JP7197886B2 - 線維化コラーゲンゲル作製用鋳型材料 - Google Patents
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〔1〕その表面の少なくとも一部に凹形状及び/又は凸形状を有する線維化コラーゲンゲルを作製するための鋳型材料であって、下記(1)と(2)の両方の特性を有する、鋳型材料。
(1)この鋳型材料は、ガス透過性、疎水性及び柔軟性を有する素材で構成されたものである。
(2)この鋳型材料は、その表面の少なくとも一部に、凹形状及び/又は凸形状を有する領域を備えたものである。
〔2〕この鋳型材料を構成する素材が、ポリジメチルシロキサンである〔1〕に記載の鋳型材料。
〔3〕この鋳型材料が、その表面の少なくとも一部に、凹部の深さが50~500μmである凹形状及び/又は凸部の高さが50~500μmである凸形状を有する領域を備えたものである〔1〕又は〔2〕に記載の鋳型材料。
〔4〕〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の鋳型材料を用いて、その表面の少なくとも一部に凹形状及び/又は凸形状を有する線維化コラーゲンゲルを作製する方法。
(1)この鋳型材料は、ガス透過性、疎水性及び柔軟性を有する素材で構成されたものである。
(2)この鋳型材料は、その表面の少なくとも一部に、凹形状及び/又は凸形状を有する領域を備えたものである。
・その表面に凹形状を有する領域を備えるとき、凹部の深さは50~500μmである。
・その表面に凸形状を有する領域を備えるとき、凸部の高さは50~500μmである。
・その表面に凹形状及び凸形状を有する領域を備えるときき、凹部の深さは50~500μmであり、かつ、凸部の高さは50~500μmである。
即ち、この鋳型材料は、その表面の少なくとも一部に、凹部の深さが50~500μmである凹形状及び/又は凸部の高さが50~500μmである凸形状を有する領域を備えていることが好ましい。
・接触方法1:鋳型材料を、その凹形状及び/又は凸形状を有する領域が上向きとなるように設置し、そこにゲル形成用コラーゲン水溶液を注入する方法。
・接触方法2:所定の容器内に収容したゲル形成用コラーゲン水溶液の上に、鋳型材料を、その凹形状及び/又は凸形状を有する領域が下向きとなるようにして載置する方法。
なお、上記の接触方法1において、鋳型材料だけではゲル形成用コラーゲン水溶液を保持できないときは、鋳型材料を取り囲む所定の枠や容器を用いることが好ましい。
鋳型材料A~Cを構成する素材は、いずれもポリジメチルシロキサン(酸素透過係数:620barrer、水接触角:約100°、ヤング率:約0.5GPa)である。鋳型材料A~Cは、Siモールド(平面視1辺14mmの正方形)にポリジメチルシロキサン(東レ・ダウコーニング社製の商品名SILPOT 184)を流し込み、既知の条件で硬化させることにより作製した。得られた鋳型材料A~Cの平面視中央部の1辺10mmの正方形の領域内には、下記に示す各パターン形状が施された。
鋳型材料Aは、図1の模式図に示した凹形状を有した鋳型材料である。L1及びL2の各長さが200μm、D1及びD2の各長さが100μm、凹部の深さH1が200μmである。
鋳型材料Bは、図2の模式図に示した凸形状を有した鋳型材料である。L3、L4、D3、D4の各長さ及び凸部の高さH3がいずれも200μmである。
鋳型材料Cは、図2の模式図に示した凸形状を有した鋳型材料である。L3、L4、D3、D4の各長さ及び凸部の高さH3がいずれも100μmである。
鋳型材料Dを構成する素材は、ポリジメチルシロキサンである。鋳型材料Dは、Siモールド(平面視1辺30mmの正方形)に前述のポリジメチルシロキサンを流し込み、既知の条件で硬化させることにより作製した。得られた鋳型材料Dは、その平面上の中央部にパターン形状として、図2の模式図に示した凸形状(L3、L4、D3、D4の各長さ及び凸部の高さH3がいずれも200μm)が1辺10mmの正方形内に施されたものである。
ティラピアの鱗から製造された多木化学(株)製「セルキャンパス FD-08G」(凍結乾燥品)をpH3のHCl溶液に溶解した後、コラーゲン濃度1.1%、pH3に調整して、無色透明の可溶化コラーゲン水溶液を得た。
ガス透過性を有さないシリコン板上に、凹形状を有する領域が上向きとなるように鋳型材料Aを設置した。ここで、鋳型材料Aの設置場所は、シリコン板に設けた穴の上である。なお、当該穴は鋳型材料Aよりも一回り小さいものである。更に、このシリコン板上に、鋳型材料Aを取り囲むシリコン枠を設置し、ここに、可溶化コラーゲン水溶液の9容量部と、10倍濃度のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)の1容量部とを混合したゲル形成用コラーゲン水溶液(水飴状)0.78mLを流し込んだ。なお、ゲル形成用コラーゲン水溶液の流し込み時は、シリコン板の下面から穴を介して油回転式真空ポンプを用いて脱気操作をおこなって陰圧状態とした。
ゲル形成用コラーゲン水溶液の流し込み完了後、脱気操作を終了した。その後、25℃で12時間保持して線維化コラーゲンゲルを得た。次いで、線維化コラーゲンゲルを鋳型材料Aから取り外した。鋳型材料Aからの取り外しは容易であり、また、鋳型材料Aには何らの付着物もなかった。
線維化コラーゲンゲルの鋳型材料Aと接触した面を実体顕微鏡で観察したところ、鋳型材料Aの各凹部に対応する箇所に、約100μmの高さで山状の凸形状が形成されていたことを確認した。
鋳型材料として、形状は鋳型材料Aと同形状であるが、素材がステンレス製のものを用いた。脱気操作を行わなかった以外は、実施例1と同様にして線維化コラーゲンゲルを得た。鋳型材料からの線維化コラーゲンゲルの取り外しは容易であった。
線維化コラーゲンゲルの鋳型材料と接触した面を確認したが、ほぼ平面な形状であり、鋳型材料の形状が反映されたものではなかった。
鋳型材料として、鋳型材料Bを用いた。実施例1と同様にして線維化コラーゲンゲルを得たが、鋳型材料Bの凸部と凸部の間の窪み部にゲル形成用コラーゲン水溶液が容易に入り込んだため、脱気操作は行わなかった。鋳型材料Bからの線維化コラーゲンゲルの取り外しは容易であり、また、鋳型材料Bには何らの付着物もなかった。
線維化コラーゲンゲルの鋳型材料Bと接触した面を確認したところ、鋳型材料Bの形状がほぼそのまま反映された線維化コラーゲンゲル、すなわち、凹形状を付与された線維化コラーゲンゲルであることを確認した。
鋳型材料Cを用いた以外は、実施例2と同様にして、線維化コラーゲンゲルを得た。なお、鋳型材料Cにおいても、凸部と凸部の間の窪み部にゲル形成用コラーゲン水溶液が容易に入り込んだため、脱気操作は行わなかった。また、鋳型材料Cからの線維化コラーゲンゲルの取り外しは容易であり、また、鋳型材料Cには何らの付着物もなかった。
線維化コラーゲンゲルの鋳型材料Cと接触した面を確認したところ、鋳型材料Cの形状がほぼそのまま反映された線維化コラーゲンゲル、すなわち、凹形状を付与された線維化コラーゲンゲルであることを確認した。
鋳型材料として、鋳型材料Dを用いた。パターン形状が形成された領域が上向きとなるように設置した鋳型材料Dの上に、中央部に穴を設けたシリコン板(厚さ2.5mm)を載置した。この穴は直径19mmの円形であり、穴の中心部分に鋳型材料Dのパターン形状が配置されるようにした。
次に、上記穴に対し、可溶化コラーゲン水溶液の9容量部と10倍濃度のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)の1容量部とを混合したゲル形成用コラーゲン水溶液を0.78mL流し込んだ。鋳型材料Dの凸部と凸部の間の窪み部にゲル形成用コラーゲン水溶液が容易に入り込んだため、脱気操作は行わなかった。その後、25℃で12時間保持して線維化コラーゲンゲルを得た。鋳型材料Dからの線維化コラーゲンゲルの取り外しは容易であり、また、鋳型材料Dには何らの付着物もなかった。
線維化コラーゲンゲルの鋳型材料Dと接触した面を確認したところ、鋳型材料Dの形状がほぼそのまま反映された線維化コラーゲンゲル、すなわち、凹形状を付与された線維化コラーゲンゲルであることを確認した。
次に、この線維化コラーゲンゲルをD-PBS中に浸漬した状態で25kGyのγ線照射により架橋した。
細胞培養基材として、実施例4の凹形状を付与された線維化コラーゲンゲルを用いて、以下の手順により、細胞培養方法を実施した。なお、角化細胞(Keratinocyte)として、新潟大学歯学部倫理委員会の承認を受けて実験に使用している、新潟大学医歯学総合病院の口腔外科を受診した患者の口腔粘膜上皮由来の初代培養細胞を用いた。
12wellプレートに、細胞培養基材を収容した。なお、凹形状を有する面を上面とした。これを1 wellあたり1μg/μLのIV型コラーゲン溶液25μLとD-PBS 500μLの混合液でコーティングした後、4℃で一晩静置した。
(Day 1)
角化細胞の細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液を、1×106cells/wellとなるように、細胞培養基材の表面に播種した。培地は、EDGS(EpiLfe Defined Growth Supplement) を添加したEpiLife(登録商標、Thermo Fisher Scientific)high Ca++(1.2mM)培地5.5mLを用い、液相培養(Submerged Culture)にて培養4日目(Day 4)まで毎日培地交換した。
(Day 4)
気相-液相培養(air-liquid interface culture)に移行し、EDGSを添加したEpiLife(登録商標、Thermo Fisher Scientific)high Ca++(1.2mM)培地10mLで1日おきに培地交換した。当該培養を培養11日目(Day 11)まで継続した。
(Day 11)
得られた培養組織を、4%パラホルムアルデヒドに一晩浸漬(4℃)することにより固定した。
その後、パラフィン包埋したものに常法によるヘマトキシリン・エオジン(HE)染色を施して、光学顕微鏡による形態観察に供した。
21・・・基準面
31・・・凹部
33・・・凸部
Claims (6)
- その表面の少なくとも一部に凹形状及び/又は凸形状を有する線維化コラーゲンゲルを作製するための鋳型材料であって、下記(1)と(2)の両方の特性を有する、鋳型材料。
(1)上記鋳型材料が、ガス透過性、疎水性及び柔軟性を有する素材で構成されたものである。
(2)上記鋳型材料が、その表面の少なくとも一部に、凹部の深さが50~500μmである凹形状及び/又は凸部の高さが50~500μmである凸形状を有する領域を備えたものであり、一つの凹部又は一つの凸部の平面視面積が50μm 2 ~1×10 6 μm 2 である。 - 上記鋳型材料を構成する素材が、ポリジメチルシロキサンである請求項1に記載の鋳型材料。
- 上記鋳型材料を構成する素材のガス透過性が、10barrer以上である請求項1又は2に記載の鋳型材料。
- 上記鋳型材料を構成する素材の水接触角が、90°以上である請求項1から3のいずれか1項に記載の鋳型材料。
- 上記鋳型材料を構成する素材のヤング率が、0.01GPa以上10GPa以下である請求項1から4のいずれか1項に記載の鋳型材料。
- 請求項1から5のいずれか1項に記載の鋳型材料を用いて、その表面の少なくとも一部に凹形状及び/又は凸形状を有する線維化コラーゲンゲルを作製する方法。
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Acta Biomaterialia,Vol.49,2017年,pp.204-217 |
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