JP7139340B2 - 抗ｈｅｒｖ－ｋエンベロープ抗体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、グリコシル化または天然コンホメーションに影響されない保存領域を標的とする、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープに対する新規な抗体に関する。本発明はまた、診断および／または治療における使用に関する。

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；amyotrophic lateral sclerosis）疾患は、フランスの神経学者Jean-Martin Charcotによって最初に報告された。その名称には、皮質脊髄運動ニューロンの変性、外側脊髄における下行性軸索の構造変化（lateral sclerosis）および脊髄運動ニューロンの死滅と、筋肉の消耗（amyotrophy）を伴う二次的な除神経との双方が反映されている（Taylor, Brown, and Cleveland 2016）。実際に、ＡＬＳは、大脳運動皮質、脳幹および脊髄において随意運動の計画、制御および実行に関与している運動ニューロンの変性に起因する、進行性で最終的には死に至る神経変性疾患である。致死的な結果には、通常、診断から３～５年で至る（Taylor, Brown, and Cleveland 2016）。ＡＬＳの有病率は、１００，０００症例中約５症例に達しており、この疾患の急速な致死性を反映している（Taylor, Brown, and Cleveland 2016）。ＡＬＳの症例の約１０％は、特定のゲノム変異に関連して、家族内で遺伝的に伝播すると見られる（遺伝性ＡＬＳ）。例えば、家族性ＡＬＳの約２０％は、スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子（ｓｏｄ１）の変異に関連している（Vucic and Kiernan 2009; Rosen 1993）。他の非家族性の症例は、散発性ＡＬＳとして分類され（ＡＬＳの症例の９０％）（Lagier-Tourenne and Cleveland 2009）。つまり、家族歴がなくともこの疾患を発症することを意味している。

神経変性障害（パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、ＡＬＳなど）は、中枢神経系のニューロン細胞およびグリア細胞の内外両方における、ミスフォールドタンパク質の蓄積に関連している（Polymenidou and Cleveland 2011）。これらミスフォールドタンパク質の凝集体は各疾患の病理学的特徴であり、発症イベントの後、プリオンと同様の機構を通じて細胞から細胞へと伝播することができる。広く抱かれている見解の一つによると、これらの凝集体は疾患の発症および進行において重要な役割を果たしており、ミスフォールドされた内因性タンパク質は毒性を獲得するようである。この毒性の獲得は、凝集体に含まれている必須細胞成分の疎水性の増加および／または隔離、酸素種の生成、プロテアソームの阻害、および他の経路を介している可能性がある。他の見解によると、大型の凝集体は毒性のある形態にならなず、防御的細胞応答の最終産物は、より毒性の高いオリゴマー種からの細胞の保護を目的としている。このオリゴマー種は、ほとんどの技術によっては、依然として検出できない（Polymenidou and Cleveland 2011）。

ＡＬＳに罹患しており、外来性ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）の血清反応が陰性である患者に由来する血清サンプルの研究によると、ＡＬＳサンプルの逆転写酵素活性（ＲＴ活性）は５０～６０％であり、これはＨＩＶ感染患者に匹敵するレベルであった（(MacGowan et al. 2007; McCormick et al. 2008; Andrews et al. 2000; Steele et al. 2005）。このことは、マウスレトロウイルスおよびヒトレトロウイルスがいずれもＡＬＳ様の症候群を引き起こしうることが知られて以降数年にわたって、レトロウイルスの関与が疑われてきたと言う事実と整合している（McCormick et al. 2008）。ＨＩＶ陽性患者におけるＡＬＳ様の障害は、抗レトロウイルス療法によって寛解しうる（Moulignier et al. 2001; von Giesen et al. 2002）。このことは、ＨＩＶ感染患者におけるＡＬＳ症候学に有効である。そして、それにもかかわらず、ＡＬＳ症例の特定のサブカテゴリとしても表されうる。

また、ＲＴ活性の上昇は、ＡＬＳ患者の一親等の近親者の血清中にも見られる。このことから推測するに、ＲＴ活性は、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）の遺伝的に活性コピー（ヒトのゲノムの８％を占めている）に由来している可能性がある（Steele et al. 2005）。

ＡＬＳなどにおけるＲＴ活性の検出は、この酵素の起源を同定するものではない。しかしそれにもかかわらず、死後の脳においてＨＥＲＶ－Ｋの関与が示されている（Douville et al. 2011を参照）。配列決定研究により明らかになったところによると、７ｑ３４染色体遺伝子座および７ｑ３６．１染色体遺伝子座（それぞれ、ＨＥＲＶ－ＫのＨＭＬ－２サブファミリーおよびＨＭＬ－３サブファミリーに対応している）は、対称群と比較すると、ＡＬＳ患者において高発現している（Douville and Nath 2014）。さらに、最近観察されたところによると、ＨＥＲＶ－Ｋのｇａｇ－ｐｏｌ ＲＮＡおよびｅｎｖ ＲＮＡはいずれも、対称群と比較すると、ＡＬＳ患者由来の脳において顕著に高発現している（Li et al. 2015）。

ヒトニューロンの培養細胞におけるＨＥＲＶ－Ｋの発現により、ニューロンに対する細胞毒性を引き起こされる。この細胞毒性は、ＨＥＲＶ－Ｋゲノム全体またはＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ遺伝子のみをトランスフェクションした後に、ニューロンの数が減少し、神経突起が用量依存的に退縮する点に見られる。このことから、細胞内のＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質は、神経毒性に寄与しうることが示唆される。このことは、ＶＰ６４転写因子によってＨＥＲＶ－Ｋの発現をＬＴＲ活性化させ、発現量を２倍に増強させたＣＲＩＳＰ／ｃａｓｐ９アッセイによって確認された（Li et al. 2015）。ＨＥＲＶ－Ｋの発現により、in vivoで、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ遺伝子を発現しているトランスジェニックマウスの皮質ニューロン中における運動皮質の体積が減少する。この現象は、小膠細胞に関してイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ－１）マーカーにより測定される免疫反応とは、独立に発生する（Li et al. 2015）。行動分析により明らかになったところによると、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖトランスジェニックマウスの移動距離は短くなり、休息時間は長くなり、ロータロッドパフォーマンステストにおける落下時間が早くなった。また、後肢を抱きしめることが多くなることから、痙直の証拠が示された。上記の運動性機能障害に加えて、トランスジェニックマウスには、四肢および脊椎の筋肉（呼吸のための筋肉を含む）に重篤な衰弱が見られ、１０箇月までの死亡率が５０％に及んだ（Li et al. 2015）。

興味深いことに、ＨＥＲＶ－ＫのＲＴ発現は、ＡＬＳ患者由来のニューロンにおけるＴＤＰ－４３レベルの増加と相関している。このことは、ＲＴ発現は、ＡＬＳ疾患に特徴的な他の異常な細胞プロセスと共に生じることを示唆している（Buratti and Baralle 2009; Geser et al. 2009; Douville et al. 2011）。ＡＬＳにおけるこのようなプリオンに類似した機構の証拠は、現在のところ、主要なミスフォールドタンパク質であるＳＯＤ１およびＴＤＰ－４３に関連している（Polymenidou and Cleveland 2011）。Li et al.が最近実証したところによると、ＴＤＰ－４３は、ヒトニューロンにおいてＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖの発現を活性化させうる。このことは、ＴＤＰ－４３はＨＥＲＶ－Ｋの長末端反復（ＬＴＲ）領域（726-CCCTCTCCC-734）に結合できるという、彼／彼女らの観察と整合している（Li et al. 2015）。彼／彼女らがまた示したところによると、内因性のＴＤＰ－４３をサイレンシングすることにより、ＨＥＲＶ－Ｋの発現が減少する。これらの結果は、最近、以下の事実によって補足されている。すなわち、正常なＴＤＰ－４３は、in vitroにおいて、ヒト星状細胞およびニューロンのＨＥＲＶ－Ｋの転写に影響を及ぼさない。しかし、ＴＤＰ－４３は、ＨＥＲＶ－ＫプロモーターのＵ５領域に結合部位を有している。後者の結合は、炎症（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の存在下にて）またはプロテアソーム阻害によって促進される（Manghera, Ferguson-Parry, and Douville 2016）。興味深いことに、同じ研究が示したところによると、ＴＤＰ－４３の凝集型を過剰発現させると、ＨＥＲＶ－Ｋウイルスタンパク質の発現および蓄積が促進されたが、野生型ＴＤＰ－４３（正常なＴＤＰ－４３）ではそうならなかった（Manghera, Ferguson-Parry, and Douville 2016）。さらに、ＡＬＳの皮質ニューロンにおいては、ストレス顆粒およびオートファジー反応の上昇が見られるにもかかわらず、当該細胞は、ＨＥＲＶ－Ｋタンパク質を過剰に蓄積させていた。多くのレトロウイルス制限因子において一般的であるＴＤＰ－４３プロモーターは、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ１、ＩＲＦ３）および核因子κＢ（ＮＦκＢ）に対する結合部位を有していることから、インターフェロン関連転写因子および炎症関連転写因子に応答するようである（Douville et al. 2011）。

以上を総合的に考慮し、これらの知見によって示唆されるところによると、内在性レトロウイルスエレメント（および、特にＨＥＲＶ－Ｋ）はＡＬＳの病態生理学に関わっており、ＴＤＰ４３とこのタンパク質症とを結ぶミッシング・リンクとなっている可能性がある（(Alfahad and Nath 2013）。したがって、ＡＬＳ患者のニューロン内におけるＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質発現は、神経変性および疾患のの一因であるかもしれない。

今日においても依然として、リルゾールは対症療法として比較的有効性のある唯一の薬剤である。しかし、この薬剤は、患者の平均生存期間を３～６箇月間延長するにすぎない（Hardiman, van den Berg, and Kiernan 2011）。現在の治療プロトコルは、症状マネジメントおよびＱＯＬの維持に基づいており、これらは多様なディシプリンを背景に提供されている。この急速に死に至る疾患の患者にとって、効果的な治療の発見は、依然として重大な必要性を帯びている（Hardiman, van den Berg, and Kiernan 2011）。

すなわち、ＡＬＳを治療する効果的な治療剤という、未だ満たされていない必要性が存在している。

〔発明の概要〕
本発明者らは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質に対する新規な抗体を開発した。この抗体は、予想外の特性を示すものであった。

本発明者らが示したところによると、本発明に係る抗体（ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１と命名）は、マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の表面にある線状エピトープ（SLDKHKHKKLQSFYP；配列番号９）に選択的に結合する。ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ＩｇＧ２ｂ／κマウスサブクラスの全長抗体である。ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１の生物活性は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングイムノアッセイにおいて確認されている。驚くべきことに、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、天然ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質および変性ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の両方を認識した上に、非グリコシル化形態およびグリコシル化形態も認識した（この点に関して、市販の抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ抗体は、グリコシル化形態を検出することができない）。

さらに、そして最も予想外であったことには、標的化されたエピトープは、データベースに登録された複数のＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ遺伝子中において、安定なアミノ酸配列として高度に保存されているようである。これによって、上記の抗体は固有の位置を与えられる。このことは、ＨＥＲＶ－Ｋのコピーが、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質の病原性の発現に関与しているか否かとは関係がない。これら予想外の結果によって示されるのは、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１が、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を標的化するためのオリジナルな道具であることである。また、これらの結果が示すところによると、上記のモノクローナル抗体を選択し獲得することは、既存の免疫化のプロトコルによっては、たとえ当業者であっても予見も予測もできなかったのである。

したがって、本発明は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を認識する抗体に関する。この抗体はエピトープ：SLDKHKHKKLQSFYP（配列番号９）に結合する。

本発明はまた、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を認識する抗体に関する。この抗体は、治療における使用のために、エピトープ：SLDKHKHKKLQSFYP（配列番号９）に結合する。

本発明はまた、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を認識する抗体に関する。この抗体は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；好ましくは散発性ＡＬＳ）の処置方法における使用のために、エピトープ：SLDKHKHKKLQSFYP（配列番号９）に結合する。

他の態様において、本発明は、上記に定義した抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含んでいる医薬組成物に関する。

他の態様において、本発明はまた、生体サンプル中のＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体を検出する方法に関する。この方法は、上記の生体サンプルを、上記で定義した抗ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体と接触させる工程を含む。

他の態様において、本発明はまた、患者におけるＡＬＳ（特に、散発性ＡＬＳ）を診断する方法に関する。この方法は、上記の患者から得られた生体サンプルを、上記で定義した抗ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体と接触させる工程を含む。

〔発明の詳細な説明〕
［定義］
本明細書において用いられるとき、用語「処置(treating; treatment)」とは、この用語が適用される障害または状態を、逆転させたり、緩和したり、進行を阻害したり、予防したりすることを意味する。あるいは、この用語が適用される障害または状態の１つ以上の症状を、逆転させたり、緩和したり、進行を阻害したり、予防したりすることを意味する。

本明細書において用いられるとき、用語「予防」とは、臨床症状、典型的病変、または、これらの臨床診断を可能にする生理的機能障害をまだ示していない被験体において、疾患または症状の発生を予防することを表す。

本明細書において用いられるとき、「抗体」または「免疫グロブリン」とは、同じ意味を有しており、本発明において同様に使用される。本明細書において用いられるとき、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫学的な活性部位を表す。すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有している分子を表す。したがって、用語「抗体」には、全長の抗体分子だけではなく、抗体断片および抗体誘導体も含まれる。

本明細書において用いられるとき、表現「抗体の断片」とは、ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）などの超可変領域を模倣する、抗体の部分を表す。本発明に係る抗体の断片は、当該抗体の結合親和性および特異性を保持している。このような断片は、上記抗体の機能的等価物であり、当該抗体と実質的に同じエピトープに結合する。抗体の断片の例としては、重鎖、軽鎖、ＶＬ、ＶＨ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦ（ａｂ’）２が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において用いられるとき、表現「抗体の誘導体」とは、天然の配列とは異なる配列（例えば、他の種類のリンカー配列）の１つ以上と融合している、本発明の抗体の断片を表す。好ましくは、この誘導体は、上記抗体のＣＤＲの１つ以上（好ましくは、上記の抗体のＣＤＲ３の１つ以上）を有している。また、この誘導体のＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖに対する結合親和性および特異性は、本発明の抗体のものに匹敵する。本発明に係る誘導体は、上記抗体の結合親和性および特異性を保持している。このような誘導体は、上記抗体の機能的等価物であり、上記抗体と実質的に同じエピトープに結合する。抗体の誘導体の例としては、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２およびdiabodyが挙げられるが、これらに限定されない。

天然抗体においては、２つの重鎖（ＨＣ）がジスルフィド結合によって相互に連結されており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖（ＬＣ）に連結されている。軽鎖は２種類あり、λ（ｌ）とκ（ｋ）である。重鎖には５種類の主要なクラス（またはアイソタイプ）があり、抗体分子の機能的活性を決定している。これらのクラスとは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥである。各鎖は、異なる配列ドメインを有している。

通常、軽鎖は２つのドメインを有しており、それらは可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）である。重鎖は４つのドメインを有しており、それらは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３。ＣＨと総称される）である。軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ）はいずれも、抗原のエピトープに対する特異的な結合部位を決定する。軽鎖および重鎖の定常領域ドメイン（ＣＬおよびＣＨ）は、重要な生物学的特性を与える（抗体鎖の会合、分泌、経胎盤性の移動、補体の結合、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合など）。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体の結合部位と抗原のエピトープとの間の、構造的な相補性に起因している。抗体の結合部位は、主として、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から構成されている。しかし、時には、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が、全体的なドメイン構造に影響を及ぼし、したがって結合部位にも影響を及ぼす。相補性決定領域またはＣＤＲとは、天然の免疫グロブリンの結合部位における天然のＦｖ領域の、結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、３つのＣＤＲを有している。これらは、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、Ｈ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と称される。したがって、抗原結合部位は６つのＣＤＲを有しており、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットが含まれている。フレームワーク領域（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に介在しているアミノ酸配列を表す。

本明細書において用いられるとき、用語「キメラ抗体」とは、任意の種（好ましくはマウス）に由来する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインと、を有している抗体を表す。

本発明によれば、用語「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体由来に由来する可変領域フレームワークおよび定常領域を有している抗体を表す。ヒト化抗体は、任意の種（好ましくはマウス）に由来する抗体のＣＤＲを有している。

用語「Ｆａｂ」とは、分子量が約５０，０００の、抗原結合活性を有している抗体断片を意味する。Ｆａｂは、プロテアーゼ（パパイン）でＩｇＧを処理することにより得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側の約半分と軽鎖の全体とがジスルフィド結合を介して結合しているものである。

本明細書において使用されるとき、用語「Ｆ（ａｂ’）２」とは、分子量が約１００，０００の、抗原結合活性を有している抗体断片を表す。Ｆ（ａｂ’）２は、プロテアーゼ（ペプシン）でＩｇＧを処理することにより得られる断片のうち、Ｆａｂよりもわずかに大きく、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合しているものである。

本明細書において使用されるとき、用語「Ｆａｂ’」とは、分子量が約５０，０００のの、抗原結合活性を有している抗体断片を表す。Ｆａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。

表現「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、共有結合しているＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を表す。このヘテロ二量体は、通常、遺伝子融合物から発現するポリペプチドである。この遺伝子融合物は、ＶＨおよびＶＬをコードしている遺伝子を含んでおり、これらの遺伝子はペプチドをコードしているリンカーによって連結されている。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されているＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価の抗体断片および多価の抗体断片は、一価のｓｃＦｖの会合によって自発的に形成させることもできる。あるいは、ペプチドリンカーにより、一価ｓｃＦｖをカップリングさせることによって生成することもできる（二価のｓｃ（Ｆｖ）２など）。

用語「diabody」とは、２つの抗原結合部位を有している小型の抗体断片を表す。この断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、同じポリペプチド鎖中に有している（ＶＨ－ＶＬ）。同じ鎖上の２つのドメイン間では対合できない程度の短さのリンカーを使用することによって、これらのドメインは、他の鎖上の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位が生まれる。

本明細書において用いられるとき、表現「本発明の抗体」とは、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ）に対して指向されている抗体（すなわち、特異的に結合する抗体）を表す。好ましくは、上記抗体が指向されている対象は、Ｋ型ヒト内在性レトロウイルスファミリー（ＨＥＲＶ－Ｋ）のＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質である。より好ましくは、上記抗体が指向されている対象は、配列番号９に記載のエピトープである。

本明細書において使用されるとき、用語「生体サンプル」とは、in vitroにおける評価を目的として得られる、任意の生体サンプルを表す。本発明において、サンプルまたは患者のサンプルには、任意の体液、または疾患に特異的な組織および病変（例えば、生検サンプル）が含まれうる。体液の例としては、血液、血清、血漿、乳頭吸引液、尿、唾液、滑液および脳脊髄液（ＣＳＦ）が挙げられる。

通常、本発明の抗体は、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に対するニューロンの露出によって誘導される細胞毒性から、ヒトニューロン細胞を保護する。

より詳細には、本発明の抗体は、好ましくは、以下の機能的特徴の１つ以上を示す。
（１）ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に曝露されたニューロンの、ニューロン機能活性を維持する。
（２）ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に曝露されたニューロンの、細胞生存率を維持する。および／または、
（３）ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に曝露されたニューロンの、ニューロン形態を維持する。

ニューロン機能活性おける、細胞外ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープの細胞毒性に対する本発明に係る抗体の保護効果は、本発明の実施例２に示すように、in vitroで評価できる（２．１．３項を参照）。具体的に、この効果は、ヒトニューロンを組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質で処理した後における当該ニューロンの自発的な電気生理学的活動を、in vitroで記録することによって評価できる。したがって、本発明の抗体で処理することにより、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に曝露されたヒトニューロンの自発的な活動は、通常、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質で処理していないヒトニューロンと比較した場合の５０％以上回復する。自発的な活動の回復率は、とりわけ、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上である。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体の保護効果は、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質で処理した後における培養ニューロン細胞の生存率を分析することにより、代替的にまたは付加的にin vitroで評価できる。このことは、例えば、実施例２に説明されている（２．１．１項を参照）。実施形態のように本発明の抗体によって処理することにより、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質とプレインキュベートしたヒトニューロンの生存率は、通常、本発明の抗体で処理していないヒトニューロンの生存率と比較して２０％以上向上する。

いくつかの実施形態において、本発明の抗体の保護効果は、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質で処理した後における培養中のヒトニューロンのニューロン形態（例えば、神経突起長）を推定することにより、代替的にまたは付加的にin vitroで評価できる。このことは、例えば、実施例２に説明されている（２．１．２項を参照）。実施形態のように本発明の抗体によって処理することにより、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質とプレインキュベートしたヒトニューロンの神経突起長は、通常、本発明の抗体で処理していないヒトニューロンの生存率と比較して２０％以上増加する。

一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載の６つのＣＤＲを有している。

一実施形態において、本発明の抗体は、以下を有している。
（１）３つのＣＤＲを有している可変ドメインを有する軽鎖。それぞれのＣＤＲは、配列番号１に記載のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２に記載のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３に記載のＣＤＲ－Ｌ３である。および、
（２）３つのＣＤＲを有している可変ドメインを有する重鎖。それぞれのＣＤＲは、配列番号４に記載のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５に記載のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６に記載のＣＤＲ－Ｈ３である。

上記の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、表１に示す。

一実施形態において、本発明の抗体、断片または誘導体は、以下を有している。
（１）配列番号７に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）。および、
（２）配列番号８に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）。

上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、表２に示す。

一実施形態において本発明の抗体、断片または誘導体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、diabody、および抗体断片から形成される多重特異性抗体、からなる群から選択される。

好適な実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、一価、二価、多価、単一特異性、二重特異性または多特異性である。他の実施形態において、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖに対する抗体は、結合断片または複合体である。例えば、本発明の抗体は、増殖阻害剤、細胞毒性剤、またはプロドラッグ活性化酵素と複合体化されていてもよい。

本発明の抗体を他の種類のアミノ酸で修飾することが、当該抗体の元来のグリコシル化パターンを改変するために有用である場合もある。「改変する」とは、（i）上記抗体に見られる１つ以上の炭化水素部分を欠失させること、および／または、（ii）上記抗体中には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加すること、を意味する。抗体のグリコシル化は、通常はＮ結合型である。「Ｎ結合型」とは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭化水素部分の付加を表す。トリペプチド配列「アスパラギン－Ｘ－セリン」および「アスパラギン－Ｘ－スレオニン」（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖に対する炭化水素部分の酵素による付加のための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。抗体に対するグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位のための配列）の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することによって、簡単に達成される。

他の実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナルヒト化抗体である。より好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ４ヒト化モノクローナル抗体である。

上記のヒト化抗体は、以下のようにＣＤＲドメインをコードしている核酸配列を得ることによって作製することができる。（i）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域をコードしている遺伝子と、ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードしている遺伝子と、を有している動物細胞用の発現ベクター内に、ＣＤＲドメインをコードしている核酸配列を挿入する。（ii）この発現ベクターを動物細胞内に導入することにより、発現させる。ヒト化抗体の発現ベクターは、（i）抗体の重鎖をコードしている遺伝子と、抗体の軽鎖をコードしている遺伝子とが、別々のベクター上に存在するタイプであってもよいし、（ii）両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデム型）であってもよい。ヒト化抗体の発現ベクターの構築が容易であり、動物細胞内への導入が容易であり、さらに、動物細胞内での抗体の重鎖と軽鎖との発現レベルのバランスが良いという点から、ヒト化抗体の発現ベクターは、タンデム型がより好ましい。タンデム型のヒト化抗体の発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３、ｐＥＥ１８などが挙げられる。従来の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術に基づいてヒト化抗体を産生する方法は、本技術分野で周知である。本技術分野において周知の様々な技術を利用して、抗体をヒト化することができる（CDR-grafting、veneeringまたはresurfacing、chain shufflingなど）。このような抗体を作製するための一般的な組換えＤＮＡ技術も、公知である。

したがって、本発明の実施形態は、以下を有しているモノクローナルヒト化抗体に関する。
（１）３つのＣＤＲを有している可変ドメインを有する軽鎖。それぞれのＣＤＲは、配列番号１に記載のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２に記載のＣＤＲ－Ｌ２、および配列番号３に記載のＣＤＲ－Ｌ３である。および、
（２）３つのＣＤＲを有している可変ドメインを有する重鎖。それぞれのＣＤＲは、配列番号４に記載のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号５に記載のＣＤＲ－Ｈ２、および配列番号６に記載のＣＤＲ－Ｈ３である。

［医薬組成物］
本発明のさらなる目的は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ）に対する抗体の有効な用量と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含んでいる医薬組成物に関する。

上述した本発明の任意の治療剤は、薬学的に許容可能な賦形剤と、さらに任意構成で徐放性基剤（生分解性ポリマーなど）と組合せて、治療組成物を形成していてもよい。

「薬学的に」または「薬学的に許容可能な」とは、哺乳類（特にヒト）に適切に投与した場合に、有害反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じさせない分子存在および組成物を表す。薬学的に許容可能な担体または賦形剤とは、任意の種類の、非毒性で固体、半固体または液体である、フィラー、稀釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を表す。

医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、当然ながら、処置すべき状態、疾患の重篤度、患者の年齢、体重および性別などに依存する。

本発明の薬学的組成物は、局所投与用、経口投与用、鼻腔内投与用、眼内投与用、静脈内投与用、髄腔内投与用（脳脊髄液中への直接投与用）、筋肉内投与用または皮下投与用などに製剤化できる。

いくつかの実施形態において、髄腔内投与用に製剤化されている組成物は、特に有利な場合がある。実のところ、この投与様式ならば、特定の治療戦略においては、非ヒト抗体（マウス抗体など）またはキメラ抗体を短期的に投与可能にすることができる。実際に、ＣＮＳの「免疫特権」的な生理学的特徴によれば、全身性の経路による投与ではできない耐性が得られる。このように、髄腔内注射という様式は、神経学および神経外科学における一般的な実践である。例えば、リツキシマブはマウス－ヒトキメラ抗体であって、多発性硬化症およびＣＮＳリンパ腫の患者に対して髄腔内に使用されている（特に、下記を参照：Bonnan M, Ferrari S, Bertandeau E, Demasles S, Krim E, Miquel M, Barroso B. "Intrathecal rituximab therapy in multiple sclerosis: review of evidence supporting the need for future trials. Curr Drug Targets". 2014;15(13):1205-14. Topping J, Dobson R, Lapin S, Maslyanskiy A, Kropshofer H, Leppert D, Giovannoni G, Evdoshenko E. "The effects of intrathecal rituximab on biomarkers in multiple sclerosis". Mult Scler Relat Disord. 2016 Mar;6:49-53. and Kadoch C, Li J, Wong VS, Chen L, Cha S, Munster P, Lowell CA, Shuman MA, Rubenstein JL. "Complement activation and intraventricular rituximab distribution in recurrent central nervous system lymphoma". Clin Cancer Res. 2014 Feb 15;20(4):1029-41）。

好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容可能なビヒクルを含んでいる。このビヒクルは、特に、等張な無菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはこれらの塩の混合物）であってもよい。あるいは、場合によっては、滅菌水または生理食塩水を加えたときに注射可能な溶液の構成することができる、乾燥組成物（特に、凍結乾燥組成物）であってもよい。

投与する用量は、種々のパラメータの関数として、また特に、採用する投与方法、関連する病理学、または所望の処置期間の関数として、適合させることができる。

薬学的組成物を調製するために、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－ＫＥｎｖ）に対する抗体の有効量を、薬学的に許容可能な担体または水性媒体中に、溶解または分散させてもよい。

注射可能な用途に好適な薬学的形態の例としては、無菌水溶液または無菌分散液；ゴマ油、落花生油、または含水プロピレングリコールを含んでいる製剤；および、注射可能な溶液または分散液を即席で調製するための無菌粉末。全ての場合において、形態は無菌であり、容易に注射できる程度の流動体でなければならない。これらの形態は、製造および保存の条件下で安定でなければならない。また、微生物（細菌および真菌など）の汚染作用から保護されていなければならない。

遊離塩基または薬理学的に許容可能な塩としての有効成分の溶液は、界面活性剤（ヒドロキシプロピルセルロースなど）とともに、水中にて適宜混合することによって調製できる。また、分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物、および油中でも調製できる。保存および使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含んでいる。

製剤に際しては、用量製剤に適合した様式で、かつ治療上効果的な量の溶液が投与される。製剤は、種々の剤型において容易に投与される。この剤型は、上述した注射可能な溶液などであるが、薬物放出カプセルなども採用できる。

好ましくは、本発明のＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質（ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ）に対する抗体は、緩衝液で製剤化されていてもよい。この抗体は、緩衝液中にて可溶化され、保存され、患者に注射される。好ましくは、上記緩衝液は、２０ｍＭヒスチジン、５％スクロース、および０．０１％ポリソルベート２０を含んでおり、ｐＨは６．０である。

水溶液の非経口投与のために、例えば、溶液は適切に緩衝液化されていてもよい。また、液体の稀釈剤によって最初から、充分な生理食塩水またはグルコースで等張化されていてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に、特に適している。これに関連して、本開示を参酌すれば、使用できる無菌水性媒体は当業者にとって既知であるはずである。例えば、１回分の用量を１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させて、１０００ｍＬの皮下輸液に加えることができるし、あるいは点滴の候補部位に注入することができる（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pp.1035-1038, 1570-1580を参照）。処置される患者の状態に依存して必然的に、用量はある程度変化する。いずれにせよ、投与の責任者が、個々の患者のために適切な用量を決定する。

非経口投与（静脈内注射、髄腔内注射または筋肉内注射など）用に製剤化される化合物に加えて、他の薬学的に許容可能な形態の例としては、経口投与用の錠剤または他の固体；時間放出カプセル；および、現在使用されている任意の他の形態が挙げられる。

［本発明の診断方法］
他の態様において、本発明はまた、生体サンプル中のＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体を検出する方法に関する。この方法は、上記生体サンプルを、上記で定義した抗ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体と接触させる工程を含む。

他の態様において、本発明はまた、患者におけるＡＬＳを診断する方法に関する。この方法は、上記患者から得られた生体サンプルを、上記で定義した抗ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体と接触させる工程を含む。

通常、生体サンプルは、体液（脳脊髄液など）であってもよい。

［本発明に係る治療方法およびモニタリング方法］
一態様において、本発明はまた、ＡＬＳを患う患者を処置する方法に関する。この方法は、上記で定義したＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を認識する抗体の有効量を、上記患者に投与する工程を含む。

好ましくは、上記患者は、ＡＬＳ（特に、散発性ＡＬＳ）に罹患している。

通常は、上記抗体を、髄腔内投与、静脈内投与または皮下投与する。

本発明はまた、ＡＬＳ（特に、散発性ＡＬＳ）に罹患している患者の処置方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
（１）生体サンプル中のＨＥＲＶ－Ｋウイルスを検出および／または定量化することによって、患者の予後を予測する工程。
（２）その後、工程（１）がヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）Ｋ型の発現を示す場合に、本発明の方法は、上記患者に本発明の抗体を提供する工程を含む。

本発明はまた、ＡＬＳ（特に、散発性ＡＬＳ）に罹患している患者の処置に対する応答をモニタリングする方法に関する。この方法は、以下の工程を含む。
（ａ）本発明の抗体で患者を処置する工程。
（ｂ）その後、上記患者の生体サンプル中のＨＥＲＶ－Ｋを検出および／または定量化する工程。

本発明によれば、ＡＬＳに罹患している患者の処置に対する応答をモニタリングする場合、生体サンプルは、体液のサンプルであってもよい（血液、脳脊髄液、尿など）。あるいは、生体サンプルは、疾患に特異的な組織の生検サンプルであってもよい。

通常、検出および／または定量化の工程は、当業者に周知の一般的な技術に従って実行できる。上記工程は、通常、患者の生体サンプルを選択的な試薬（プローブ、プライマー、リガンドまたは抗体など）と接触させ、それによって、サンプル中に元来存在する所定の核酸またはタンパク質の存在を検出する工程を含む。

一実施形態において、検出および／または定量化工程は、上記で定義した抗ＨＥＲＶ－Ｋ抗体を用いて実施できる。

〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１はＩｇＧ２ｂマウス抗体であり、κ軽鎖を有している〕抗マウス免疫グロブリンによって捕捉したＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１ハイブリドーマ（モノクローナル段階）に由来する上清を、１：１０に稀釈して、ＥＬＩＳＡによりアイソタイピングした。種々の（Ａ）抗マウス軽鎖抗体または（Ｂ）抗マウス重鎖抗体による検出が示すところによると、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ＩｇＧ２Ｂ／κマウス抗体であった。結果を、２組のＯＤ_{４５０ｎｍ}値の平均±ＳＤでプロットする。 〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１の軽鎖配列および重鎖配列〕ハイブリドーマ細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。これをＰＣＲによって増幅した後、マウス抗体の（Ａ）重鎖および（Ｂ）軽鎖をコードしているｃＤＮＡを標的とするプライマーを用いて、配列を決定した。（Ａ）κ軽鎖のＣＤＲ１（太字）、ＣＤＲ２（下線）およびＣＤＲ３（太字イタリック）配列。（Ｂ）重鎖のＣＤＲ４（太字）、ＣＤＲ５（下線）およびＣＤＲ６（太字イタリック）配列。マウスＩｇＧ２定常配列（灰色イタリック）。 〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＥｎｖのSLDKHKHKKLQSFYPエピトープに結合する〕（右）ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（MyBiosource）に由来する、（左）各ペプチドの強度プロファイルを示す。これらのオーバーラップしている１５アミノ酸のペプチドには、１残基分のオフセットがある。これによると、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、線状エピトープ：SLDKHKHKKLQSFYP（配列番号９）に結合することが示された。結果を、使用したＣＣＤカメラで得られたシグナル強度（ｍＡＵ）として示す（標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダと同様）。 〔グリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖは、ＥＬＩＳＡにおいて、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１によって検出される〕（Ａ）ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１または（Ｂ）AMSBIO製の抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（１μｇ／ｍＬ）を、ＨＥＫ細胞溶解物に対するＥＬＩＳＡにおいて一次抗体として使用した。このとき、種々の稀釈率にて実験を行った。（１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００）。抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（AMSBIO）とは対照的に、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、グリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖを認識した。結果を、２組のＯＤ_{４５０ｎｍ}値の平均±ＳＤでプロットする。 〔グリコシル化されていないＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖは、ＥＬＩＳＡにおいて、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１によって検出される〕ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１またはAMSBIO製の抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（１μｇ／ｍＬ）を、E.Coli由来のｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ組換えタンパク質１μｇ／ｍＬに対するＥＬＩＳＡにおいて、一次抗体として使用した。いずれの抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖも、グリコシル化されていないＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質を認識した。結果を、２組のＯＤ_{４５０ｎｍ}値の平均±ＳＤでプロットする。 〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１を用いたウェスタンブロッティングによる、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖの検出〕（ウェル番号１、２）AMSBIO製の抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（１μｇ／ｍＬ）、または、（ウェル番号３、４）ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１ハイブリドーマ由来の上清の稀釈物（１：５）を、ウェスタンブロッティングにおける一次抗体として使用した。ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ化したＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（０．２μｇ）を、ウェル番号１、３に付着させた。また、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＥｎｖをトランスフェクションしたＨＥＫ細胞に由来するタンパク質抽出物（２４．５μｇ）を、ウェル番号２、４に付着させた。グリコシル化されていない、ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ化したＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質は、両方の抗体により、７５ｋＤａにおいて検出される。このとき、高分子量の多量体および低分子量の切断断片も検出される。グリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（９０ｋＤａ）は、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１によってのみ検出される。「ＭＷ」は分子量を表す。 〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体は、細胞外ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質によって誘導される細胞毒性からヒトニューロン細胞を特異的に保護する（細胞生存アッセイ）〕培養ニューロン細胞を、分化培地（実施例２を参照）と、ＩｇＧサンプルのＧＮ＿Ｋ０１または対照の非免疫ＩｇＧ（Thermo Product # MA 1-10418）と、で処理した（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）。６０分間プレインキュベートした後、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（My BioSource, amino acid 90-632, Cat # MBS1391552）を加えて、最終濃度を１００ｎＭとした。ＧＮ＿Ｋ０１＿Ｉｇの１つのサンプルを、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖと共に３０分間プレインキュベートした。次に、これらを共にヒトニューロンに加えた。培養ニューロン細胞を、GE INCell Analyzer 2000 BioImagerで観察して、様々な時点における各ウェルの画像を得た（１ウェルあたり４枚の画像。本実験ではＥｎｖ処理の５日後に得た）。ニューロン細胞の数を、GE Investigator high content imagingソフトウェアを用いて決定した。棒グラフの上にある矢印は、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体を用いたときの結果を示す。 〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体は、細胞外ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質によって誘導される細胞毒性からヒトニューロン細胞を特異的に保護する（神経突起長）〕培養ニューロン細胞を、分化培地（上述）とＩｇＧサンプルのＧＮ＿Ｋ０１または対照の非免疫ＩｇＧ（Thermo Product # MA 1-10418）と、で処理した（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）。６０分間プレインキュベートした後、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（My BioSource, amino acid 90-632, Cat # MBS1391552）を加えて、最終濃度を１００ｎＭとした。培養ニューロン細胞を、GE INCell Analyzer 2000 BioImagerで観察して、様々な時点における各ウェルの画像を得た（１ウェルあたり４枚の画像。本実験ではＥｎｖ処理の５日後に得た）。神経突起繊維の長さの平均を、GE Investigator high content imagingソフトウェアを用いて決定した。 〔ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体は、細胞外ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質によって誘導される細胞毒性からヒトニューロン細胞を特異的に保護する：ニューロン全体の電気生理学的活動〕電気生理学的活動（ウェル中のスパイク発生率の増加によって示される）は、第２１日までにin vitroにおいて有意に上昇した。電気生理学的活動は、１日あたり５分間、全てのウェル中の自発的な電気活動を記録することによってモニタリングした。この時点で、培養ニューロン細胞を、分化培地（上述）と、ＧＮ＿Ｋ０１または対照の非免疫ＩｇＧ（Thermo Product # MA 1-10418）と、で処理した（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）。６０分間プレインキュベートした後、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（My BioSource）を加えて、最終濃度を１００ｎＭとした。処理後２４時間から、自発的な電気活動を毎日記録した。ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖへの曝露後２４時間において、各処理群の平均発火率を決定した。棒グラフの上にある矢印は、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体を用いたときの結果を示す。

〔実施例１：ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１抗体の開発および特徴付け〕
［１．材料および方法］
［１．１．モノクローナル抗体の開発］
［１．１．１．免疫化および免疫細胞の回収］
E.coli由来のｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ化したＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（７５ｋＤａ；Mybiosourceより提供；MBS1391552）で、３匹の雌ＯＦマウス（Charles River）を免疫化した。免疫化は、Biotem社の機密のＲＡＤプロトコル（Rapid Antibody developmentプロトコル）に従った。

要約すると、第１０日（Ｄ＋１０）に、免疫化マウスから採取した血液サンプルを、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（MyBiosource, MBS1391552）またはネガティヴ・コントロールのEscherichia coli溶解物に対する直接ＥＬＩＳＡによって分析した。Ｄ＋１３に免疫化マウスを致死させ、リンパ節から免疫細胞を回収した。次に、４５ｍＬのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, SIGMA, D5671）で３回洗浄した。その後、２４４ｇにて７分間遠心分離し、２０ｍＬのＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）に再分散させた。免疫化マウス由来の免疫細胞（４２０×１０^６細胞）を、指数増殖期の骨髄腫細胞（１０７×１０^６細胞）と混合した（比率は１：３．９）。２４４ｇにて７分間、細胞を遠心分離し、ペレットを１ｍＬのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に再分散させた。このＰＥＧは、融合剤（SIGMA, P7181）として使用した。次に、１０８ｇにて１２分間遠心分離して洗浄した。その後、細胞を、１０ｍＬのＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、１×ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン（HAT, SIGMA, H0262-10VL）、２０％ウシ胎児血清（FCS, PAA, A15-251）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（SIGMA, G7513）に再分散させ、２４４ｇにて７分間遠心分離した。細胞をＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、１×ＨＡＴ（SIGMA, H0262-10VL）、２０％ＦＣＳ（PAA, A15-251）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（SIGMA, G7513）に再分散させ、室温にて２時間保存した。

［１．１．２．融合］
Ｄ－１に、免疫不全ヌードマウス（BIOTEM）に、２０％ＦＣＳ（PAA, A15-251）を含有している５ｍＬのＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）を注射した。２±１分後に、腹水由来のマクロファージを回収し、ＤＭＥＭ培地（SIGMA, D5671）中で培養した。

P3X63Ag8骨髄腫と融合したヒツジ赤血球で免疫化されたマウス由来のBALB/c脾臓細胞が、BIOTEMによって既に選抜され、特徴付けられ、保存されている。Ｄ－１０に、この骨髄腫を解凍し、ＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）－８－アザグアニン（ＡＺＡ；SIGMA, A5284）－１０％ＦＣＳ（PAA, A15-251）中で培養した。

ヌードマウス由来のマクロファージを計数し、ＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、１×ＨＡＴ（SIGMA, H0262-10VL）、２０％ＦＣＳ（PAA, A15-251）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（SIGMA, G7513）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（SIGMA, P0781）中に、１０^４マクロファージ／ｍＬとなるように再分散させた。次に、増殖因子として５０μＬのマクロファージ分散液（５００個のマクロファージに相当する）と、５０μＬのハイブリドーマ細胞分散液と、を９６ウェルプレートに播種した。この細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２にて２１日間培養した。

［１．１．３．クローニング］
ハイブリドーマ細胞を解凍し、ＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、ＨＴ（ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭ；SIGMA H0137）、２０％ＦＣＳ（PAA, A15-251）、２％ハイブリドーマ増強サプリメント（ＨＥＳ；SIGMA, H6020）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（SIGMA, G7513）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（SIGMA, P0781）を用いて培養した。培養は、３７℃、５％ＣＯ_２の２４ウェルプレート中にて、１週間行った。クローニングの前日に、ハイブリドーマ細胞を分割した。

Ｄ０に、ハイブリドーマ分散液を培地で連続的に稀釈して、１０^４細胞／ｍＬ、５０細胞／ｍＬ、２５細胞／ｍＬ、５細胞／ｍＬ、さらには２．５細胞／ｍＬとした。その後、９６ウェルプレートのウェルに、５細胞／２００μＬ、１細胞／２００μＬ、および０．５細胞／２００μＬとなるように注入した。Ｄ＋６に、細胞が含まれているウェルから、１００μＬの上清を除去した（細胞が含まれているウェルは、光学顕微鏡によるスクリーニングで選択した）。そして、新しいＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、ＨＴ（ヒポキサンチン１００μＭ、チミジン１６μＭ；SIGMA H0137）、２０％ＦＣＳ（PAA, A15-251）、２％ＨＥＳ（SIGMA, H6020）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（SIGMA, P0781）と置換した。

Ｄ＋１０に該当する日に、第１のＥＬＩＳＡスクリーニングを実行した。その後、抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖが陽性であるハイブリドーマを２４ウェルプレートで培養した（０．５ｍＬ／ウェル）。

Ｄ＋１４に該当する日に、第２のＥＬＩＳＡスクリーニングを実行した。その後、抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖが陽性であるハイブリドーマを、プレートまたは培養フラスコ（Corning）で培養した。５×１０^６細胞を４組含んでいる５つのバイアルを、ＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、１５％ＦＣＳ（PAA, A15-251）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（SIGMA, G7513）、１％ＨＥＳ（SIGMA, H6020）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（SIGMA, P0781）、２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；SIGMA, D2650）培地中で、－１９６℃（液体窒素）にて凍結させた。

［１．２．抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ ＥＬＩＳＡ］
maxisorp 96円錐底ウェルプレート（NUNC, 449824）を、（i）５０μＬの１μｇ／ｍＬ ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（Mybiosource, MBS1391552）、（ii）E.Coli溶解物（XL1-Blue MRF, Stratagene）、（iii）１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；BIOTEM）中のＨＥＫ細胞溶解物で、室温にて一晩コーティングした。プレートを、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（VWR, 28829.296）］洗浄バッファで洗浄した（３００μＬ／ウェル）。非特異的結合部位を、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋２．５％ミルク（Regilait）］ブロッキングバッファで、室温にて１時間ブロッキングした（１５０μＬ／ウェル）。プレートを、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］洗浄バッファで洗浄した（３００μＬ／ウェル）。

抗体サンプルを〔１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．５％ＢＳＡ（VWR, 1.12018.0100）稀釈バッファで稀釈した。１μｇ／ｍＬの抗体サンプルまたは精製抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（AMSBIO製）を、室温にて２時間インキュベートした（５０μＬ／ウェル）。プレートを、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］洗浄バッファで３回洗浄した（３００μＬ／ウェル）。次に、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．５％ＢＳＡ中で１／１００００に希釈したポリクローナルペルオキシダーゼ結合affiniPureＦ（ａｂ）’２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Jackson, 115-036-068）と共に、室温にて１時間インキュベートした（５０μＬ／ウェル）。プレートを３回洗浄し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Eurobio, 52-00-01）基質溶液を用いて、室温にて１０分間発色させた（５０μＬ／ウェル）。反応を、０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４（Merck, 1.12080.1000）（で停止させた５０μＬ／ウェル）。光学密度（ＯＤ）リーダ（Dynex）を用いて、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定した。

［１．３．作製、精製、透析］
ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１ハイブリドーマ細胞を解凍した。最初はＴ７５ｃｍ^２組織培養フラスコ（Corning）内で、次にＴ３００ｃｍ^２組織培養フラスコ（Corning）内で培養した。最後に、１０×１０^６の細胞を１０組、５００ｍＬのＤＭＥＭ（SIGMA, D5671）、１５％ＦＣＳ（PAA, A15-251）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（SIGMA, G7513）、１％ＨＥＳ（SIGMA H6020）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（SIGMA, P0781）培地中で培養した。この最後の培養は、Hyperflask（Corning, 10030）内で、３７℃、５％ＣＯ_２にて１０±１日行った。

培養上清を、２４４ｇにて７分間遠心分離した。次に、１１μｍナイロンネットフィルタ（SIGMA, NY1104700）に通して濾過した。タンパク質Ａクロマトグラフィカラム（GE Healthcare, Mab Select Xtra）を、脱塩水で２回洗浄し、５倍容量の１×ＰＢＳ（Biotem）で平衡化した。次に、細胞を含んでいない０．５Ｌの培養上清をロードした。カラムを、５容量の１×ＰＢＳで洗浄した。３．５±０．５容量の酢酸（SIGMA, A6283）を用いて、酸性ｐＨにて免疫グロブリンを溶出させた。免疫グロブリンを含んでいる溶出画分を、１００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）緩衝液（Biotem）で中和して、４℃にて保存した。

精製されたＩｇＧ画分を、0.5ml micro dialysis capsule Quixsep（登録商標；Roth, H448-1）および10kDa SnakeSkin Dialysis Tubing, 22 mm（Thermofischer, 68100）で、２回透析した。この透析は、１×ＰＢＳ中で、４℃にて２時間行った。次に、Vivaspin 20 (30Kda)（Sartorius, ref）を使い、４℃にて遠心分離することにより濃縮した。抗体を0.22μm Minisart（登録商標）フィルタ（Sartorius, ref）で濾過して、２８０ｎｍにおける分光光度法によってタンパク質濃度を測定した。

［１．４．ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動による純度分析］
ＬａｅｍｍＬｉ緩衝液（Biotem）で予め稀釈した抗体（０．２μｇ／μＬを５μＬ）を、９５℃にて５分間加熱した。次に、スタッキングゲルおよび５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを含んでいる１３．５％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離した。ゲル中を９０Ｖにて３０分間、次に１２０Ｖにて２時間泳動させた。タンパク質の検出は、染色液（Biotem）を用いて、撹拌しながら１時間行った。ゲルを脱色液（Biotem）で撹拌しながら、１時間洗浄した。

［１．５．アイソタイピング］
［１．５．１．ＥＬＩＳＡによるアイソタイピング］
maxisorp 96円錐底ウェルプレート（NUNC, 449824）を、５０μＬの１μｇ／ｍＬ抗マウス免疫グロブリン（Clinisciences, 1010-01）で、室温にて一晩コーティングした。プレートを、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］洗浄バッファで洗浄した（３００μＬ／ウェル）。非特異的結合部位を、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋２．５％ミルク］ブロッキングバッファで、室温にて１時間ブロッキングした（１５０μＬ／ウェル）。プレートを、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］洗浄バッファで洗浄した（３００μＬ／ウェル）。ハイブリドーマ上清を、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．５％ＢＳＡ］稀釈バッファで、１：１０に稀釈した。サンプルを、室温にて２時間インキュベートした（５０μＬ／ウェル）。プレートを、［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０］洗浄バッファで１回洗浄した（３００μＬ／ウェル）。次に、１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋０．５％ＢＳＡ中で１／２０００に稀釈した、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス重鎖（ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）（Clinisciences, 5300-05）と共に、室温にて１時間インキュベートした（５０μＬ／ウェル）。プレートを１回洗浄し、ＴＭＢ（Eurobio, 52-00-01）基質溶液を用いて、室温にて１０分間発色させた（５０μＬ／ウェル）。０．１Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４（Merck, 1.12080.1000）停止液で、反応を停止させた（５０μＬ／ウェル）。光学密度（ＯＤ）リーダ（Dynex）を用いて、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定した。

［１．５．２．ラテラルフローイムノアッセイによるアイソタイピング］
軽鎖（κまたはλ）を、ラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩＡ；ThermoFisher,26179）で特徴付けた。

［１．６．ＨＥＫトランスフェクション］
ヒト胚細胞（１．１０^６細胞／ｍＬ）を、１μｇのＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（アクセッション番号：AY037928.1）発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃、８％ＣＯ_２、１２０ｒｐｍで撹拌しながら培養した。

［１．７．ウェスタンブロット分析］
１２．５ｎｇ／μＬの組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（Mybiosource）と、１．５μｇ／μＬのＨＥＫトランスフェクト細胞由来タンパク質溶解物とを、２×ＬａｅｍｍＬｉ緩衝液（SIGMA, S3401）で１：１に稀釈し、９０℃にて５分間加熱した。次に、３２μＬのサンプルを、８～１６％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Novex, EC60452BOX）にロードした。ゲルを１×Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳ泳動バッファ（Novex, LC2675）に入れ、１６０ｍＡにて１時間泳動させた。１×Ｔｒｉｓ－グリシン転写バッファ（Novex, LC3675）中で、０．２μｍニトロセルロース膜（Biorad, 162-0146）上にタンパク質を転写した。その後、この膜を、［１×ＰＢＳ＋５％ミルク（La Vie Claire）］ブロッキングバッファ中で、室温にて回転台に載せながら１時間ブロッキングした。ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１ハイブリドーマ由来の細胞上清を［１×ＰＢＳ＋１％乳汁］抗体稀釈液で１：５に稀釈し、これで１時間インキュベートすることにより、一次抗体とした。次に、膜を［１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（SIGMA, P7949）］洗浄バッファ中で５分間、３回洗浄した。次に、１：１０００に稀釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Jackson, 115035-146）と共に、３０分間インキュベートした。膜を３回洗浄し、提供されているプロトコルに則って、目的のタンパク質を比色反応（Opti 4-CN,Biorad,170-8235）で検出した。

［１．８．エピトープマッピング］
エピトープマッピングは、Pepscan Presto BV（Zuidersluisweg 2, 8243RC Lelystad, The Netherlands）で行った。

［１．８．１．ペプチドライブラリーの合成］
標的分子のエピトープを再構築するために、ペプチドライブラリーを合成した。（i）製造者独自の親水性ポリマー物質をグラフトし、（ii）ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を用いて、ｔ－ブチルオキシカルボニル－ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、（iii）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ基を切断することによって、アミノ官能化ポリプロピレン支持体を得た。標準的なＦｍｏｃ－ペプチド合成により、アミノ官能化固相支持体上でペプチドを合成した。このとき、自己改造したJANUS liquid handling stations（Perkin Elmer）を使用した。構造模倣物の合成には、Pepscan独自のChemicallynked Peptides on Scaffolds（ＣＬＩＰＳ）技術を用いた。ＣＬＩＰＳ技術ならば、ペプチドを構造化して、一重ループ、二重ループ、三重ループ、シート状折畳み、らせん状折畳み、およびその組合せにすることができる。ＣＬＩＰＳテンプレートは、システイン残基に連結している。ペプチド中の複数のシステインの側鎖が、１個または２個のＣＬＩＰＳテンプレートと連結する。一例として、Ｐ２ ＣＬＩＰＳ（２，６－ビス（ブロモメチル）ピリジン）の０．５ｍＭ溶液を、重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：３（ｖ／ｖ））に溶解させる。この溶液を、ペプチドアレイ上に注入する。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイの固相に結合しているペプチド中に存在している、２つのシステイン側鎖と結合する（４５５ウェルのプレート；１ウェルあたり３μＬ）。ペプチドアレイを、溶液中で３０～６０分間穏やかに振盪する。このとき、ペプチドアレイが溶液に完全に覆われるようにする。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ_２Ｏで充分に洗浄する。次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１％ＳＤＳ／０．１％β－メルカプトエタノールを含んでいる破砕バッファ中で、７０℃にて３０分間超音波処理し、その後、Ｈ_２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理する。ペプチドを担持させるＴ３ ＣＬＩＰＳも同様の方法で作製したが、これは３つのシステインを用いた。

［１．８．２．ＥＬＩＳＡスクリーニング］
合成ペプチドの各々に対する抗体の結合を、Pepscan系ＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを、一次抗体溶液（Pepscanバッファ中に１μｇ／ｍＬのＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、ペプチドアレイを、１／１０００に稀釈したウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合抗体（Southern Biotech；表４）と共に、２５℃にて１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）と、２０μＬ／ｍＬの３％Ｈ_２Ｏ_２とを加えた。１時間後、発色を測定した。発色は、電荷結合素子カメラ（ＣＣＤカメラ）および画像加工システムを用いて、発色を定量化した。ＣＣＤカメラから得られた値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダと同じく、０～３０００ｍＡＵの範囲である。

［１．９．配列決定］
高品質なＲＮＡを、PureLink RNA Mini Kit（Life technologies, 12183018A）を用いてハイブリドーマ細胞から抽出して精製し、アガロースゲル上で扱った。精製したＲＮＡの全量を出発物質として、Superscript酵素（Invitrogen, 18064022）を使用して、第１鎖に相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。次に、HotStar HiFidelity Polymerase Kit（Qiagen, 202602）と、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしているｃＤＮＡを特異的に標的とする縮重プライマー（Biotem design）とを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を施した。ＰＣＲ産物はアガロースゲル上で扱い、配列を決定した（２本鎖配列を決定）。得られた配列を、専用のバイオインフォマティクスツール（Blast-ClustalW）を用いて集合および品質管理に関して分析し、ペプチド配列に翻訳した。

［１．１０．Biotemバッファの組成］

［２．結果］
モノクローナル抗体の様々な重鎖および軽鎖を検出できる特異的な抗免疫グロブリン抗体を用いたところ、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、抗κ軽鎖抗体（図１Ａ）および抗ＩｇＧ２ｂ重鎖（図１Ｂ）によって検出された。

ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１の重鎖および軽鎖の配列を決定した。それらに含まれている３つのＣＤＲ領域を示す（図２）。また、それぞれがＩｇＧ２ｂ重鎖およびκ軽鎖であることを確認した。

［２．１．ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖの表面ユニットに由来する線状エピトープ：SLDKHKHKKLQSFYPを認識する］
ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（Mybiosource製）を短縮した配列である５２９ペプチドのパネル（シグナルペプチドがなく、膜貫通ドメインが切断されている）を用いて、高ストリンジェンシー条件下にてエピトープマッピング試験を行った。この試験によって明らかになったところによると、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１抗体は、「SLDKHKHKKLQSFYP」というコア配列を有している直鎖ペプチドに結合する（図３左パネル）。このエピトープは、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の細胞外ドメイン内に含まれている（図３右パネル）。また、この配列は、Dewannieux et al（Dewannieux, Blaise, and Heidmann 2005）が報告したＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の、２９８～３１２の領域に対応している。このエピトープを、National Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔｐで検索すると、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ配列に対応する上位１００件のヒット配列において１００％の相同性を有している、高度に保存されたエピトープであることが明らかになる（データ不図示）。

〔２．２．ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、本来の状態において、グリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質およびグリコシル化されていないＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質を認識する〕
ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１がグリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖを認識する能力を、さらに分析した。この目的のために、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ細胞）を、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質をコードしているプラスミドでトランスフェクトした。種々の緩衝液を用いて何度か試みたものの、可溶性のＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質は抽出できなかった（データ不図示）。しかし、トランスフェクトされたＨＥＫ細胞溶解物に由来するグリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の不溶性断片が示すところによると、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ＥＬＩＳＡにおいて、グリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ抗原を特異的に認識している可能性がある（図４左パネル）。逆に、従来市販の抗ＨＥＲＶ＿Ｋ＿Ｅｎｖ＿ｍＡｂ（HERM-1821-5, IgG2b；AMSBIO製）は、グリコシル化されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖを検出しなかった（図４右パネル）。

この結果が示すところによると、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１はＥＬＩＳＡにおいて生物学的に活性であり、エピトープ：SLDKHKHKKLQSFYPが天然の条件においてアクセスできる。

ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１も、抗ＨＥＲＶ＿Ｋ＿Ｅｎｖ＿ｍＡｂ（HERM-1821-5, IgG2b；AMSBIO製）も、いずれも、ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ化した天然組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（E.Coli由来）を認識した（図５）。しかし、同じ濃度（１μｇ／ｍＬ）で試験した場合に、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、比較対象である抗ＨＥＲＶ＿Ｋ＿Ｅｎｖ＿ｍＡｂ（AMSBIO製）よりも、遥かに高い検出結果を示すことが判った（図５）。これによって証明されるのは、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖに対する親和性は、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１の方が高いことである。

図６に示すように、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１も、抗ＨＥＲＶ＿Ｋ＿Ｅｎｖ＿ｍＡｂ（HERM-1821-5, IgG2b；AMSBIO製）も、いずれも、ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグ化した変性組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ（E.Coli由来）を認識した。このことは、７５ｋＤａのシグナルにおいて観察される。

重要であることには、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ＨＥＫトランスフェクト細胞に由来する、グリコシル化された変性ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質をも検出する（９０ｋＤａにおけるシグナルから観察される）。一方、抗ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ抗体（AMSBIO製）では、シグナルは検出されなかった。さらに、非変性タンパク質を用いた上記のＥＬＩＳＡの結果に加えて、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、ウェスタンブロットにおいても生物学的な活性を示す。したがって、エピトープ：SLDKHKHKKLQSFYPは、変性状態においてもアクセス可能である。

［４．結論］
本報告により明らかになったところによると、マウスの免疫化、抗体のスクリーニング、およびモノクローナルハイブリドーマの選抜を経た後、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖのエピトープ：SLDKHKHKKLQSFYPを認識するマウスモノクローナル抗体（命名：ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１）が開発された。また、この抗体は、予期しない特性を示すことも明らかになった。

他の抗ＨＥＲＶ＿Ｋ＿Ｅｎｖ＿ｍＡｂ（HERM-1821-5, IgG2b；AMSBIO製）と生物学的に比較したところ、以下の事項が判明した。すなわち、起源（マウス）、アイソタイプ（ＩｇＧ２ｂ、κ）、および標的タンパク質（ＨＥＲＶ－Ｗ－Ｅｎｖタンパク質）が類似しているにもかかわらず、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１には、グリコシル化されたタンパク質およびグリコシル化されていないタンパク質の両方を認識するという利点があった。また、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、自然状態および変性状態の両方に対して高い親和性を示した。さらに、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１抗体は、データベースに登録されている多数かつ多様なＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ配列の中でも、安定で保存されているエピトープを標的化する。

したがって、ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１は、イムノアッセイにとって有用な道具であるのみならず、（例えば、ＡＬＳの）治療標的としてのＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に対する治療目的にも有用な道具である。ＨＥＲＶ－Ｋコピーの間においてエピトープ配列が安定であり、親和性が高く、天然のグリコシル化形態に対して効率的な結合することは、患者を有効に治療するための重要な条件を満たしている。この患者は、例えばＡＬＳ患者であり、異なるＨＥＲＶ－Ｋコピーが有意に発現している思われる患者である。

〔実施例２：ＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体は、ヒトニューロン細胞に対するＨＥＲＶ－Ｋエンベロープの神経毒性を効果的に中和する〕
［１．材料および方法］
［１．１．ヒトニューロン細胞］
ヒト神経幹細胞（ＮＳＣ）由来の培養ニューロン細胞を、既報の通り用意した（Efthymiou, Shaltouki et al. 2014）。要約すると、以下の通りである。まず、０．００２％ポリ－Ｌ－オルニチン（Sigma, St. Louis, MO）および１０μｇ／ｍＬラミニン（Life Technologies）でコーティングした９６ウェルプレートにＮＳＣを分割した（７５００～１０，０００細胞／ｃｍ^２）。播種から２４時間後に、ニューロン分化培地を添加した。分化培地はDMEM/F12を含んでおり、GlutaMax、１．８％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１×StemPro hESC supplement（全てLife Technologies製）、１０ｎｇ／ｍＬ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、およびグリア細胞下部由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ；R&D Systems, Minneapolis, MN）を添加した。７～１２日目のニューロンを、in vitroにて、神経毒性アッセイに利用した。

［１．２．神経毒性試験］
［１．２．１．ニューロンの形態および生存率］
Ｔｄ－トマト蛍光タンパク質を定常的に発現させて細胞およびプロセスを標識化してある培養ヒトニューロン細胞（１５，０００～２０，０００細胞／ウェル）を、上述のように９６ウェルプレートに播種した。このプレートを、５％ＣＯ_２、湿潤条件下の組織培養インキュベーター中で３７℃にて維持した。培養ニューロン細胞を、分化培地（上述）と、ＩｇＧサンプルＧＮ＿Ｋ０１または対照非免疫ＩｇＧ（Thermo Product # MA 1-10418）で処理した（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）。６０分のプレインキュベート後、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（My BioSource, amino acid 90-632, Cat # MBS1391552）を添加した（最終濃度：１００ｎＭ）。ＧＮ＿Ｋ０１ Ｉｇの１つのサンプルを、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖと共に３０分間プレインキュベートした後、一緒にヒトニューロンに加えた。培養ニューロン細胞をGE INCell Analyzer 2000 BioImagerで観察して、様々な時点における各ウェルの画像を得た（処理後２４時間、４８時間、７２時間。１ウェルあたり４枚の画像）。この培養細胞のハイコンテントな撮像および分析には、GE Investigator 1.93分析ソフトウェアを用いた。ニューロン生存率、神経突起長および他の形態学的パラメータを、サンプルごとに定量化した。Graph Pad Prism 7.02でデータを描画した。

［１．２．２．電気生理学的分析］
Axion Maestro微小電極アレイアッセイ（ＭＥＡアッセイ）による電気生理学的分析
４８ウェルｔ－ＭＥＡプレートに培養ヒトニューロン細胞を播種して分析した。このプレートには、１ウェルあたり１６個の活動記録電極が設けられている。２００，０００個のニューロンをｔ－ＭＥＡプレートの各ウェルに注入し、培養物を５％ＣＯ_２、湿潤条件下の組織培養インキュベーター中で３７℃にて維持した。電気生理学的活動（ウェル中のスパイク発生率の増加によって示される）は、第２１日までにin vitroにおいて有意に上昇した。電気生理学的活動は、１日あたり５分間、全てのウェル中の自発的な電気活動を記録することによってモニタリングした。この時点で、培養ヒトニューロン細胞を、分化培地（上述）と、ＩｇＧサンプルのＧＮ＿Ｋ０１または対照の非免疫ＩｇＧ（Thermo Product # MA 1-10418）と、で処理した（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）。６０分間プレインキュベートした後、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（My BioSource）を加えて、最終濃度を１００ｎＭとした。上述の条件において、抗体は、初めにＥｎｖを含んでいない細胞に添加される。そのため、「患者の脳組織中に治療抗体が拡散して存在している」という処置された患者の状態が再現されている。その後、活性なＥｎｖタンパク質を添加する（このタンパク質は、抗体と一緒にプレインキュベートされておらず、「事前に中和」されておらず、不活性なタンパク質として添加されない）。これにより、細胞外空間における細胞外分泌を伴う病原性タンパク質の発現が再現されている。ＧＮ＿Ｋ０１ Ｉｇの１つのサンプルを、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖと共に３０分間プレインキュベートした後、一緒にヒトニューロンに加えた。処理後２４時間から、自発的な電気活動を毎日記録した。電気的活動の定量化には、Axion Axisソフトウェアを用いた。スパイク数、平均発火率およびバースト数などのパラメータを、処理ごとに決定した。

［２．結果］
［２．１．細胞外ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質はヒトニューロン細胞に対して毒性があり、その毒性はＧＮ＿ｍＡｂ＿Ｅｎｖ＿Ｋ０１（ＧＮ＿Ｋ０１）抗体によって特異的に阻害される］
［２．１．１．ニューロンの生存率］
１００ｎＭの組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質で処理した培養ヒトニューロン細胞では、有意な神経毒性が示された。その結果、翌日までに重大なニューロン細胞の損失が生じた。ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質への曝露から５日後に、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖの効果を定量化した。ＥｎｖおよびＧＮ＿Ｋ０１ Ｉｇ（３μｇ／ｍＬ）で処理したニューロンは、Ｅｎｖで処理ニューロンと比較して、生存率が向上していたことが観察された。ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を培地に添加した５日後に分析したところ、Ｅｎｖおよび非免疫ＩｇＧ対照抗体（３μｇ／ｍＬ）で処理した細胞では、同様の毒性が示された。ＧＮ＿Ｋ０１（３μｇ／ｍＬ）で処理したニューロンは、（i）ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖに先立って処理したものであっても、（ii）Ｅｎｖと共にプレインキュベートした後、培養ニューロン細胞適用されたものであっても、ニューロンの生存率をさらに有意に向上させた。これによって、ＧＮ＿Ｋ０１抗体のＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の毒性を中和する効果が確認された（図７）。

［２．１．２．ニューロンの神経突起長］
平均神経突起長に対するＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖの影響を、並行して分析した。Ｅｎｖに曝露したニューロンに対してＧＮ＿Ｋ０１（３μｇ／ｍＬ）を添加すると、Ｅｎｖで処理したニューロンまたはＥｎｖおよび対照非免疫Ｉｇで処理した処理ニューロンと比較して、神経突起長が有意に増加した（図８）。

［２．１．３．ニューロンの機能活性］
Axion Maestro MEAシステムを用いた電気生理学的研究によって、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ処理が、自発的な電気活動（正常なニューロン活動の主要な特徴）に対する機能的変化を生じさせたか否かを評価した。４８ウェルＭＥＡプレートに培養ヒトニューロン細胞を播種してから２１日後、（i）分化培地（上述）および（ii）ＧＮ＿Ｋ０１または対照非免疫ＩｇＧ（Thermo Product # MA 1-10418）、の中で培養細胞をインキュベートした（最終濃度：３μｇ／ｍＬ）。６０分のプレインキュベート後、組換えＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質（My BioSource, Cat # MBS1391552）を添加した（最終濃度：１００ｎＭ）。ＧＮ＿Ｋ０１ Ｉｇの１つのサンプルを、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖと共に３０分間プレインキュベートした後、一緒にヒトニューロンに加えた。処理後２４時間から、自発的な電気活動を記録した。ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖによる処理後２４時間において、Ｅｎｖで処理したニューロンは、スパイク数および平均発火率が４０％減少した。ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖおよび対照非免疫ＩｇＧ処理に曝露したニューロンは、スパイク数および平均発火率が約３０％減少した。最も興味深いことに、ＨＥＲＶ－Ｋ－ＥｎｖおよびＧＮ＿Ｋ０１に曝露したニューロンは、コントロール培地のみでインキュベートしたウェルと同様のスパイク数および平均発火率を示した。このことから、全体的なニューロンの機能活動に対するＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖの病原性効果が、完全に阻害されたことが示される（図９）。

［３．結論］
したがって、ＧＮ＿Ｋ０１抗体の効力は特異的である。ニューロンをＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に曝露した結果生じる病原性に対する有利な効果は、以下の有意なデータによって立証された。（i）細胞死を阻害する。（ii）ニューロン細胞の形態および神経突起長を維持する。（iii）無関係な対照抗体を用いて（または、抗体を用いずに）ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖに対して曝露したニューロンと比較して、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の病原性の存在下における電気生理学的活動によって測定されるニューロンの機能活動を、完全に回復させる。

したがって、（i）散発性ＡＬＳ患者の脳実質内の変質したニューロンにおいて、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質が特異的に検出され、さらに、（ii）「ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質のみでも、この特有のタンパク質をコードしているＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおいて再現された、散発性ＡＬＳの臨床的徴候および組織学的徴候である病原性の原因となる」という概念（Li, Lee et al,2015）が証明された後には、ヒトニューロンの細胞的側面および機能的側面に関して本発明者らによって実証されたように、ＧＮ＿Ｋ０１抗体の特異的な有効性によって、ＡＬＳ（とりわけ散発性ＡＬＳ）に対する治療価値が証拠づけられる。

この抗体の特異的な活性は、ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質の病原性効果を中和する（すなわち、治療する）と考えられる。Ｅｎｖタンパク質は、それ自体、散発性ＡＬＳ患者の脳内におけるＡＬＳに特徴的なニューロン病変との関連が示されている。また、Ｅｎｖタンパク質を培養ニューロン細胞に添加した場合（または、マウスにおいて単一の導入遺伝子として発現させた場合）、ＡＬＳに見られる臨床徴候と同じニューロン変性を再現することも示されている。さらに、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ病原性タンパク質の存在下においてＧＮ＿Ｋ０１抗体を添加した場合は、in vitroにおいてＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖ組換えタンパク質とＧＮ＿Ｋ０１とをプレインキュベートした場合よりも、有効性が有意に高かった。このことは、ＧＮ＿Ｋ０１が、生理学的状態において（したがって、治療的応用において）最適な有効性を示すことを表している。

ＨＥＲＶ＿Ｋタンパク質の毒性は、トランスフェクトされた標的細胞における細胞内発現（または、既報の通りトランスジェニック動物のニューロンにおける細胞内発現）だけに関与している訳ではない。この他に、正常なニューロン（ＨＥＲＶ－Ｋをトランスフェクトされていない、または、ＨＥＲＶ－Ｋを過剰発現していないニューロン）に対する、分泌された細胞外ＨＥＲＶ－Ｋタンパク質の病原性も関与している。したがって、本発明の抗体はまた、分泌されたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質および／または細胞外ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質に対するニューロンの曝露によって誘導される細胞毒性の傍分泌拡散から、ヒトニューロン細胞を保護する。この保護作用は、潜在的に、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖをコードしている遺伝子を発現している（または、過剰発現している）ニューロンにおいて産生される、ＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖタンパク質の自己分泌による細胞毒性にも適用される。

結論として、本発明に係るＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を特異的に標的とする抗体は、ＡＬＳ（特に、散発性ＡＬＳ）において見られる、またはＡＬＳの特徴を再現すしたＨＥＲＶ－Ｋ－Ｅｎｖトランスジェニックマウスモデルにおいて見られる病態生理学的特性を、中和することができる。

〔参考文献〕
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Claims (9)

1. Ｋ型ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ－Ｋ）エンベロープタンパク質を認識する抗体であって、
   上記抗体は、配列番号９に記載のエピトープに結合し、
   上記抗体は、
   ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３）を有している軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖と、
   ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３）を有している重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖と、
   を有しており、
   上記ＣＤＲ－Ｌ１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、上記ＣＤＲ－Ｌ２は配列番号２に記載のアミノ酸を含み、上記ＣＤＲ－Ｌ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、上記ＣＤＲ－Ｈ１は配列番号４のアミノ酸配列を含み、上記ＣＤＲ－Ｈ２は配列番号５のアミノ酸配列を含み、上記ＣＤＲ－Ｈ３は配列番号６のアミノ酸配列を含む、
   抗体。
2. 上記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含んでおり、
   上記重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含んでいる、
   請求項１に記載の抗体。
3. 上記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
4. 上記抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体。
5. 治療における使用のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
6. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置のための、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体を含んでいる医薬組成物。
7. 上記筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は散発性ＡＬＳである、請求項６に記載の医薬組成物。
8. 請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体と、薬学的に許容可能な賦形剤と、を含んでいる、医薬組成物。
9. 生体サンプル中のＨＥＲＶ－Ｋエンベロープタンパク質を検出するin vitroの方法であって、
   上記生体サンプルを、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗ＨＥＲＶ－Ｋエンベロープ抗体と接触させる工程を含む、方法。

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