CN111278850B

CN111278850B - 用于诊断分析的改进的rep蛋白

Info

Publication number: CN111278850B
Application number: CN201880051256.1A
Authority: CN
Inventors: 蒂莫·邦德; 埃塞尔-米歇尔·德维利耶; 哈拉尔德·祖尔·豪森
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2017-07-07
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2038-07-04

Abstract

本发明涉及一种DNA复制相关(Rep)蛋白，其包括SEQ ID NO：11或12所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：11或12的片段，其能够结合对具有SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体；或(c)氨基酸序列，其与(a)或(b)的氨基酸序列具有90％或更高的同源性，并且能够结合对具有SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体。本发明还涉及诊断MS或MS易感性的方法，以及用于这种方法的试剂盒。

Description

用于诊断分析的改进的REP蛋白

本发明涉及DNA复制相关(Rep)蛋白的检测和定量，其用于诊断神经退行性疾病，诸如例如，多发性硬化(MS)。特别地，本发明涉及突变的MSBI1基因组编码的Rep蛋白。

多发性硬化(MS)的病因尚未解决。因此，需要用于MS的生物标记物，其可用于诊断MS和/或监测MS或治疗MS和/或评估MS的易感性。

多发性硬化(MS)的特征是MS病变的脱髓鞘作用，其破坏大脑和脊髓中的神经细胞。MS症状或以突然恶化(复发、加重、再发、发作)出现或随时间逐渐恶化(渐进形式)出现。脱髓鞘作用开始炎症过程，其触发T细胞并释放细胞因子和抗体。对于MS的诊断，尤其是使用了神经影像学、脑脊液分析和诱发电位。

从不同的测试材料(多发性硬化(MS)脑组织、牛血清、牛奶)中分离出了17种不同但部分相关的DNA分子谱(Funk,Gunst et al.2014,Gunst,Zur Hausen et al.2014,Lamberto,Gunst et al.2014,Whitley,Gunst et al.2014)。

在这些分离物中，从MS患者的脑组织中分离出两种与可传播的海绵状脑炎(TSE)相关分离物Sphinx 1.76(1,758bp；登录号HQ444404，(Manuelidis L.2011))密切相关的DNA分子。这些分离物是分别称为“MSBI1基因组”和“MSBI2基因组”的MSBI1.176(MSBI，多发性硬化脑分离物)(1,766bp)和MSBI2.176(1,766bp)。MSBI1,176与Sphinx 1.76的序列具有98％的核苷酸相似性。这些分离物的大开放阅读框(ORF)编码一种假定的DNA复制蛋白，它们之间具有高度相似性。另一个共同特征是存在重复子样串联重复。该重复区域的比对表明单核苷酸核心的变化。该重复子样重复可以构成Rep蛋白的结合位点。分离物的序列已以登录号LK931491(MSBI1.176)和LK931492(MSBI2.176)保藏在EMBL数据库中(Whitley C.etal.2014)，并已在WO 2016/005064中进行了比对和描述。

本发明人最近发现，野生型MSBI1基因组显示出转录的RNA的大量产生，并且MSBI1基因组编码的Rep蛋白在人细胞中表达。他们发现，野生型MSBI1和MSBI2基因组编码的Rep蛋白(MSBI1 Rep和MSBI2 Rep)代表了用于致病性筛选测定的生物标记物。作为DNA复制相关蛋白(RepB)，Rep蛋白具有DNA结合活性，并且对于启动游离体或病毒DNA分子的复制可能是必不可少的。但是，与野生型MSBI1和2基因组编码的Rep在结构上相似的Rep蛋白显示出显著的自我低聚和聚集潜能(aggregation potential)。

为了诊断筛选测定，将野生型Rep蛋白抗原MSBI1 Rep和MSBI2 Rep纯化并在变性和还原条件下保存，以最大程度地减少对该蛋白的聚集或降解作用。不幸的是，发明人观察到在非变性条件下野生型MSBI1 Rep蛋白的先前纯化确实显示出大量可见的蛋白聚集，这最明显地使得Rep蛋白不可用于亲和纯化。残留的极少量纯化的Rep蛋白在非常短的时间内(数小时)聚集，从而使该蛋白不足以用于进一步的诊断测定。这与描述了与MSBI1 Rep相当的Rep蛋白的聚集的先前的研究一致。

对于诊断筛选测定，用于检测血液样品中抗原结合抗体的蛋白质抗原的稳定性和完整性对于此类敏感实验的可重复性和可靠性至关重要。在这方面，蛋白质抗原在长期存储期间的保存期限以及诊断筛选测定本身(包被、封闭、洗涤、检测抗体温育的步骤)期间的生物物理行为对于成功测定至关重要。然而，鉴于观察到的野生型Rep蛋白(MSBI1 Rep和MSBI2Rep)的聚集行为，需要一种改进的Rep蛋白，其不具有与野生型Rep蛋白一样的聚集和自低聚特性。

本发明人发现，突变蛋白可以避免上述负面特性。本发明提供了突变型MSBI1 Rep和MSBI2 Rep蛋白，与相应的野生型蛋白相比，它们具有至少两个点突变，并且代表了用于致病性筛选测定的生物标记物。合成的MSBI1和MSBI2 Rep蛋白是衍生自野生型(wt)MSBI1和MSBI2基因组编码的Rep蛋白(如SEQ ID NO：1(MSBI1.176)和SEQ ID NO:8(MSBI 2.176))所示的突变体。合成的突变型MSBI1和MSBI2 Rep蛋白提供了REP蛋白在体外条件下也在尿素存储缓冲液中的更高稳定性和更少的聚集。与野生型MSBI1和MSBI2 Rep蛋白相比，合成的突变型MSBI1和MSBI2 Rep蛋白是更稳定的抗原，可用于诊断筛选测定。

由于分离的DNA(例如MSBI1)试剂的致病活性与Rep蛋白表达之间的联系，抗Rep抗体被用作致病标记。含有增加量的抗Rep抗体的患者血清表明，相应的患者一定是在足够启动Rep特异性免疫应答的长的时间内暴露于Rep相关蛋白或自己表达的Rep。作为人抗体的靶标，Rep蛋白被用作抗原。基于抗Rep抗体的量的定量，可以诊断或监测急性MS以及MS的易感性。因为已经认识到样品中诱导的抗Rep抗体或表达的Rep蛋白的量的增加表明MS的发作和/或状态，所以可分别将Anti-Rep抗体和Rep蛋白的量的增加用作MS诊断的致病生物标志。

有利地，可以在血液样品如血清或血浆样品中检测MS的致病生物标志，并且不必从脑脊液中获得样品。

因此，本发明提供了一种DNA复制相关(Rep)蛋白，其包括(i)如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO：11的片段，其能够结合对包括SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体；或

(iii)氨基酸序列，其与(i)或(ii)的氨基酸序列具有90％或更高的同源性，并且能够结合对包括SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体。

另外，本发明提供了一种DNA复制相关(Rep)蛋白，其包括(i)SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；

(ii)SEQ ID NO：12的片段，其能够结合对包括SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体；或

(iii)氨基酸序列，其与(i)或(ii)的氨基酸序列具有90％或更高的同源性，并且能够结合对包括SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的蛋白质有特异性的抗Rep抗体。实际上，本发明的Rep蛋白可以以任何采用已知抗原来检测抗体或细胞介导的免疫应答的测定形式使用。因此，本发明还包括细胞介导的检测，例如针对Rep蛋白的T细胞免疫应答。

在某些实施方式中，本发明提供了一种诊断受试者中神经退行性疾病的方法，包括以下步骤：

(a)将来自受试者的样品与以上限定的Rep蛋白一起温育；

(b)检测来自受试者的样品中与Rep蛋白形成免疫复合物的抗体的量；和

(c)使与对照样品中的量相比的，与Rep蛋白结合的抗体的量与神经退行性疾病的诊断相关联。

在具体实施方式中，本发明提供了一种诊断受试者中MS的方法，包括以下步骤：

(a)将来自受试者的样品与Rep蛋白一起温育；

(c)将与对照样品中的量相比的，与Rep蛋白结合的抗体的量与MS的诊断相关联。

与对照样品中抗Rep抗体量相比，来自受试者的样品中抗Rep抗体的量的增加与神经退行性疾病例例如MS的诊断相关联，即指示MS。在某些实施方式中，神经退行性疾病例如MS或神经退行性疾病例如MS的易感性的诊断由抗Rep抗体的量相比于对照样品增加，至少2倍，来指示。

在具体实施方式中，将Rep蛋白固定化，例如将其附连到支持物或载体上，然后将固定化Rep蛋白与来自受试者的样品一起温育。

在其他实施方式中，使Rep蛋白在细胞中表达，然后将细胞与来自受试者的样品一起温育。

在某些实施方式中，通过与信号产生化合物连接的另外的结合剂来定量与Rep蛋白形成免疫复合物的抗体的量，所述结合剂能够结合免疫复合物的抗Rep抗体，例如可检测地标记的第二抗体，优选抗人抗体。

在其他实施方式中，将来自受试者的样品中的抗体固定化，然后与限定量的Rep蛋白一起温育。

优选地，来自受试者的样品和对照样品是血液样品诸如血清或血浆样品。

另外，发明人已经产生了与表位结合的抗Rep抗体，该表位在选自由SEQ ID NO：1或11的氨基酸1至136、137至229和230至324组成的组的氨基酸序列内。例如，抗体结合SEQID NO：2或SEQ ID NO：3包括的表位。

在进一步的实施方式中，本发明提供了用于诊断MS的试剂盒，其包括(a)Rep蛋白MSBI1 Rep 27/154E或MSBI2 Rep 27/154E，(b)与信号产生化合物连接的另外的结合剂，例如，与可检测标记连接并能结合根据本发明抗Rep抗体的抗人抗体，以及(c)适于固定化根据(a)的Rep蛋白或抗Rep抗体的固体基质，其中辅助抗体疑似存在于样品，特别是血清或血浆样品中。

在具体实施方式中，将试剂盒放在一起用于免疫测定，例如选自由酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)和条测定(strip assay)组成的组。

附图说明

图1通过用编码MSBI1 Rep野生型(WT)或突变型MSBI1 Rep 27/154E的pcDNA3.1(-)质粒瞬时转染HEK293TT来过量表达Rep蛋白72小时。将细胞用胰蛋白酶消化，在PBS中洗涤并在裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.6、150mM NaCl、1.5％曲拉通X-100、5mM咪唑、5mMβ-巯基乙醇、1x蛋白酶抑制剂混合物)中超声处理。温育(30min，4℃)并离心(30min，10,000g，4℃)后，非变性蛋白质纯化通过以下进行：将蛋白质与1ml平衡的Ni-NTA珠(Clontech)结合，用10个柱体积的洗涤缓冲液(含有55mM咪唑的裂解缓冲液)洗涤，以及洗脱(含有300mM咪唑的裂解缓冲液)。通过NanoDrop和Bradford蛋白质定量后，将等量的蛋白质(每泳道500ng)在存在(还原)或不存在(氧化)5mMβ巯基乙醇的缓冲液中煮沸，并通过SDS-PAGE和用抗Rep抗体的蛋白质印迹进行分析。

图2Rep蛋白在上述非变性条件下纯化。将2000ng Rep蛋白进行BN-PAGE(Serva)，并通过抗Rep免疫检测或蛋白银染色进行染色。

图3Rep蛋白是在变性条件下从大肠杆菌中纯化的(流程见下文)。2μg(蛋白质印迹)或5μg(考马斯染色)的纯化的MSBI1 Rep wt或突变型MSBI1 Rep 27/154E在SDS-PAGE后通过抗Rep免疫检测或考马斯蛋白染色进行表征。

图4Rep蛋白是在变性条件下从大肠杆菌中纯化的(流程见下文)。5μg MSBI1 Repwt或突变型MSBI1 Rep 27/154E用于BN-PAGE和抗Rep免疫检测。

图5将ELISA板(Maxisorp，Thermo Fisher Scientific)用纯化的变性MSBI1 Repwt或突变型MSBI1 Rep 27/154E在1：1稀释的1xPBS/8M尿素(每孔200ng蛋白)中在4℃下包被过夜，一式三份。在室温下，在不同的测定缓冲液(酪蛋白、超级封闭、PBS中的1％BSA)中进行封闭2h。将包被的蛋白用作为第一抗体的三种小鼠单克隆抗Rep抗体(1：500稀释，具有在N、中心和C端Rep结构域中的表位)的混合物定量，然后与HRP连接的山羊抗小鼠二抗一起温育(1：5000稀释，各自在37℃下持续1h，用0.1％吐温PBS、Thermo Fisher Scientific的TMB ELISA底物洗涤，在450nm处读出)。显示了原始信号强度。

图6将ELISA板(Maxisorp，Thermo Fisher Scientific)用纯化的变性MSBI1 Repwt或突变型MSBI1 Rep 27/154E在1：1稀释的1xPBS/8M尿素(每孔200ng蛋白)中在4℃下包被过夜。在室温下在超级封闭测定缓冲液中封闭2h。血清温育(在超级封闭缓冲液中1：500)在37℃下温育1h。Rep结合的人IgG抗体用HRP连接的山羊抗人二抗(1：5000稀释，在37℃下1h)进行一式两份的分析(用PBS 0.1％吐温、Thermo Fisher Scientific的TMB ELISA底物洗涤，在450nm处读出，信号归一化为BSA对照)。

本发明提供了突变型Rep蛋白和用于抗Rep抗体作为致病标记的诊断筛选测定。样品包含增加量的抗Rep抗体的表明，相应的受试者确定地在足够长以诱导Rep蛋白特异性免疫应答的时期段中暴露于Rep相关蛋白或自身表达的Rep蛋白。利用这种筛选测定，可以基于抗Rep抗体的定量进行MS的诊断、预后和监测。

如本文所用，“Rep蛋白”是指DNA复制相关蛋白(RepB)。Rep蛋白具有DNA结合活性，可能对于启动游离体/病毒DNA分子的复制至关重要。通常，Rep蛋白是指来自小Sphinx的Rep蛋白(Whitley等，2014)。特别地，Rep蛋白是合成的基因组编码的Rep蛋白MSBI1 Rep27/154E和MSBI2的基因组编码的Rep 27/154E蛋白。优选地，合成的MSBI1 Rep蛋白具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列，并且衍生自在EMBL数据库中在登录号LK931491下保藏的MSBI1.176，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或合成的Rep蛋白具有SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列，并且衍生自在EMBL数据库中在登录号LK931492下保藏的MSBI2.176——其具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在一个具体优选实施方式中，Rep蛋白包括：在小Sphinx基因组中保守的N端区域，其基本上由SEQ ID NO：11或12的1至229氨基酸组成；以及对MSBI1.176有特异性的C端可变区，其基本上由SEQ ID NO：11的230至324氨基酸组成，或对MSBI2.176有特异性的C端可变区，基本上由SEQ ID NO：12的230至324氨基酸组成。N端保守区包括：推定的第一DNA结合结构域，其基本上由SEQ ID NO：1、8、11和12的1至136的氨基酸组成；以及第二推定的DNA结合结构域，基本上由SEQ ID NO：1、8、11和12的137至229氨基酸组成。

“Rep蛋白”还包括能够结合对具有SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列的Rep蛋白有特异性的抗Rep抗体的蛋白的片段和变体。优选地，这样的片段是具有SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列的蛋白的免疫原性片段，其包括针对SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的Rep蛋白的抗Rep蛋白抗体的至少一个表位，并且优选包括至少7、8、9、10、15、20、25或50个连续氨基酸。在具体实施方式中，该片段包括Rep蛋白的结构域或基本上由Rep蛋白的结构域组成，例如，N端保守区、C端可变区、第一或第二DNA结合结构域。具有SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的蛋白的变体与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12相比包括一个或多个氨基酸缺失、替换或添加，并且具有与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性，其中该变体能够结合对具有SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列的Rep蛋白有特异性的抗Rep抗体。变体的定义中包括，例如，含有一种或多种氨基酸类似物的多肽(包括，例如，非天然氨基酸、肽核酸(PNA)等)，具有替换的键以及本领域已知的其他修饰的多肽，其为天然存在和非天然存在的。术语Rep蛋白包括融合蛋白，其具有异源氨基酸序列，具有前导序列或具有标签序列等。例如，Rep蛋白可以与标签序列融合，该标签序列例如选自由His6标签(SEQ ID NO：4)、T7标签(SEQ ID NO：5)、FLAG标签(SEQ ID NO：6)和Strep-II标签(SEQ ID NO：7)组成的组。

可以通过经典的化学合成来制备本发明的合成的MSBI1 Rep蛋白(MSBI1 Rep 27/154E)或MSBI2 Rep蛋白(MSBI2 Rep 27/154E)，包括上面定义的Rep片段和Rep变体。合成可以在均相溶液或固相中进行。根据本发明的多肽也可以通过重组DNA技术来制备。例如，对MSBI1 Rep27/154E进行了工程改造，其中通过两个单点突变将残基25-31(LLILLAII)和残基151-155(LLICW)之间的两个氨基酸序列的聚集潜能最小化。克隆的基础是MSBI1 RepDNA序列，该序列经密码子优化用于在编码原始MSBI1 Rep一级氨基酸序列的人系统中的Rep表达。编码氨基酸27(L，亮氨酸，DNA密码子CTA)的核苷酸以及编码氨基酸154(C，半胱氨酸，DNA密码子TGT)的核苷酸被编码氨基酸谷氨酸(E，DNA密码子GAG)的核苷酸替换)，相当于最终DNA序列SEQ ID NO：11。该Rep双突变体的净聚集潜能被最小化至141的得分，在非聚集倾向蛋白范围内。

如实施例中所示(图2、3)，与野生型Rep蛋白相比，Rep 27/154E突变体显示出Rep低聚体和更大聚集体的显著减少(＞50％)。蛋白质印迹也显示明显更少的Rep低聚体以及更少的高分子量聚集体(图4)。在仅针对Rep突变体的天然PAGE条件下检测到大部分明显是单体的Rep蛋白的其他种类。显然，对于27/154E Rep双突变体，高分子量聚集体的强度显著降低。通常，对于在非变性条件下纯化的蛋白质，Rep聚集体的存在较高。无论如何，在变性条件下纯化和储存的蛋白质也显示出非常强的聚集，这对于Rep双突变体而言明显降低。这是特别有意义的，如ELISA实验设置依赖和表面结合的蛋白抗原的复性，因为抗体抗原结合需要天然条件。

可以通过经典化学合成来制备野生型Rep蛋白。合成可以在均相溶液或固相中进行。根据本发明的多肽也可以通过重组DNA技术来制备。实施例1中示出了产生和纯化野生型Rep蛋白的实例。

如本文所用，“受试者”是指哺乳动物个体或患者，包括鼠类、家畜例如牛、猿猴和人类。优选地，受试者是人类患者。

如本文所用，“样品”是指包括液体和固体样品的生物样品。液体样品包括血液，如，例如，血清或血浆和脑脊液(CSF)。固体样品包括组织样品如组织培养物或活检样本。

如本文所用，“与……相关联”分别指抗Rep抗体和Rep蛋白的量，即水平或滴度与例如MS的疾病状态显著相关联。通过检测来自待测受试者的样品和对照样品中存在的量的差异程度来确定相关性。“对照样品”是指单个样品或各种(即多于两个)对照样品的平均值。对照取自并未诊断为MS的健康个体。替代地，可以通过以预定的截止值检测待测受试者的样品中存在的量的差异程度在理论上确定相关性。截止值是在不同疾病状之间(例如在健康和疾病状态之间)具有统计学上显著分离的参考值。可以通过本领域已知的统计检验对足够大的来自具有疾病史患者的测试样品和来自健康测试组的样品进行统计分析来确定截止值。

在某些实施方式中，通过与对照样品相比，蛋白，即受试者样品中的Rep蛋白和抗Rep抗体各自增加，至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍的量来指示例如MS的诊断。

如本文所用，“抗Rep抗体”是指在本发明的方法中以可检测的水平与Rep蛋白结合的抗体，其对本发明的Rep蛋白的亲和性比对非Rep蛋白的亲和性强。优选地，对Rep蛋白的抗原亲和性为背景结合的至少2倍大。特别地，抗Rep抗体对具有SEQ ID NO：1或11的氨基酸序列的MSBI1 Rep或具有SEQ ID NO：8或12的氨基酸序列的MSBI2 Rep具有特异性。在具体实施方式中，抗体对MSBI1 Rep或MSBI2 Rep具有交叉特异性。

所有测定的共同特点是，在允许Rep蛋白与样品中存在的任何此类抗体结合的条件下，将Rep蛋白与疑似含有抗Rep蛋白抗体的样品接触。这样的条件将通常是生理温度、pH和离子强度，使用过量的Rep蛋白。将Rep蛋白与样品一起温育，然后检测由抗原组成的免疫复合物。在某些实施方式中，将Rep蛋白连接至信号产生化合物，例如，可检测的标记，或与信号产生化合物连接的另外的结合剂，例如抗人二抗用于检测免疫复合物。

基于Rep蛋白作为蛋白抗原，其可作为样本中疑似存在的哺乳动物例如人抗体的靶标，可以在测定中检测和定量抗Rep抗体。优选地，将Rep蛋白纯化(例如参见实施例1)，并且样品可以是，例如，血清或血浆样品。方法包括将Rep蛋白固定化在基质上，然后将固定化Rep蛋白与样品一起温育。最后，针对Rep蛋白和样品的抗体之间形成的免疫复合物的Rep结合抗体通过与信号产生化合物连接的检测结合剂例如允许基于HRP底物的定量的第二HRP(辣根过氧化物酶)连接的检测抗体来定量。该信号产生化合物或标记本身是可检测的，或者可与另外的化合物反应以产生可检测的产物。

在其他实施方式中，通过如下方式间接定量抗Rep抗体：首先将样品的抗体固定化在基质上，然后与限定量的Rep蛋白一起温育，其中固定化并存在于基质上的抗Rep抗体从蛋白质-样品液体混合物中捕获Rep蛋白，然后定量结合的Rep蛋白。

在其他实施方式中，Rep蛋白可以在细胞中表达，并且将这些细胞与样品一起温育。此后，检测并定量与细胞表达的Rep蛋白结合的样品的抗Rep抗体。

免疫测定的设计有很大的变化，并且许多形式是本领域已知的。方案可以，例如，使用固体支持物或免疫沉淀。大多数测定都涉及使用与信号产生化合物连接的结合剂，例如标记的抗体或标记的Rep蛋白；标记可以是，例如，酶、荧光、化学发光、放射性或染料分子。还已知放大来自免疫复合物的信号的测定，其实例是利用生物素和抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素的测定，以及酶标记和介导的免疫测定，诸如ELISA测定。

免疫测定可以是均相或非均相形式，并且可具有标准或竞争性类型。以非均相形式，多肽(Rep蛋白或抗Rep抗体)通常与固体基质或支持物或载体结合，以促进温育后从多肽中分离样品。可以使用的固体支持物的实例是硝酸纤维素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)、聚氯乙烯(例如，以薄片或微量滴定的孔的形式)、聚苯乙烯乳胶(例如，以珠或微量滴定板的形式、聚偏氟乙烯(polyvinylidine fluoride)(称为Immunolon)、重氮化纸、尼龙膜、活化珠和蛋白A珠。含有抗原性多肽的固体支持物通常在将其与测试样品分离之后并在检测结合的抗Rep抗体之前进行洗涤。标准格式和竞争形式都是本领域已知的。

以均相形式，将测试样品与Rep蛋白在溶液中温育。例如，它可能是在沉淀任何形成的Rep蛋白-抗体复合物的条件下。这些测定的标准和竞争形式都是本领域已知的。

以标准形式，直接监测抗体-Rep蛋白复合物中抗Rep抗体的量。这可以通过确定识别抗Rep抗体上的表位的(标记的)抗异种(例如抗人)抗体是否由于复合物形成而结合来实现。以竞争形式，通过监测对复合物中已知量的标记抗体(或其他竞争配体)结合的竞争作用来推导样品中抗Rep抗体的量。

取决于形式，通过多种已知技术中的任一种检测包括抗Rep抗体的形成的复合物(或在竞争性测定的情况下，竞争抗体的量)。例如，可以使用与标记(例如酶标记，诸如例如，HRP)复合的抗异种Ig的缀合物来检测复合物中未标记的抗Rep抗体。

在免疫沉淀或凝集测定形式中，Rep蛋白和抗Rep抗体之间的反应形成网络，该网络从溶液或悬浮液沉淀出来并形成可见的沉淀层或膜。如果样品中不存在抗Rep抗体，则不会形成可见的沉淀。

选择的固相可以包括聚合物或玻璃珠、硝酸纤维素、微粒、反应盘的微孔、试管和磁珠。信号产生化合物可以包括酶、发光化合物、色原、放射性元素和化学发光化合物。酶的实例包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)和β-半乳糖苷酶。增强化合物的实例包括生物素、抗生物素和抗生物素蛋白。增强剂化合物结合成员的实例包括生物素、抗生物素和亲和素。

在进一步的实施方式中，本发明提供方法，其中样品中Rep蛋白的增加量与神经退行性疾病例如MS的诊断或易感性相关联，或用于监测疾病例如MS或监测疾病例如MS治疗的方法。在这样的实施方式中，样品中的Rep蛋白由抗Rep抗体检测。

这样的方法包括以下步骤：

(a)通过抗Rep抗体检测来自受试者的样品中的Rep蛋白的量；以及

(b)使与对照样品中的量相比的，在步骤(a)中来自受试者的样品中检测到的Rep蛋白的量与神经退行性疾病例如MS的诊断相关联。

可以用于检测血清或血浆样品中Rep蛋白的这种方法的测定的实例包括但不限于免疫沉淀、免疫荧光、斑点印迹和蛋白质印迹。

例如，可以将血清样品与抗Rep蛋白抗体一起温育以捕获样品中的Rep蛋白，随后是Rep蛋白的免疫沉淀步骤，此后是通过SDS-PAGE和蛋白质印迹的检测步骤。

在另一个实例中，可以将斑点印迹膜与血清一起温育，然后是SDS-PAGE和蛋白质印迹的步骤。

在另一个实例中，将样品的血清稀释物装载在SDS-Page上，然后进行蛋白质印迹。

在进一步的实施方式中，通过免疫组织化学方法或免疫荧光显微镜术在组织样品中检测Rep蛋白。

在某些实施方式中，抗Rep抗体用于检测或捕获样品中的Rep蛋白。

术语“抗体”优选地涉及基本上由具有不同表位特异性的混合的多克隆抗体以及不同的单克隆抗体制备物组成的抗体。如本文所用，术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)旨在包括完整的免疫球蛋白分子以及抗体片段(诸如例如，Fab和F(ab')2片段)，其能够特异性结合Rep蛋白。Fab和F(ab')2片段缺少完整抗体的Fc片段，从循环中清除得更快，并且与完整抗体相比，可能具有更少的非特异性组织结合。因此，这些片段以及FAB或其他免疫球蛋白表达文库的产物是优选的。此外，可用于本发明目的的抗体包括嵌合的、单链、多功能的(例如双特异性的)和人源化抗体或人抗体。

在某些实施方式中，抗体或其抗原结合片段与信号产生化合物连接，例如携带可检测的标记。抗体/片段可以用例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶直接或间接地可检测地标记。本领域普通技术人员将知道用于与抗体结合的其他合适的标记，或者将能够使用常规实验确定这种标记。

如实施例部分中所示，新工程化的双Rep突变体显示出与野生型Rep蛋白相当的的ELISA包被性能。此外，当与ELISA测定中的野生型Rep相比时，使用27/154E Rep双突变体作为抗原时，人MS血清中Rep反应性抗体的反应性平均增加了约40％(图6)。

本发明人还通过本领域技术人员熟知的方法提出(产生)了针对具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：8的氨基酸序列的Rep蛋白或其片段的抗Rep抗体。这些抗Rep抗体用于与来自小Sphinx基因组中的几种或所有Rep蛋白结合(抗小Sphinx样Rep抗体或抗SSLRep抗体)。这样的抗SSLRep抗体与来自SEQ ID NO：1的氨基酸1至229的Rep蛋白的保守N端区域内的表位结合。使用抗-SSLRep类型的抗Rep抗体，其结合至SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：1的氨基酸32-49)或SEQ ID NO：3(SEQ ID NO：1的氨基酸197-216)内的表位。在来自小Sphinx基因组组的Rep蛋白中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽片段是高度保守的，并且由于其亲水特性而显得暴露。抗SSLRep类型的抗Rep抗体可以通过用基本上由SEQ ID NO：2或3所示的氨基酸序列组成的肽；或用其他免疫原性片段(优选包括至少8-15个氨基酸，衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸1至229的保守N端Rep蛋白区域)来免疫例如小鼠或豚鼠来产生。

例如，通过用具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的全长Rep蛋白免疫哺乳动物诸如小鼠或豚鼠来产生这样的抗体。

这些抗Rep抗体能够在不同种类的体液如例如血液、血清、脊髓液或脑液中检测达皮克至飞克的Rep蛋白。

可以使用特定种类的抗Rep抗体或两种或多种不同种类的抗Rep抗体的混合物。如果使用不同种类的抗Rep抗体的库，则抗Rep抗体库可包括与Rep蛋白——特别是MSBI1 Rep蛋白(SEQ ID NO：1)——的不同结构域内的不同表位结合的不同抗Rep抗体，所述结构域为例如第一DNA结合结构域(例如SEQ ID NO：1的氨基酸1-136)、第二DNA结合结构域(例如SEQID NO：2的氨基酸137-229)和/或可变结构域(例如SEQ ID NO：1的氨基酸230-324)。

鉴于两个DNA结合结构域中仅有两个单点突变以及可变域中保持了相同序列，这些抗体还识别SEQ ID No.11和12的突变蛋白。

为了通过抗Rep抗体检测Rep蛋白，可以使用方法如，例如，蛋白质印迹、免疫荧光显微术或免疫组织化学方法。

抗Rep抗体能够在某些细胞定位处检测Rep蛋白。例如，抗Rep抗体可以检测细胞质、核膜和细胞核中的Rep蛋白或检测细胞质中的斑点。表1中显示了这样的抗Rep抗体的实例：

表1

A组的抗Rep抗体具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的氨基酸198-217)内的一个表位，并且能够检测小Sphinx基因组组(例如MSBI2、CMI1、CMI4)的包括该保守表位的MSBI1 Rep和Rep蛋白。在免疫荧光测定中，此类抗Rep抗体检测特异的Rep定位模式，其中主要定位均匀地分布在细胞质和核膜上；在细胞核中看到另外的弱且均匀分布的定位。这种A组抗体的实例是抗体AB01 523-1-1(DSM ACC3327)，其在实施例中用作A组抗体。

B组的抗Rep抗体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1的氨基酸33-50)内的一个表位，并且能够检测小Sphinx基因组组(例如MSBI2、CMI1、CMI4)的包括该保守表位的MSBI1 Rep和Rep蛋白。在免疫荧光测定中，此类抗Rep抗体特异性检测Rep蛋白的斑点(细胞质聚集体)(常常在核膜的周围)。这种B组抗体的实例是命名为AB02 304-4-1的抗体(DSM ACC3328)，其在实施例中用作B组抗体。

C组的抗Rep抗体特异性地检测MSBI1的结构表位(SEQ ID NO：1)。在免疫荧光测定中，此类抗Rep抗体检测特异的Rep定位模式，其中主要定位均匀地分布在细胞质和核膜上，在细胞核中看到另外的弱且均匀分布的定位。这种C组抗体的实例是抗体MSBI1 381-6-2(DSM ACC3329)，其在实施例中用作C组抗体。

D组的抗Rep抗体特异性地检测MSBI1(SEQ ID NO：1)的结构表位，其中命名为“D1”的抗体MSBI1 961-2-2检测MSBI1的C端结构域中的SEQ ID NO：9所示的表位(氨基酸281-287)。命名为“D2”的抗体MSBI1761-5-1(DSM ACC3328)检测MSBI1的3D结构表位，该表位仅在体内条件下可及，而在蛋白质印迹中不可及。在免疫荧光测定中，此类抗Rep抗体可特异性地检测Rep蛋白的斑点(细胞质聚集体)(常常在核膜的周围)。

在某些实施方式中，A、B、C或D组的抗Rep抗体；或A、B、C或D组的至少两个不同组的抗Rep抗体的组合用于确定探针中Rep蛋白定位的种类，以及这种Rep蛋白定位是否与病原体功能相关联。例如，是否存在斑点。在某些实施方式，即，本发明的方法或试剂盒中，将至少一种选自A和B组的抗Rep抗体与至少一种选自C和D组的抗Rep抗体组合。在具体实施方式，即，本发明的方法或试剂盒中，将A组的抗Rep抗体与至少一种选自B、C和D组的另外的抗Rep抗体组合。例如，可以将A组的抗Rep抗体与C和D组的抗Rep抗体组合。不同组的抗Rep抗体的这种组合增加了诊断评估的独特性，特别是对于MS的诊断。

以下抗体于2017年9月28日保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ)：

DSM ACC3327下的抗体AB01 523-1-1；

DSM ACC3328下的抗体AB02 304-4-1；

DSM ACC3329下的抗体MSBI1 381-6-2；和

DSM ACC3330下的抗体MSBI1 761-5-1。

抗体MSBI1 961-2-2已于2017年10月6日保藏在DSMZ。

在一个优选的实施方式中，A、B、C或D组的抗Rep抗体；或A、B、C或D组的至少两个不同组的抗Rep抗体组合用于确定合成的MSBI1 Rep基因组编码的Rep蛋白(MSBI1 Rep 27/154E或MSBI2 Rep 27/154E)。

在进一步的实施方式中，提供了用于MS诊断的试剂盒。该试剂盒可包括用于检测抗Rep抗体和/或Rep蛋白的材料，以及在MS诊断测定中使用该材料的说明书。试剂盒可包括一种或多种以下组分：根据本发明的生物标志物，即分别是Rep蛋白和抗Rep抗体；信号产生化合物、用于附连捕获剂的固体基质、用于样品的稀释剂、洗涤缓冲液。信号产生化合物是指可检测的标记，其与能够与本发明的生物标记物结合的另外的结合剂连接或与本发明的生物标记物直接连接。

通过但不限于以下实施例进一步说明本发明：

实施例1：

MSBI1 Rep蛋白纯化

将在MSBI1基因组中鉴定出的编码全长Rep开放阅读框(ORF)的核苷酸分子克隆到表达质粒(pEXP5-CT，Invitrogen)中，其能够基于大肠杆菌高产量无细胞体外翻译系统(ExpresswayTM Cell-Free E.coli Expression System,Invitrogen)表达蛋白。通过添加20个反应体积的含有100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl，pH 8.0、5mM咪唑的pH 8.0的8M尿素样品缓冲液，将体外翻译反应中具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的合成的Rep蛋白变性。随后，基于融合至Rep蛋白的C端His6标签，在变性条件下纯化Rep蛋白(20mM咪唑用于洗涤和300mM咪唑用于蛋白质洗脱)。纯化的质量通过考马斯蛋白染色和用抗Rep蛋白抗体的蛋白质印迹来确定。Rep蛋白纯度通过光密度法计算得出，大于95％。纯化的蛋白可直接用于基于ELISA的血清筛选或进行SDS-Page，然后转移印迹到硝化纤维素膜上，用于1D大小分辨的Rep蛋白膜条的血清温育。

实施例2：

A.使用SDS-PAGE和蛋白质印迹在变性条件下表征野生型或突变型Rep蛋白

纯化的Rep抗原(野生型和突变型Rep)的特性通过不同组实验进行了表征。在进行SDS-PAGE和抗Rep蛋白质印迹时，在还原和氧化样品加样条件下，在非变性(天然)条件下从人HEK293TT细胞系中纯化的Rep蛋白，单C154E和双27/154E突变体与野生型相比显示显著更低的水平的Rep低聚体(100kDa带)和更少的大分子量聚集体(图1)。

B.使用天然PAGE在非变性条件下表征野生型或突变型Rep蛋白

通过蓝色天然PAGE对相同的非变性(天然)Rep蛋白进行表征，双突变体的高分子量蛋白质聚集体(高分子量涂片)与野生型相比也显著更少，二者均通过蛋白质印迹(WB，抗Rep)或通过高灵敏度总蛋白染色(银染)(图2)检测。但是，通常，在天然PAGE条件下，Rep的低聚体种类(分子量约为150kDa)代表了主要的Rep蛋白种类。这些可能是单体Rep(理论分子量为38.2kDa)的三聚体或四聚体。

C.使用SDS-PA和蛋白质印迹在变性条件下表征野生型或突变型Rep蛋白

对于标准ELISA测定，在变性条件下从大肠杆菌纯化Rep蛋白，以实现高产率生产和更好的蛋白稳定性(参见以下方案)。为了表征变性的Rep WT和Rep MUT的聚集体，将蛋白在PBS中缓冲1h，以模拟复性ELISA包被和封闭条件，然后进行SDS-PAGE和用抗Rep抗体的蛋白质印迹或考马斯蛋白染色(图3)。同样，Rep突变体显示与野生型Rep蛋白相比显著减少(>50％)的Rep低聚体，和更大聚集体。

D.使用BN-PAGE和蛋白质印迹在变性条件下表征野生型或突变型Rep蛋白

在BN-PAGE和随后的抗Rep蛋白质印迹上对相同样品(每个5μg)的表征也显示明显更少的Rep低聚体和更少的高分子量聚集体(图4)。仅对于Rep突变体，在天然PAGE条件下检测到另外种类的大部分明显为单体的Rep蛋白。

所有结果显示存在高度稳定的Rep低聚体(MW～110kDa)，其甚至在SDS-PAGE期间仍能抵抗SDS处理。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹还可检测到覆盖甚至更高分子量范围(120-170kDa和更高)的高度稳定的Rep聚集体。显然，对于27/154E Rep双突变体，这种高分子量聚集体的强度显著降低。通常，对于在非变性条件下纯化的蛋白质，Rep聚集体的存在量较高。无论如何，在变性条件下纯化和储存的蛋白质也显示出非常强的聚集，这对于Rep双突变体而言明显降低。这是特别有意义的，如ELISA实验设置依赖并表面结合的蛋白抗原的复性，因为抗体抗原结合需要天然条件。

实施例3：

A.野生型或突变型Rep蛋白的ELISA包被性能

重要的是，新工程化的双Rep突变体显示出与野生型Rep蛋白相当的ELISA包被性能(测定缓冲液：酪蛋白缓冲液、超级封闭缓冲液、PBS中的1％BSA)。

B.人MS血清中野生型或突变型Rep蛋白的ELISA性能

此外，在ELISA测定中与野生型Rep相比，使用27/154E Rep双突变体作为抗原时，人MS血清中Rep反应性抗体的反应性平均提高了约40％(图6)。

实施例4：

野生型和突变型Rep蛋白抗原的纯化

将编码MSBI1基因组中鉴定的全长野生型Rep开放阅读框(ORF)的核苷酸分子或核苷酸分子Rep双突变体27/154E克隆到表达质粒(pEXP5-CT，Invitrogen)中，其使蛋白质能够在大肠杆菌中表达。简而言之，用该表达质粒转染化学感受态的大肠杆菌(E.coli，SoluBl21，Genlantis)，然后在具有氨苄青霉素的LB琼脂平板上进行克隆选择。通过低体积预筛选中的蛋白质测试表达来选择高水平的蛋白质表达克隆。因此，将克隆培养物在LBAmp(37℃，振荡装置)中扩大至约10ml，直到OD600达到0,4-0,6，然后用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，0,66mM)诱导蛋白质表达)，在振荡装置上于25℃过夜。

通过SDS-PAGE和用对Rep蛋白的C端6xHis标签具有反应性的抗His抗体对大肠杆菌裂解物(在SDS-PAGE样品缓冲液中制备)进行蛋白质印迹来确定目标蛋白的表达。然后将显示Rep蛋白最高表达的最初大肠杆菌培养物进一步扩大至1000ml LB Amp，OD600为0.5。由IPTG(0.66mM)诱导蛋白表达，在振荡装置上于25℃过夜。然后将细胞在4℃下以6000g离心，用PBS洗涤，并以等分试样(10等分试样，对应于1000ml初始IPTG诱导的大肠杆菌培养物的各个100ml)在-80℃下保存。

通过添加20个反应体积的含有100mM NaH2PO4、10mM Tris HCl，pH 8.0、5mM咪唑、5mMβ-巯基乙醇的pH 8.0的8M尿素样品缓冲液，将大肠杆菌表达中具有SEQ ID NO：1(野生型)或SEQ ID NO：11(突变体)的氨基酸序列的合成的Rep蛋白变性。随后，基于融合到Rep蛋白的C端His6标签，在变性条件下纯化Rep蛋白(55mM咪唑用于洗涤和300mM咪唑用于蛋白质洗脱)。通过考马斯蛋白染色和用抗Rep蛋白抗体的蛋白质印迹来确定纯化的质量。Rep蛋白纯度通过光密度法计算得出，大于95％。纯化的蛋白可直接用于基于ELISA的血清筛选或进行SDS-Page，然后转移印迹到硝酸纤维素膜上，用于1D大小分辨的Rep蛋白膜条的血清温育。

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Claims

1.一种DNA复制相关Rep蛋白，其中，所述DNA复制相关Rep蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：11所示。

2.根据权利要求1所述的DNA复制相关Rep蛋白制备用于诊断受试者中MS的试剂盒的用途。

3.一种用于诊断MS的试剂盒，包括

(a)Rep蛋白，其中所述Rep蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；

(b)抗人抗体，其与可检测标记连接并能够结合对氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的蛋白质有特异性的抗Rep抗体，以及

(c)适于固定化根据(a)的Rep蛋白的固体基质。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，用于选自由以下组成的组的测定：酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、发光免疫测定(LIA)和条测定的用途。