JP7159229B2 - 診断アッセイで使用するための改善されたｒｅｐタンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、例えば多発性硬化症（ＭＳ）などの神経変性疾患の診断に使用するためのＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質の検出および定量化に関する。特に、本発明は、変異体ＭＳＢＩ１ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質に関する。
多発性硬化症（ＭＳ）の病因は解決されていない。したがって、ＭＳの診断および／またはＭＳのモニタリング、あるいはＭＳの治療および／またはＭＳの素因の評価に使用することができるＭＳのバイオマーカーに対する需要がある。
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄の神経細胞に損傷を与えるＭＳ病変の脱髄を特徴とする。ＭＳの症状は、突然の悪化のエピソード（再発、悪化、発作、発病）として、または経時的な悪化（進行性形態）として起こる。脱髄は炎症プロセスを開始し、Ｔ細胞とサイトカインおよび抗体の放出を引き起こす。ＭＳの診断には、とりわけ、神経画像、脳脊髄液および誘発電位の分析が使用される。
１７種類が異なるが部分的に関連するＤＮＡ分子のスペクトルが、さまざまな試験材料（多発性硬化症（ＭＳ）脳組織、ウシ血清、ミルク）から単離された（Ｆｕｎｋ、Ｇｕｎｓｔら、２０１４年、Ｇｕｎｓｔ、Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎら、２０１４年、Ｌａｍｂｅｒｔｏ、Ｇｕｎｓｔら、２０１４年、Ｗｈｉｔｌｅｙ、Ｇｕｎｓｔら、２０１４年）。
これらの単離物のうち、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）関連単離物Ｓｐｈｉｎｘ １．７６（１，７５８ｂｐ、受託番号ＨＱ４４４４０４、（Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ Ｌ．２０１１））と密接に関連する２つのＤＮＡ分子が、ＭＳ患者の脳組織から単離された。これらの単離物は、ＭＳＢＩ１．１７６（ＭＳＢＩ、多発性硬化性脳単離物）（１，７６６ ｂｐ）およびＭＳＢＩ２．１７６（１，７６６ ｂｐ）であり、それぞれ「ＭＳＢＩ１ゲノム」および「ＭＳＢＩ２ゲノム」と呼ばれる。ＭＳＢＩ１，１７６は、Ｓｐｈｉｎｘ １．７６の配列と９８％のヌクレオチド類似性を共有している。単離物の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、それらの間で高い類似性を共有する推定ＤＮＡ複製タンパク質をコードする。別の共通する特徴は、イテロン様タンデム反復の存在である。この反復領域のアラインメントは、単一ヌクレオチドのコアの変動を示している。このイテロン様反復は、Ｒｅｐタンパク質の結合部位を構成する可能性がある。単離物の配列は、受託番号ＬＫ９３１４９１（ＭＳＢＩ１．１７６）およびＬＫ９３１４９２（ＭＳＢＩ２．１７６）（Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｃら、２０１４年）でＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されており、国際公開第２０１６／００５０６４号に並べられ、記載されている。
本発明者らは最近、野生型ＭＳＢＩ１ゲノムが転写ＲＮＡの顕著な産生を示し、ＭＳＢＩ１ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質がヒト細胞で発現されることを見出した。本発明者らは、野生型ＭＳＢＩ１およびＭＳＢＩ２ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ ＲｅｐおよびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）が病原性スクリーニングアッセイのバイオマーカーであることを見出した。ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）として、Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡ結合活性を有し、エピソームまたはウイルスＤＮＡ分子の複製の開始に不可欠である可能性がある。しかし、野生型ＭＳＢＩ１および２ゲノムにコードされたＲｅｐに構造的に類似したＲｅｐタンパク質は、自己オリゴマー化および凝集の顕著な可能性を示している。
診断スクリーニングアッセイでは、野生型Ｒｅｐタンパク質抗原ＭＳＢＩ１ ＲｅｐおよびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐを精製し、変性条件下およびタンパク質の凝集または分解の影響を最小限に抑える還元条件下で保存した。残念ながら、本発明者らは、非変性条件下で野生型ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質を先に精製することは、実際に、Ｒｅｐタンパク質を親和性精製することができないようにする、大規模で目に見えるタンパク質凝集を示したことを観察した。非常に短い時間スケール（数時間）内に凝集された、残りの非常に少量の精製Ｒｅｐタンパク質は、タンパク質をさらなる診断アッセイに対して不適切にする。これは、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐと類似するＲｅｐタンパク質の凝集を記載した以前の研究と一致している（Ｇｉｒａｌｄｏ ２００７年、Ｔｏｒｒｅｉｒａ、Ｍｏｒｅｎｏ－Ｄｅｌ Ａｌａｍｏら、２０１５年）。
診断スクリーニングアッセイでは、血液サンプル中の抗原結合抗体の検出に使用されるタンパク質抗原の安定性および完全性が、このような敏感な実験の再現性および信頼性にとって最も重要である。この点で、長期保存中のタンパク質抗原の保存期間だけでなく、診断スクリーニングアッセイ自体（コーティング、ブロッキング、洗浄、検出抗体インキュベーションのステップ）の間の生物物理的挙動もアッセイの成功にとって極めて重要である。しかし、野生型Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ ＲｅｐおよびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ）の観察された凝集挙動を考慮すると、野生型Ｒｅｐｓのような凝集および自己オリゴマー化特性を有しない、改良されたＲｅｐタンパク質が必要である。
本発明者らは、変異体タンパク質により、上記の負の特性を回避できることを見出した。本発明は、それぞれの野生型タンパク質と比較して少なくとも２つの点変異を有し、病原性スクリーニングアッセイのバイオマーカーを表す、変異体ＭＳＢＩ１ ＲｅｐおよびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質を提供する。合成ＭＳＢＩ１およびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１（ＭＳＢＩ１．１７６）および配列番号８（ＭＳＢＩ２．１７６）に示すように、野生型（ｗｔ）ＭＳＢＩ１およびＭＳＢＩ２ゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質に由来する変異体である。合成変異体ＭＳＢＩ１およびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質は、尿素貯蔵バッファーにおいても、インビトロ条件下でＲＥＰタンパク質のより高い安定性およびより少ない凝集を提供する。合成変異体ＭＳＢＩ１およびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質は、診断スクリーニングアッセイで使用するための野生型ＭＳＢＩ１およびＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質として、安定した抗原である。
抗Ｒｅｐ抗体は、単離ＤＮＡ（例えば、ＭＳＢＩ１）薬剤の病原性活性とＲｅｐタンパク質発現との関連性のために、病原性マーカーとして使用される。抗Ｒｅｐ抗体の量が増加した患者の血清は、対応する患者がＲｅｐ関連タンパク質に確実に曝露されたか、Ｒｅｐ特異的免疫応答を開始するのに十分な期間にわたってＲｅｐを発現したことを示している。ヒト抗体の標的として、Ｒｅｐタンパク質が抗原として使用される。抗Ｒｅｐ抗体の量の定量化に基づいて、急性ＭＳおよびＭＳの素因を診断またはモニタリングすることができる。サンプル中の誘導抗Ｒｅｐ抗体または発現Ｒｅｐタンパク質の量が増加することは、ＭＳの発症および／または状態を示すことが認識されているため、抗Ｒｅｐ抗体およびＲｅｐタンパク質の量が増加することは、それぞれ、ＭＳを診断するための病原性バイオマーカーとして使用することができる。
有利なことに、ＭＳの病原性バイオマーカーは、血清または血漿サンプルなどの血液サンプルで検出でき、脳脊髄液からサンプルを取得する必要はない。
したがって、本発明は、（ｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１１のフラグメント、または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含むＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質を提供する。
さらに、本発明は、（ｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる配列番号１２のフラグメント、または
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有し、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるアミノ酸配列を含むＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質を提供する。
本発明のＲｅｐタンパク質は、抗体または細胞性免疫応答を検出するために既知の抗原を使用する、実質的に任意のアッセイ形式で使用することができる。したがって、本発明はまた、Ｒｅｐタンパク質に対する細胞性免疫応答、例えば、Ｔ細胞免疫応答の検出を包含する。
特定の実施形態では、本発明は、被験体の神経変性疾患を診断する方法を提供し、
（ａ）被験体からのサンプルを、上記に定義されるようなＲｅｐタンパク質と共にインキュベートし、
（ｂ）Ｒｅｐタンパク質と免疫複合体を形成する被験体からのサンプル中の抗体の量を検出し、および
（ｃ）対照サンプル中の量と比較して、Ｒｅｐタンパク質に結合した抗体の量を神経変性疾患の診断と相関させるステップを含む。
特定の実施形態では、本発明は、被験体のＭＳを診断する方法を提供し、
（ａ）被験体からのサンプルを、Ｒｅｐタンパク質と共にインキュベートし、
（ｂ）Ｒｅｐタンパク質と免疫複合体を形成する被験体からのサンプル中の抗体の量を検出し、および
（ｃ）対照サンプル中の量と比較して、Ｒｅｐタンパク質に結合した抗体の量をＭＳの診断と相関させるステップを含む。
対照サンプル中の抗Ｒｅｐ抗体量と比較して、被験体からのサンプル中の抗Ｒｅｐ抗体の量が増加することは、神経変性疾患、例えばＭＳの診断と相関し、すなわち、ＭＳを示す。特定の実施形態では、神経変性疾患、例えばＭＳの診断または神経変性疾患、例えばＭＳの素因は、対照サンプルと比較して抗Ｒｅｐ抗体の量が少なくとも２倍増加することにより示される。
特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質を固定化し、例えば、支持体または担体に付着させ、続いて、固定化Ｒｅｐタンパク質を被験体のサンプルと共にインキュベートする。
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は細胞内で発現し、続いて、細胞を被験体からのサンプルと共にインキュベートする。
特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質と免疫複合体を形成する抗体の量を、免疫複合体の抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるシグナル生成化合物に結合した追加的な結合剤、例えば検出可能に標識された二次抗体、好ましくは抗ヒト抗体によって定量する。
他の実施形態では、被験体からのサンプル中の抗体を固定化し、続いて、規定量のＲｅｐタンパク質と共にインキュベートする。
好ましくは、被験体からのサンプルおよび対照サンプルは、血清または血漿サンプルなどの血液サンプルである。
さらに、本発明者らは、配列番号１または１１のアミノ酸１～１３６、１３７～２２９および２３０～３２４からなる群から選択されるアミノ酸配列内にあるエピトープに結合する抗Ｒｅｐ抗体を産生した。例えば、抗体は、配列番号２または配列番号３に含まれるエピトープに結合する。
さらなる実施形態では、本発明は、（ａ）Ｒｅｐタンパク質ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４ＥまたはＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ、（ｂ）シグナル生成化合物に結合した追加的な結合剤、例えば検出可能な標識に結合し、本発明による抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる抗ヒト抗体、および（ｃ）（ａ）によるＲｅｐタンパク質または抗Ｒｅｐ抗体を固定化するのに適した固体マトリックス、補助抗体は、サンプル中、特に血清または血漿サンプル中に存在することが考えられることを含む、ＭＳの診断に使用するキットを提供する。
特定の実施形態では、キットは、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）およびストリップアッセイからなる群から選択される免疫測定法で使用するために構成される。
Ｒｅｐタンパク質を、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ野生型（ＷＴ）または変異体ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４ＥのいずれかをコードするｐｃＤＮＡ３．１（－）プラスミドを使用したＨＥＫ２９３ＴＴの７２時間にわたる一過性トランスフェクションにより過剰発現させた。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭイミダゾール、５ｍＭベータメルカプトエタノール、１ｘプロテイナーゼ阻害剤ミックス）で超音波処理した。インキュベーション（３０分、４℃）および遠心分離（３０分、１０，０００ｇ、４℃）の後、１ｍｌの平衡化Ｎｉ－ＮＴＡビーズ（クロンテック社）にタンパク質を結合させ、１０カラム容量の洗浄バッファー（５５ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）で洗浄し、溶出（３００ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー）することにより、非変性タンパク質精製を行った。ＮａｎｏＤｒｏｐおよびＢｒａｄｆｏｒｄによるタンパク質の定量後、等量のタンパク質（レーンあたり５００ｎｇ）を、５ｍＭベータメルカプトエタノールを含む（還元）または含まない（酸化）のＬａｍｍｌｉバッファーで煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗Ｒｅｐ抗体を用いたウェスタンブロッティングで分析した。 Ｒｅｐタンパク質を上記の非変性条件下で精製した。２０００ｎｇのＲｅｐタンパク質をＢＮ－ＰＡＧＥ（Ｓｅｒｖａ社）に供し、抗Ｒｅｐ免疫検出またはタンパク質銀染色のいずれかで染色した。 Ｒｅｐタンパク質を変性条件下で大腸菌から精製した（プロトコルは以下を参照）。２μｇ（ウェスタンブロット）または５μｇ（クーマシー染色）の精製ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ｗｔまたは変異体ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅのいずれかを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後の抗Ｒｅｐ免疫検出またはクーマシータンパク質染色によって特徴付けた。 Ｒｅｐタンパク質を変性条件下で大腸菌から精製した（プロトコルは以下を参照）。５μｇのＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ｗｔまたは変異体ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４ＥをＢＮ－ＰＡＧＥおよび抗Ｒｅｐ免疫検出に使用した。 ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）は、精製変性ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ｗｔまたは変異体ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅのいずれかで、１ｘＰＢＳ／８ Ｍ尿素の１：１希釈（ウェルあたり２００ｎｇタンパク質）で４℃で一晩、三重にコーティングした。ブロッキングは、異なるアッセイバッファー（カゼイン、スーパーブロック、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）でＲＴで２時間行った。コーティングタンパク質を、一次抗体として３つのマウスモノクローナル抗Ｒｅｐ抗体のプール（１：５００希釈、Ｎ、中央、およびＣ末端Ｒｅｐドメイン内のエピトープ）で定量し、続いて、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（１：５０００希釈、それぞれ３７℃で１時間、ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、サーモフィッシャーサイエンティフィック社からのＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質、４５０ｎｍで読み出し）と共にインキュベートした。生のシグナル強度を示す。 ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）は、精製変性ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ｗｔまたは変異体ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅのいずれかで、１ｘＰＢＳ／８ Ｍ尿素の１：１希釈（ウェルあたり２００ｎｇタンパク質）で４℃で一晩、コーティングした。ブロッキングは、スーパーブロックアッセイバッファーでＲＴで２時間行った。血清インキュベーション（スーパーブロックバッファーで１：５００）は、３７℃で１時間行った。Ｒｅｐ結合ヒトＩｇＧ抗体を、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト二次抗体（１：５０００希釈、３７℃で１時間）で二重分析で定量した（ＰＢＳ ０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄、サーモフィッシャーサイエンティフィック社からのＴＭＢ ＥＬＩＳＡ基質、４５０ｎｍで読み出し、ＢＳＡ対照に標準化したシグナル）。
本発明は、変異体Ｒｅｐタンパク質および病原性マーカーとしての抗Ｒｅｐ抗体の存在についての診断スクリーニングアッセイを提供する。抗Ｒｅｐ抗体の量が増加したサンプルは、対応する被験体がＲｅｐ関連タンパク質に確実に曝露されたか、Ｒｅｐタンパク質特異的免疫応答を誘発するのに十分な期間にわたってＲｅｐタンパク質を発現したことを示している。そのようなスクリーニングアッセイにより、抗Ｒｅｐ抗体の定量に基づいたＭＳの診断、予後およびモニタリングを行うことができる。
本明細書で使用される「Ｒｅｐタンパク質」は、ＤＮＡ複製関連タンパク質（ＲｅｐＢ）を指す。Ｒｅｐタンパク質はＤＮＡ結合活性を含み、エピソーム／ウイルスＤＮＡ分子の複製の開始に不可欠である可能性がある。一般的に、Ｒｅｐタンパク質は、Ｓｍａｌｌ Ｓｐｈｉｎｘゲノムの群からのＲｅｐタンパク質を指す（Ｗｈｉｔｌｅｙら、２０１４年）。特に、Ｒｅｐタンパク質は、合成されたゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４ＥおよびＭＳＢＩ２ゲノムにコードされたＲｅｐ ２７／１５４Ｅタンパク質である。好ましくは、合成ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する受託番号ＬＫ９３１４９１でＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されたＭＳＢＩ１．１７６に由来し、あるいは合成Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有し、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する受託番号ＬＫ９３１４９２でＥＭＢＬ Ｄａｔａｂａｎｋに寄託されたＭＳＢＩ２．１７６に由来する。
特定の好ましい実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、配列番号１１または１２のアミノ酸１～２２９から本質的になるｓｍａｌｌ Ｓｐｈｉｎｘゲノム間で保存されたＮ末端領域と、配列番号１１のアミノ酸２３０～３２４から本質的になるＭＳＢＩ１．１７６に特異的なＣ末端可変領域または配列番号１２のアミノ酸２３０～３２４から本質的になるＭＳＢＩ２．１７６に特異的なＣ末端可変領域とを含む。Ｎ末端保存領域は、配列番号１、８、１１および１２のアミノ酸１～１３６から本質的になる第１の推定ＤＮＡ結合ドメイン、および配列番号１、８、１１および１２のアミノ酸１３７～２２９から本質的になる第２の推定ＤＮＡ結合ドメインを含む。
「Ｒｅｐタンパク質」はまた、配列番号１１または１２のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができるタンパク質のフラグメントおよび変異体を包含する。好ましくは、そのようなフラグメントは、配列番号１１または配列番号１２のＲｅｐタンパク質に対する抗Ｒｅｐタンパク質抗体の少なくとも１つのエピトープを包含する配列番号１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性フラグメントであり、好ましくは、少なくとも７、８、９、１０、１５、２０、２５または５０の連続アミノ酸を含む。特定の実施形態では、フラグメントは、Ｒｅｐタンパク質のドメイン、例えば、Ｎ末端保存領域、Ｃ末端可変領域、第１または第２のＤＮＡ結合ドメインを含むか、または本質的にそれらからなる。配列番号１１または配列番号１２のタンパク質の変異体は、配列番号１１または配列番号１２と比較して１つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換または付加を含み、配列番号：１１または配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、変異体は、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質に特異的な抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる。変異体の定義には、例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）を含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、ならびに天然および非天然両方の当技術分野で公知の他の修飾が含まれる。用語Ｒｅｐタンパク質には、異種アミノ酸配列、リーダー配列、またはタグ配列などを有する融合タンパク質が含まれる。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、例えば、Ｈｉｓ６タグ（配列番号４）、Ｔ７タグ（配列番号５）、ＦＬＡＧタグ（配列番号６）およびＳｔｒｅｐ－ＩＩタグ（配列番号７）からなる群から選択されるタグ配列と融合することができる。
上記に定義されるようなＲｅｐフラグメントおよびＲｅｐ変異体を含む、本発明の合成ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ）またはＭＳＢＩ２ Ｒｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ）は、古典的な化学合成により調製することができる。合成は、均一溶液または固相で行うことができる。本発明によるポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。例えば、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅは、残基２５－３１（ＬＬＩＬＬＡＩＩ）と残基１５１－１５５（ＬＬＩＣＷ）との間の２つのアミノ酸配列の凝集能が、２つの単一点変異によって最小化されるように改変された。クローニングの基礎は、元のＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ一次アミノ酸配列をコードするヒト系でのＲｅｐ発現のためにコドン最適化されたＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ＤＮＡ配列であった。アミノ酸２７（Ｌ、ロイシン、ＤＮＡコドンＣＴＡ）をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸１５４（Ｃ、システイン、ＤＮＡコドンＴＧＴ）をコードするヌクレオチドは、最終的なＤＮＡ配列番号：１１に等しいアミノ酸グルタミン酸（Ｅ、ＤＮＡコドンＧＡＧ）をコードするヌクレオチドで置換された。このＲｅｐ二重変異体の正味の凝集能は、非凝集性タンパク質の範囲内にあるスコア１４１まで最小化された。
例（図２、３）に示すように、Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ変異体は、野生型Ｒｅｐタンパク質と比較した場合、Ｒｅｐオリゴマーおよびより大きな凝集体の有意な減少（５０％超）を示した。ウェスタンブロッティングはまた、Ｒｅｐオリゴマーが有意に少なく、高分子量の凝集体がより少ないことを示した（図４）。最も明らかな単量体Ｒｅｐタンパク質のさらなる種は、Ｒｅｐ変異体についてのみ、ネイティブＰＡＧＥ条件下で検出された。明らかに、２７／１５４Ｅ Ｒｅｐ二重変異体では、高分子量凝集体の強度が有意に低下している。一般に、Ｒｅｐ凝集体の存在は、非変性条件下で精製されたタンパク質の方が高くなる。いずれにしても、変性条件下で精製および保存されたタンパク質はまた、非常に強い凝集を示し、Ｒｅｐ二重変異体に対して有意に減少する。抗体抗原結合が天然の条件を必要とするため、ＥＬＩＳＡの実験セットアップは表面結合タンパク質抗原の再生に依存するので、これは特に興味深いものである。
野生型Ｒｅｐタンパク質は、古典的な化学合成によって調製することができる。合成は、均一溶液または固相で行うことができる。本発明によるポリペプチドはまた、組換えＤＮＡ技術により調製することができる。野生型Ｒｅｐタンパク質の産生および精製の例を、例１に示す。
本明細書で使用される「被験体」は、マウス、畜牛、例えばウシ属、サルおよびヒトを含む哺乳動物個体または患者を指す。好ましくは、被験体はヒト患者である。
本明細書で使用される「サンプル」は、液体および固体サンプルを含む生物学的サンプルを指す。液体サンプルには、例えば血清および血漿などの血液液ならびに脳脊髄液（ＣＳＦ）が含まれる。固体サンプルには、組織培養または生検標本などの組織サンプルが含まれる。
本明細書で使用される「相関する」とは、例えば、ＭＳの疾患状態と有意な相関を有する抗Ｒｅｐ抗体およびＲｅｐタンパク質の量、すなわちレベルまたは力価をそれぞれ指す。相関は、試験される被験体サンプルおよび対照サンプルに存在する量の差の程度を検出することにより決定される。「対照サンプル」とは、単一のサンプル、またはさまざまな、すなわち３つ以上の対照サンプルの平均を意味する。対照は、ＭＳと診断されていない健康な個体から取得される。また、相関は、所定のカットオフ値で、試験される被験体のサンプルに存在する量の差の程度を検出することにより理論的に決定することができる。カットオフ値は、例えば健康状態と疾患状態との間の異なる疾患状態間で統計的に有意な分離を有する基準値である。カットオフ値は、当技術分野で公知の統計的試験により、病歴のある患者からの試験サンプルおよび健康な試験群からのサンプルの十分に大きいパネルの統計的分析によって決定することができる。
特定の実施形態では、例えばＭＳの診断は、対照サンプルと比較して、被験体からのサンプル中のタンパク質の量、すなわちＲｅｐタンパク質およびＡｎｔｉ Ｒｅｐ抗体の量が、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍または１０００倍増加したことにより示される。
本明細書で使用される「抗Ｒｅｐ抗体」は、本発明の方法において、Ｒｅｐタンパク質に対する検出可能なレベルで結合する抗体を指し、この親和性は、非Ｒｅｐタンパク質よりも本発明のＲｅｐタンパク質に対してより強力である。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質に対する抗原親和性は、バックグラウンド結合よりも少なくとも２倍大きい。特に、抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号１または１１のアミノ酸配列を有するＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、あるいは配列番号８または１２のアミノ酸配列を有するＭＳＢＩ２ Ｒｅｐに特異的である。特定の実施形態では、抗体は、ＭＳＢＩ１ ＲｅｐまたはＭＳＢＩ２ Ｒｅｐに対して交差特異的である。
すべてのアッセイに共通する特徴は、Ｒｅｐタンパク質が、サンプル中に存在するそのような抗体に結合することを可能にする条件下で、抗Ｒｅｐタンパク質抗体を含むと疑われるサンプルと接触することである。そのような条件は、典型的には、過剰のＲｅｐタンパク質を使用する生理学的温度、ｐＨおよびイオン強度である。Ｒｅｐタンパク質とサンプルとのインキュベーションに続いて、抗原からなる免疫複合体を検出する。特定の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、シグナル生成化合物、例えば検出可能な標識に結合し、またはシグナル生成化合物に結合した追加的な結合剤、例えば二次抗ヒト抗体は、免疫複合体を検出するために使用される。
抗Ｒｅｐ抗体は、タンパク質抗原としてＲｅｐタンパク質に基づくアッセイにおいて検出および定量することができ、このアッセイは、サンプル中で疑われる哺乳動物、例えばヒト抗体に対する標的として機能する。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質を精製し（例えば、例１を参照）、サンプルは、例えば、血清または血漿サンプルであってもよい。この方法には、Ｒｅｐタンパク質のマトリックスへの固定化と、それに続く固定化Ｒｅｐタンパク質のサンプルとのインキュベーションが含まれる。最後に、Ｒｅｐタンパク質とサンプルの抗体との間に形成された免疫複合体のＲｅｐ結合抗体を、シグナル生成化合物に結合した検出結合剤、例えばＨＲＰ－基質ベースの定量化が可能な二次ＨＲＰ－（西洋ワサビペルオキシダーゼ）結合検出抗体により定量する。このシグナル生成化合物または標識は、それ自体が検出可能であるか、または追加的な化合物と反応して検出可能な産物を生成することができる。
他の実施形態では、抗Ｒｅｐ抗体は、最初にサンプルの抗体がマトリックスに固定化され、続いて、規定量のＲｅｐタンパク質と共にインキュベートされ、マトリックス上に固定化され存在する抗Ｒｅｐ抗体が、タンパク質－サンプル液体混合物からのＲｅｐタンパク質を捕捉し、続いて、結合Ｒｅｐタンパク質を定量化することにより、間接的に定量化される。
他の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質を細胞内で発現させることができ、これらの細胞はサンプルとともにインキュベートされる。その後、細胞によって発現されたＲｅｐタンパク質に結合したサンプルからの抗Ｒｅｐ抗体が検出され、定量化される。
イムノアッセイの設計には、非常に多くのバリエーションがあり、多くの形式が当技術分野で公知である。プロトコルは、例えば、固体支持体または免疫沈降を使用することができる。ほとんどのアッセイは、シグナル生成化合物に結合した結合剤、例えば標識抗体または標識Ｒｅｐタンパク質の使用を伴い、標識は、例えば、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であってもよい。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイも公知であり、その例は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンを利用するアッセイ、ならびにＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識および媒介免疫アッセイである。
イムノアッセイは、異種または同種の形式、および標準または競合型であってもよい。異種形式では、ポリペプチド（Ｒｅｐタンパク質または抗Ｒｅｐ抗体）は、典型的には、固体マトリックスまたは支持体または担体に結合して、インキュベーション後のポリペプチドからのサンプルの分離を促進する。使用できる固体支持体の例は、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）、ポリフッ化ビニリデン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎとして公知）、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、プロテインＡビーズである。抗原性ポリペプチドを含む固体支持体は、典型的には、試験サンプルから分離した後、結合した抗Ｒｅｐ抗体を検出する前に洗浄する。標準形式および競合形式の両方が当技術分野で公知である。
均一な形式では、試験サンプルを、溶液中のＲｅｐタンパク質と共にインキュベートする。例えば、形成されるＲｅｐタンパク質－抗体複合体を沈殿させる条件下であってもよい。これらのアッセイの標準形式および競合形式の両方が当技術分野で公知である。
標準形式では、抗体－Ｒｅｐタンパク質複合体中の抗Ｒｅｐ抗体の量を直接モニタリングする。これは、抗Ｒｅｐ抗体上のエピトープを認識する（標識）抗異種（例えば、抗ヒト）抗体が複合体の形成により結合するかどうかを決定することで達成することができる。競合形式では、サンプル中の抗Ｒｅｐ抗体の量は、複合体中の既知量の標識抗体（または他の競合リガンド）の結合に対する競合効果をモニタリングすることにより推定される。
抗Ｒｅｐ抗体（または競合アッセイの場合、競合抗体の量）を含む形成された複合体は、形式に応じて、多くの既知の技術のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の非標識抗Ｒｅｐ抗体は、標識（例えば、ＨＲＰなどの酵素標識）と複合体化された抗異種Ｉｇコンジュゲートを使用して検出することができる。
免疫沈降または凝集アッセイ形式では、Ｒｅｐタンパク質と抗Ｒｅｐ抗体との反応により、溶液または懸濁液から沈殿するネットワークが形成され、沈殿物の目に見える層またはフィルムが形成される。サンプルに抗Ｒｅｐ抗体が存在しない場合、目に見える沈殿物は形成されない。
選択された固相には、ポリマーまたはガラスビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレイのマイクロウェル、試験管、および磁気ビーズを含むことができる。シグナル生成化合物は、酵素、発光化合物、色素原、放射性元素および化学発光化合物を含むことができる。酵素の例には、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびベータガラクトシダーゼが含まれる。エンハンサー化合物の例には、ビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが含まれる。メンバーに結合するエンハンサー化合物の例には、ビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが含まれる。
さらなる態様では、本発明は、サンプル中のＲｅｐタンパク質の量の増加が、例えばＭＳである神経変性疾患の診断または素因と相関するか、あるいは例えばＭＳである疾患のモニタリング、または例えばＭＳである疾患の治療のモニタリングに使用される方法を提供する。そのような実施形態では、サンプル中のＲｅｐタンパク質は、抗Ｒｅｐ抗体により検出される。
そのような方法は、
（ａ）抗Ｒｅｐ抗体により、被験体からのサンプル中のＲｅｐタンパク質の量の検出し、および
（ｂ）対照サンプルの量と比較した、ステップ（ａ）の被験体からのサンプルで検出されたＲｅｐタンパク質の量を、神経変性疾患、例えばＭＳの診断と相関させるステップを含む。
血清または血漿サンプル中のＲｅｐタンパク質を検出するための、そのような方法で使用することができるアッセイの例には、免疫沈降、免疫蛍光、ドットブロッティングおよびウェスタンブロットが含まれるが、これらに限定されない。
例えば、血清サンプルを抗Ｒｅｐタンパク質抗体と共にインキュベートし、サンプル中のＲｅｐタンパク質を捕捉し、続いて、Ｒｅｐタンパク質の免疫沈降のステップを行い、その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによる検出のステップを行うことができる。
さらなる例では、ドットブロット膜を血清と共にインキュベートし、続いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットのステップを行うことができる。
さらなる例では、サンプルの血清希釈液をＳＤＳ－Ｐａｇｅにロードし、続いて、ウェスタンブロットを行う。
さらなる実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、免疫組織化学的方法または免疫蛍光顕微鏡法により組織サンプルで検出される。
特定の実施形態では、サンプル中のＲｅｐタンパク質を検出または捕捉するために、抗Ｒｅｐ抗体が使用される。
用語「抗体」は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有するプールされたポリクローナル抗体から本質的になる抗体、ならびに別個のモノクローナル抗体調製物に関する。本明細書で使用する場合、用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、無傷の免疫グロブリン分子ならびにＲｅｐタンパク質に特異的に結合することができる抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠いており、より迅速に循環から除去され、無傷の抗体よりも非特異的な組織結合が少ない場合がある。したがって、これらのフラグメント、ならびにＦＡＢまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が好ましい。さらに、本発明の目的に有用な抗体には、キメラ、単鎖、多機能（例えば二重特異性）およびヒト化抗体またはヒト抗体が含まれる。
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、シグナル生成化合物、例えば検出可能な標識を有するシグナル生成化合物に結合している。抗体／フラグメントは、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素で直接または間接的に検出可能に標識することができる。当業者は、抗体と結合する他の適切な標識を知っており、または日常的な実験を使用してそのような標識を確認することができるであろう。
例の部分に示すように、新たに改変された二重Ｒｅｐ変異体は、野生型Ｒｅｐタンパク質と比較した場合、同等のＥＬＩＳＡコーティング性能を示す。さらに、ヒトＭＳ血清中のＲｅｐ反応性抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイで野生型Ｒｅｐと比較した場合、２７／１５４Ｅ Ｒｅｐ二重変異体を抗原として使用すると、平均で約４０％増加した（図６）。
本発明者らはまた、当業者に公知の方法により、配列番号１または配列番号８のアミノ酸配列またはそのフラグメントを有するＲｅｐタンパク質に対する抗Ｒｅｐ抗体を生じさせ（産生し）た。これらの抗Ｒｅｐ抗体は、Ｓｍａｌｌ Ｓｐｈｉｎｘゲノムの群からのいくつかまたはすべての種類のＲｅｐタンパク質（抗Ｓｍａｌｌ－Ｓｐｈｉｎｘ様Ｒｅｐ抗体または抗ＳＳＬＲｅｐ抗体）に結合するために使用される。そのような抗ＳＳＬＲｅｐ抗体は、配列番号１のアミノ酸１～２２９のＲｅｐタンパク質の保存されたＮ末端領域内のエピトープに結合する。配列番号２（配列番号１のアミノ酸３２～４９）または配列番号３（配列番号１のアミノ酸１９７～２１６）内のエピトープに結合する、抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体が使用される。配列番号２および配列番号３のペプチドフラグメントは、Ｓｍａｌｌ Ｓｐｈｉｎｘゲノム群からのＲｅｐタンパク質の間で高度に保存されており、それらの親水性の性質により露出されるようである。抗ＳＳＬＲｅｐ型の抗Ｒｅｐ抗体は、例えば、マウスまたはモルモットを、配列番号２または３に示されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドにより、または、配列番号１のアミノ酸１～２２９の保存されたＮ末端Ｒｅｐタンパク質領域に由来する、少なくとも８～１５個のアミノ酸を含むことが好ましい他の免疫原性フラグメントによって免疫化することにより産生することができる。
そのような抗体は、例えば、マウスまたはモルモットなどの哺乳動物を、配列番号１のアミノ酸配列を有する全長Ｒｅｐタンパク質で免疫化することにより産生されてきた。
これらの抗Ｒｅｐ抗体は、例えば、血液、血清、脊髄液、脳液などのさまざまな種類の体液で、ピコグラムからフェムトグラムまでの範囲のＲｅｐタンパク質を検出することができる。
特定の種類の抗Ｒｅｐ抗体または２種類以上の異なる種類の抗Ｒｅｐ抗体のプールのいずれかを使用することができる。異なる種類の抗Ｒｅｐ抗体のプールを使用する場合、抗Ｒｅｐ抗体プールは、Ｒｅｐタンパク質の異なるドメイン内、例えば、第１のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸１～１３６）、第２のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸１３７～２２９）および／または可変ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸２３０～３２４）、特にＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質（配列番号１）の異なるドメイン内の異なるエピトープに結合する異なる抗Ｒｅｐ抗体を含むことができる。
２つのＤＮＡ結合ドメインでのわずか２つの単一点突然変異および可変ドメインでの同じ配列の維持を考慮すると、これらの抗体はまた、配列番号１１および１２の変異体タンパク質を認識する。
抗Ｒｅｐ抗体によるＲｅｐタンパク質の検出には、例えば、ウェスタンブロット、免疫蛍光顕微鏡法または免疫組織化学的方法などの方法を適用することができる。
抗Ｒｅｐ抗体は、特定の細胞局在性でＲｅｐタンパク質を検出することができる。例えば、抗Ｒｅｐ抗体は、細胞質、核膜および核中のＲｅｐタンパク質を検出するか、細胞質の斑紋を検出することができる。このような抗Ｒｅｐ抗体群の例を表１に示す。
Figure 0007159229000001
Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号３（配列番号１のアミノ酸１９８～２１７）に示されるアミノ酸配列内にエピトープを有し、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、およびＳｍａｌｌ Ｓｐｈｉｎｘゲノム群のこの保存されたエピトープを含むＲｅｐタンパク質（例えば、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）を検出することができる。免疫蛍光アッセイでは、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、特定のＲｅｐ局在性パターンを検出し、主な局在性は、細胞質および核膜にわたって均一に分布し、さらに弱く均一に分布した局在性が核内に見られる。そのようなＡ群の抗体の例は、Ａ群の抗体として例で使用された抗体ＡＢ０１ ５２３－１－１（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７）である。
Ｂ群の抗Ｒｅｐ抗体は、配列番号２（配列番号１のアミノ酸３３～５０）に示されるアミノ酸配列内にエピトープを有し、ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ、およびＳｍａｌｌ Ｓｐｈｉｎｘゲノム群のこの保存されたエピトープを含むＲｅｐタンパク質（例えば、ＭＳＢＩ２、ＣＭＩ１、ＣＭＩ４）を検出することができる。免疫蛍光アッセイでは、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質の斑紋（細胞質凝集）（多くの場合、核膜の周辺部）を特異的に検出する。そのようなＢ群の抗体の例は、Ｂ群の抗体として例で使用されたＡＢ０２ ３０４－４－１（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）と呼ばれる抗体である。
Ｃ群の抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１の構造エピトープ（配列番号１）を特異的に検出する。免疫蛍光アッセイでは、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、特定のＲｅｐ局在性パターンを検出し、主な局在性は、細胞質および核膜にわたって均一に分布し、さらに弱く均一に分布した局在性が核内に見られる。そのようなＣ群の抗体の例は、Ｃ群の抗体として例で使用された抗体ＭＳＢＩ１ ３８１－６－２（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９）である。
Ｄ群の抗Ｒｅｐ抗体は、ＭＳＢＩ１の構造エピトープ（配列番号１）を特異的に検出し、「Ｄ１」と呼ばれる抗体ＭＳＢＩ１ ９６１－２－２は、ＭＳＢＩ１のＣ末端ドメインの配列番号９（アミノ酸２８１～２８７）に示されるエピトープを検出する。「Ｄ２」と呼ばれる抗体ＭＳＢＩ１ ７６１－５－１（ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８）は、インビボ条件下でのみアクセス可能であり、ウェスタンブロットではアクセスできないＭＳＢＩ１の３Ｄ構造エピトープを検出する。免疫蛍光アッセイでは、そのような抗Ｒｅｐ抗体は、Ｒｅｐタンパク質の斑紋（細胞質凝集）（多くの場合、核膜の周辺部）を特異的に検出する。
特定の実施形態では、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ群の抗Ｒｅｐ抗体、あるいはＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤ群の抗Ｒｅｐ抗体の少なくとも２つの異なる組み合わせを使用して、プローブ内のＲｅｐタンパク質の局在性の種類、およびそのようなＲｅｐタンパク質の局在性が病原体機能と相関するかどうかを測定する。例えば、斑紋が存在する場合である。特定の実施形態では、すなわち本発明の方法またはキットでは、ＡおよびＢ群から選択される少なくとも１つの抗Ｒｅｐ抗体は、ＣおよびＤ群から選択される少なくとも１つの抗Ｒｅｐ抗体と組み合わされる。特定の実施形態では、すなわち本発明の方法またはキットでは、Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は、Ｂ、Ｃ、およびＤ群から選択される少なくとも１つのさらなる抗Ｒｅｐ抗体と組み合わされる。例えば、Ａ群の抗Ｒｅｐ抗体は、ＣおよびＤ群のさらなる抗Ｒｅｐ抗体と組み合わせることができる。異なる群の抗Ｒｅｐ抗体のそのような組み合わせは、特にＭＳの診断の診断評価の明確性を向上させる。
以下の抗体は、２０１７年９月２８日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）［微生物および細胞培養のドイツコレクション］に寄託された：
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２７での抗体ＡＢ０１ ５２３－１－１、
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２８での抗体ＡＢ０２ ３０４－４－１、
ＤＳＭ ＡＣＣ３３２９での抗体ＭＳＢＩ１ ３８１－６－２、および
ＤＳＭ ＡＣＣ３３３０での抗体ＭＳＢＩ１ ７６１－５－１。
抗体ＭＳＢＩ１ ９６１－２－２は、２０１７年１０月６日にＤＳＭＺに寄託された。
好ましい実施形態では、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ群の抗Ｒｅｐ抗体、あるいはＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤ群の抗Ｒｅｐ抗体の少なくとも２つの異なる組み合わせを使用して、合成ＭＳＢＩ１ ＲｅｐゲノムにコードされたＲｅｐタンパク質（ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４ＥまたはＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ）を測定する。
さらなる実施形態では、ＭＳの診断に使用するキットが提供される。キットには、抗Ｒｅｐ抗体および／またはＲｅｐタンパク質を検出するための材料と、ＭＳを診断するためのアッセイにおける材料の使用説明書が含まれ得る。キットは、以下の成分の１つまたは複数を含むことができる：本発明によるバイオマーカー、すなわち、それぞれＲｅｐタンパク質および抗Ｒｅｐ抗体、シグナル生成化合物、捕捉剤を付着させるための固体マトリックス、サンプルの希釈液、洗浄バッファー。シグナル生成化合物は、本発明のバイオマーカーに結合することができる追加的な結合剤に結合するか、または本発明のバイオマーカーに直接結合する検出可能な標識を指す。
以下の例により本発明をさらに説明するが、これらに限定されない。
例１：
ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐタンパク質精製
ＭＳＢＩ１ゲノム内で同定された完全長Ｒｅｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヌクレオチド酸分子を、大腸菌高収率無細胞インビトロ翻訳システム（Ｅｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ大腸菌発現システム、インビトロジェン社）に基づくタンパク質発現を可能にする発現プラスミド（ｐＥＸＰ５－ＣＴ、インビトロジェン社）にクローン化する。インビトロ翻訳反応内の配列番号１のアミノ酸配列を有する合成Ｒｅｐタンパク質を、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭイミダゾールを含む２０反応容量の８Ｍ尿素サンプルバッファーｐＨ８．０を加えることにより変性させる。Ｒｅｐタンパク質を、続いて、Ｒｅｐタンパク質に融合したＣ末端Ｈｉｓ６タグに基づいて、変性条件下（洗浄用の２０ｍＭイミダゾールおよびタンパク質溶出用の３００ｍＭイミダゾール）で精製する。精製の品質を、クーマシータンパク質染色および抗Ｒｅｐタンパク質抗体を用いたウェスタンブロッティングにより測定する。Ｒｅｐタンパク質の純度を、密度で算出し、９５％以上である。精製タンパク質は、ＥＬＩＳＡベースの血清スクリーニングに直接使用されるか、ＳＤＳ－Ｐａｇｅに供され、続いて、１Ｄサイズに分割されたＲｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションのためにニトロセルロース膜に転写ブロッティングされるかのいずれかである。
例２：
Ａ． ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを使用した変性条件下での野生型または変異体Ｒｅｐタンパク質の特性評価
精製Ｒｅｐ抗原（野生型および変異体Ｒｅｐ）の特性を、異なる実験セットによって特徴付けた。ヒトＨＥＫ２９３ＴＴ細胞株から非変性（ネイティブ）条件下で精製されたＲｅｐタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗Ｒｅｐウェスタンブロッティングに供された際に、還元および酸化サンプルローディング条件下での野生型と比較した場合、単一Ｃ１５４Ｅおよび二重２７／１５４Ｅ変異体について、Ｒｅｐオリゴマー（１００ｋＤａバンド）のレベルが有意に低く、重分子量凝集体が有意に少ないことを示した（図１）。
Ｂ．ネイティブＰＡＧＥを使用した非変性条件下での野生型または変異体Ｒｅｐタンパク質の特性評価
ブルーネイティブＰＡＧＥによる同じ非変性（ネイティブ）Ｒｅｐタンパク質の特性評価また、野生型と比較した場合、ウェスタンブロッティング（ＷＢ、抗Ｒｅｐ）または高感度の総タンパク質染色（銀染色）による検出の両方について、二重変異体に対して高分子量凝集体（高分子量スメア）が有意に少ないことを示した（図２）。しかし、一般的に、ネイティブＰＡＧＥ条件下では、Ｒｅｐのオリゴマー種（約１５０ｋＤａのＭＷ）が、Ｒｅｐタンパク質種において優勢である。これらは、単量体Ｒｅｐの三量体または四量体（３８，２ｋＤａの理論的ＭＷ）のいずれかである。
Ｃ． ＳＤＳ－ＰＡおよびウェスタンブロッティングを使用した変性条件下での野生型または変異体Ｒｅｐタンパク質の特性評価
標準的なＥＬＩＳＡアッセイの場合、Ｒｅｐタンパク質は、高収率の産生および良好なタンパク質の安定性のために、大腸菌から変性条件下で精製した（以下のプロトコルを参照）。変性Ｒｅｐ ＷＴおよびＲｅｐ ＭＵＴの凝集を特徴付けるために、タンパク質をＰＢＳで１時間緩衝し、再生ＥＬＩＳＡコーティングおよびブロッキング条件を模倣し、次いで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗Ｒｅｐ抗体を用いたウェスタンブロッティングまたはクーマシータンパク質染色のいずれかに供した（図３）。再び、Ｒｅｐ変異体は、野生型Ｒｅｐタンパク質と比較した場合、Ｒｅｐオリゴマーおよびより大きな凝集体の有意な減少（５０％超）を示した。
Ｄ． ＢＮ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを使用した変性条件下での野生型または変異体Ｒｅｐタンパク質の特性評価
ＢＮ－ＰＡＧＥおよび続いての抗Ｒｅｐウェスタンブロッティングでの同じサンプル（各５μｇ）の特性評価はまた、Ｒｅｐオリゴマーの有意な減少および高分子量凝集体の減少を示した（図４）。最も明らかな単量体Ｒｅｐタンパク質のさらなる種は、Ｒｅｐ変異体についてのみ、ネイティブＰＡＧＥ条件下で検出された。
すべての結果は、非常に安定したＲｅｐオリゴマー（ＭＷ約１１０ｋＤａ）の存在を示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中のＳＤＳ処理にも耐える。また、より高分子量の範囲（１２０～１７０ｋＤａ以上）をカバーする非常に安定したＲｅｐ凝集体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで検出することができる。明らかに、２７／１５４Ｅ Ｒｅｐ二重変異体では、このような高分子量凝集体の強度が有意に低下している。一般に、Ｒｅｐ凝集体の存在は、非変性条件下で精製されたタンパク質の方が高くなる。いずれにしても、変性条件下で精製および保存されたタンパク質はまた、非常に強い凝集を示し、Ｒｅｐ二重変異体に対して有意に減少する。抗体抗原結合が天然の条件を必要とするため、ＥＬＩＳＡの実験セットアップは表面結合タンパク質抗原の再生に依存するので、これは特に興味深いものである。
例３：
Ａ．ＥＬＩＳＡ野生型または変異体Ｒｅｐタンパク質のコーティング性能
重要なことに、新たに改変された二重Ｒｅｐ変異体は、野生型Ｒｅｐタンパク質（アッセイバッファー：カゼインバッファー、スーパーブロックバッファー、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）と比較した場合、同等のＥＬＩＳＡコーティング性能を示す（図５）。
Ｂ．ヒトＭＳ血清における野生型または変異体Ｒｅｐタンパク質のＥＬＩＳＡ性能
さらに、ヒトＭＳ血清中のＲｅｐ反応性抗体の反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイで野生型Ｒｅｐと比較した場合、２７／１５４Ｅ Ｒｅｐ二重変異体を抗原として使用すると、平均で約４０％増加した（図６）。
例４：
野生型および変異体Ｒｅｐタンパク質抗原の精製
ＭＳＢＩ１ゲノム内で同定された全長野生型Ｒｅｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードするヌクレオチド酸分子、またはヌクレオチド酸分子Ｒｅｐ二重変異体２７／１５４Ｅを、大腸菌でのタンパク質発現を可能にする発現プラスミド（ｐＥＸＰ５－ＣＴ、インビトロジェン社）にクローン化する。簡潔に言えば、化学的にコンピテントな大腸菌（ＳｏｌｕＢｌ２１、Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社）に発現プラスミドをトランスフェクトし、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上でクローン選択を行った。高レベルのタンパク質発現クローンを、低容量予備スクリーニングにおけるタンパク質試験発現により選択した。したがって、クローン培養物を、ＬＢ Ａｍｐ（３７℃、振盪装置）で、
ＯＤ６００が０，４～０，６に達するまで、約１０ｍｌに拡大し、続いて、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０，６６ｍＭ）を用いて、２５℃で一晩、タンパク質発現を誘導した。
標的タンパク質の発現を、Ｒｅｐタンパク質のＣ末端６ｘＨｉｓタグに対して反応する抗Ｈｉｓ抗体を用いて、大腸菌溶解物（Ｌａｍｍｌｉ ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーで調製）のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより測定した。次いで、Ｒｅｐタンパク質の最も高い発現を示す最初の大腸菌培養物を、１０００ｍｌ ＬＢ Ａｍｐにさらに拡大し、ＯＤ６００を０．５にした。タンパク質発現を、振盪装置で２５℃で一晩、ＩＰＴＧ（０．６６ｍＭ）により誘導した。次いで、細胞を６０００ｇで４℃で遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、アリコート（１０００ｍｌの初期ＩＰＴＧ誘導大腸菌培養物の各１００ｍｌに対応する１０アリコート）において－８０℃で保存した。
大腸菌発現内の配列番号１（野生型）または配列番号１１（変異体）のアミノ酸配列を有する合成Ｒｅｐタンパク質を、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭイミダゾール、５ｍＭベータメルカプトエタノールを含む２０反応容量の８Ｍ尿素サンプルバッファーｐＨ８．０を加えることにより変性させる。Ｒｅｐタンパク質を、続いて、Ｒｅｐタンパク質に融合したＣ末端Ｈｉｓ６タグに基づいて、変性条件下（洗浄用の５５ｍＭイミダゾールおよびタンパク質溶出用の３００ｍＭイミダゾール）で精製した。精製の品質を、クーマシータンパク質染色および抗Ｒｅｐタンパク質抗体を用いたウェスタンブロッティングにより測定した。Ｒｅｐタンパク質の純度を、密度で算出し、９５％以上である。精製タンパク質は、ＥＬＩＳＡベースの血清スクリーニングに直接使用されるか、ＳＤＳ－Ｐａｇｅに供され、続いて、１Ｄサイズに分割されたＲｅｐタンパク質膜ストライプの血清インキュベーションのためにニトロセルロース膜に転写ブロッティングされるかのいずれかである。
Figure 0007159229000002
Figure 0007159229000003
参考文献
Figure 0007159229000004
配列表４ ＜２２３＞Ｈｉｓタグ
配列表５ ＜２２３＞Ｔ７タグ
配列表６ ＜２２３＞Ｆｌａｇタグ
配列表７ ＜２２３＞Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ
配列表１０ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ変異体
配列表１１ ＜２２３＞ＭＳＢＩ１ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ変異体
配列表１２ ＜２２３＞ＭＳＢＩ２ Ｒｅｐ ２７／１５４Ｅ変異体

Claims (11)

  1. ＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質であって、
    （ｉ）配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ複製関連（Ｒｅｐ）タンパク質。
  2. 請求項１で定義されたＲｅｐタンパク質に対する抗体の量を検出する方法であって、
    （ａ）被験体からのサンプルを、請求項１で定義されたＲｅｐタンパク質と共にインキュベートし、
    （ｂ）前記Ｒｅｐタンパク質と免疫複合体を形成する前記被験体からのサンプル中の抗体の量を検出するステップを含む、方法。
  3. ステップ（ａ）において、前記Ｒｅｐタンパク質を固定化し、続いて、前記固定化Ｒｅｐタンパク質を前記被験体のサンプルと共にインキュベートする、請求項２に記載の方法。
  4. ステップ（ａ）において、前記Ｒｅｐタンパク質が細胞内で発現し、続いて、前記細胞を前記被験体からのサンプルと共にインキュベートする、請求項２に記載の方法。
  5. ステップ（ｂ）において、Ｒｅｐタンパク質と免疫複合体を形成する抗体の量が、シグナル生成化合物に結合した検出結合剤により定量化される、請求項２に記載の方法。
  6. ステップ（ａ）において、前記被験体からのサンプル中の抗体を固定化し、続いて、規定量のＲｅｐタンパク質と共にインキュベートする、請求項２に記載の方法。
  7. 前記被験体からのサンプルが、血清または血漿サンプルである、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 対照サンプルと比較して、前記被験体のサンプル中の抗Ｒｅｐ抗体の量が少なくとも２倍増加したことを決定する、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ＭＳの診断に使用するキットであって、
    配列番号１１または１２に示されるアミノ酸配列を含むＲｅｐタンパク質を含む、ＭＳの診断に使用するキット。
  10. 更に、
    検出可能な標識に結合し、前記配列番号１１または１２のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異性を有する抗Ｒｅｐ抗体に結合することができる抗ヒト抗体と、
    前記Ｒｅｐタンパク質の固定化に適した固体マトリックスと
    を含む、請求項９に記載のキット。
  11. 酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）およびストリップアッセイからなる群から選択されるアッセイで使用するための、請求項９または１０に記載のキット。
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