真空下で乾燥させた。
モノマー／開始剤の供給比を２８とした。ＰＳ／ＰＥＯ組成物を核磁気共鳴スペクトル法により同定した。
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物に変更を加え（約１．２のＰＳ／ＰＥＯ比であるＰＳ（２４００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）、及び約３．０のＰＳ／ＰＥＯ比であるＰＳ（６０００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）、Advanced Polymer Materials社）、ＰＳ（６０００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）のポリマー量を変更した（１０ｍｇ）。
アンモニアの定量：ピラニン含有ポリマーソーム（ＰＳ（２４００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）に対しては０．００７ｍＭ、ＰＳ（６０００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）に対しては０．００２ｍＭのピラニン濃度に標準化済）を、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～０．５ｍＭ）を含むＰＢＳ溶液、及び０．２ｍＭのアンモニアを含むＰＢＳ溶液と共に、ｐＨ７．４、室温でインキュベーションした。１０分後、４５５ｎｍ（ｐＨ依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度と、４１３ｎｍ（ｐＨ非依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。０．２ｍＭアンモニア含有ＰＢＳ溶液のアンモニア濃度を、アンモニア標準の蛍光強度比から得られた線形回帰曲線（蛍光強度比標準曲線）を用いて比較することにより算出した。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソーム（ＰＳ／ＰＥＯ比は約１．２～３．０）は、リン酸緩衝液のアンモニアを定量することができた。結果を図１４に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
実施例１５
バッファ中のピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームによるフェニルアラニンの定量
ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）のポリマー合成：ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）を実施例１２の通りに合成した。
ポリマーソーム調製：蛍光膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物に変更を加えた（約１．９のＰＳ／ＰＥＯ比、ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００））。
フェニルアラニン定量：ロドトルラ・グルティニス（ＥＣ番号４．３．１．５、グレードＩ、活性：０．８～２．０ユニット／ｍｇタンパク質（１ユニットは、ｐＨ８．５、３０℃で１分当たり０．００１ｍｍｏｌのフェニルアラニンを変換する）、Sigma-Aldrich Chemie社）由来の市販のフェニルアラニンアンモニアリアーゼを、１５０００×ｇで２分間の遠心ろ過（カットオフ３０ｋＤａ）を８回行って精製した。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（０．０１３ｍｇ／ｍＬ）を、種々のフェニルアラニン溶液（０ｍＭ～１．２ｍＭ、標準曲線として使用）及びフェニルアラニン試液（公称濃度０．６２５ｍＭ）と共に、ｐＨ８．５、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン５ｍＭ中にて３０℃で１５分間インキュベーションした。続いて、これらの溶液のアリコートを、ｐＨ７．４（分散液の最終ｐＨが７．４）、３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇのリン酸緩衝液５０ｍＭ中、ピラニン含有ポリマーソーム（ピラニン濃度０．０１７ｍＭに標準化）と共に室温でインキュベーションした。１０分後、４５５ｎｍ（ｐＨ依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度と、４１３ｎｍ（ｐＨ非依存性励起波長）で励起された５１０ｎｍでの蛍光放射強度とを、蛍光分光光度計を用いて測定した。前者の蛍光放射強度を後者の蛍光放射強度に対して正規化することにより、蛍光強度比を算出した。フェニルアラニン蛍光強度比標準曲線を用いて、フェニルアラニン試液の濃度を算出した結果、０．６３１±０．０２２ｍＭ（平均値及び標準偏差、ｎ＝３）であった。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼでインキュベーションした後に、バッファ中のフェニルアラニン濃度を測定可能である。
実施例１６
リン酸緩衝液の種々のアンモニア濃度におけるピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソームの吸光度比に基づく標準曲線
ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）のポリマー合成：ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００）を実施例１２の通りに合成した。
ポリマーソーム調製：膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームを、実施例３に記載した通りに作製し、精製したが、ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマー組成物に変更を加えた（約１．９のＰＳ／ＰＥＯ比、ＰＳ（３７００）－ｂ－ＰＥＯ（２０００））。
アンモニアの定量：ピラニン含有ポリマーソーム（０．０１ｍＭのピラニン濃度に標準化済）を、種々のアンモニア濃度（０ｍＭ～０．５ｍＭ）を含むｐＨ７．４のＰＢＳ溶液と共に室温でインキュベーションした。１０分後、分光光度計を用いて、４５０ｎｍ及び４０５ｎｍのｐＨ依存性吸光波長で吸光度を測定した。前者の吸光度を後者の吸光度に対して正規化することにより、吸光度比を算出した。
ピラニン含有膜貫通ｐＨ勾配ＰＳ－ｂ－ＰＥＯポリマーソームの吸光度比は、バッファのアンモニア濃度と相関する。結果を図１５に示し、平均値及び標準偏差として示している（ｎ＝３）。
参考文献
Agostoni et al. Advanced Functional Materials 2016; 26:8357-8357.
Aldred et al. J Autism Dev Disord. 2003; 33:93-97.
Ando et al. Biopsychosoc Med. 2017; 11 :19.
Baliga et al J Indian Soc Periodontol. 2013; 17:461-465.
Barsotti The Journal of Pediatrics 2001; 138: S11-S20.
Blachier et al. Journal of Hepatology 2013; 58:593-608.
Bergmann et al. Pediatrics 2014; 133: e1072-e1076.
Chen et al. J Breath Res. 2014; 8:036003.
Davankov and Tsyurupa Reactive Polymers 1990; 13:27-42.
Goggs et al. Veterinary Clinical Pathology 2008; 37:198-206.
Haugen et al. International Journal of Andrology 1998;21: 105-108.
Hibbard et al. Anal Chem 2013; 85: 12158-12165.
Kano and Fendler BBA Biomembranes 1978; 509:289-299.
Kim et al. International Journal of Andrology 1998;21: 29-33.
Krack et al. J. Am. Chem. Soc. 2008; 130.7315-7320.
Lukkarinen et al. Metabolism 2003; 52:935-938.
Maalouf et al. Clinical Journal of the American Society of Nephrology 2007; 2:883-888.
Matoori and Leroux ADDR 2015; 90:55-68.
Mook et al. Desalination 2012; 285: 1-13.
Mortimer and Mueller, Chemie, 12nd edition, Thieme, 2015.
Oncescu et al. Lab Chip 2013; 13:3232-3238.
Rose et al. Hepatology 1999; 30:636-640.
Seiden-Long et al. Clinical Biochemistry 2014; 47: 11 16-1120.
Strickler et al. Leuk Lymphoma 2017; doi: 10.1080/10428194.2017.1352090.
van Spronsen et al. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017; 5: 743-756.
Vilstrup et al. Hepatology 2014; 60:715-735.

Claims (42)

  1. （ａ）ポリ（スチレン）（ＰＳ）とポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）とのブロックコポリマーを含む膜であって、前記ＰＳ／ＰＥＯの分子量比が１．１以上かつ３．５以下である膜、及び（ｂ）酸と少なくとも１つのｐＨ感受性色素とを封入するコア、を含む、ポリマーソーム。
  2. 前記ＰＳ／ＰＥＯの分子量比が１．２以上かつ３．０以下である、請求項１に記載のポリマーソーム。
  3. 前記ブロックコポリマーがジブロックコポリマーである、請求項１または請求項２に記載のポリマーソーム。
  4. 前記酸が、前記ポリマーソームが水和した場合に１～６．５、２～６．５、２～６、２～５．５、または３～５．５のｐＨをもたらす濃度である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  5. 前記酸が酸性水溶液内にある、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  6. 前記酸性水溶液内のｐＨが１～６．５、２～６．５、２～５．５、または３～５．５である、請求項５に記載のポリマーソーム。
  7. 前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、（ｉ）ヒドロキシピレン、（ｉｉ）フェニルピリジルオキサゾール、（ｉｉｉ）アミノナフタレン、（ｉｖ）シアニン、または（ｖ）（ｉ）から（ｉｖ）のいずれか１つのｐＨ感受性蛍光誘導体を含む、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  8. 前記ｐＨ感受性色素が、８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホネート（ＨＰＴＳ）、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue、８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホネート（ＡＮＴＳ）、またはIRDye（商標）680RDカルボキシレートを含む、請求項７に記載のポリマーソーム。
  9. 前記酸と前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素とが異なる分子である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  10. 前記酸がヒドロキシ酸である、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  11. 前記酸がクエン酸である、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  12. 前記酸と前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素とが同一の分子である、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  13. 前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性蛍光色素である、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  14. 前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性吸光色素である、請求項１から請求項１２のいずれか
    １項に記載のポリマーソーム。
  15. 請求項１から請求項１４のいずれか１項で定義されるポリマーソームを作製する方法であって、
    （ａ）コポリマー含有有機相を形成するために、ＰＳとＰＥＯとの前記ブロックコポリマーを、有機溶媒に溶解することと、
    （ｂ）前記ポリマーソームを形成するために、前記コポリマー含有有機溶媒相と、前記酸及び少なくとも１つのｐＨ感受性色素を含む水相とを混合することと、
    （ｃ）封入されていない前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素及び有機溶媒を除去することと、を含む、方法。
  16. 前記有機溶媒が、水不混和性または部分的に水混和性の有機溶媒である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記水相が０．２ｍＭ～１００ｍＭの酸を含む、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
  18. ポリマーソームの前記コアがアンモニアをさらに封入している、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のポリマーソーム。
  19. 請求項１から請求項１４のいずれか１項で定義されるポリマーソームと、少なくとも１つの賦形剤とを含む、組成物。
  20. 前記少なくとも１つの賦形剤が、防腐剤、凍結保護剤、凍結乾燥保護剤、酸化防止剤、またはこれらのうちの少なくとも２つの組み合わせを含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記組成物が液体形態または固体形態である、請求項１９または請求項２０に記載の組成物。
  22. 請求項１９または請求項２０で定義される組成物を固体形態で含む、ストリップ。
  23. 液体試料中のアンモニアの定量に使用するための、請求項１から請求項１４のいずれか１項目に記載のポリマーソーム、または請求項１９から請求項２１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項２２に記載のストリップ。
  24. 前記試料が対象由来の体液を含む、請求項２３に記載の使用のためのポリマーソーム、組成物、またはストリップ。
  25. 前記試料がバッファをさらに含む、請求項２４に記載の使用のためのポリマーソーム、組成物、またはストリップ。
  26. 前記対象が（ｉ）アンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症に罹患しているか、（ｉｉ）アンモニアに関連する疾患もしくは障害もしくはフェニルケトン尿症に罹患している疑いがある、もしくは罹患する可能性があるか、または（ｉｉｉ）抗高アンモニア血症の治療もしくは抗フェニルケトン尿症の治療を受けている、請求項２４または請求項２５に記載の使用のためのポリマーソーム、組成物、またはストリップ。
  27. 試料のアンモニア濃度を算出するための、請求項１から請求項１４のいずれか１項に定義されるポリマーソーム、請求項１９から請求項２１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項２２に記載のストリップを使用する方法であって、
    （ａ）前記ポリマーソーム、組成物、またはストリップと、前記試料とを接触させること
    と、
    （ｂ）前記ポリマーソーム含有試料もしくは前記組成物含有試料、または前記試料含有ストリップにおける少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性を測定することと、
    （ｃ）前記少なくとも１つｐＨ依存性分光特性を使用し標準曲線に照合することによって、前記試料のアンモニア濃度を算出することと、を含む方法。
  28. 前記ｐＨ依存性分光特性がｐＨ依存性吸光度であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ依存性吸光色素であり、前記標準曲線が吸光度標準曲線である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ｐＨ依存性分光特性がｐＨ依存性蛍光強度であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性蛍光色素であり、前記標準曲線が蛍光標準曲線である、請求項２７に記載の方法。
  30. 請求項２７に記載の方法であって、（ｂ）が、少なくとも１つの分光特性比を算出するために、前記ポリマーソーム含有試料もしくは前記組成物含有試料または前記試料含有ストリップにおいて、少なくとも１つのｐＨ非依存性分光特性または少なくとも１つのさらなるｐＨ依存性分光特性を測定することをさらに含み、（ｃ）が、前記少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性比を使用し分光特性比の標準曲線に照合することによって、前記ポリマーソーム含有試料もしくは前記組成物含有試料または前記試料含有ストリップのアンモニア濃度を算出する、方法。
  31. 前記少なくとも１つのｐＨ依存性分光特性及び前記少なくとも１つのｐＨ非依存性分光特性が、同一のｐＨ感受性色素から得られる、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記分光特性が吸光度であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性吸光色素である、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  33. 前記分光特性が蛍光であり、前記ｐＨ感受性色素がｐＨ感受性蛍光色素である、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  34. 前記ポリマーソームコア内のｐＨが２～６．５である、請求項２７から請求項３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、ヒドロキシピレン、またはその誘導体のうちの１つを含む、請求項２７から請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が８－ヒドロキシピレン－１，３，６－トリスルホネート（ＨＰＴＳ）を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、ピリジルフェニルオキサゾール、もしくはその誘導体のうちの１つ、アミノナフタレン、もしくはその誘導体のうちの１つ、またはシアニン、もしくはその誘導体のうちの１つを含む、請求項２７から請求項３４のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記少なくとも１つのｐＨ感受性色素が、デキストランコンジュゲートLysosensor（商標）Yellow/Blue、ＡＮＴＳ、またはIRDye（商標）680RDカルボキシレートを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記試料が対象由来の体液試料を含む、請求項２７から請求項３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記体液が血液試料もしくは血液画分試料、唾液試料、または精液試料である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記体液がフェニルアラニンアンモニアリアーゼで前処理された、請求項４０に記載の方法。
  42. 試料のアンモニア濃度を算出するキットであって、（ａ）請求項１から請求項１４のいずれか１項で定義されるポリマーソーム、請求項１９から請求項２１のいずれか１項で定義される組成物、または請求項２２に記載のストリップ、ならびに（ｂ）（ｉ）前記ポリマーソームを水和するための溶液、（ｉｉ）前記ポリマーソームの外相及び／もしくはアッセイする前記試料のｐＨを調整するためのバッファ、（ｉｉｉ）アッセイする前記試料を希釈するための希釈剤、（ｉｖ）蛍光標準曲線及び／もしくは吸光度標準曲線、（ｖ）既知のアンモニア濃度の１つもしくは複数の溶液、または（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）のうちの少なくとも２つの組み合わせ、を含む、キット。
JP2020506727A 2017-09-12 2018-09-10 体液中アンモニア定量用の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソーム Active JP7203438B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762557256P 2017-09-12 2017-09-12
US62/557,256 2017-09-12
PCT/IB2018/056887 WO2019053578A1 (en) 2017-09-12 2018-09-10 TRANSMEMBRANE PH GRADIENT POLYMERSOMES FOR THE QUANTIFICATION OF AMMONIA IN BODY FLUIDS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2020533562A JP2020533562A (ja) 2020-11-19
JP7203438B2 true JP7203438B2 (ja) 2023-01-13

Family

ID=63686035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020506727A Active JP7203438B2 (ja) 2017-09-12 2018-09-10 体液中アンモニア定量用の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソーム

Country Status (12)

Country Link
US (3) US11713376B2 (ja)
EP (1) EP3668927B1 (ja)
JP (1) JP7203438B2 (ja)
KR (1) KR102446794B1 (ja)
CN (1) CN110945076B (ja)
AU (1) AU2018333099B2 (ja)
CA (1) CA3071798A1 (ja)
DK (1) DK3668927T3 (ja)
FI (1) FI3668927T3 (ja)
LT (1) LT3668927T (ja)
PT (1) PT3668927T (ja)
WO (1) WO2019053578A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3679343B1 (en) * 2017-09-06 2023-06-07 Clemson University Research Foundation Coupon design for enhanced color sensitivity for colorimetric-based chemical analysis of liquids
AU2018333099B2 (en) 2017-09-12 2023-11-23 Eth Zurich Transmembrane pH-gradient polymersomes for the quantification of ammonia in body fluids
KR20210133541A (ko) 2020-04-29 2021-11-08 주식회사 엘지에너지솔루션 전지 모듈 및 이를 포함하는 전지팩
MX2023005797A (es) 2020-11-17 2023-05-29 Genfit Metodos de tratamiento de la insuficiencia hepatica.
JPWO2022209703A1 (ja) * 2021-03-31 2022-10-06

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030119396A1 (en) 2001-12-20 2003-06-26 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Products for controlling microbial generated odors
US20090170342A1 (en) 2006-08-03 2009-07-02 International Business Machines Co. Dielectric nanostructure and method for its manufacture
JP2014526314A (ja) 2011-09-08 2014-10-06 インディケーター システムズ インターナショナル， インコーポレイテッド 感染により活性化される創傷ケア組成物およびデバイス
WO2015052579A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 King Abdullah University Of Science And Technology Polystyrene-b-polyethylene oxide block copolymer membranes, methods of making, and methods of use
JP2016507158A (ja) 2013-01-24 2016-03-07 コーニング インコーポレイテッド ポリマーナノマスクを使用した表面ナノ複製
JP2016529515A (ja) 2013-08-30 2016-09-23 ユニバーシティー オブ メリーランド，カレッジ パーク 高アンモニア血症の検出のためのデバイス及びデバイスを使用する方法
JP2016173293A (ja) 2015-03-17 2016-09-29 国立研究開発法人物質・材料研究機構 メソポーラス金属膜を用いた分子センサー、酸化還元触媒及びリチウムイオン電池電極
JP2017507113A (ja) 2014-01-29 2017-03-16 ウメクライン コグニション アーベー 肝性脳症の治療において使用するためのステロイド化合物
JP2022510519A (ja) 2019-11-14 2022-01-27 エムビーアイ （ウェールズ） リミテッド アンモニアセンサー

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5302731A (en) 1992-07-13 1994-04-12 Becton, Dickinson And Company Fluorescent pH indicators
US6916488B1 (en) 1999-11-05 2005-07-12 Biocure, Inc. Amphiphilic polymeric vesicles
US20050003016A1 (en) 1999-12-14 2005-01-06 Discher Dennis E. Controlled release polymersomes
US6835394B1 (en) 1999-12-14 2004-12-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polymersomes and related encapsulating membranes
US7160551B2 (en) * 2002-07-09 2007-01-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Injectable system for controlled drug delivery
KR100669161B1 (ko) * 2002-11-23 2007-01-15 (주)아모레퍼시픽 양친성 공중합체로 제조되는 생분해성 고분자 베지클
US7682603B2 (en) 2003-07-25 2010-03-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polymersomes incorporating highly emissive probes
CA2581775A1 (en) 2004-09-27 2006-04-06 Sigmoid Biotechnologies Limited Dihydropyrimidine microcapsule - formulations
EP2248578B1 (en) 2005-03-04 2012-06-06 President and Fellows of Harvard College Method for forming multiple emulsions
CA2652280C (en) 2006-05-15 2014-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for functional particles
WO2009117188A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stabilization of macromolecular membranes
WO2010017177A1 (en) 2008-08-06 2010-02-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Ultrasonically induced release from polymer vesicles
US8951571B2 (en) 2008-09-26 2015-02-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polymer vesicles for selective electromagnetic energy-induced delivery
WO2010148395A1 (en) 2009-06-19 2010-12-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Paramagnetic porous polymersomes and uses thereof
WO2010148653A1 (en) 2009-06-26 2010-12-29 Shanghai Jiao Tong University Polymer vesicles of asymmetric membrane
US8808748B2 (en) 2010-04-20 2014-08-19 Vindico NanoBio Technology Inc. Biodegradable nanoparticles as novel hemoglobin-based oxygen carriers and methods of using the same
AU2011278308B2 (en) 2010-07-16 2014-09-04 Technical University Of Denmark Nanoparticle-guided radiotherapy
PT2661275T (pt) 2011-01-07 2019-04-24 Poseida Therapeutics Inc Composições e métodos para a entrega a tumores de agentes ligantes de elevada afinidade para o oxigénio
GB201106433D0 (en) 2011-04-15 2011-06-01 Reckitt & Colman Overseas Composition and method
WO2013020714A2 (en) * 2011-08-11 2013-02-14 Qiagen Gmbh Cell- or virus simulating means comprising encapsulated marker molecules
EP2744399B1 (en) 2011-08-15 2017-07-12 University of Connecticut Control of biofouling in implantable biosensors
EP2695606A1 (en) 2012-08-09 2014-02-12 ETH Zürich Liposome composition for peritoneal dialysis
CN111450060A (zh) * 2012-11-19 2020-07-28 新加坡科技研究局 用于引发对免疫原的免疫响应的方法
WO2014130761A2 (en) 2013-02-22 2014-08-28 President And Fellows Of Harvard College Nanostructured active therapeutic vehicles and uses thereof
WO2015050869A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Becton Dickinson And Company Polymersome encapsulation of hydrophobic fluorescent polymers
RU2628696C1 (ru) * 2013-10-02 2017-08-21 Адзиномото Ко., Инк. Способ получения основной аминокислоты (варианты)
GB201318787D0 (en) 2013-10-24 2013-12-11 Univ Leiden Upconverting vehicles and uses
US10865278B2 (en) 2015-03-24 2020-12-15 Applied Biomimetic A/S Vesicles formed from block copolymers, and novel block copolymers
CN104771382A (zh) 2015-03-31 2015-07-15 中国医学科学院生物医学工程研究所 亲水性内腔载蒽环类药物的聚合物囊泡及制备方法及用途
US10591495B2 (en) * 2015-04-27 2020-03-17 University Of Maryland, College Park Device and methods of using device for detection of hyperammonemia
AU2018333099B2 (en) 2017-09-12 2023-11-23 Eth Zurich Transmembrane pH-gradient polymersomes for the quantification of ammonia in body fluids

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030119396A1 (en) 2001-12-20 2003-06-26 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Products for controlling microbial generated odors
US20090170342A1 (en) 2006-08-03 2009-07-02 International Business Machines Co. Dielectric nanostructure and method for its manufacture
JP2014526314A (ja) 2011-09-08 2014-10-06 インディケーター システムズ インターナショナル， インコーポレイテッド 感染により活性化される創傷ケア組成物およびデバイス
JP2016507158A (ja) 2013-01-24 2016-03-07 コーニング インコーポレイテッド ポリマーナノマスクを使用した表面ナノ複製
JP2016529515A (ja) 2013-08-30 2016-09-23 ユニバーシティー オブ メリーランド，カレッジ パーク 高アンモニア血症の検出のためのデバイス及びデバイスを使用する方法
WO2015052579A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 King Abdullah University Of Science And Technology Polystyrene-b-polyethylene oxide block copolymer membranes, methods of making, and methods of use
JP2017507113A (ja) 2014-01-29 2017-03-16 ウメクライン コグニション アーベー 肝性脳症の治療において使用するためのステロイド化合物
JP2016173293A (ja) 2015-03-17 2016-09-29 国立研究開発法人物質・材料研究機構 メソポーラス金属膜を用いた分子センサー、酸化還元触媒及びリチウムイオン電池電極
JP2022510519A (ja) 2019-11-14 2022-01-27 エムビーアイ （ウェールズ） リミテッド アンモニアセンサー

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chun-Ze Lai，Autonomous Optofluidic Chemical Analyzers for Marine Applications: Insights from the Submersible Autonomous Moored Instruments (SAMI) for pH and pCO2，Front. Mar. Sci.，2018年01月19日，Vol.4，Page.Article No.438
Elijah M. Bolotin，Ammonium Sulfate Gradients for Efficient and Stable Remote Loading of Amphipathic Weak Bases into Liposomes and Ligandoliposomes，Journal of Liposome Research，1994年，Vol.4 No.1，Page.455-479
Giovanna Giacalone，Liposome-supported peritoneal dialysis in the treatment of severe hyperammonemia: An investigation on potential interactions，Journal of Controlled Release，2018年05月28日，Vol.278，Page.57-65
大河内直彦，アンモニアとアンモニウム，KAGAKU，2017年12月，Vo1.87 No.12，Page.1081-1082
片野由美 内田勝雄，看護roo! 現場で使える看護知識 細胞内外間の物質の移動（１）｜細胞の基本機能 拡散 〔 diffusion 〕 単純拡散 〔 simple diffusion 〕，2016年02月14日，https://www.kango-roo.com/learning/2073/

Also Published As

Publication number Publication date
CN110945076B (zh) 2023-10-17
KR102446794B1 (ko) 2022-09-23
JP2020533562A (ja) 2020-11-19
KR20200052264A (ko) 2020-05-14
CN110945076A (zh) 2020-03-31
CA3071798A1 (en) 2019-03-21
PT3668927T (pt) 2024-04-05
AU2018333099A1 (en) 2019-12-05
AU2018333099B2 (en) 2023-11-23
WO2019053578A1 (en) 2019-03-21
LT3668927T (lt) 2024-04-25
EP3668927A1 (en) 2020-06-24
US20230220165A1 (en) 2023-07-13
US11999829B2 (en) 2024-06-04
US20230303778A1 (en) 2023-09-28
US20200283583A1 (en) 2020-09-10
FI3668927T3 (fi) 2024-04-05
DK3668927T3 (da) 2024-03-25
US11713376B2 (en) 2023-08-01
EP3668927B1 (en) 2024-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7203438B2 (ja) 体液中アンモニア定量用の膜貫通ｐＨ勾配ポリマーソーム
JP6139012B2 (ja) 希釈生体試料成分の分析方法
Ensafi et al. A highly selective optical sensor for catalytic determination of ultra-trace amounts of nitrite in water and foods based on brilliant cresyl blue as a sensing reagent
Ali et al. Optical sensing scheme for carbon dioxide using a solvatochromic probe
JP4214271B2 (ja) クレアチニン測定用試験片
TWI531574B (zh) A lithium reagent composition, a lithium ion measurement method and a measuring device using the same
EP2462441B1 (en) Method of detecting oxides of nitrogen
JP6101268B2 (ja) 色素が捕捉されたゾルゲルフィルムに基づく亜硝酸塩テストストリップセンサ、及び、該ストリップセンサを調製するためのプロセス
US9829474B2 (en) Acetate complexes and methods for acetate quantification
RU2424515C2 (ru) Способ определения циннаризина
WO2021080951A1 (en) Compositions and methods for detection of oxidizable analytes
S Awadis et al. Spectrophotometric determination of mefenamic acid in pharmaceutical preparations via arsenazo III–cerium (III) reaction
WO1998038263A1 (en) Optical membrane films for polycation detection
US20200400663A1 (en) Silica nanoparticles for biomarker diagnosis and method for producing same
Weinstein et al. Low neutrophil alkaline phosphatase in renal tubular acidosis with hypophosphatemia after toluene sniffing.
TW202229859A (zh) 用於檢測緩衝液中聚乙烯基磺酸鹽（ｐｖｓ）之滴定方法
JPH04177165A (ja) イオン濃度測定方法
BRPI1001067A2 (pt) determinação espectrométrica de compostos fenólicos em água utilizando sistemas aquosos bifásicos

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210416

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220225

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220314

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220610

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220822

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221012

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20221205

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20221220

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7203438

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150