CN110945076B - 用于定量体液中的氨的跨膜pH梯度聚合物囊泡 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含两亲嵌段共聚物的聚合物囊泡及其用于定量样品(例如，体液样品)中的氨的用途。更具体地，本发明提供了一种聚合物囊泡，其包含(a)膜，该膜包含聚(苯乙烯)(PS)和聚(环氧乙烷)(PEO)的嵌段共聚物，其中PS/PEO分子量比高于1.0且低于4.0；和(b)核，该核包封酸和至少一种pH敏感性染料。还提供了包含所述聚合物囊泡的组合物、试纸条和试剂盒以及使用所述聚合物囊泡、组合物和试剂盒对样品中的氨进行定量的方法。

Description

用于定量体液中的氨的跨膜pH梯度聚合物囊泡
技术领域
本发明涉及用于定量体液(例如，血清、血浆和唾液)中的氨的跨膜pH梯度聚合物囊泡的组合物和用途。更具体地，本发明涉及定量该分子以例如诊断和监测疾病或病症(例如肝性脑病)。
背景技术
氨(NH3)为一种神经毒性内源性代谢物，其在患有各种疾病和病症(例如，(例如，由于肝硬化、急性肝衰竭、门体分流、氨代谢的先天缺陷)肝功能受损(Matoori和Leroux，《先进药物递送综述(ADDR)》2015；90：55-68))或接受某些治疗的患者中积累。氨也可在其它环境(例如土壤和废水)中积聚。
体液中的氨
高血氨水平(高氨血症)与肝性脑病(HE)有关，肝性脑病(HE)是一种严重的神经精神系统病症，具有急慢性表现，可能导致死亡(Vilstrup等人，《肝脏病学(Hepatology)》2014；60：715-735)。肝硬化患者中HE患病率高(高达20％)(Vilstrup等人，同上；Blachier等人，《肝脏病学杂志(Journal of Hepatology)》2013；58：593-608)。这种慢性疾病通常会从轻度(认知损伤)发展为重度(在一些具有致命性结局的患者中出现高氨血症昏迷)症状(Vilstrup等人，同上)。成人的血浆氨临界值为50μM，婴儿的为100μM(Matoori和Leroux，同上)。在急性高氨血症危象中，报道了超过1.5mM的血清氨水平(Bergmann等人，《儿科(Pediatrics)》2014；133：e1072-e1076)。
血液或血浆中氨的定量是HE初始诊断和HE患者随访的重要部分。HE患者对治疗性干预(例如乳果糖治疗)的反应部分地基于血浆氨水平的变化来确定(Vilstrup等人，同上)。此外，在某些与高氨血症相关的药物治疗(例如丙戊酸治疗)中也会测量血浆氨水平(Vilstrup等人，同上)。
精液中的氨水平也与精液质量和生育力降低有关(Kim等人，1998)。
唾液氨水平主要受脲酶介导的尿素在口腔中降解为氨的影响，因此可能是血浆尿素的替代参数。由于血浆尿素水平是血液透析成功的标志，例如，对患有慢性肾病患者的口腔的氨进行定量，使护理人员能够确定何时可终止透析过程(Hibbard等人，《分析化学(Anal Chem)》2013；85：12158-12165)。由于唾液中氨的浓度相对较高(约1-8mM，Chen等人，《呼吸研究杂志(J Breath Res)》2014；8：036003，图5)，因此如果不事先稀释就无法通过既定的氨定量方法对其进行评估。目前，许多体液中氨的测量都很具挑战性。除了需要在低温下储存样品以防止样品中产生氨的降解过程之外，用于氨定量的可用方法具有重要局限性(Barsotti《儿科杂志(The Journal of Pediatrics)》2001；138：S11-S20)。由于低选择性，基于苯酚、氨和次氯酸盐的吲哚酚形成反应的贝特罗反应(Berthelot reaction)(图1)受到伯胺(例如，氨基酸、蛋白质)的强烈影响，这阻碍了其在生物流体中的使用。在基于酶的氨测定(例如，Randox氨测定AM1015，Randox Laboratories公司，瑞士施维茨)中，谷氨酸脱氢酶在NAD(P)H至NA(D)P+的化学计量氧化下将氨和α-酮戊二酸转化成L-谷氨酸和水。由于NAD(P)H和NAD(P)+的吸收光谱不同，因此可以用分光光度法跟踪反应进行，并且可以测定氨浓度。大多基于谷氨酸脱氢酶的商业化测定的定量上限约为1.2mM。不幸的是，酶法氨定量法受多种因素(例如，脂质、重金属(如锌或铁)、与NAD(P)H或NAD(P)+反应的酶、单宁)的影响，并且由于酶反应强烈的时间依赖性，该方法依赖于精确的时间以产生可靠的结果(Seiden-Long等人，《临床生物化学(Clinical Biochemistry)》2014；47：1116-1120)。这使得高通量实验变得复杂。PocketChemTM BA血氨分析仪是一种用于毛细管血液中的即时氨检测的基于试纸条的系统。当样品渗透试纸条时，其被碱化，将铵转化为氨。随后，氨穿过疏水膜并导致指示剂试纸条上的pH变化，该变化通过分光光度法进行定量。由于其负常数和比例偏差、低通量(每次测量3分钟)和定量上限低(0.285mM)，PocketChemTM BA血氨仪PA-4140未被广泛用于临床前和临床(Goggs等人，《兽医临床病理学(Veterinary ClinicalPathology)》2008；37：198-206)。
其他样品
氨是土壤和水的一种常见污染物(由于例如含氨肥料或工业废物(Mook等人，《淡化(Desalination)》2012；285：1-13)。通常使用铵离子选择性电极对其进行定量(Mook等人，同上)。然而，具有相同电荷和相似离子半径(例如，钾)的阳离子可干扰离子选择性电极测量。
需要用于包括体液在内的样品中的氨的替代定量工具。
本说明书涉及大量文献，其全部内容通过引用整体并入本文。
发明内容
本发明描述了用于定量(例如，测定浓度)体液中的氨的跨膜pH梯度聚合物囊泡的组合物和用途。其使用例如由两亲嵌段共聚物(例如，聚(苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)(PS-b-PEO，也称为聚(苯乙烯)-b-聚(乙二醇)，PS-b-PEG))组成的聚合物囊泡。
使用pH敏感性染料(例如，荧光黄染料(8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐，即HPTS三钠盐)、LysosensorTM黄/蓝右旋糖酐缀合物、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐(ANTS)、IRDyeTM 680RD羧酸盐等)来定量因捕获氨而导致的聚合物囊泡核中的pH升高。
由两亲嵌段共聚物聚(苯乙烯)-b-聚(乙二醇)(PS-b-PEO)和酸性组分组成的聚合物囊泡(参见例如2017年8月15日提交的共同未决PCT申请PCT/IB2017/054966)用于测量体液中的氨的浓度。为了制备聚合物囊泡，使用了有机溶剂。将聚合物溶解于合适的溶剂(例如二氯甲烷)中，并在含有pH敏感性染料的酸性溶液(例如，柠檬酸)或氯化钠溶液中乳化。除去溶剂后，纯化聚合物囊泡以除去未包封的染料(如果有的话)和其它弱酸。然后，一旦暴露于中性或高pH溶液，聚合物囊泡表现出对氨的吸收性质。通过显示对缓冲液中以及天然和加标血清、血浆、唾液、尿液、汗液和精液中氨的定量，证明了聚合物囊泡的功效(图3-5和7-9)。
本发明的聚合物囊泡可以用于氨的定量(或间接地，可在体外转化为相应(1倍或更多)量的氨(例如，氨基酸如苯丙氨酸)的其它生物标记物)。在更具体的实施例中，本发明的聚合物囊泡可用于测定体液以诊断氨相关疾病或病症(例如，高血氨症)、随访患有氨相关疾病或病症的患者，以及用于研究和临床前用途。本发明的诊断产品可用于需要氨定量的体外、临床前(例如动物研究)和临床研究以及常规临床实践中的氨测量。氨测量可用于氨相关疾病或病症的诊断和分期，以及用于评估高氨血症患者对抗高氨血症治疗的反应或有高氨血症风险的患者对预防措施的反应。本发明可以进一步用于在体外测定中定量氨，更具体地用于鉴定抑制氨产生的化合物。
本发明的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡可有利地显示出对氨的高选择性(图6)(推测但不受该假设的限制，是由于高疏水性聚苯乙烯膜的不可渗透性)和至少约0.005mM至约8mM的大检测范围(图2和13)。高的定量上限将是有利的，因为其将至少减少(甚至消除)稀释浓氨样品的需要。
此外，在生理pH下温育2.5分钟后，氨吸收至聚合物囊泡中的动力学快速且不依赖于时间(低时间依赖性)(图2)。这些特征使得能够同时分析大量样品。
更具体地，根据本发明的一个方面，提供了以下主题：
第1项.一种聚合物囊泡，其包含(a)膜，所述膜包含聚(苯乙烯)(PS)和聚(环氧乙烷)(PEO)的嵌段共聚物，其中PS/PEO分子量比高于1.0且低于4.0；和(b)核，所述核包封酸和至少一种pH敏感性染料。
第2项.根据第1项所述的聚合物囊泡，其中所述嵌段共聚物为二嵌段共聚物。
第3项.根据第1或2项的聚合物囊泡，其中当所述聚合物囊泡被水合时，所述酸的浓度为产生在1和6.5，2和6.5，2和6，2和5.5或3和5.5之间的pH。
第4项.根据第1至3项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述酸在酸性水溶液中。
第5项.根据第4项所述的聚合物囊泡，其中所述酸性水溶液中的pH在1和6.5，2和6.5，2和5.5，或3和5.5之间。
第6项.根据第1至5项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述至少一种pH敏感性染料包含(i)羟基芘；(ii)苯基吡啶基恶唑；(iii)氨基萘；(iv)花青；或(v)(i)至(iv)中任一项的任何pH敏感性荧光衍生物。
第7项.根据第6项所述的聚合物囊泡，其中所述pH敏感性染料包含8-羟基芘-1,3,6-三磺酸盐(HPTS)、右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸盐(ANTS)或IRDyeTM 680RD羧酸盐。
第8项.根据第1至7项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述酸和所述至少一种pH敏感性染料为不同的分子。
第9项.根据第1至8项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述酸为羟基酸，最优选柠檬酸。
第10项.根据第1至7项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述酸和所述至少一种pH敏感性染料为相同的分子。
第11项.根据第1至10项中任一项所述的聚合物囊泡，其通过一种方法制备，所述方法包括将含有所述共聚物的有机溶剂与含有所述酸和至少一种pH敏感性染料的水相混合。
第12项.根据第11项所述的聚合物囊泡，其中所述有机溶剂为不溶于水的或部分水溶性的。
第13项.根据第1至12项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述pH敏感性染料为pH敏感性荧光染料。
第14项.根据第1至12项中任一项所述的聚合物囊泡，其中所述pH-敏感性染料为pH-敏感性吸收染料。
第15项.一种制备第1至14项中任一项所述的聚合物囊泡的方法，其包含：
(a)将所述的PS和PEO的嵌段共聚物溶解于有机溶剂(优选不溶于水的或部分水溶性的有机溶剂)中，以形成含共聚物的有机相；
(b)将所述的含共聚物的有机溶剂相与一种含有酸与至少一种pH敏感性染料的水相混合以形成所述聚合物囊泡；以及
(c)除去未包封的至少一种pH敏感性染料和有机溶剂。
第16项.根据第15项所述的方法，其中所述水相包含0.2至100mM的酸。
第17项.一种根据第15或16项中所述的方法制备的聚合物囊泡。
第18项.根据第1至14项和第17项中任一项所述的聚合物囊泡，所述聚合物囊泡的核进一步包封氨。
第19项.一种组合物，其包含第1至14项和第17项中任一项所述的聚合物囊泡和至少一种赋形剂。
第20项.根据第19项所述的组合物，其中所述至少一种赋形剂包含防腐剂、低温防护剂、冻干保护剂、抗氧化剂或其至少两种的组合。
第21项.根据第19或20项所述的组合物，其中所述组合物为液体或固体形式。
第22项.一种试纸条，其包含根据第19或20项中所述的呈固体形式的组合物。
第23项.根据第1至14项和第17项中任一项所述的聚合物囊泡、或根据第19至21项中任一项所述的组合物、或根据第22项所述的试纸条，用于流体样品中的氨的定量。
第24项.根据第23项所使用的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述样品包含来自受试者的体液。
第25项.根据第24项所使用的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述样品进一步包含缓冲液。
第26项.根据第24项所使用的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述受试者(i)患有氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症；(ii)疑似或可能患有氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症；或(iii)正在接受抗高氨血症或抗苯丙酮尿症的治疗。
第27项.一种使用根据第1至14项和第17项中任一项所述的聚合物囊泡、根据第19至21项中任一项所述的组合物或根据第22项所述的试纸条测定样品中的氨浓度的方法，其包括：
(a)使所述聚合物囊泡、组合物或试纸条与所述样品接触；
(b)测定所述含聚合物囊泡或组合物的样品或所述含样品的试纸条中的至少一种pH依赖性光谱特性；以及
(c)通过参照标准曲线，使用所述至少一种pH依赖性光谱特性来确定所述样品中的氨浓度。
第28项.根据第27项所述的方法，其中所述pH依赖性光谱特性为pH依赖性吸光度，所述pH敏感性染料为pH依赖性吸收染料，并且所述标准曲线为吸光度标准曲线。
第29项.根据第27项所述的方法，其中所述pH依赖性光谱特性为pH依赖性荧光强度，所述pH敏感性染料为pH敏感性荧光染料，并且所述标准曲线为荧光标准曲线。
第30.根据第27项所述的方法，其中(b)进一步包括测定所述含聚合物囊泡或组合物的样品或所述含样品的试纸条中的至少一种非pH依赖性光谱特性或至少一种另外的pH依赖性光谱特性以计算至少一种光谱特性比，并且其中(c)通过参照光谱特性比标准曲线，使用所述至少一个pH依赖性光谱特性比，确定所述含聚合物囊泡或组合物的样品或所述含样品的试纸条中的氨浓度。
第31项.根据第30项所述的方法，其中所述至少一种pH依赖性光谱特性和所述至少一种非pH依赖性光谱特性是由相同的pH敏感性染料产生的。
第32项.根据第30或31项所述的方法，其中所述光谱特性为吸光度，且所述pH敏感性染料为pH敏感性吸收染料。
第33项.根据第30或31项所述的方法，其中所述光谱特性为荧光，并且所述pH敏感性染料为pH敏感性荧光染料。
第34项.根据第27至33项中任一项所述的方法，其中所述聚合物囊泡核中的pH在2和6.5之间。
第35项.根据第27至34项中任一项所述的方法，其中所述至少一种pH敏感性染料包含羟基芘或其衍生物之一。
第36项.根据第35项所述的方法，其中所述至少一种pH敏感性染料包含8-羟基芘-1,3,6-三磺酸盐(HPTS)。
第37项.根据第27至34项中任一项所述的方法，其中所述至少一种pH敏感性染料包含吡啶基苯基恶唑或其衍生物之一；氨基萘或其衍生物之一；或花青或其衍生物之一。
第38项.根据第37项所述的方法，其中所述至少一种pH敏感性染料包含右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝、ANTS或IRDyeTM 680RD羧酸盐。
第39项.根据第27至38项中任一项所述的方法，其中所述样品包含来自受试者的体液样品。
第40项.根据第39项所述的方法，其中所述体液为血液或血液级分样品、唾液样品或精液样品。
第41项.根据第40项所述的方法，其中所述体液已用苯丙氨酸解氨酶预处理。
第42项.根据第40或41项所述的方法，其用于(i)诊断所述受试者的氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症，其中所述样品中高于参比氨浓度的氨浓度指示所述受试者患有氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症；或用于(ii)监测抗高氨血症或抗苯丙酮尿症治疗的有效性，其中所述样品中低于参比氨浓度的氨浓度指示所述抗高氨血症或抗苯丙酮尿症治疗是有效的。
第43项.一种用于测定样品中氨浓度的试剂盒，其包含(a)根据第1至14项和第17项中任一项所述的聚合物囊泡、根据第19至21项中任一项所述的组合物或第22项所述的试纸条，以及(b)(i)用于水合所述聚合物囊泡的溶液；(ii)用于调节所述聚合物囊泡的外相和/或待测样品的pH的缓冲液；(iii)用于稀释待测样品的稀释剂；(iv)荧光标准曲线和/或吸光度标准曲线；(v)已知氨浓度的一种或多种溶液；或(vi)(i)至(v)中至少两种的组合。
本发明的其它目的、优点和特征将在阅读以下仅通过参考附图的示例给出的特定实施例的非限制性描述后变得更加明显。
附图说明
附图中：
图1显示L-赖氨酸对基于贝特罗反应的氨定量的影响。L-赖氨酸的存在导致使用贝特罗反应对氨浓度的估计不足。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图2显示了在磷酸盐缓冲液中，不同氨浓度下，含荧光黄染料的PS-b-PEO跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度比。含荧光黄染料的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比是媒介中氨浓度的函数。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图3对比了通过荧光PS-b-PEO聚合物囊泡和通过商业酶法氨测定对人血清中的氨的定量。与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人血清中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(对于聚合物囊泡测定，n＝3；对于酶试剂盒，n＝8)。
图4对比了通过荧光PS-b-PEO聚合物囊泡和通过商业酶法氨测定对人血浆中的氨的定量。类似于酶试剂盒，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人血浆中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图5对比了通过荧光PS-b-PEO聚合物囊泡和通过商业酶法氨测定对人唾液中的氨的定量。与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人唾液中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图6显示L-赖氨酸对基于PS-b-PEO聚合物囊泡的氨定量的影响。高达15mM的L-赖氨酸(即，正常血浆浓度的100倍)的存在不影响测量的氨浓度。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图7对比了通过荧光PS-b-PEO聚合物囊泡和通过商业酶法氨测定对人尿液中的氨的定量。与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人尿液中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图8对比了通过荧光PS-b-PEO聚合物囊泡和通过商业酶法氨测定对人汗液中的氨的定量。类似于酶试剂盒，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人汗液中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图9对比了通过荧光PS-b-PEO聚合物囊泡和通过商业酶法氨测定对人精液中的氨的定量。与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人精液中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图10显示了在磷酸盐缓冲液中，在不同氨浓度下，含右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比。含右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比为媒介中氨浓度的函数。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图11显示了在磷酸盐缓冲液中，在不同氨浓度下，含ANTS的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比。含ANTS的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比是媒介中氨浓度的函数。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图12显示了在磷酸盐缓冲液中，在不同氨浓度下，含有IRDyeTM 680RD的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度。含有IRDyeTM 680RD的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度是媒介中氨浓度的函数。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图13显示了在磷酸盐缓冲液中，在不同氨浓度下，含荧光黄染料的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比，在聚合物囊泡核中不存在其他的酸。在聚合物囊泡核中不存在其他的酸的情况下，含荧光黄染料的PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比是媒介中氨浓度的函数。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图14显示了在磷酸盐缓冲液中通过含荧光黄染料的PS-b-PEO聚合物囊泡(PS/PEO比为约1.2和约3)对氨的定量。含有荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡(PS/PEO比为约1.2和约3.0)能够定量磷酸盐缓冲液中的氨。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
图15显示了在磷酸盐缓冲液中，在不同氨浓度下，含荧光黄染料的PS-b-PEO聚合物囊泡的吸光度比。结果表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
具体实施方式
本发明包括用于定量体液中氨的跨膜pH梯度聚合物囊泡、包含该聚合物囊泡的组合物、制备该聚合物囊泡的方法以及这些聚合物囊泡和组合物的用途。
聚合物囊泡
聚合物囊泡是一种囊泡，其双层膜由合成共聚物组装而成。通过激光衍射测定，其平均直径为50nm至100μm或更大，在一具体实施例中，为100nm至40μm。尽管平均直径在100nm至40μm之间变化的本发明的测试聚合物囊泡能够有效地包封氨，但没有理由相信直径大于40μm的聚合物囊泡是无效的。
本发明的聚合物囊泡包含两亲嵌段共聚物并且使用有机溶剂制备。
本发明的作用机制基于跨聚合物囊泡膜的pH梯度。在用于本发明的各种流体样品(例如体液样品)中，包含在水性聚合物囊泡核中的酸性试剂的pH不同于(低于)样品pH(例如生理pH)或加入缓冲液后的样品pH。通常，人类血液及其液体部分的pH值在7.35和7.45之间；唾液的pH在6.7和7.4之间(Baliga等人，《印度牙周病学会杂志(J Indian SocPeriodontol)》.2013，17：461-465)；尿液的pH在4.5和7.5之间(Maalouf等人，《美国肾脏病学会临床杂志(Clinical Journal of the American Society of Nephrology)》2007；2：883-888)；汗液的pH在4.5和7之间(Oncescu等人，《芯片实验室(Lab Chip)》2013；13：3232-3238)；精液的pH在7.2和8.0之间(Haugen等人，《国际男科学杂志(International Journalof Andrology)》1998；21：105-108)。这些范围在其它哺乳动物中是相似的。因此，氨可以以其不带电的状态扩散通过聚合物囊泡的疏水性聚合物膜，然后以其质子化(离子化)状态(例如，在氨为铵的情况下)被捕获在内隔室中。尽管氨在样品(例如体液)的pH下主要以其质子化状态存在，直接使用或用缓冲液稀释，但总会有一小部分氨处于非电离状态。该部分可以在聚合物囊泡中扩散并以其质子化状态被捕获在聚合物囊泡内。氨分子的质子化消耗质子，从而增加了聚合物囊泡核中的pH。氨/铵平衡很快在外相中重建(即，铵去质子化以重新建立氨部分)，产生了更多的氨分子，它们可以扩散到聚合物囊泡核中。聚合物囊泡核内的pH敏感性染料在pH依赖性波长下的光谱特性(荧光强度或吸光度)随着核中氨浓度的增加而改变。
如本文所用，“跨膜pH梯度以定量氨”的特性是指当在样品(例如体液样品)中稀释时(其本身可以在缓冲液中稀释)，本发明的聚合物囊泡螯合氨的能力。
嵌段共聚物
“聚合物”是包含连接的单体单元的大分子。单体单元可以是单一类型(均聚物)或多种类型(共聚物)。由一系列两种或更多种单一类型的单体(嵌段)共价连接至另一类型(另一嵌段)的两种或更多种单体而制成的共聚物称为嵌段共聚物。由共价连接在一起的两种嵌段类型构成的共聚物称为二嵌段，由三种嵌段类型构成的共聚物称为三嵌段，等等。作为用于产生嵌段共聚物的特定合成的结果，嵌段共聚物可包含不同的端基。
本发明的聚合物囊泡包含嵌段共聚物。在一具体实施例中，本发明的嵌段共聚物为二嵌段共聚物或三嵌段共聚物。这些嵌段共聚物是两亲性的，并且由至少两种聚合物(即芳香族高疏水性聚合物(例如聚(苯乙烯))和亲水性不带电荷且不可生物降解的聚合物)形成。在更具体的实施例中，嵌段共聚物为二嵌段共聚物(例如，聚(苯乙烯)-b-聚(环氧乙烷)(PS-b-PEO))或三嵌段共聚物(例如，PEO-b-PS-b-PEO))(即，PS PEO嵌段共聚物)。
“两亲”共聚物为含有亲水(水溶性)和疏水(非水溶性)基团的共聚物。
如本文所用，术语“不可生物降解的”意指在流体样品条件(例如，体液样品)中不可水解(例如，对通过pH、酶或其他手段的降解具有抗性)。
疏水性不带电荷聚合物
在一具体实施例中，用于本发明共聚物的疏水性不带电荷聚合物为聚(乙烯)(-(CH2-CH(C2H5))n-，即-(C4H8)n-)或聚(苯乙烯)(-(CH2-CH(Ph))n-，即-(CH2-CH(C6H5))n-或-(C8H8)n-)。在具体实施例中，疏水性不带电荷聚合物为聚(苯乙烯)(PS)。用于本发明的聚(苯乙烯)可以包括未取代的和/或取代的/官能化的苯乙烯单体。因此，除非另有明确定义，否则术语“聚(苯乙烯)”在本文中通常用于表示包含完全未取代的苯乙烯单体、取代和未取代的苯乙烯单体的混合物或完全取代的苯乙烯单体的聚(苯乙烯)。苯乙烯单体上的一个或多个取代基可以包括苯基上和/或苯基相连的碳上的取代基，和/或可以与苯基形成多环衍生物(例如，双环、三环等，包含C3-C6芳基和/或C3-C6环烷基)。可能的取代基包括烷基(C1-C7(C1、C2、C3、C4、C5、C6或C7，更具体地，C1、C2或C3))、芳基(C3-C6)、C3-C8环烷基、芳基烷基、乙酰氧基、烷氧基(甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等)、卤素(Br、Cl、F等)、胺、酰胺、烷基胺、NO2。取代基本身可被取代。不限于此，取代的苯乙烯单体包括乙酰氧基苯乙烯、二苯甲基苯乙烯、苄氧基甲氧基苯乙烯、溴苯乙烯(2-、3-、4-或α)、氯苯乙烯(2-、3-、4-或α)、氟苯乙烯(2-、3-、4-或α)、叔丁氧基苯乙烯、叔丁基苯乙烯、氯甲基苯乙烯、二氯苯乙烯、二氟苯乙烯、二甲氧基苯乙烯、二甲基苯乙烯、二甲基乙烯基苄胺、二苯基甲基戊烯、(二苯基膦基)苯乙烯、乙氧基苯乙烯、异丙烯基苯胺、异丙烯基-α,α-二甲基苄基异氰酸酯、[N-(甲基氨基乙基)氨基甲基]苯乙烯、甲基苯乙烯、硝基苯乙烯、4-乙烯基苯甲酸五氟苯酯、五氟苯乙烯、(三氟甲基)苯乙烯(2-、3-或4-)、三甲基苯乙烯、乙烯基苯胺(3-或4-)、甲氧基苯乙烯、乙烯基苯甲酸(3-、4-)、乙烯基苄基氯、(乙烯基苄基)三甲基铵乙烯基联苯、4-乙烯基苯并环丁烯(4-，等)、乙烯基蒽(9-，等)、2-乙烯基萘、乙烯基联苯(3-、4-，等)等。在一实施例中，PS包含至少一种取代的苯乙烯单体。取代基可以为非离子基团(例如，甲基或叔丁基)。在具体实施例中，取代的苯乙烯单体为烷基苯乙烯(例如，甲基苯乙烯)或叔丁基苯乙烯。在另一具体实施例中，聚(苯乙烯)中的苯乙烯单体为未取代的。
亲水性不带电荷聚合物
可与本发明的嵌段共聚物中的聚(苯乙烯)一起使用的亲水性不带电荷聚合物包括聚(环氧乙烷)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙基唑啉)、聚(甲基唑啉)和低聚乙二醇烷基丙烯酸酯的聚合物。在具体实施例中，亲水性不带电荷聚合物为聚(环氧乙烷)。
用于本发明的聚(环氧乙烷)(PEO)具有以下通式：(-(O-CH2-CH2)n-，即-(C2H4O)n-)，并且包括未取代的和取代的/官能化的环氧乙烷单体。因此，除非另有明确定义，否则术语“聚(环氧乙烷)”或“PEO”在本文中通常用于表示包含完全未取代的环氧乙烷单体、取代和未取代的环氧乙烷单体的混合物或完全取代的环氧乙烷单体。在一实施例中，PEO包含至少一种取代的环氧乙烷单体。在另一实施例中，环氧乙烷单体为未取代的。
聚合物比例
PS和PEO嵌段(例如，二嵌段PS-b-PEO或三嵌段PEO-b-PS-b-PEO)的分子量可以变化，只要保持双层的结构和稳定性。本发明人发现，在PS/PEO数均分子量比高于1.0且低于4之间形成稳定的PS-b-PEO聚合物囊泡(参见，例如，实例2-16)。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于4。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于4。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于4。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于4。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.9或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.9。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.9。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.9。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.9。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.8或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.8。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.8。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.8。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.8。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.7或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.7。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.7。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.7。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.7。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.6或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.6。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.6。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.6。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.6。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.5或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.5。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.5。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.5。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.5。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.4或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.4。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.4。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.4。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.4。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.3或更低。在一个具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.3。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.3。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.3。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.3。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.2或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.2。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.2。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.2。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.2。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约3.2或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3.1。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3.1。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3.1。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3.1。在一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且低于3。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且低于3。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且低于3。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且低于3。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.9或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且为约2.9或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且为约2.9或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.9或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.9或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.8或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.1或更高且为约2.8或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.2或更高且为约2.8或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.8或更低。在另一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.8或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.7或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1和约2.7或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.7或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.7或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.7或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.6或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1且为约2.6或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.6或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.6或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.6或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.5或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1至约2.5或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.5或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.5或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.5或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.4或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1至约2.4或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.4或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且约2.4或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.4或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.3或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1且为约2.3或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.3或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.3或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.3或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.2或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1至约2.2或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.2或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.2或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.2或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.1或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1至约2.1或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.1或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.1或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.1或更低。在另一具体实施例中，该比例高于1且为约2.0或更低。在另一具体实施例中，该比例高于约1.1且为约2.0或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.2至约2.0或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.3或更高且为约2.0或更低。在一具体实施例中，该比例为约1.4或更高且为约2.0或更低。
在不限制上述陈述的一般性的情况下，本发明包括分子量为约400g/mol至20000g/mol的PEO。然而，申请人没有理由预期更高分子量的PEO不能有效地用于本发明。分子量较小的聚合物更容易操作。通常，PEO分子量为1000至5000g/mol。选择PS分子量以满足上述比例。根据本发明，当PEO的分子量为例如约20000g/mol时，PS分子量低于约80000g/mol。
由疏水性不带电荷聚合物+亲水性不带电荷聚合物(二嵌段共聚物或三嵌段共聚 物(例如PS-b-PEO或PEO-b-PS-b-PEO共聚物))制成的聚合物囊泡的特性
不受这种假设的限制，据信囊泡膜中高度疏水的聚合物(例如，具有产生π堆积相互作用能力的芳族化合物(例如PS))的强相互作用提供了对流体样品(例如，诸如血清、血浆和唾液的体液样品)，并提供了对氨的选择性(即，对氨的选择性渗透性和对大多数其它生物化合物的较差渗透性)，如通过跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡在不同复杂生物环境中和过量伯胺L-赖氨酸中的残留氨定量能力所证明的(参见实例3-9)。在具体实施例中，聚合物囊泡中的聚合物嵌段是不可生物降解的。
聚合物囊泡的制备方法
共聚物的制备
可以使用任何已知的制备共聚物的方法。用于本文所述实例的共聚物购自Advanced Polymer Materials公司(加拿大多瓦尔)(PS-b-PEO)(参见实例2-11、14)或是合成的(参见实例12-16)。
聚合物囊泡的制备
将共聚物溶解于有机溶剂中以形成有机相，并将后者与酸性水溶液(例如pH敏感性染料，和任选地，如果pH敏感性染料的浓度不够高，则与其他的酸(例如柠檬酸))(水相)混合。混合步骤可以通过不同的技术进行。例如，可以使用水包油(o/w)乳液(即酸性水溶液(即水相)中的含聚合物的有机溶剂相(即油相))、反相蒸发、纳米沉淀或双乳液法来混合含聚合物的有机相和水相。
如本文所用，术语“pH敏感性染料”在本文中是指光谱特性取决于媒介的pH的染料。特别地，其包括pH敏感性吸收染料和pH敏感性荧光染料。由于本发明的方法基于测量聚合物囊泡核中的pH变化，因此本发明涵盖了所有pH敏感性染料。
如本文所用，术语“吸收染料”是指当被其被某些紫外、可见和/或近红外波长照射时吸收这些紫外、可见和/或近红外波长的染料。如本文所用，术语“pH敏感性吸收染料”在本文中是指其吸收光谱随媒介中的pH而变化的染料。不限于此，本发明的pH敏感性吸收染料包括HPTS或其盐(例如，HPTS钾盐或三钠盐)、三芳基甲烷染料(例如，溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲酚红、氯酚红、酚红、酚酞、孔雀绿、百里酚蓝、溴百里酚蓝)、偶氮染料(例如，甲基橙、甲基红、铬黑T、刚果红)、硝基酚染料(例如，2,4-二硝基苯酚)、蒽醌染料(例如，茜素)和下面“pH敏感性荧光染料”下列出的染料。
pH敏感性吸收染料还可包含至少一个非pH依赖性(等吸光度)波长，其吸光度值为非pH依赖性的，并且可以用于标准化pH依赖性波长处的吸光度值。pH敏感性吸收染料可以进一步标准化为在另一pH依赖性波长下的吸光度值(参见实例16)。
如本文所用，术语“荧光染料”是指当在某些紫外、可见和/或近红外波长下照射时产生荧光强度的染料，该荧光强度产生或改变以适当浓度溶解染料的溶液的荧光强度。如本文所用，术语“pH敏感荧光染料”是指包含至少一种pH依赖性(激发或发射)波长的荧光染料。
pH敏感性荧光染料还可包含至少一种非pH依赖性(等吸)(激发或发射)波长，其荧光强度是非pH依赖性的，并且可以用于在pH依赖性(激发或发射)波长下标准化荧光强度。不限于此，本发明的pH敏感性荧光染料包括羟基芘及其衍生物，例如HPTS或其盐(例如HPTS三钾盐或三钠盐)，苯基吡啶基恶唑及其衍生物，例如右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝、萘衍生物(例如，氨基萘及其衍生物诸如ANTS或其盐(例如二钠盐或二钾盐))、花青及其衍生物(例如IRDyeTM 680RD)，氧杂蒽衍生物(例如荧光素及其衍生物(例如羧基荧光素钠)，罗丹明B及其衍生物、香豆素衍生物、方酸衍生物、恶二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物、恶嗪衍生物、吖啶衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物、二氢吲哚鎓衍生物((E)-6-羟基-5-磺基-4-(2-(1,3,3-三甲基-3H-二氢吲哚-1-鎓-2-基)乙烯基)-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-7-磺酸盐、(E)-2-(2-(6-羟基-7-(吗啉代甲基)-2,4a-二氢-1H-氧杂蒽-3-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-丙基-3H-吲哚-1-鎓碘化物、(E)-2-(2-(7-(苯并[d]噻唑-2-基)-6-羟基-2,3-二氢-1H-氧杂蒽-4-基)乙烯基)-3,3-二甲基-1-(3-磺酰基丙基)-3H-吲哚-1-鎓-5-磺酸盐)和四吡咯衍生物。值得注意的是，近红外(NIR)荧光染料(如IRDyeTM 680RD)可直接用于测定含细胞的体液样品(如血液(即全血))(即细胞(例如红细胞)，无需在荧光测定之前将细胞从体液样品中除去)。每种染料具有特定的pH依赖性荧光(激发或发射)强度分布：聚合物囊泡核的pH适应于其中染料对pH变化最敏感的pH范围(即其中染料的荧光(激发或发射)强度光谱显示最强的pH依赖性)。在一具体实施例中，聚合物核中的pH在约2和6.5之间。在更具体的实施例中，聚合物核中的pH约在2和5.5之间。
可以使用超过一种染料。例如，但不限于此，包含至少一种pH依赖性波长但不包含非pH依赖性波长的pH敏感荧光染料可以与包含至少一种非pH依赖性波长的另一种染料组合(例如，用于校准目的)。
选择pH敏感性染料在聚合物囊泡核中的浓度，以产生适当的吸光度或荧光强度。在不存在另一种酸的情况下，选择聚合物囊泡核的pH和pH敏感性酸性染料(例如荧光染料)的浓度，以显示pH依赖性荧光强度相对于聚合物囊泡核中氨浓度的逐渐变化。pH敏感性染料的浓度通常为约0.002至约200mM。在一个具体的实施例中，当使用pH敏感性荧光染料时，该范围为约0.002至约200mM。在本文公开的实施例中，其范围为约0.01mM(LysosensorTM黄/蓝右旋糖酐，10000MW)至约10mM(荧光黄染料和ANTS)。在水包油(o/w)乳液法中，将含聚合物的有机溶剂与酸性水相(含有pH敏感性染料)在超声下混合足以形成乳液的一段时间。在以下实例中，在添加含聚合物的有机溶剂相之前，在搅拌下将水相用有机溶剂饱和30分钟。随后，使用以下机器特异性参数：振幅70，循环0.75(UP200H，200W，24kHz，使用SonotrodeS1的Hielscher超声技术)持续3分钟或振幅10(3.1mm Sonotrode，Fisher ScientificModel 705 Sonic DismembratorTM，700W，50/60Hz，Fisher Scientific)持续2分钟，将含聚合物的有机溶剂相在冰浴中超声处理下加入到含酸的水相中(以减少由超声发生器产生的热)。可以使用本领域已知的产生乳液的任何方法。超声处理的使用以及适于制备乳液的特定超声处理参数和时间将取决于所使用的乳液技术。该乳液在本发明的制备方法中不需要稳定。
在反相蒸发法中，超声处理包含有含聚合物的有机溶剂和pH敏感性染料的两相体系，并且如果合适的话，对另一种含酸的水相进行超声处理，形成油包水(w/o)乳液。在减压下蒸发外相，直到形成粘性凝胶状状态。在凝胶态崩溃时形成聚合物囊泡(Krack等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》2008；130：7315-7320)。随后除去溶剂和未包封的染料。
在纳米沉淀方中，将聚合物溶解于合适的有机溶剂中，向其中缓慢加入pH敏感性染料和(如果合适的话)其他含酸的水。或者，可以将有机相加入到水相中。随后除去溶剂和未包封的染料。
在双乳液法中，聚合物囊泡以w/o/w双乳液形式形成，该双乳液含有pH敏感性染料和(如果合适的话)其他含酸的水性内相，中间相中的含有完全或部分不溶于水的有机溶剂的聚合物，和水性外相。随后除去溶剂和未包封的染料。
外相中的pH(例如，中性和碱性pH)和组合物(无缓冲液(即，在天然缓冲的生理溶液(如血清或血浆)中稀释含聚合物囊泡的溶液)或有缓冲液)也可以变化。由于平衡氨/铵中氨的部分增加，增加外相的pH有可能将吸收动力学加速到甚至更高的速度。
如本文所用，用于聚合物囊泡的外相和/或加入待测体液样品中的“缓冲液”用于稳定pH或提高pH，以便进一步使待测样品中铵去质子化(即增加氨丰度)，从而提高氨在聚合物囊泡中的扩散速率。预期任何中性或碱性缓冲液都适于稳定pH，并且任何碱性缓冲液都适于提高pH。不限于此，其可以更具体地为含有磷酸盐、硼酸盐、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、咪唑、碳酸氢盐和碳酸盐或三(羟基甲基)氨基甲烷的缓冲液。
考虑到聚合物囊泡核的pH，选择外相中或加入到待测试样品(例如体液)中的缓冲液浓度，以确保所得溶液的适当pH值，产生足够的pH梯度，其取决于染料的pH曲线。其通常为约2至约150mM。在一具体实施例中，其为约2至约60mM，或约4至约50mM。
选择外相中的缓冲液或加入待测样品(例如体液)的缓冲液的pH，以便在外相和内相之间提供足够的pH梯度，并确保适当的动力学曲线。其通常在pH7-10的范围内。在一具体实施例中，其为约pH 7.4(即用于制备氨标准曲线的PBS缓冲液的pH)(参见实例2-16)。在另一具体实施例中，将所有待测定样品的pH调节至与氨或苯丙氨酸标准品相同的pH值，以进行对比(参见实例2-16)。在另一具体实施例中，在将具有pH 7.4的缓冲外相的聚合物囊泡加入到pH 8.5的待测定的苯丙氨酸样品和pH 8.5的苯丙氨酸标准曲线后，所得分散体的pH也约为7.4(参见实例15)。然而，如果在将标准品或样品与聚合物囊泡分散体混合时调节pH，则待测试样品和标准品的pH不必相同，而聚合物囊泡分散体中的外相的缓冲能力将设定pH和/或使用另外的缓冲液设定所得分散体的pH。在一具体实施例中，对由将聚合物囊泡分散体与待测样品和(如果合适的话)另外的缓冲液混合所得到的分散体的外相的pH进行调节，使其与由将聚合物囊泡分散体与氨或苯丙氨酸标准品和(如果合适的话)另外的缓冲液混合所得到的分散体的外相的pH相同，从而能够进行对比。不限于此，测定血液和血液部分样品的pH为7.4也是有利的，因为它对应于这些样品的pH，所以限制了潜在的pH依赖性假象的风险。如果可以通过样品固有的缓冲能力在聚合物囊泡核和待测定的样品之间产生足够的pH梯度，则可以省略外加到外相的任何缓冲液。
如本文所用，术语“足够的梯度”通常理解为核pH和待测样品之间至少一个pH单位的差，并且在优选的实施例中，至少1个pH单位的差，优选至少2个pH单位的差(例如，样品中的pH为6或更高，核中的pH为5或更低，优选样品中的pH为7或更高，核中的pH为5或更低)。通常，待测样品固有地具有或被调节(通过直接添加缓冲液或通过添加具有缓冲的外相的聚合物囊泡)至具有约7至约10的pH。
使用任何已知的技术将制备过程中使用的有机溶剂从聚合物囊泡中除去。不限于此，可以使用低于环境压力的应用、加热、过滤、错流过滤、透析或这些方法的组合来除去溶剂。
除去有机溶剂后，纯化聚合物囊泡以减少未包封的pH敏感性染料的量，并且如果需要，以适应外相的pH。使用任何已知的技术将未包封的pH敏感性染料从聚合物囊泡分散体中除去。不限于此，可以采用(错流)过滤、离心(例如离心过滤)、尺寸排阻层析(例如凝胶渗透层析、凝胶过滤层析)、渗析或这些方法的组合以除去未包封的pH敏感性染料。
然后可以原样使用纯化的聚合物囊泡分散体(与聚合物囊泡的外部和内部的酸性水溶液一起使用，或在外部酸性溶液与pH较高(例如7至10)的溶液交换之后使用)，通过常规药物干燥程序(例如冷冻干燥、喷雾干燥)进一步干燥，和/或掺入诊断试纸条中。在所有这些形式(原样、纯化和/或干燥)中，聚合物囊泡核含有pH敏感性染料，并且任选地，例如，如果染料的浓度不足以产生足够pH梯度以供待测样品使用，则聚合物囊泡核还含有酸。当酸和/或pH敏感性染料与待测样品(例如，体液)(有或无其他的缓冲液)混合时，酸和/或pH敏感性染料向聚合物囊泡提供跨膜pH梯度。如此形成的本发明的聚合物囊泡还可含有盐(即具有反离子(如钠，钾或钙)的部分去质子化的酸)，其可以在聚合物囊泡制备过程中加入以调节核中的pH和/或摩尔渗透压浓度，并且以其水合形式存在的聚合物囊泡还含有水。在具体的实施例中，核还可含有防腐剂，其可在聚合物囊泡制备过程中加入，以在例如核pH相对高(例如pH 5.5或更高)的情况下防止核中的微生物生长。在用于本发明的方法中之后，核还可含有氨。根据具体的实施例，聚合物囊泡核的内容物可包含至少一种pH敏感性染料或由至少一种pH敏感性染料组成。在其它实施例中，核可进一步包含至少一种酸。在其它实施例中，核可进一步包含至少一种盐。在其它实施例中，核可进一步包含水。在其它实施例中，核可进一步包含至少一种防腐剂。在其它实施例中，核可进一步包含氨。在其它实施例中，聚合物囊泡核的内容物可由以下组成：(a)至少一种pH敏感性染料；以及(b)(i)至少一种酸；(ii)至少一种盐；(iii)水；(iv)至少一种防腐剂；(v)氨；或(vi)(i)至(v)中至少两种的组合。
当聚合物囊泡被水合时(即含有水性酸性核)，其核中的pH通常在约1和6.5(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5)。在一具体实施例中，其在约1和约6.5，约1和约6，约1和约5.5，约1和约4.5，约1和约4，约1.5和约5，约1.5和约4.5，约1.5和约4，约2和约6.5，约2和约6，约2和约5.5，约2和约5，约2和约4.5，约2和约4，约2.5和约6.5，约2.5和约6，约2.5和约5.5，约2.5和约5，约2.5和约4.5，约2.5和约4，约3和约6.5，约3和约6，约3和约5.5，约3和约5，约3和约4.5以及约3和约4之间。
尽管对于本发明的聚合物囊泡的稳定性不是必需的，但聚合物囊泡膜也可以是交联的。例如，与交联剂对苯撑二甲氯、1,4-双氯甲基二苯、氯二甲醚、二甲氧基甲烷、三(氯甲基)-均三甲基苯或p,p'-双氯甲基-1,4-二苯基丁烷的Friedel-Crafts反应可用于交联聚(苯乙烯)(Davankov和Tsyurupa，《反应性聚合物(Reactive Polymers)》1990；13：27-42)。
溶剂
用于本发明的溶剂溶解共聚物，然后将含聚合物的溶剂与酸性水相混合。在混合步骤(例如，o/w乳液)中，在水相中形成聚合物的精细分散体。在混合步骤之后，除去溶剂(例如，蒸发)以确保维持聚合物囊泡的稳定性(例如，溶剂可以潜在地使膜塑化，从而产生更具渗透性的聚合物囊泡)。
可以使用约2％至约40％(v/v)溶剂相/水相比例的浓度。在一具体实施例中，溶剂相/水相的比例为约5％至30％(v/v)。在另一具体实施例中，溶剂相/水相的比例为约5％至20％(v/v)。在另一具体实施例中，溶剂相/水相的比例为约5％至15％(v/v)。在另一具体实施例中，溶剂相/水相的比例为约10％(v/v)。在一具体的实施例中，所得乳液中溶剂相/水相的比例为约9％(v/v)。在具体的实施例中，溶剂为有机溶剂。
不限于此，溶剂可为氯化溶剂(例如，二氯甲烷(参见例如实例2-16)或氯仿)、芳族溶剂或芳族溶剂衍生物(例如，芳烃或芳烃衍生物(如甲苯))、脂族溶剂或脂族溶剂衍生物(例如，己烷、1-己醇)、酮或酮衍生物(例如，2-己酮)、醚或醚衍生物(例如，乙醚)或其混合物(例如，当使用o/w乳液、w/o/w双乳液或反相蒸发技术时)。
在一具体实施例中，当o/w乳液用于混合含聚合物的有机相和水相时，可用于本发明的溶剂为不溶于水的或部分不溶于水的有机溶剂。不限于此，这样的溶剂包括例如二氯甲烷(参见，例如，实例2-16)、氯仿、芳族溶剂或芳族溶剂衍生物(例如，芳烃或芳烃衍生物(如甲苯))、脂族溶剂或脂族溶剂衍生物(例如，己烷、1-己醇)、酮或酮衍生物(例如，2-己酮)、醚或醚衍生物(例如，乙醚)或其混合物。
酸和酸性溶液
在具体实施例中，pH敏感性染料是促进跨膜pH梯度的酸。可以使用浓度足够高的弱酸pH敏感性染料(例如，10mM的荧光黄染料)，而不需要其他的酸(参见实例13)。不限于此，pH敏感性染料HPTS(例如，荧光黄染料)例如在约5.5的pH(即，低于其7.2的pKa约1.7pH单位)缓冲(Kano和Fendler《生物化学与生物物理学报：生物膜(BBA Biomembranes)》1978；509：289-299)，其使得能够在不存在其他酸的情况下感测氨。在具体实施例中，对于最佳的氨测量，所用的酸不是pH敏感性染料(参见实例2-12、14-16)。如本文所用，术语“弱酸”是指pKa值为3.5或更高的弱酸和pKa值为-0.35或更高的中等强酸(Mortimer和Mueller，《化学(Chemie)》，第12版，Thieme，2015)。
不限于此，包封于聚合物囊泡核中的酸为(i)羟基酸，例如柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸、酒石酸或乳酸；(ii)脂族酸，例如短链脂肪酸(例如乙酸)或不饱和酸(例如山梨酸)；(iii)糖酸，例如糖醛酸；(iv)二羧酸，例如丙二酸；(v)三羧酸，例如丙烷-1,2,3-三羧酸或乌头酸；(vi)四羧酸，例如1,2,3,4-丁烷四羧酸；(vii)五羧酸，例如1,2,3,4,5-戊烷五羧酸；(viii)聚合的聚(羧酸)，如聚(丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸)；(ix)聚氨基羧酸，例如乙二胺四乙酸；(x)氨基酸，例如谷氨酸或天冬氨酸；(xi)无机酸，例如硝酸、硫酸、卤化氢；(xii)芳族羧酸，例如苯甲酸；(xiii)酸性pH敏感性染料，例如但不限于羟基芘及其衍生物(例如，荧光黄染料，也称为HPTS三钠盐)、苯基吡啶基恶唑及其衍生物(例如，右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝)、氨基萘及其衍生物(例如，ANTS)、花青及其衍生物(例如IRDyeTM680RD)、三芳基甲烷染料(例如，溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲酚红、氯酚红、酚红、酚酞、百里酚蓝、溴百里酚蓝)、偶氮染料(例如，甲基红、铬黑T)、硝基酚染料(例如，2,4-二硝基苯酚)、蒽醌染料(例如，茜素)；或(xiv)其至少两种的组合；在一具体实施例中，使用柠檬酸；在另一具体实施例中，使用HPTS。使用聚合物缀合的pH敏感性染料(例如右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝、右旋糖酐缀合的荧光素异硫氰酸酯、甲氧基聚环氧乙烷缀合的荧光素、右旋糖酐缀合的罗丹明B)可能有利于减少纯化后的染料泄漏。然后可以将任何水溶性聚合物，例如，但不限于，右旋糖酐、聚(环氧乙烷)、聚(乙烯吡咯烷酮)或聚(乙烯醇))与染料缀合。
尽管某些以上列出的酸可以具有某些药理学活性，但在某些剂量下，用于本发明的聚合物囊泡的具体实施例中的包封的酸并非旨在发挥直接的药理或成像功能，而是仅用于产生跨膜pH梯度，并且当酸也是pH敏感性染料时，用于感测核中与氨相关的pH变化。本发明包括上述任何一种酸的用途，无论它们是否还具有某些药理活性。然而，根据本发明的某些实施例或方面，除了上面列出的任何酸以外，该酸也可以不是酸，其被称为抗生素、抗癌药、抗高血压药、抗真菌药、抗焦虑药、抗炎药、免疫调节药、抗病毒药或降脂剂。
在具体实施例中，用于该方法的酸的浓度可以在0.1和100mM之间变化，且摩尔渗透压浓度为50至700mOsmol/kg。当使用柠檬酸时，浓度为约0.5mM至50mM，摩尔渗透压浓度为150至600mOsmol/kg的柠檬酸最佳。在另一具体实施例中，摩尔渗透压浓度为100至750mOsmol/kg。在另一具体实施例中，摩尔渗透压浓度为100至700mOsmol/kg。在另一具体实施例中，摩尔渗透压浓度为115至700mOsmol/kg。选择酸浓度以避免影响测定灵敏度，并且当使用的酸也是pH敏感性染料时，选择酸浓度以也能够进行可靠的荧光或吸光度测量。
当聚合物囊泡被水合时，核内酸的浓度为产生1至6.8的pH，在更具体的实施例中，1至6.5的pH，2至6的pH。在具体实施例中，使用约5.5的pH。在另一具体实施例中，使用约3.0的pH。在另一具体实施例中，使用约2.0的pH。
使用方法
本发明包括使用本发明的跨膜pH梯度聚合物囊泡来定量各种样品中氨的方法。该方法可检测至少低至约0.005mM且至少高至8mM的氨浓度。
在具体实施例中，测试样品中的精确氨浓度可通过以下方法确定。
根据一种方法，样品中的氨浓度可通过使样品与本发明的聚合物囊泡(即含有pH敏感性染料)接触(或与含有聚合物囊泡的组合物或试纸条接触)并测量含聚合物囊泡的样品、含组合物的样品或含样品的试纸条中的至少一种pH依赖性光谱特性来评估。然后，在已知氨浓度的标准曲线中，通过将测量的光谱特性与相同pH依赖性波长下的光谱特性(即，吸光度或荧光强度)进行对比，可以推导出样品中的氨浓度。通过首先确定在每个特定氨浓度下在测定中使用的特定条件下获得的“相应的参比光谱性质”来制备标准曲线。更具体地，在相同的特异性跨膜pH梯度聚合物囊泡的核中，于核中特定pH下的酸浓度与用于测定具有未知氨量(如果有的话)的样品的那些相同的情况下，由相同的特异性pH敏感性染料在相同的特异性pH依赖性波长下产生的光谱特性是在聚合物囊泡外部和内部的每种特定氨浓度的存在下测定的。“标准曲线”是通过对在这些条件下测得的所有测试氨浓度的一组相应的参比光谱特性进行数学曲线拟合而获得的曲线。用于产生标准曲线的测试氨浓度的数目至少为1(即，如果标准曲线在给定范围内是线性的，则一种浓度可能就足够了)。
如本文所用，术语“光谱特性”是指在约10-2000nm的电磁光谱，即在光谱的紫外(约10-390nm)、可见(约390-700nm)和近红外(NIR，约700-2000nm)区域中的吸光度或荧光强度。
如本文所用，术语“标准曲线”是用于涵盖术语“吸光度标准曲线”和“荧光标准曲线”的通用术语。
或者，“光谱特性比”可通过将染料在pH依赖性波长下的光谱特性标准化为相同或不同染料在pH依赖性波长下或在另一pH依赖性波长下的光谱特性来确定。如果使用的染料不具有非pH依赖性波长，则可以使用具有非pH依赖性波长的第二染料作为参比来计算比例。然后，可以将在样品上测定的光谱特性比与通用光谱比标准曲线进行对比，该通用光谱比标准曲线由在相同波长下针对每个氨浓度计算的通用参比光谱特性比产生，并且因此可以不再需要对于每个特定组的测定条件获得的不同标准曲线。当然，由针对特定测定条件测量和计算的相应参考光谱特性比产生的特定光谱特性比标准曲线(“特定光谱特性比标准曲线”)仍可制备用于最佳精度。
如本文所用，术语“通用参比光谱特性比”是指在流体中，在跨膜pH梯度聚合物囊泡的核中，在定pH下的酸浓度下，由pH敏感性染料在pH依赖性波长和非pH依赖性波长(或另一pH依赖性波长)下(在聚合物囊泡的外部和内部都存在氨浓度下)产生的光谱特性比。“通用光谱特定比标准曲线”是通过对在这些条件下对于所有测试氨浓度计算出的一组通用参比光谱特性比进行数学曲线拟合而产生的曲线。用于产生标准曲线的测试氨浓度的数目至少为1(即，如果标准曲线在给定范围内是线性的，则一种浓度可能就足够了)。
如本文所用，术语“光谱特性比标准曲线”是用于涵盖术语“特定光谱特性比标准曲线”和“通用光谱特性比标准曲线”的通用术语。如本文所用，术语“特定光谱特性比标准曲线”和“通用光谱特性比标准曲线”是用于表示“特定荧光强度比标准曲线”和“特定吸光度比标准曲线”；以及“通用荧光强度比标准曲线”和“通用吸光度比标准曲线”的通用术语。
如本文所用，术语“pH依赖性波长”和“非pH依赖性波长”是用于涵盖术语“pH依赖性荧光波长”和“pH依赖性吸收波长”；以及“非pH依赖性荧光波长”和“非pH依赖性吸收波长”的通用术语。
如本文所用，术语“pH依赖性光谱特性”和“非pH依赖性光谱特性”是用于涵盖术语“pH依赖性荧光强度”和“pH依赖性吸光度”；以及“非pH依赖性荧光强度”和“非pH依赖性吸光度”的通用术语。
如本文所用，术语“光谱特性比”是用于涵盖术语“荧光强度比”和“吸光度比”的通用术语。
更具体地，上述光谱法可以是荧光法或比色法。这样的方法可以如下进一步定义。
荧光方法
根据一种方法，通过参比已知氨浓度的荧光强度标准曲线中相同发射和激发波长下的荧光强度，可以推导出样品中的氨浓度。通过首先确定在每个特定氨浓度下在测定中使用的特定条件下获得的“相应参比荧光强度”，制备荧光强度标准曲线。更具体地，在相同的特异性跨膜pH梯度聚合物囊泡的核中，于核中特定pH下的酸浓度与用于测定具有未知氨量(如果有的话)的样品的那些相同的情况下，由相同的特异性pH敏感性染料在相同的特异性pH依赖性波长下产生的荧光是在聚合物囊泡外部和内部的每种特定氨浓度的存在下测定的。“荧光强度标准曲线”是通过对在这些条件下对于所有测试氨浓度测量的一组相应的参比荧光强度进行数学曲线拟合而获得的曲线。用于产生标准曲线的测试氨浓度的数目至少为1(即，如果标准曲线在给定范围内是线性的，则一种浓度可能就足够了)。
或者，“荧光强度比”可通过将染料在pH依赖性(发射或激发)波长下的荧光强度标准化为相同或不同染料在非pH依赖性(等吸)(发射或激发)波长下的荧光强度来确定。如果所用的染料不具有非pH依赖性的波长，则可以使用具有非pH依赖性波长的第二染料作为参比来计算比例。然后可以将在样品上测定的荧光强度比与通用荧光强度比标准曲线进行对比，该通用荧光强度比标准曲线由在相同波长下针对每种氨浓度计算的通用参比荧光强度比产生，并且因此可以不再需要对针对每种特定组的测定条件获得的不同荧光强度标准曲线。当然，由针对特定测定条件测量和计算的相应参比荧光强度比产生的特定荧光强度比标准曲线(“特定荧光强度比标准曲线”)仍可制备用于最佳精度。
如本文所用，术语“通用参考荧光强度比”是指在流体中，在跨膜pH梯度聚合物囊泡的核中，在定pH下的酸浓度下，由pH敏感荧光染料在pH依赖性(发射或激发)波长和非pH依赖性(发射或激发)波长下(在聚合物囊泡的外部和内部都存在氨浓度下)产生的荧光强度比。“通用荧光强度比标准曲线”是通过对在这些条件下对于所有测试氨浓度计算的一组通用参比荧光强度比进行数学曲线拟合所产生的曲线。用于产生标准曲线的测试氨浓度的数目至少为1(即，如果标准曲线在给定范围内是线性的，则一种浓度可能就足够了)。
如本文所用，术语“荧光标准曲线”是用于涵盖术语“荧光强度标准曲线”和“荧光强度比标准曲线”的通用术语。如本文所用，术语“荧光强度比标准曲线”是用于涵盖术语“特定荧光强度比标准曲线”和“通用荧光强度比标准曲线”的通用术语。
如本文所用，术语“pH依赖性激发波长”和“非pH依赖性激发波长”是指在特定发射波长下其激发分别导致pH依赖性荧光强度和非pH依赖性荧光强度的激发波长。如本文所用，术语“pH依赖性发射波长”和“非pH依赖性发射波长”是指如果在特定激发波长下激发，则分别显示pH依赖性荧光强度和非pH依赖性荧光强度的发射波长。如本文所用，术语“pH依赖性荧光波长”是指pH依赖性发射波长或pH依赖性激发波长。如本文所用，术语“非pH依赖性荧光波长”是指非pH依赖性发射波长或非pH依赖性激发波长。
如本文所用，术语“pH依赖性荧光强度”是指在pH依赖性发射波长或pH依赖性激发波长下产生的荧光强度，或指在pH依赖性发射波长和pH依赖性激发波长两者下产生的荧光强度。如本文所用，术语“非pH依赖性荧光强度”是指在非pH依赖性发射波长和非pH依赖性激发波长下产生的荧光强度。
如染料供应商所示，或通过记录不同pH值下的发射和激发光谱和通过鉴定pH依赖性荧光波长和pH依赖性荧光波长来选择荧光强度。
比色法
根据另一种方法，可以通过参比已知氨浓度的吸收标准曲线中在相同紫外或可见光或NIR波长下的吸光度来推导氨浓度。吸光度标准曲线通过首先测定在用于测定的特定条件下在每个特定氨浓度下获得的“相应参比吸光度”来制备。更具体地，在相同的特异性跨膜pH梯度聚合物囊泡的核中，于核中特定pH下的酸浓度与用于测定具有未知氨量(如果有的话)的样品的那些相同的情况下，由相同的特异性pH敏感性染料在相同的特异性pH依赖性可见光波长下产生的吸光度是在聚合物囊泡外部和内部的每种特定氨浓度的存在下测定的。“吸光度标准曲线”是通过对在这些条件下对于所有测试氨浓度测量的一组相应的参比吸光度值进行数学曲线拟合所获得的曲线。用于产生标准曲线的测试氨浓度的数目至少为1(即，如果标准曲线在给定范围内是线性的，则一种浓度可能就足够了)。
如本文所用，术语“pH依赖性吸收波长”用于指随介质pH的变化，染料吸收电磁光谱的紫外(约10至390nm)、可见(约390至700nm)或NIR(约700至2000nm)区域中的光的波长。根据染料供应商的指示或通过记录不同pH值下的吸收光谱和通过鉴定pH依赖性吸收波长和非pH依赖性吸收波长来选择吸收波长。
如本文所用，术语“pH依赖性吸光度”和“非pH依赖性吸光度”分别指pH依赖性吸收波长和非pH依赖性吸收波长下的吸光度。
根据本发明，常规实验室规模或便携式分光光度计(例如用于比色法的标准分光光度计或用于荧光方法的荧光分光光度计)和酶标仪可用于测量吸光度或荧光。
如本文所用，可根据本发明测定氨(或间接测定苯丙氨酸)含量的“样品”可以是，但不限于，可含氨或苯丙氨酸的样品，包括生物样品(如体液样品)、土壤样品、废水样品或简单缓冲液。样品可以是固有的流体或在加入水溶液后形成的流体(例如土壤样品)。可以通过任选地添加缓冲液和/或酶(例如，分别用于pH稳定或调节和用于产生氨的酶反应)来进一步修饰样品(固有流体或在添加水溶液后形成的流体)。根据具体实施例，样品可包含生物样品(例如体液)或由其组成。在其它实施例中，样品可进一步包含水溶液。在其它实施例中，样品可进一步包含至少一种缓冲液。在其它实施例中，样品可进一步包含至少一种酶(例如，苯丙氨酸解氨酶)。在其他实施例中，样品可以由以下组成：(a)生物样品(例如体液)；以及(b)(i)水溶液；(ii)至少一种缓冲液；(iii)酶(例如苯丙氨酸解氨酶)；或(iv)(i)至(iii)中的至少两种的组合。在与聚合物囊泡混合之前，从样品溶液中除去苯丙氨酸氨裂解酶是不必要的或没有用的。
样品中聚合物囊泡的温育时间可以根据样品的性质而变化。对于生物样品，限制最佳温育时间以避免蛋白质降解。如本文所示，在短至2分钟且至多15分钟的温育时间后，可在生物样品中进行可靠的光谱特性(即，荧光强度和/或吸光度)读数(参见图2)。对于非生物样品(即简单的缓冲液)，可以增加温育，同时避免氨蒸发。
如本文所用，术语“体液”是指来自脊椎动物的任何流体。在一具体的实施例中，其是指来自哺乳动物的流体。不限于此，其包括血液(如在本发明的荧光或吸收方法中使用NIR染料，或者在例如经由过滤器去除红细胞之后)、血液级分(例如血清、血浆)、唾液、尿液、汗液、精液、腹膜液、来自腹水的流体和脑脊液。某些体液可含有氨水平或特定氨基酸水平，其可以提供关于受试者的信息(例如，根据受试者疾病或病症的存在或存在的指示，治疗或预防措施的有效性或非有效性，或由施用药物引起的副作用的发展而言)。在下面的实施例中，某些体液已被因子稀释，该因子被选择落入用于对比的商用氨测定试剂盒的测量范围内。
因此，在所测定样品是体液样品的特定实施例中，定量方法可用于诊断某些疾病或病症(例如，与氨相关疾病或病症，或特征在于特定氨基酸水平增加的疾病(例如苯丙酮尿症))。在更具体的实施例中，当疾病或病症为高氨血症时，其可用于在某些高氨血症诱导治疗(例如丙戊酸治疗)中诊断/检测/监测该病症。在其它实施例中，其可用于监测抗高氨血症治疗(例如血液透析)或抗苯丙酮尿症治疗(例如低苯丙氨酸饮食方案)的效率。
如本文所用，“氨相关疾病或病症”包括高氨血症(例如，由肝功能受损引起或丙戊酸疗法引起)、肝性脑病、肝硬化、急性肝衰竭、急慢性肝衰竭、门体静脉转流、门体静脉分流、药物引起的高氨血症、先天性肝氨代谢缺陷(原发性高氨血症)、影响肝氨代谢的先天性缺陷(继发性高氨血症)、慢性肾病和氨相关性生育力降低。血液及其级分(血清、血浆)可用作大多数氨相关疾病或病症的体液样品。唾液可用作慢性肾病的体液样品，精液可用作氨相关生育力降低的体液样品。
某些疾病的特征在于受试者体液中氨基酸水平增加。例如，患有苯丙酮尿症的受试者血液中苯丙氨酸水平升高。苯丙酮尿症是先天性代谢缺陷，其导致苯丙氨酸羟化酶(PAH)的水平降低，导致氨基酸苯丙氨酸的代谢降低，从而导致苯丙氨酸血液水平升高(vanSpronsen等人，《柳叶刀·糖尿病与内分泌学(Lancet Diabetes Endocrinol)》.2017；5：743-756)。这种氨基酸的异常水平可以通过以下方式间接定量，即首先将样品与产氨酶(例如苯丙氨酸的苯丙氨酸解氨酶)温育，然后使用本发明的氨定量方法间接测定氨基酸水平。苯丙氨酸解氨酶(EC4.3.1.24)是一种催化将L-苯丙氨酸转化成氨和反式肉桂酸的反应的酶。
如本文所用，术语“受试者”是指其体液样品中可能具有可通过本发明的方法有利地定量的氨或氨基酸水平的受试者。其是指脊椎动物，在一具体的实施例中是指哺乳动物，在一更具体的实施例中是指人类。本发明的聚合物囊泡或组合物也可用于临床前研究或兽医应用，并可用于宠物或其它动物(例如，宠物诸如猫、狗、马等；以及牛、鱼、猪、家禽等)。
在具体实施例中，受试者患有氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症。在另一实施例中，受试者经历抗高氨血症治疗(例如，血液透析、脂质体支持的腹膜透析)或抗苯丙酮尿症治疗(例如，低苯丙氨酸饮食方案)。
在另一具体实施例中，受试者疑似患有或可能是患有氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症。不限于此，这类受试者包括例如患有尿素循环障碍、肝性脑病、苯丙氨酸羟化酶或四氢生物蝶呤缺乏的患者，以及用高氨血症诱导药物(例如，L-天冬酰胺酶、丙戊酸)治疗的患者。
因此，在具体实施例中，体液样品可以来自任何这样的受试者(。
根据所进行的测定的类型，“参比氨浓度”可选自特定体液样品中建立的氨标准水平、在较早时间(例如，当该方法用于监测抗高氨血症或抗苯丙酮尿症治疗的有效性或诱导高氨血症治疗的影响时)在来自受试者的相应样品中测定的相应氨浓度；在已知不易患某些疾病或病症(例如，氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症)和/或已知未患有某些疾病或病症(例如，氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症)的一个或多个受试者的相应生物流体中测定的氨浓度(例如，当该方法用于诊断某些疾病或病症(例如氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症)时)。在另一实施例中，参比氨浓度是在测定多个样品(例如，获自若干健康受试者的样品或获自若干患有某些疾病或病症(例如，氨相关疾病或病症或苯丙酮尿症)的受试者的样品)中的氨浓度之后获得的平均值或中值。
如本文所用，术语“诱导高氨血症的治疗”是指可导致高氨血症或高氨血症是所报道的副作用的治疗。不限于此，其是指丙戊酸治疗和L-天冬酰胺酶治疗(Ando等人，《生物心理学医学(Biopsychosoc Med)》.2017；11：19；Strickler等人，《白血病和淋巴瘤(LeukLymphoma)》2017)。
如本文所用，术语“抗高氨血症治疗”是指任何药理学的(例如苯基丁酸钠苯基丁酸甘油酯/>苯基乙酸钠和苯甲酸钠谷氨酸/>不可吸收的二糖乳果糖的施用、利福昔明(例如XifaxanTM)、球形碳吸附剂(AST-120，/>)和/或跨膜pH梯度聚合物囊泡的施用(参见例如2017年8月15日提交的共同未决PCT申请PCT/IB2017/054966，Matoori和Leroux，同上))；和/或非药理学(例如，血液透析)治疗干预，旨在降低体液中的氨水平。其还涉及旨在防止体液中氨水平升高的任何预防措施(例如，乳果糖和/或利福昔明的预防性施用，HE患者的自发性细菌性腹膜炎或胃肠出血的处理，Vilstrup等人，同上)。如本文所用，术语“抗苯丙酮尿症治疗”是指旨在降低体液中苯丙氨酸水平的任何药理学的(例如，四氢生物蝶呤，van Spronsen等人，同上)或非药理学治疗干预(例如，低苯丙氨酸饮食方案，van Spronsen等人，同上)或旨在防止体液中苯丙氨酸水平升高的任何预防措施(例如，低苯丙氨酸饮食方案，van Spronsen等人，同上)。
在测定样品是土壤或废水样品的具体实施例中，定量方法可用于(例如，在废水被含氨肥料或工业废物污染的情况下)定量这些基质的氨污染(例如，测定其浓度)。
组合物
聚合物囊泡可以以不同形式混合在待测样品中(例如，测定氨浓度)，例如，可以分散在水性介质(例如，水)(可能与赋形剂，例如防腐剂一起)或以其干燥形式(例如，沉积在试纸条上)。
本发明的聚合物囊泡可以作为液体(例如，液体悬浮液)或固体(例如，用于在使用前重构或沉积在诊断试纸条上的粉末)形式储存。
本发明还涉及所述聚合物囊泡和/或组合物在制备诊断试剂中的用途。
本发明的组合物可含有一种或多种赋形剂，包括但不限于防腐剂(例如，叠氮化钠、山梨酸/山梨酸盐、苯甲酸/苯甲酸盐、尼泊金)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸及其盐、异抗坏血酸及其盐)和/或盐。当聚合物囊泡为干燥形式时，它们可以进一步与低温防护剂和/或冻干保护剂(糖，例如海藻糖、甘蔗糖和蔗糖；多元醇，例如，聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇))和/或增量剂(例如，糖、纤维素衍生物)。聚合物囊泡也可以合并到试纸条(例如，诊断试纸条)上。用于这种试纸条的载体可以是例如聚合物(纸、膜、塑料)或无机支架。
试剂盒
试剂盒也在本发明的范围内，该试剂盒包含(a)至少一种类型的本发明的聚合物囊泡、组合物和/或试纸条；以及(b)(i)用于水合该聚合物囊泡的溶液(在其使用之前)；(ii)用于调节待测外相或样品(例如，样品，例如体液样品(例如，血液或血液级分(例如，血清、血浆))、唾液、尿液、泪液、精液)的pH(和/或摩尔渗透压浓度)的缓冲液；(iii)用于稀释待测样品(例如，土壤样品)的稀释剂；(iv)荧光标准曲线(例如，荧光强度标准曲线和/或荧光强度比标准曲线)和/或吸光度标准曲线；(v)一种或多种已知氨浓度的溶液(标准氨溶液)；或(vi)(i)至(v)中的至少两种的组合，以及最终其使用说明书(例如，用于氨的定量或用于诊断特定疾病或病症(例如，氨相关疾病或病症，诸如HE或苯丙酮尿症)。试剂盒可进一步含有至少一种另外的(诊断)试剂，和/或一种或多种另外类型的本发明的聚合物囊泡。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物预期用途的标签。术语标签包括试剂盒上或随附的任何书写或记录材料，或另外与试剂盒一起提供。试剂盒可进一步包括一个或多个容器、试剂、给药装置。
数量
用于定量(例如，浓度测定)和诊断方法的本发明的聚合物囊泡或其组合物的量将取决于多种因素，包括聚合物囊泡核的pH、聚合物囊泡核的pH敏感性染料浓度、聚合物囊泡核的酸浓度、聚合物囊泡核的摩尔渗透压浓度、外相氨浓度、外相pH和外相摩尔渗透压浓度。本发明的聚合物囊泡或其组合物的量将是有效定量样品(例如，体液样品、土壤、废水或缓冲溶液)中的氨的量。不限于此，在一具体实施例中，估计液态的聚合物囊泡的摩尔浓度在100nM至100mM的范围内。在另一具体实施例中，由聚合物的质量浓度表示的聚合物囊泡的浓度为0.01mg/mL至100mg/mL。
本发明包括使用本文所述的溶剂、pH敏感性染料，和最终使用上述有机相和水相混合技术的酸或酸溶液以本文所述的比例制备的本文所述的聚合物囊泡或包含其的组合物的任何组合。
在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)，术语“一”和“一个”和“所述”以及类似指示的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。
除非本文另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。范围内的值的所有子集也并入本说明书中，如同它们在本文中单独引用一样。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行。
除非另有声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制。
说明书中的任何语言都不应被解释为将任何未要求保护的元素指示为实施本发明所必需的。
本文中，术语“约”具有其一般含义。在实施例中，其可以是指合格数值加减10％。在此，术语“约”具有其一般含义。在实施例中，其可以是指合格数值加减10％。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
通过以下非限制性实例进一步详细说明本发明。
实例1：L-赖氨酸对基于贝特罗反应的氨定量的影响。
实验设置。在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(磷酸二氢钾1mM、磷酸氢钠3mM、氯化钠155mM)中将0.3mM氨(不含和含15mM L-赖氨酸)在室温下与贝特罗试剂(即用型碱性次氯酸盐溶液和苯酚硝普钠溶液，均购自Sigma-Aldrich Chemie GmbH，瑞士，布克斯)。使用分光光度计在636nm处测量溶液的吸光度。L-赖氨酸的存在导致对由贝特罗反应测定的氨浓度估计不足。结果示于图1中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例2：在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下含荧光黄染料的跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度比标准曲线。
聚合物囊泡制备。PS-b-PEO聚合物囊泡使用水包油(o/w)乳液方法制备。更具体地，30mg的PS-b-PEO(PS/PEO比为约1.4，PS(2770)-b-PEO(2000)，Advanced PolymerMaterials公司)溶解于100L有机溶剂(二氯甲烷)中。在冰浴中，超声处理下，将聚合物有机溶剂溶液(含聚合物的有机溶剂相，即油相)以300mOsmol/kg的摩尔渗透压浓度滴加到1mL的pH 5.5柠檬酸溶液(1mM)中，该柠檬酸溶液含有10mM荧光黄染料(酸性水相)，从而形成具有9％(v/v)溶剂/水相比例的乳液。使用旋转蒸发器在40℃，700mbar下蒸发有机溶剂至少5分钟。在该方法的这一阶段，在聚合物囊泡内部和外部都存在柠檬酸和荧光染料。为了除去未包封的荧光染料，并用pH 7.4，300mOsmol/kg的磷酸盐缓冲盐水(PBS、磷酸二氢钾1mM、磷酸氢二钠3mM、氯化钠155mM)交换外部缓冲相，在交联右旋糖酐凝胶过滤柱上纯化聚合物囊泡分散体(排阻极限5000g/mol)。所得聚合物囊泡包封了pH 5.5的柠檬酸溶液和荧光染料。使用荧光分光光度计测量的在413nm处激发的510nm的荧光发射强度定量荧光染料浓度。
氨的定量。在室温下，将含荧光黄染料的聚合物囊泡(标准化为0.057mM的荧光黄染料浓度)与pH 7.4的含有不同氨浓度(0-2mM)的PBS溶液一起温育。在不同的时间点(2.5、5、10和15分钟)，使用荧光分光光度计测量在455nm(pH依赖性激发波长)处激发的510nm荧光发射强度和在413nm(非pH依赖性激发波长)处激发的510nm荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。
含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比取决于缓冲液中的氨浓度。结果示于图2中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例3：通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡和商业酶法氨测定对人血清中的氨进行定量。
聚合物囊泡制备。如实例2所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡，在基于柱的纯化方法中，使用5mM的改性的柠檬酸浓度和改性的外相(300mOsmol/kg，pH7.4的50mM磷酸盐缓冲液)。
氨的定量。在室温下，将含荧光黄染料的聚合物囊泡(标准化为0.016mM的荧光黄染料浓度)与市售人血清、0.1mM氨加标人血清和含不同氨浓度(0-0.5mM)的PBS溶液一起温育。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在455nm(pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度和在413nm(非pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。通过与源自氨标准品的荧光强度比的线性回归曲线(荧光强度比标准曲线)进行对比，来测定血清氨加标血清的氨浓度。另外，根据制造商的说明书，使用酶法氨试剂盒(Randox Ammonia Assay AM1015，RandoxLaboratories公司)分析相同的溶液，改变之处在于仅使用指定体积的30％以能够在带有酶标仪的96孔板中进行测量。
与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标人血清中的氨。结果示于图3中，并表示为平均值和标准偏差(对于聚合物囊泡测定，n＝3，对于酶试剂盒，n＝8)。
实例4：通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡和商业酶法氨测定对人血浆中的氨进行定量。
聚合物囊泡制备。如实例3所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。如实例3所述，通过含荧光黄染料的聚合物囊泡和酶氨试剂盒对市售人血浆的氨浓度进行定量。
类似于酶试剂盒，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标人血浆中的氨。结果示于图4中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例5：通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡和商业酶法氨测定对人唾液中的氨进行定量。
聚合物囊泡制备。如实例3所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。如实例3所述，通过含荧光黄染料的聚合物囊泡和酶氨试剂盒对市售人唾液中的氨浓度进行定量，其中改性的荧光黄染料浓度为0.017mM，且改性的加标和未加标体液制剂(在PBS中1:10(v/v)稀释并用0.1mM氨进行加标)。最后，将结果乘以稀释倍数。
与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标人唾液中的氨。结果示于图5中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例6：L-赖氨酸对含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡的氨定量的影响。
聚合物囊泡制备。如实例2所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。在0、1、5和15mM L-赖氨酸的存在下以及在PBS中的氨标准品(0-0.5mM)中，在室温下，将含荧光黄染料的聚合物囊泡(标准化为0.054mM的荧光黄染料)与pH 7.4的0.1mM含氨PBS溶液温育。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在455nm(pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度和在413nm(非pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。通过与由氨标准品的荧光强度比得到的线性回归曲线(荧光强度比标准曲线)进行对比，测定不含L-赖氨酸的氨溶液和L-赖氨酸加标氨溶液的氨浓度。
高达15mM L-赖氨酸(即正常血浆浓度的100倍，Aldred等人，《自闭症与其他发展性障碍杂志(J Autism Dev Disord)》.2003；33：93-97)的存在不影响通过荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡测量的氨浓度。结果示于图6中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例7：通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡和商业酶法氨测定对人尿液中的氨进行定量。
聚合物囊泡制备。如实例3所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。如实例5所述，通过含荧光黄染料的聚合物囊泡和酶氨试剂盒对市售人尿液中的氨浓度进行定量，其中使用改性的加标和未加标体液制剂(在PBS中1:100(v/v)稀释并用0.1mM氨进行加标)。最后，将结果乘以稀释倍数。
与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标人尿液中的氨。结果示于图7中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例8：通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡和商业酶法氨测定对人汗液中的氨进行定量。
聚合物囊泡制备。如实例3所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。如实例3所述，通过含荧光黄染料的聚合物囊泡和酶氨试剂盒对市售人汗液中的氨浓度进行定量，其中使用改性的加标和未加标体液制剂(在PBS中1:10(v/v)稀释并用0.1mM氨进行加标)。最后，将结果乘以稀释倍数。
与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人汗液中的氨。结果示于图8中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例9：通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡和商业酶法氨测定对人精液中的氨进行定量。
聚合物囊泡制备。如实例3所述制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。如实例3所述，通过含荧光黄染料的聚合物囊泡和酶氨试剂盒对市售人精液中的氨浓度进行定量，其中使用改性的加标和未加标体液制剂(在PBS中1:100(v/v)稀释并用0.1mM氨进行加标)。最后，将结果乘以稀释倍数。
与酶试剂盒类似，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡能够定量天然和加标的人精液中的氨。结果示于图9中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例10：在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下含右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝的跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度比标准曲线。
聚合物囊泡制备。如实例3中所述，用浓度为0.01mM的改性荧光染料(右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝，10000g/mol)和pH为2.0的改性柠檬酸溶液制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。在室温下，将含右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝的聚合物囊泡(标准化为0.0012mM的右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝浓度)与含有不同氨浓度(0-0.25mM)的pH 7.4的PBS溶液一起温育。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在360nm(pH依赖性发射波长)处激发的540nm的荧光发射强度和在360nm(非pH依赖性发射波长)处激发的485nm的荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。
含右旋糖酐缀合的LysosensorTM黄/蓝的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比取决于缓冲液中的氨浓度。结果示于图10中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例11：在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下含ANTS的跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度比标准曲线。
聚合物囊泡制备。如实例3所述，用改性的PS-b-PEO聚合物组合物(PS/PEO比为约1.8，PS(3570)-b-PEO(2000)，Advanced Polymer Materials公司)和改性的荧光染料(8-氨基萘-1,3,6-三磺酸二钠盐，ANTS)和pH为2.0的改性柠檬酸溶液制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。在室温下，将含ANTS的聚合物囊泡(标准化至ANTS浓度为0.008mM)与含有不同氨浓度(0-0.5mM)的pH 7.4的PBS溶液一起温育。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在368nm(pH依赖性激发波长)处激发的520nm的荧光发射强度和在308nm(非pH依赖性激发波长)处激发的520nm的荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。
含ANTS的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比取决于缓冲液中的氨浓度。结果示于图11中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例12：在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下含IRDyeTM 680RD羧酸盐的跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度标准曲线。
PS(3700)-b-PEO(2000)的聚合物合成。PS(3700)-b-PEO(2000)的合成通过原子转移自由基聚合(ATRP)进行。通过在干燥的四氢呋喃(THF)中与2-溴丙酰溴反应，将单甲基PEO(2000)转化为ATRP大分子引发剂，并将其进一步用于本体聚合苯乙烯。简言之，将ATRP大分子引发剂与分别作为催化剂和配体的溴化铜(CuBr)和4,4'-二壬基-2,2'-联吡啶一起装入火焰干燥的Schlenk烧瓶中。将Schlenk烧瓶抽空，并通过几个循环用氩气再填充以除去氧气。在另一个烧瓶中，通过向其中鼓入氩气至少1小时使苯乙烯脱氧，然后装入Schlenk烧瓶中。然后将该混合物在115℃加热16h，并将棕色产物溶液溶于THF中，通过碱性氧化铝柱过滤，并在己烷中沉淀两次。过滤沉淀并真空干燥。[单体]/[引发剂]的进料比为50。通过核磁共振光谱法测定PS/PEO组成。
聚合物囊泡制备。如实例3所述，用改性的PS-b-PEO聚合物组合物(PS/PEO比为约1.9，PS(3700)-b-PEO(2000))、浓度为0.04mM的改性荧光染料(IRDyeTM680RD羧酸盐)、浓度为20mM且pH为3.0的改性柠檬酸溶液和改性定量程序(通过在二甲基甲酰胺中1:20(v/v)稀释并通过使用UV分光光度计测定271nm处的吸光度并与在二甲基甲酰胺中的PS(3700)-b-PEO(2000)标准曲线对比来定量PS-b-PEO聚合物浓度)制备并纯化荧光跨膜pH梯度的PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。在室温下，将含IRDyeTM 680RD羧酸盐的聚合物囊泡(标准化为0.73mg/mL的PS-b-PEO浓度)与含不同氨浓度(0-0.625mM)的pH 7.4的PBS溶液一起温育。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在666nm处激发的696nm的荧光发射强度。
含IRDyeTM 680RD羧酸盐的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度取决于缓冲液中的氨浓度。结果示于图12中，并表示为平均值和标准偏差(n＝4)。
实例13：在聚合物囊泡核中不存在其他酸的情况下，在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下含荧光黄染料的跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度比标准曲线。
PS(3700)-b-PEO(2000)的聚合物合成。如实例12中所述合成PS(3700)-b-PEO(2000)。
聚合物囊泡制备。如实例3所述，使用氯化钠0.9％(m/V)溶液代替柠檬酸溶液，并使用改性的PS-b-PEO聚合物组合物(PS/PEO比为约1.9，PS(3700)-b-PEO(2000))制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。因此，核中唯一的酸为荧光染料。
氨的定量。如实例2所述，采用改变的荧光黄染料浓度(0.017mM)、温育时间(10分钟)和氨浓度范围(0-8mM)进行氨定量。
在核中不存在另一种酸的情况下，含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡的荧光强度比取决于缓冲液中的氨浓度。结果在图13中显示为对数-对数图，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例14：在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下具有改性的PS-b-PEO聚合物组合物的含荧光黄染料的跨膜pH梯度聚合物囊泡的荧光强度比。
PS(2400)-b-PEO(2000)的聚合物合成。PS(2400)-b-PEO(2000)合成通过ATRP进行。通过在干燥THF中与2-溴异丁酰溴反应，将单甲基PEO(2000)转化为ATRP大分子引发剂，并进一步用于本体聚合苯乙烯。简言之，将ATRP大分子引发剂与分别作为催化剂和配体的CuBr和4,4'-二壬基-2,2'-联吡啶一起装入火焰干燥的Schlenk烧瓶中。将Schlenk烧瓶抽空，并通过几个循环用氩气再填充以除去氧气。在另一个烧瓶中，通过向其中鼓入氩气至少1小时使苯乙烯脱氧，然后装入Schlenk烧瓶中。然后将混合物在115℃加热3小时，并将棕色产物溶液溶于THF中，通过碱性氧化铝柱过滤，在己烷中沉淀两次。过滤沉淀并真空干燥。[单体]/[引发剂]的进料比为28。通过核磁共振光谱法测定PS/PEO组成。
聚合物囊泡制备。如实例3所述，用改性的PS-b-PEO聚合物组合物(PS/PEO比为约1.2，PS(2400)-b-PEO(2000)，和PS/PEO比为约3.0，PS(6000)-b-PEO(2000)，AdvancedPolymer Materials公司)和用于PS(6000)-b-PEO(2000)的改性聚合物的量(10mg)来制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。在室温下，将含荧光黄染料的聚合物囊泡(对于PS(2400)-b-PEO(2000)标准化为0.007mM的荧光黄染料浓度，对于PS(6000)-b-PEO(2000)标准化为0.002mM的荧光黄染料浓度)与含不同氨浓度(0-0.5mM)的PBS溶液和含有0.2mM氨的PBS溶液一起温育，所有PBS溶液的pH均为7.4。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在455nm(pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度和在413nm(非pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。通过与从氨标准品的荧光强度比导出的线性回归曲线(荧光强度比标准曲线)进行对比，确定PBS中0.2mM含氨溶液的氨浓度。
含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡(PS/PEO比为约1.2和3.0)能够定量磷酸盐缓冲液中的氨。结果示于图14中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
实例15：在缓冲液中通过含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡对苯丙氨酸的定量。
PS(3700)-b-PEO(2000)的聚合物合成。如实例12所述合成PS(3700)-b-PEO(2000)。
聚合物囊泡制备。如实例3所述，用改性的PS-b-PEO聚合物组合物(PS/PEO比为约1.9，PS(3700)-b-PEO(2000))制备并纯化荧光跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
苯丙氨酸的定量。来自粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的市售苯丙氨酸解氨酶(EC编号4.3.1.5，等级I，活性：使用离心过滤(截留30kDa)，将0.8-2.0单位/mg蛋白质(在pH8.5，30℃下，1单位每分钟转化0.001mmol苯丙氨酸)，Sigma-Aldrich Chemie GmbH)在15000x g下纯化8次，2分钟。于30℃下，苯丙氨酸解氨酶(0.013mg/mL)与不同的苯丙氨酸溶液(0-1.2mM，用作标准曲线)和苯丙氨酸测试溶液(标称浓度0.625mM)在5mM的三(羟甲基)氨基甲烷(300mOsmol/kg，pH 8.5)中温育15分钟。随后，在室温下，将这些溶液的等分试样与含荧光黄染料的聚合物囊泡(标准化为0.017mM的吡喃宁浓度)在50mM的磷酸盐缓冲液(300mOsmol/kg，pH 7.4(分散体的最终pH为7.4))中一起温育。10分钟后，使用荧光分光光度计测量在455nm(pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度和在413nm(非pH依赖性激发波长)处激发的510nm的荧光发射强度。通过将前者标准化为后者的荧光发射强度来确定荧光强度比。使用苯丙氨酸荧光强度比标准曲线，测定苯丙氨酸测试溶液的浓度为0.631±0.022mM(平均值和标准偏差，n＝3)。
含荧光黄染料的跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡可以在与苯丙氨酸解氨酶温育后测量缓冲液中的苯丙氨酸浓度。
实例16：在磷酸盐缓冲液中不同氨浓度下含荧光黄染料的跨膜pH梯度聚合物囊泡的吸光度比标准曲线。
PS(3700)-b-PEO(2000)的聚合物合成。如实例12所述合成PS(3700)-b-PEO(2000)。
聚合物囊泡制备。如实例3所述，用改性的PS-b-PEO聚合物组合物(PS/PEO比为约1.9，PS(3700)-b-PEO(2000))制备并纯化跨膜pH梯度PS-b-PEO聚合物囊泡。
氨的定量。在室温下，将含荧光黄染料的聚合物囊泡(标准化为荧光黄染料浓度为0.01mM)与pH 7.4的含不同氨浓度(0-0.5mM)的PBS溶液一起温育。10分钟后，使用分光光度计在pH依赖性吸收波长450nm和405nm处测量吸光度。通过将前者标准化为后者的吸光度来确定吸光度比。
含荧光黄染料的跨膜pH梯度PPS-b-PEO聚合物囊泡的吸光度比取决于缓冲液中的氨浓度。结果示于图15中，并表示为平均值和标准偏差(n＝3)。
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Claims (34)

1.一种聚合物囊泡，其包含(a)膜，所述膜包含聚(苯乙烯)(PS)和聚(环氧乙烷)(PEO)的嵌段共聚物，其中PS/PEO分子量比高于1.0且低于4.0；和(b)核，所述核包封酸和至少一种pH敏感性染料。
2.根据权利要求1所述的聚合物囊泡，其中PS/PEO分子量比为1.1或更高且低于3.5。
3.根据权利要求1所述的聚合物囊泡，其中PS/PEO分子量比为1.2或更高且低于3.1。
4.根据权利要求1所述的聚合物囊泡，其中(a)所述嵌段共聚物为二嵌段共聚物；和/或(b)所述酸和至少一种pH敏感性染料是不同的分子或相同的分子；和/或(c)其中所述酸为羟基酸；和/或(d)所述pH敏感性染料为pH敏感性荧光染料或pH敏感性吸收染料。
5.根据权利要求1所述的聚合物囊泡，其中所述酸为柠檬酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡，其通过一种方法制备，所述方法包括将含有所述共聚物的有机溶剂与含有所述酸和至少一种pH敏感性染料的水相混合。
7.根据权利要求6所述的聚合物囊泡，其中所述有机溶剂是不溶于水的或部分水溶性的。
8.一种制备如权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡的方法，其包含：
(a)将所述PS和PEO的嵌段共聚物溶解于有机溶剂中，以形成含共聚物的有机相；
(b)将所述含共聚物的有机相与含有酸和至少一种pH敏感性染料的水相混合以形成所述聚合物囊泡；以及
(c)除去未包封的至少一种pH敏感性染料和有机溶剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述有机溶剂是不溶于水的或部分水溶性的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述水相包含0.2至100mM的酸。
11.一种通过权利要求8所述的方法制备的聚合物囊泡。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡，所述聚合物囊泡的核进一步包封氨。
13.一种组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡和至少一种赋形剂。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中(i)所述至少一种赋形剂包含防腐剂、低温防护剂、冻干保护剂、抗氧化剂或其至少两种的组合；和/或(ii)所述组合物为液体或固体形式。
15.一种试纸条，其包含根据权利要求14所述的呈固体形式的组合物。
16.根据权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡，或根据权利要求13或14所述的组合物，或根据权利要求15所述的试纸条，用于定量流体样品中的氨。
17.根据权利要求16所述的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述样品包含来自受试者的体液。
18.根据权利要求16所述的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述样品还包含缓冲液。
19.根据权利要求17所述的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述受试者疑似或可能患有高氨血症、肝性脑病、肝硬化、急性肝衰竭、急慢性肝衰竭、门体静脉转流、门体静脉分流、慢性肾病、氨相关性生育力降低或苯丙酮尿症。
20.根据权利要求19所述的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述受试者患有高氨血症、肝性脑病、肝硬化、急性肝衰竭、急慢性肝衰竭、门体静脉转流、门体静脉分流、慢性肾病、氨相关性生育力降低或苯丙酮尿症。
21.根据权利要求20所述的聚合物囊泡、组合物或试纸条，其中所述受试者正在接受抗高氨血症或抗苯丙酮尿症的治疗。
22.一种使用根据权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡、根据权利要求13或14所述的组合物或根据权利要求15所述的试纸条在制备用于测定样品中的氨浓度的材料中的用途，其包括：
(a)使所述聚合物囊泡、组合物或试纸条与所述样品接触；
(b)测定所述含聚合物囊泡或组合物的样品或所述含样品的试纸条中的至少一种pH依赖性光谱特性；以及
(c)通过参照标准曲线，使用所述至少一种pH依赖性光谱特性来确定所述样品中的氨浓度。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述pH依赖性光谱特性为pH依赖性吸光度，所述pH敏感性染料为pH敏感性吸收染料，并且所述标准曲线为吸光度标准曲线。
24.根据权利要求22所述的用途，其中所述pH依赖性光谱特性为pH依赖性荧光强度，所述pH敏感性染料为pH敏感性荧光染料，并且所述标准曲线为荧光标准曲线。
25.根据权利要求22所述的用途，其中(b)进一步包括测定所述含聚合物囊泡或组合物的样品或所述含样品的试纸条中的至少一种非pH依赖性光谱特性或至少一种另外的pH依赖性光谱特性以计算至少一种光谱特性比，并且其中(c)通过参照光谱特性比标准曲线，使用所述至少一个pH依赖性光谱特性比，确定所述含聚合物囊泡或组合物的样品或所述含样品的试纸条中的氨浓度。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述至少一种pH依赖性光谱特性和所述至少一种非pH依赖性光谱特性是由相同的pH敏感性染料产生的。
27.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述光谱特性为吸光度，并且所述pH敏感性染料为pH敏感性吸收染料。
28.根据权利要求25或26所述的用途，其中所述光谱特性为荧光，并且所述pH敏感性染料为pH敏感性荧光染料。
29.根据权利要求22所述的用途，其中所述样品包含来自受试者的体液样品。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述体液为血液或血液级分样品、唾液样品或精液样品。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述体液已用苯丙氨酸解氨酶预处理。
32.根据权利要求30所述的用途，其中所述材料用于诊断所述受试者的高氨血症、肝性脑病、肝硬化、急性肝衰竭、急慢性肝衰竭、门体静脉转流、门体静脉分流、慢性肾病、氨相关性生育力降低或苯丙酮尿症，其中所述样品中高于参比氨浓度的氨浓度指示所述受试者患有所述疾病。
33.根据权利要求30所述的用途，其中所述材料用于监测抗高氨血症或抗苯丙酮尿症治疗的有效性，其中所述样品中低于参比氨浓度的氨浓度指示所述抗高氨血症或抗苯丙酮尿症治疗是有效的。
34.一种用于测定样品中氨浓度的试剂盒，其包含(a)根据权利要求1至5中任一项所述的聚合物囊泡、根据权利要求13或14所述的组合物或根据权利要求15所述的试纸条，以及(b)(i)用于水合所述聚合物囊泡的溶液；(ii)用于调节所述聚合物囊泡的外相和/或待测样品的pH的缓冲液；(iii)用于稀释待测样品的稀释剂；(iv)荧光标准曲线和/或吸光度标准曲线；(v)一种或多种氨浓度已知的溶液；或(vi)(i)至(v)中的至少两种的组合。
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