UA126677C2 - Антитіло проти оболонкового herv-k і його застосування - Google Patents

Антитіло проти оболонкового herv-k і його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA126677C2
UA126677C2 UAA201909194A UAA201909194A UA126677C2 UA 126677 C2 UA126677 C2 UA 126677C2 UA A201909194 A UAA201909194 A UA A201909194A UA A201909194 A UAA201909194 A UA A201909194A UA 126677 C2 UA126677 C2 UA 126677C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
antibody
epm
nekm
specified
protein
Prior art date
Application number
UAA201909194A
Other languages
English (en)
Inventor
Ерве Перрон
Эрве Перрон
Жюлі Медіна
Жюли МЕДИНА
Авіндра Нат
Авиндра Нат
Джозеф Пері Штайнер
Джозеф Пери Штайнер
Веньсюе Лі
Веньсюе Ли
Міуонґ-Хва Лі
Миуонг-Хва Ли
Original Assignee
Женьоро Са
Те Юнайтед Стейтс Оф Амеріка, Ез Репрезентед Бай Те Секретарі, Департмент Оф Хелт Енд Хьюман Сервісиз
Те Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Те Секретари, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Женьоро Са, Те Юнайтед Стейтс Оф Амеріка, Ез Репрезентед Бай Те Секретарі, Департмент Оф Хелт Енд Хьюман Сервісиз, Те Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Те Секретари, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз filed Critical Женьоро Са
Publication of UA126677C2 publication Critical patent/UA126677C2/uk

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C07K14/162—HIV-1 ; HIV-2 env, e.g. gp160, gp110/120, gp41, V3, peptid T, CD4-Binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
    • C07K16/1045—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV
    • C07K16/1063—Lentiviridae, e.g. HIV, FIV, SIV env, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, PND, CD4 binding site
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/66—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a swap of domains, e.g. CH3-CH2, VH-CL or VL-CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/28—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Vibrionaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Abstract

Винахід стосується антитіла проти оболонкового HERV-K, яке впливає на консервативну область, що не піддається глікозилуванню або природній конформації, та до його застосування в діагностиці і/або в терапії.

Description

Галузь техніки
Даний винахід відноситься до нового антитіла проти оболонкового НЕКУ-К, яке впливає на консервативну область, яка не піддається глікозилюванню або природній конформації та до його застосування в діагностиці і/або в терапії.
Рівень техніки
Бічний аміотрофічний склероз (БАС) - захворювання, яке вперше було описано французьким невропатологом Жаном-Мартеном Шарко, і його назва відбиває як дегенерацію кортико-спінальних мотонейронів, нисхідні аксони яких демонструють змінену структуру в бічних відділах спинного мозку (бічний склероз), так і загибель спінальних мотонейронів із вторинною денервацією, яка поєднується з м'язовою атрофією (аміотрофія) (Тауїог, Вгому/п і СІемеІапа 2016). Дійсно, БАС є прогресуючим і таким, що врешті призводить до летального результату, нейродегенеративним захворюванням, яке виникає внаслідок дегенерації мотонейронів у руховій області кори головного мозку, стовбуровій області мозку й у спинному мозку, які задіяні у плануванні і контролі за виконанням довільних рухів. Летальний результат у типовому випадку наступає через 3-5 років після встановлення діагнозу (Тауїог, Вгом/п і СіІемеїапа 2016).
Поширеність БАС досягає приблизно 5 випадків на 100 000, що відбиває швидку летальність захворювання (Тауг, Вгомуп і Сіемеіапа 2016). Близько 1095 випадків БАС, очевидно, передаються генетичним шляхом у родинах (спадковий БАС) у контексті специфічних геномних мутацій. Наприклад, приблизно 2095 родинного БАС пов'язані з мутацією в гені супероксиддисмутази (50941) (Мисіс і Кіегпап 2009; Козеп 1993). Інші неродинні випадки класифікуються як спорадичний БАС (90 90 випадків БАС) (І адієї- Тоигеппе і СІемеїапа 2009), припускають, що вони зустрічаються без родинного анамнезу.
Нейродегенеративні розлади, такі як хвороби Паркінсона, Хантінгтона, Альцгеймера, лобово-скронева лобарна дегенерація (ЕТ О) і БАС пов'язані з нагромадженням неправильно згорнутих білків як усередині, так і зовні нейронних і гліальних клітин у центральній нервовій системі (РоїЇутепідои і СіемеЇапа 2011). Ці неправильно згорнуті білкові агрегати є патологічними ознаками кожного захворювання й можуть поширюватися від клітини до клітини через пріоноподібний механізм після ініціюючої події. Одна широко поширена думка полягає в тому, що ці агрегати відіграють критичну роль в ініціюванні й розвитку захворювання із імовірним
Зо набуванням неправильно згорнутими версіями ендогенних білків токсичних властивостей, потенційно через збільшену гідрофобність і/або секвестрацію необхідних клітинних компонентів усередині таких агрегатів, утворення оксидативних сполук, інгібування протеасом та іншими шляхами. Альтернативна точка зору полягає в тому, що великі агрегати не представляють токсичну форму на відміну від кінцевого продукту захисної клітинної відповіді, орієнтованого на захист клітин від впливу більш токсичних олігомерних сполук, які залишаються невиявленими більшістю методик (Роіутепідои і Сіемеїапа 2011).
Дослідження зразків сироватки, отриманих від хворих на БАС, але серонегативних за екзогенними вірусом імунодефіциту людину (ВІЛ) або вірусом людського Т-клітинного лейкозу (НТІМ), показали ревертазну (КТ) активність в 50-60 9о зразків БАС із рівнем, співрозмірним з таким у ВІЛ-інфікованих пацієнтів (МассСомап та ін. 2007; МеоСоптіскК та ін. 2008; Апагему5 та ін. 2000; Біеєіє та ін. 2005). Це узгоджується з тим фактом, що були підозри про участь ретровірусів протягом декількох років після з'ясування того, що БАС-подібні синдроми здатні викликати як ретровіруси миші, так і людини (МеоСогтіскК та ін. 2008). БАС-подібний розлад у
ВІЛ-позитивних пацієнтів може стихати під дією антиретровірусної терапії (Моцііднпіег та ін. 2001; моп Сіезеп та ін. 2002).
Це є дійсним для симптоматики БАС у ВІЛ-інфікованих пацієнтів і може, проте, бути специфічною підкатегорією випадків БАС.
Підвищена КТ-активність була також відзначена в сироватці родички першого ступеня хворих на БАС, що дозволяє припустити, що активність КТ може походити від успадкованих активних копій людських ендогенних ретровірусів (НЕКУ), які представляють 8 9о нашого генома («евеіе та ін. 2005).
Проте, виявлення КТ-активності при БАС, як таке, не ідентифікує походження цього ферменту, однак посмертні дослідження мозку виявили участь НЕКМ-К (ЮОоиміе та ін. 2011).
Секвенування показало, що у хворих на БАС хромосомні локуси 7434 і 7436.1 (які відповідають
НМІ-2 ї НМІ-3 підродинам НЕКМ-К, відповідно) експресуються більш часто в порівнянні з контролем (ОоиміМе і Май 2014). Крім того, недавно були зроблені спостереження того, що як дад-рої, так і епм РНК НЕКМУ-К демонструють значно збільшену експресію в мозку пацієнтів з
БАС у порівнянні з контролем (І і та ін. 2015).
Експресія НЕКМУ-К у культурах нейронів людини викликала цитотоксичність нейронів, що бо фіксувалося за зниженням кількості нейронів, і також ретракцією аксонів дозозалежним чином після трансфекції всього генома НЕКМ-К або тільки гена НЕКМ-К-Епу. Було зроблене припущення, що свій внесок у нейротоксичність міг мати внутрішньоклітинний білок НЕКМ-К-
Епу. Це отримало підтвердження в ході випробування СКІ5Р/сазро, яке показало дворазове збільшення експресії НЕКМ-К при його ЇТЕ. активації фактором транскрипції УРбА (ії та ін. 2015). Експресія НЕКУ-К викликає іп мімо втрату об'єму рухової області кори головного мозку у трансгенних мишей, які експресують ген НЕКМ-К-епм у кортикальних нейронах, яка виявляється незалежною від імунної реактивності за даними вимірювань з адаптерною молекулою 1 (Іва-1), яка зв'язує іонізований кальцій і є маркером пошкодження мікроглії (І і та ін. 2015). Поведінкові аналізи показали, що трансгенні миші НЕКМ-К-епм переміщалися на більш короткі відстані, відпочивали протягом більш тривалих періодів часу й швидше падали в тестах з обертовим стрижнем, демонструючи ознаки м'язової спастичності зі збільшеним стисканням задніх кінцівок.
На додачу до цих моторних дисфункцій у трансгенних мишей розвивалася помітна слабість кінцівок і спинних м'язів, включаючи задіяні в реалізації респіраторної функції, приводячи до 50 95-ої летальності до 10 місяців (Гі та ін. 2015).
Цікаво, що експресія НЕКМУ-К КТ корелювала зі збільшеними рівнями ТОР-43 у нейронах хворих на БАС, що вказує на те, що експресія КТ відбувається в комбінації з іншими пов'язаними з порушеннями клітинних процесів ознаками захворювання (Вигайі апа Вагаїе 2009; Севзег та ін. 2009; Юоиміе та ін. 2011). Дані на користь такого пріоноподібного механізму
БАС у цей час включають основні неправильно згорнуті білюим 5001 і ТОР-43 (РоїЇутепідом і
СіІемеіїапа 2011). Недавно її та ін. продемонстрували, що ТОР-43 міг активувати експресію
НЕНУ-К-епм у людському нейроні, що узгоджується з їхніми спостереженнями того, що ТОР-43 може зв'язуватися з областю 726-000 СТ000-734 довгого кінцевого повтору (ТЕ) НЕКУ-К (І і та ін. 2015). Вони також показали, що сайленсинг ендогенного ТОР-43 знижував експресію
НЕВУ-К. Ці результати були недавно доповнені демонстрацією того, що нормальний ТОР-43 ніяк не впливає на транскрипцію НЕКУМ-К у людських астроцитах і нейронах іп міїго, тоді як ТОР- 43 має сайт зв'язування в області 05 промотору НЕКУМ-К. Останнє зв'язування посилюється при запаленні, наприклад, у присутності фактора некрозу пухлини (ТМЕоа) або при інгібуванні протеосоми (МапопПега, Регдизоп-Раїту і Ооимійе 2016). Цікаво, що це ж дослідження показало, що суперекспресія агрегированних форм ТОР-43 підсилювала експресію й нагромадження
Зо вірусного білка НЕКМ-К, коли дикий (нормальний) тип ТОР-43 цього не робив (МапонНега,
Еегаизоп-Раїту і ЮоцміШе 2016). Крім того, незважаючи на ознаки збільшення кількості стресових гранул і посилення аутофагічної реакції в коркових нейронах БАС, ці клітини були не в змозі усунути надлишкове нагромадження білка НЕКУ-К. Імовірно, промотор ТОР-43 відповідає на асоційовані з інтерфероном і запаленням фактори транскрипції типовим для більшості ретровірусних рестрикційних факторів чином, оскільки він містить сайти зв'язування для регуляторних факторів інтерферону (ІКЕ1, ІКЕЗ) і ядерного каппа-фактора В (МЕКВ) (ЮоиміШе та ін. 2011).
Загалом, ці факти дозволяють припускати, що ендогенні ретровірусні елементи й НЕКМ-К, зокрема, включаються в патофізіологію БАС і можуть бути відсутньою ланкою між ТОРА4З і цієї протеїнопатією. Тому експресія оболонкового білка НЕКМ-К у нейронах пацієнтів з БАС може вносити вклад у нейродегенерацій й патогенез захворювання.
Дотепер єдиним відносно ефективним лікарським засобом залишається рилузол, що забезпечує симптоматичну терапію, яка збільшує середню тривалість виживання пацієнтів лише на 3-6 місяців (Нагаїтап, мап деп Вегоу і Кіегпап 2011). Дані лікувальні протоколи засновані на симптоматичній терапії й на збереженні якості життя, що забезпечується мультидисциплінарним підходом. Розробка ефективної терапії залишається критично необхідністю для хворих із цим швидко прогресуючим смертельним захворюванням (Нагаїтап, мап деп Вега і Кіегпап 2011).
Відповідно, зберігається незадоволена потреба розробки ефективних терапевтичних засобів для лікування БАС.
Короткий виклад сутності винаходу
Автори даного винаходу розробили нове антитіло проти оболонкового білка НЕВМ-К, яке демонструє несподівані властивості.
Автори винаходу показали, що запропоноване даним винаходом антитіло, яке називається
СМ тАр Епм КО1, є мишачим моноклональним антитілом (ТАБ), яке селективно зв'язується з лінійним епітопом З'ЮОКНКНККГОЗЕМР (ЗЕО ІЮ МО:9) на поверхні білка НЕКМ-К-епу.
СМ тАр Епм КО1 є повнорозмірним антитілом мишачого підкласу Ідс2бр/каппа. Біологічна активність СМ тАр Епм КОЇ була підтверджена імунологічними аналізами ЕГІЗА і вестерн- блотингу. Як не дивно, ЗМ тАбБ Епм КО1 розпізнавав як нативний, так і денатурований білок
НЕВУ-К-Епу, а також глікозильовану й неглікозильовану форми, у той час як комерційне Апії- бо НЕНУ-К-Епму антитіло виявилося не в змозі виявити глікозильовану форму.
Крім того й найбільш несподівано, цільовий епітоп виявився дуже консервативним і мав стабільну амінокислотну послідовність у генах НЕКУМ-К епу, описаних у базах даних.
Це надає даному антитілу унікальне позиціонування безвідносно копії НЕКУ-К, яка залучена в патогенну експресію оболонкового білка. Ці несподівані результати вказують на те, що
СМ тАБ Епм КО1 є оригінальним інструментом для цілеспрямованого впливу на оболонкові білки НЕКУ-К. Вони також показують, що добір і одержання такого моноклонального антитіла не могли бути передбачені або передвіщені даним протоколом імунізації навіть фахівцями.
Таким чином, даний винахід відноситься до антитіла, яке розпізнає оболонковий білок
НЕВУ-К, при цьому зазначене антитіло зв'язується з епітопом Б ОКНКНККІГО5ЕМУР (5ЕО І
МО:9).
Даний винахід також відноситься до застосування в терапевтичних цілях антитіла, яке розпізнає оболонковий білок НЕКМ-К, при цьому зазначене антитіло зв'язується з епітопом
ЗІ ОКНКНККІ О5ЕУР (ЗЕО ІЮ МО 9).
Винахід також відноситься до застосування антитіла, яке розпізнає оболонковий білок
НЕВУ-К і яке зв'язується з епітопом ЗІ ОКНКНККІГО5ЕУР (ЗЕО ІО МО:9), при способі лікування бічного аміотрофічного склерозу (БАС), переважно спорадичного БАС.
В іншому об'єкті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить зазначене вище антитіло й фармацевтично прийнятний наповнювач.
У ще одному об'єкті винахід також відноситься до способу детекції оболонкового білка
НЕВУ-К у біологічному зразку, який передбачає стадію введення в контакт зазначеного біологічного зразка із зазначеним вище антитілом до оболонковому НЕКМ-К.
Інший об'єкт винаходу також відноситься до способу діагностики в пацієнтів БАС, зокрема, спорадичного БАС, який передбачає стадію введення в контакт біологічного зразка, отриманого від зазначеного пацієнта, із зазначеним вище антитілом до оболонковому НЕКМ-К.
Докладний опис винаходу
Визначення
У даному контексті термін "лікування" або "терапія" для цілей даного винаходу означає купірування, полегшення, уповільнення розвитку або попередження розладу або стану, до якого такий термін застосовується, або купірування, полегшення, уповільнення розвитку або попередження одного або декількох симптомів розладу або стану, щодо якого такий термін використовується.
У даному контексті термін "профілактика" відноситься до недопущення виникнення захворювання або стану в суб'єкта, який ще не демонстрував клінічних симптомів, типових змін або фізіологічних дисфункцій, які зробили б можливим його клінічне діагностування.
У даному контексті, терміни "антитіло" або "імуноглобулін" мають однакове значення й застосовуються в даному винаході на рівних підставах. Термін "антитіло" для цілей даного винаходу відноситься до молекул імуноглобуліну й імунологічно активних ділянок молекул імуноглобуліну, тобто молекул, які містять антигензв'язувальний активний центр антитіла, який специфічно зв'язує антиген. Як такий, термін "антитіло" охоплює не тільки цілі молекули антитіла, але також і фрагменти антитіл, а також похідні антитіл.
У даному контексті вираження "фрагмент антитіла" відноситься до ділянки такого антитіла, яке імітує гіперваріабельну ділянку, такої як СОК (СОВ-І1, СОВ-12, СОВ-І 3, СОВ-НІ, СОВ-Н2,
СОВ-НЗ). Фрагменти антитіла відповідно до даного винаходу зберігають афінність зв'язування й специфічність зазначеного антитіла. Такі фрагменти є функціональними аналогами зазначеного антитіла й вони зв'язуються, вдасне кажучи, з тим же самим епітопом, що і зазначене антитіло.
Приклади фрагментів антитіла включають, але не обмежуються важким ланцюгом, легким ланцюгом, МІ, УН, Ем, Раб, Раб, Е(ар)2 і Е(аб)2.
У даному контексті поняття "похідне антитіла" відноситься до фрагмента запропонованого винаходом антитіла, що переважно включає щонайменше один СОК зазначеного антитіла, переважно щонайменше один СОКЗ зазначеного антитіла, злитий із щонайменше однією послідовністю, відмінною від природної послідовності (наприклад, лінкерна послідовність іншого виду тварин...), при цьому зазначене похідне має афінність зв'язування й специфічність до
НЕВУ-К Епу, співрозмірні з такими характеристиками запропонованого винаходом антитіла.
Похідні запропонованого даним винаходом антитіла зберігають афінність зв'язування й специфічність зазначеного антитіла. Такі похідні є функціональними аналогами зазначеного антитіла й вони зв'язуються, вдасне кажучи, з тим же самим епітопом, що і зазначене антитіло.
Приклади похідних антитіла включають, але не обмежуються 5сгЕм, (5СЕм)2 і димерами.
У природних антитілах два важкі ланцюги (НС) зв'язані один з одним дисульфідними зв'язками, і кожний важкий ланцюг зв'язаний дисульфідним зв'язком з легким ланцюгом (ІС). бо Існують два типи легкого ланцюга: лямбда (І) і каппа (К). Є п'ять головних класів (або ізотипів)
важкого ланцюга, які визначають функціональну активність молекули антитіла: ІМ, Ід, до, ІдЧА і ІМЗЕ. Кожний ланцюг містить домени з різними послідовностями.
Як правило, легкий ланцюг включає два домена: варіабельний домен (МІ) їі константний домен (СІ). Важкий ланцюг включає чотири домена: варіабельний домен (МН) і три константні домена (СНІ, СНО і СНЗ, які разом називаються СН). Варіабельні області й легкого (МІ) і важкого (МН) ланцюгів визначають зв'язувальну ділянку, специфічну до даної антигенної детермінанти. Домени константної області легкого (СІ) і важкого (СН) ланцюгів відповідальні за важливі біологічні властивості, такі як асоціація ланцюгів антитіла, секреція, трансплацентарна рухливість, зв'язування комплементу й зв'язування з Ес-рецепторами (БСК). Ем-фрагмент є М- кінцевою частиною Раб-фрагмента імуноглобуліну й складається з варіабельних ділянок одного легкого ланцюга й одного важкого ланцюга. Специфічність антитіла полягає в структурній комплементарності між зв'язувальним сайтом антитіла й антигенною детермінантою.
Зв'язувальні сайти антитіла складаються з таких залишків, які насамперед походять із гіперваріабельних або тих ділянок (СОК), які визначають комплементарність. Іноді на загальну структуру домена й тим самим на зв'язувальні сайти впливають залишки з негіперваріабельних або каркасних ділянок (ЕК). "Ділянки, які визначають комплементарність" або "СОК" відносяться до таких амінокислотних послідовностей, які разом визначають афінність і специфічність зв'язування природної ЕРу-області нативного сайту зв'язування імуноглобуліну. Кожний із легких і важких ланцюгів імуноглобуліну містить три ділянки СОК, які позначаються І -СОВА1, І-СОНР2, 1 - сОокКЗ ії Н-СОВІ, Н-СОВН2г, Н-СОКЗ, відповідно. Таким чином, антиген-зв'язувальний сайт включає шість СОЕК, які складають комплект СОК із кожної М-області важкого й легкого ланцюга.
Каркасні ділянки (ЕК) відносяться до амінокислотних послідовностей, які розміщаються між
Сов.
У даному контексті термін "химерне антитіло" відноситься до антитіла, яке містить МН-домен і Мі-домен антитіла будь-яких видів тварин, бажано миші, а також СН-домен і Сі -домен людського антитіла.
Відповідно до даного винаходу, термін "гуманізоване антитіло" відноситься до антитіла, яке має варіабельну каркасну ділянку й константні області людського антитіла, але зберігає СО антитіла будь-якого виду тварин, бажано миші.
Зо Термін "Бар" позначає фрагмент антитіла з молекулярною масою близько 50 000, який проявляє антиген-зв'язувальну активність, у якому серед фрагментів, отриманих при обробці
Ід протеазою папаїном, близько половини М-кінцевої частини Н-ланцюга й увесь І-ланцюг зв'язані один з одним дисульфідним зв'язком.
У даному контексті термін "К(ар)2" відноситься до фрагмента антитіла, що має молекулярну масу близько 100 000, і який проявляє антиген-зв'язувальну активність, який серед фрагментів, отриманих при обробці ІдсС протеазою пепсином, трохи сильніше, ніж ар, зв'язаний дисульфідним зв'язком шарнірної ділянки.
У даному контексті термін "бар" відноситься до фрагмента антитіла, що має молекулярну масу близько 50 000, і який проявляє антиген-зв'язувальну активність, який утворюється при руйнуванні дисульфідного містка шарнірної ділянки Е(ар)2.
Поняття "одноланцюговий Ем" або "5сЕм" відносяться до поліпептиду, який є ковалентно зв'язаним гетеродимером МН.УГ. і звичайно експресується при злитті генів, включаючи гени, які кодують МН і МІ, з'єднані лінкером, який кодує пептиди. "а5Ем" є гетеродимером УНУМІ, стабілізованим дисульфідним зв'язком. Двовалентні й полівалентні фрагменти антитіл можуть утворюватися або спонтанно - при об'єднанні одновалентних 5сЕм5, або ж можуть бути отримані шляхом з'єднання одновалентних 5сЕм5 пептидним лінкером, як, наприклад, двовалентний 5е(ЕМ)2.
Термін "диатіла" відноситься до невеликих фрагментів антитіл із двома антиген- зв'язувальними сайтами, які містять варіабельний домен важкого ланцюга (МН), пов'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (МІ) в одному й тому ж поліпептидному ланцюзі (УН-
МУ). За допомогою використання лінкера, занадто короткого, щоб допустити спаровування між двома доменами вв одному і тому ж ланцюзі домени змушені спаровуватися з комплементарними доменами іншого ланцюга й створювати два антиген-зв'язувальних сайти.
У даному контексті поняття "запропоноване винаходом антитіло" відноситься до антитіла, спрямованого проти, тобто такого, що специфічно зв'язується з оболонковим білюм НЕКМ-К (НЕВКМ-К Епу), бажано проти оболонкового білка НЕКМ-К родини ендогенних ретровірусів людини типу К (НЕКУ-К), ще краще, проти епітопа, наведеного в 5ЕО ІЮ МО:9.
У даному контексті термін "біологічний зразок" для цілей даного винаходу відноситься до будь-якого біологічного зразка, одержаного з мтою оцінки іп міго. У даному винаході зразок або бо отримана від пацієнта проба можуть містити будь-яку рідину організму або специфічну для захворювання або ураження тканину, наприклад, біопсію. Приклади рідин організму включають кров, сироватку, плазму, аспіраційну рідину із соска молочної залози, сечу, слину, синовіальну рідину й цереброспінальну рідину (С5БЕ).
У типовому випадку запропоноване винаходом антитіло захищає людські нейронні клітини від цитотоксичності, спричиненої впливом на нейрони білка НЕКМ К Епу.
Більш конкретно, запропоноване винаходом антитіло бажано демонструє один або декілька з поміж наступних функціональних ознак: - воно зберігає нейрональну функціональну активність нейронів, які зазнали впливу білка
НЕВМ К Епу; - воно зберігає клітинну життєздатність нейронів, які зазнали впливу більла НЕКМ К Епу; імабо - воно зберігає нейрональну морфологію нейронів, які зазнали впливу білка НЕКМ К Епу.
Захисний ефект запропонованого винаходом антитіла щодо нейрональної функціональної активності проти позаклітинної цитотоксичності оболонкового НЕКМ-К може бути оцінений іп міго, як показано в прикладі 2 даного винаходу (див. пункт 2.1.3). Зокрема, такий ефект може бути оцінений за допомогою реєстрації спонтанної електрофізіологічної активності людських нейронів іп міго після обробки рекомбінантним білюоюм НЕКМ-К Епу. Так, у типовому випадку терапія запропонованим винаходом антитілом відновлює спонтанну активність людських нейронів, які зазнали впливу рекомбінантного білка НЕКМ-К Епу, щонайменше на 50 95, зокрема, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 9о, щонайменше на 80 96, щонайменше на 90 956 або щонайменше на 95 95 у порівнянні з людськими нейронами, які не зазнали впливу зазначеного рекомбінантного білка НЕКМ-К Епу.
В одному втіленні захисний ефект запропонованого винаходом антитіла може бути як варіант або крім цього оцінений іп міго за допомогою аналізу життєздатності нейрональної культури після обробки рекомбінантним білюм НЕКМ-К Епу, що, наприклад, ілюструється в прикладі 2 (див. пункт 2.1.1). У типовому випадку в одному такому втіленні терапія запропонованим винаходом антитілом збільшує життєздатність людських нейронів, преінкубованих з рекомбінантним білюм НЕКМ-К Епм, щонайменше на 20 95 у порівнянні з життєздатністю людських нейронів, які не зазнавали терапії зазначеним запропонованим винаходом антитілом.
В одному втіленні захисний ефект запропонованого винаходом антитіла може бути як варіант або крім цього оцінений іп міго шляхом розгляду нейрональної морфології (наприклад, довжини нейриту) людських нейронів у культурі після обробки рекомбінантним білююм НЕКМ-К
Епу, як, наприклад, ілюструється в прикладі 2 (див. пункт 2.1.2). У типовому випадку в одному такому втіленні терапія запропонованим винаходом антитілом збільшує довжину нейритів людських нейронів, преінкубованих з рекомбінантним білком НЕКМ-К Епу, щонайменше на 20 95 у порівнянні з життєздатністю людських нейронів, які не піддавались обробці зазначеним запропонованим винаходом антитілом.
В одному втіленні запропоноване винаходом антитіло містить кожний із цих 6 СОК, представлених в 5ЕО ІЮ Мо: 1, БЕО ІО Мо: 2, ЗЕО ІО Мо: 3, 5ЕО ІЮО Мо: 4, БЕО ІО Мо: 5 і БЕО ІЮ
Мо: 6.
В одному втіленні запропоноване винаходом антитіло містить: - легкий ланцюг, у якому варіабельний домен містить кожний з З СОК, представлених в ЗЕО
ІО Мо: 1 для СОК-11, 5ЕО ІЮ Мо: 2 для СОК-12 і 5ЕО ІО Мо: З для СОК-І З; і - важкий ланцюг, у якому варіабельний домен містить кожний з З СОЕ, представлених в
ЗЕО ІЮ Мо: 4 для СОБК-НІ, ЗЕО ІЮ Мо: 5 для СОБ-Н2 і ЗЕО ІО Мо: 6 для СОБ-НЗ.
Вищезгадана комплементарність, яка визначає області (СО), відображена в таблиці 1.
Таблиця 1
СОВ-домени запропонованого винаходом антитіла.
Домени 7777777 | 0 ЗЕСЯОМО: | ////////// Послідовнсть./:-7-:(/3./|(:Б совНнІУ 777777777771171Ї17717171717171717171761111111111171171111111111 АВІУУОІВССССС
В одному втіленні запропоновані винаходом антитіло, фрагмент або похідне містять: - варіабельну область (МІ) легкого ланцюга, представлену в ЗЕО ІО Мо: 7; і - варіабельну область (УН) важкого ланцюга, представлену в 5ЕО ІО Мо: 8.
Вищевказані варіабельні області легкого й важкого ланцюгів показані в таблиці 2.
Таблиця 2
Легка й важка варіабельні області запропонованого винаходом антитіла. лен тов 0
ОМУМТОТРІТІ 5МГПИОРАБІЗСКВЗВО
М. 7 15 ОБрОаКтТМ МУ ОВРОЕЗРКИ ТМ
ГмЗКОоЗаУРОВЕТазавза ГОЕТІКІЗАУЕАЕОЇ СУС ОАТНЕРУТРСОССИткі ЕК
ОМОІ ООРСАЕЇ МАРОАБЗУКІ 5СКАБО
УН УТЕТБУМУММУУКОВАРЕОСІ ЕМІСВІОРМОЗЕТНУМОКЕКОКА ТУОКЗЗЗТА
УМО 551 1Т5ЕОБАМУУСАБІ мисі М СОСТІ ТУ
В одному втіленні запропоновані винаходом антитіло, фрагмент або похідне вибирається із групи, яка складається з Ем, Раб, Е(аб)2, Раб", азЕм, 5сЕм, з5с (Ем)2, диатіла й мультиспецифічних антитіл, утворених із фрагментів антитіла.
В одному кращому втіленні запропоноване винаходом антитіло є моноклональним антитілом. Моноклональні запропоновані винаходом антитіла є моновалентними, двовалентними, багатовалентними, моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. В іншому втіленні антитіло, спрямоване проти НЕКМ-К Епм, є фрагментом або кон'югатом, які зв'язують антиген. Наприклад, запропоновані винаходом антитіла можуть бути кон'югованими з інгібітором росту, цитотоксичним засобом або ферментом, який активує проліки.
Інший тип модифікації амінокислотних залишків запропонованого винаходом антитіла може бути придатним для зміни вихідного профілю глікозилювання антитіла. Під "зміною" мають на увазі видалення однієї або декількох виявлених в антитілі вуглеводневих функціональних груп і/або додавання одного або декількох сайтів глікозилювання, які не були присутніми в антитілі.
Глікозилювання антитіл у типовому випадку є М-зв'язаним глікозилюванням. "М-зв'язане" відноситься до додавання вуглеводневого фрагмента до бічного ланцюга залишку аспарагіну.
Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагин-Х-треонін, де Х може бути будь-якою амінокислотою, служать послідовностями розпізнавання для ферментативного приєднання вуглеводневого фрагмента до бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність кожної із цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання.
Додавання сайтів глікозилювання до антитіла зручно забезпечується при зміні амінокислотної послідовності таким чином, щоб вона містила одну або лекілька з вищеописаних трипептидних послідовностей (для М-зв'язаних сайтів глікозилювання).
Зо У ще одному втіленні запропоноване винаходом антитіло є гуманізованим моноклональним антитілом, ще краще, гуманізованим моноклональним антитілом Іде.
Зазначене гуманізоване антитіло може бути створене шляхом одержання послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують домен СОК, за допомогою введення їх в експресуючий вектор для тваринної клітини, який має гени, що кодують константну область важкого ланцюга, ідентичного до важкого ланцюга людського антитіла; і константну область легкого ланцюга, ідентичного до легкого ланцюга людського антитіла, і експресії експресуючого вектора шляхом уведення його в клітину тварини. Експресуючий вектор гуманізованого антитіла може бути або такого типу, у якому ген, який кодує важкий ланцюг антитіла, і ген, який кодує легкий ланцюг антитіла, перебувають на окремих векторах, або типу, у якому обидва гени перебувають на тому самому векторі (тандемного типу). Що стосується легкості конструювання експресуючего вектора з гуманізованим антитілом, легкості введення у тваринні клітини й балансу між рівнями експресії Н- і І -ланцюгів антитіла в клітинах тварин, тандемний тип експресуючего вектора гуманізованого антитіла є більш бажаним. Приклади тандемного типу експресуючого вектора гуманізованого антитіла включають РКАМТЕХОЗ, рЕЕТ8 і подібні до них. У даній галузі добре відомі способи одержання гуманізованих антитіл, що грунтуються на застосуванні стандартних методик використання рекомбінантної ДНК і трансфекції генів. Антитіла можуть бути гуманізовані за допомогою різних методик, відомих у даній галузі, включаючи, наприклад,
щеплення СОЕ, венування або зміну поверхні й перестановку ланцюгів. Також для одержання таких антитіл відома загальна технологія рекомбінантних ДНК.
Таким чином, одне втілення даного винаходу відноситься до моноклонального гуманізованого антитіла, яке містить: - легкий ланцюг, у якому варіабельний домен містить кожний з З СОК, представлених в ЗЕО
ІО Мо: 1 для СОК-11, 5ЕО ІЮ Мо: 2 для СОК-12 і 5ЕО ІО Мо: З для СОК-І З; і - важкий ланцюг, у якому варіабельний домен містить кожний з З СОК, представлених в
ЗЕО ІО Мо: 4 для СОК-НІ, 5ЕО ІО Мо: 5 для СОК-Н2 і БЕО ІО Мо: 6 для СОК-НЗ.
Фармацевтична композиція.
Наступна мета винаходу відноситься до фармацевтичної композиції, яка вклюсає ефективну дозу антитіла, спрямованого проти оболонкового білка НЕВМ-К (НЕВУ-К Епу), і фармацевтично прийнятний наповнювач.
Для утворення терапевтичних композицій будь-який описаний вище лікарський засіб відповідно до винаходу може бути об'єднаний з фармацевтично прийнятними наповнювачами й, не обов'язково, з матрицею з уповільненим вивільненням, такою як здатні до біологічного розкладу полімери.
Поняття "фармацевтично" або "фармацевтично прийнятний" відноситься, залежно від обставин, до хімічних сполук і композицій, які не викликають негативних, алергійних або інших небажаних реакцій при введенні ссавцеві, зокрема людині. Фармацевтично прийнятний носій або наповнювач відноситься до нетоксичного твердого, напівтвердого або рідкого наповнювача, розріджувача, інкапсулюючого матеріалу або допоміжної композиції будь-якого типу.
Форма фармацевтичних композицій, спосіб прийому, дозування й режим уведення природно залежать від стану хворого, лікування якого проводиться, тяжкості його захворювання, віку, маси, статі тощо.
Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом можуть бути приготовлені для місцевого, перорального, інтраназального, інтраокулярного, внутрішньовенного, внутрішнм'язового, підшкірного й іншого подібного введення.
У деяких втіленнях особливо бажаними можуть бути композиції призначені для інтратекального введення. Дійсно, такий спосіб уведення може уможливити введення за певних терапевтичних стратегій протягом нетривалого часу антитіла, яке не є людським, такого як антитіло миші, або химерне антитіло. Дійсно, "імунно-привілейована" фізіологія ЦНС допускає рівень імунної толерантності, який неможливий при введенні через системні шляхи. Таким чином, режим інтратекального введення є звичайною неврологічною й нейрохірургічною практикою. Наприклад, ритуксимаб - химерне антитіло миші/людини, яке застосовується інтратекально для хворих з розсіяним склерозом і лімфомою ЦНС (див., зокрема, Воппап М.,
Ееїтагі 5, Вепапаєаици Е, Оетабіез 5, Кгіт Е, Мідшеї! М., Ваггоз5о В. "Іпігаїпеса! пйихітАб ШПегару іп тийіріє з5сіеговзів: геміем/у ої емідепсе зирропіпуд Ше пеей ог їште ійаіє. Сип Огид Тагодеїв". 2014;15(13):1205-14. Торріпуд У, Юорзоп В, ІГаріп 5, Мавзіуапе5Кіу А, Кгорзпоїег Н, Геррег 0,
Сіомаппопі С, Емаозпепко Е. "Те ейПесів ої іпігашеса! пихітАбБ оп БіотагКег5 іп тийіріє 5сієговів". Ми 5сіег Веїаї різога. 2016 Маг;6:49-53. апа Кадосн С, Ії у), М/опа У5, Спеп Ї, Сна 5,
Мипвієг Р, Гомеї! СА, Зпитап МА, Нибрепвівїп У. "Сотріетепі асіїмайоп апа іпігамепігісшіаг пихітАЬ аізтіршіоп іп гесштепі сепіга! пег/оив зувієт Іутрпота". Сіїп Сапсег Ве5. 2014 Рер 15520(4):1029-41).
Бажано фармацевтичні композиції містять транспортні засоби, які є фармацевтично прийнятними стосовно призначеної для ін'єкції рецептури. Вони можуть бути, зокрема, ізотонічними, стерильними, сольовими розчинами (моно- або динатрійфосфатом, хлоридом натрію, калію, кальцію або магнію тощо, або ж сумішами таких солей), або сухою, зокрема ліофілізованою композицією, яка при додаванні, залежно від випадку, стерилізованої води або фізіологічного сольового розчину, дозволяє одержувати розчини для ін'єкцій.
Дози, які застосовуються для введення можуть бути адаптовані залежно від різних параметрів і, зокрема, залежно від використовуваного способу введення, відповідної до патології або, як варіант, від очікуваної тривалості лікування.
Для приготування фармацевтичних композицій ефективна кількість антитіла, спрямованого проти оболонкового білка НЕКМ-К (НЕВУ-К Епу), може бути розчинена або диспергирована у фармацевтично прийнятному носії або водному середовищі.
Придатні для застосування у вигляді ін'єкцій фармацевтичні форми включають стерильні водні розчини або дисперсії; рецептури, які включають кунжутну олію, арахісову олію або водний розчин пропіленгліколю; а також стерильні порошки для екстемпорального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. У всіх випадках така форма повинна бути бо стерильною й повинна бути рідкою настільки, щоб легко проходити крізь голку шприца. Вона повинна бути стабільною за умов виробництва й зберігання й повинна бути захищена від забруднюючої дії мікроорганізмів, таких як бактерії й гриби.
Розчини активних сполук у вигляді вільної основи або її фармакологично прийнятної солі можуть бути приготовлені у воді, відповідним чином змішаній з поверхнево-активною речовиною, такою як гідроксипропілделюлоза. Дисперсії також можуть бути отримані в гліцерині, рідких поліетиленгліколях, їхніх сумішах і в оліях. За звичайних умов зберігання й застосування ці препарати можуть містити консервант для запобігання росту мікроорганізмів.
Після приготування розчини будуть уводитися способом, сумісним з даною лікарською формою, і в такій кількості, яка є терапевтично ефективною. Рецептури легко вводяться у вигляді багатьох різних лікарських форм, таких, як описані вище розчини для ін'єкцій, але також можливе застосування капсул, які вивільняють лікарський засіб та іншого подібного.
Бажано спрямоване проти оболонкового білка НЕКМ-К (НЕНВМУ-К Епу) антитіло запропоноване даним винаходом може бути приготовлене в буфері, у якому воно солюбілізується, зберігається й вводиться пацієнтам у вигляді ін'єкції. Згаданий буфер бажано має рН 6,0 і містить 20 мМ гістидину, 5 95 сахарози й 0,01 95 полісорбату-20.
Наприклад, при парентеральному введенні у водному розчині такий розчин може бути відповідним чином буферизований, а рідкому розріджувачу спочатку надають ізотонічних властивостей за допомогою достатньої кількості фізіологічного розчину або глюкози. Ці конкретні водні розчини є особливо придатними для внутрішньовенного, внутрішнм'язового, підшкірного й внутрішньоочеревинного введення. У зв'язку із цим, фахівцям у даній галузі відомі стерильні водні середовища, придатні для використання у контексті даного опису. Наприклад, одна доза може бути розчинена в 1 мл ізотонічного розчину Масі ії або додана до 1000 мл рідини для гіподермолізу, або введена ін'єкцією в передбачуване місце інфузії (див., наприклад, "Ветіпаїюп РНаптасеціїса! Зсієпсе5" 15-е видання, сторінки 1035-1038 і 1570-1580). Деякі варіації в дозуванні обов'язково будуть мати місце залежно від стану пацієнта, лікування якого проводиться. Особа, яка відповідає за введення, у кожному разі буде визначати придатну для конкретного хворого дозу.
Крім рецептур, розроблених для парентерального введення, наприклад, внутрішньовенної, інтратекальної або внутрішнм'язової ін'єкції, інші фармацевтично прийнятні форми включають, наприклад, таблетки або інші тверді матеріали для перорального введення; капсули з уповільненим вивільненням і будь-які інші форми, які застосовуються на даний час.
Запропоновані винаходом способи діагностики
Ще одним об'єктом винаходу також є спосіб детекції оболонкового більюа НЕКМУ-К у біологічному зразку, який передбачає стадію приведення зазначеного біологічного зразка в контакт із зазначеним вище антитілом до оболонкового НЕКМ-К.
Іншим об'єктом винаходу також є спосіб діагностики в пацієнтів БАС, який передбачає стадію приведення в контакт біологічного зразка, отриманого від зазначеного пацієнта, із зазначеним вище антитілом до оболонкового НЕКМ-К.
У типовому випадку такий біологічний зразок може бути рідиною організму, такою як цереброспінальна рідина.
Запропонований винаходом терапевтичний спосіб і моніторинг
Одним об'єктом винаходу також є спосіб лікування пацієнта, що хворіє на БАС, який передбачає уведення зазначеному пацієнтові ефективної кількості описаного вище антитіла, яке розпізнає оболонковий НЕКМ-К.
Переважно такий пацієнт хворіє на БАС, зокрема, спорадичний БАС.
Як правило, зазначене антитіло вводиться інтратекально, внутрішньовенно або підшкірно.
Винахід також відноситься до способу лікування пацієнта, який хворіє на БАС, зокрема, спорадичний БАС, що включає стадії: 1) прогноз перебігу хвороби у хворого шляхом детекції і/або кількісного визначення вірусу
НЕВУ-К у біологічному зразку; а потім 2) якщо зазначена стадія 1) показує експресію людського ендогенного ретровіруса (НЕКМ) типу К, то запропонований даним винаходом спосіб включає стадію забезпечення зазначеного пацієнта запропонованим винаходом антитілом.
Винахід також відноситься до способу моніторингу відповіді на лікування пацієнта, який хворіє на БАС, зокрема, спорадичний БАС, при цьому зазначений спосіб включає наступні етапи: а) лікування зазначеного пацієнта запропонованим винаходом антитілом; потім р) детекція і/або кількісне визначення НЕКУМ-К у біологічному зразку зазначеного пацієнта.
Відповідно до винаходу, у випадку моніторингу відповіді на лікування пацієнта, який хворіє на БАС, біологічний зразок може бути зразком рідин організму, таких як кров, цереброспінальна рідина, сеча або специфічна для захворювання біопсія тканини.
Як правило, стадія детекції і/або кількісного визначення може бути виконана згідно зі звичайними методиками, відомими фахівцями в даній галузі. Як правило, зазначена стадія включає приведення в контакт біологічного зразка пацієнта із селективними реагентами, такими як зонди, праймери, ліганди або антитіла, і виявлення в такий спосіб у вихідному зразку присутності нуклеїнових кислот або білків, які становлять інтерес.
В одному втіленні стадія детекції і/або стадія кількісного визначення можуть виконуватися із зазначеним вище антитілом апіі-НЕНМ-К.
Пояснення до креслень
Фігура 1. М тАБ Епм КО1 є ІдД0526 мишачим антитілом і має легкий каппа-лвнцюг. Було виконано ізотипування за допомогою ЕГІБА на розбавленому 1:10 супернатанті гібридоми
СМ тАБ Епм КОЇ (моноклональна стадія), захопленої мишачим імуноглобуліном. Детекція різними мишачими антитілами з легкими (А) або важкими (В) ланцюгами показала, що
СМ тАБ Епм КОЇ є мишачим антитілом Ідс2Б/каппа. Результати відображені на графіку у вигляді середнього подвоєної величини ОЮахвонм - 50.
Фігура 2. Послідовності легких і важких ланцюгів М тАбБ Епм КО1.
РНК виділялась із клітин гібридоми й зазнавала зворотної транскрипції в кДНК, яка ампліфікувалась ПЦР перед секвенуванням із праймерами до кДНК, яка кодує важкі (А) і легкі (В) ланцюги антитіла миші. (А) СОКІ (жирний шрифт), СОК2 (підкреслений шрифт) і СОКЗ (напівжирний курсив) послідовності легкого каппа-ланцюга; (В) СОК4 (жирний шрифт), СОК5 (підкреслений шрифт) і СОКб (напівжирний курсив) послідовності важкого ланцюга; константні послідовності мишачого два (сірий курсив).
Фігура 3. М тАБ Епм КО! зв'язується з епітопом НЕКМ-К-Епм 5І ОКНКНККІ О5ЕМР.
Показані профілі інтенсивності (ліворуч) кожного пептиду з НЕКМ-К-Епм (МуВіобоигсеє) (праворуч). Ці пептиди з 15 амінокислот, що перекриваються, зі зсувом на один залишок показали, що ЗМ тАБ Епм КО1 зв'язується з лінійним епітопом 5'/.ОКНКНККІГО5ЕМР (ЗЕО І
Зо МО:9). Результати представлені у вигляді інтенсивності сигналу (тА), отриманого від ССО камери, аналогічної до ЕГІЗА-зчитувачу стандартного 96-коміркового планшета.
Фігура 4. Глікозильований НЕКМУ-К Епм детектується ЗМ тАб Епм КО1 при аналізі ЕГІЗА.
СМ тА Епм КО (А) або АМТІ-НЕНМУ-К-ЕММ від АМЗВІО (В) (1 мкг/мл) використовувалися при аналізі ЕГІЗА як первинні антитіла на НЕК клітинних лізатах за різних розбавлень (1:25, 150, 1:2100, 1:200, 1:400). На відміну від Апі-НЕНВНМ-К-Епли (АМ5Віо) С.М тАБ Епм КО розпізнавав глікозильований НЕКМ-К-Епу. Результати відображені на графіку у вигляді середнього подвоєної величини ОЮавонм х ЗО.
Фігура 5. Неглікозильований НЕКМУ-К Епм детектується ОМ тАБ Епм КО1 при аналізі ЕГІЗА.
СМ тАБ Епм КОЇ або АМТІ-НЕВМ-К-ЕММ від АМ5ВІО (1 мкг/мл) використовувалися як первинні антитіла при аналізі ЕГІ5А на 1 мкг/мл НіЗ-ФБИМО-НЕВМ-К-Епм рекомбінантному білку
Е.Соїї. Обидва Апі-НЕНМУ-К-Епм розпізнали неглікозильований білок НЕКМ-К-Епи. Результати відображені на графіку у вигляді середнього подвоєної величини ОЮахвонм - 50.
Фігура 6. Детекція НЕКМ-К Епм методом вестерн-блотингу із СМ тА Епм КО1.
Як первинні антитіла при вестерн-блотингу використовувалися АМТІ-НЕВМ-К-ЕММ (1 мкг/мл) від АМ5ВІО (комірки Я і 2) або розбавлений (1:5) супернатант від гібридоми СМ тАр Епм КО1 (комірки 23 і 4). 0,2 мкг міченого пі-БОМО НЕВМУ-К-Епуи було осаджено в комірках Я і З їі 24,5 мкг білкового екстракту НЕКМ-К-Епм трансфікованих НЕК клітин було осаджено в комірках 52 і 4. Неглікозильований піз-БОМО мічений білок НЕКМ-К-Епм детектувався на 75 кДа обома антитілами поряд з мультимерами з високою молекулярною вагою й низькомолекулярними відщепленими фрагментами. Глікозильований НЕКМ-К-Епм (90 кДа) детектувався тільки з
СМ тА Епм КО.
МУУ - молекулярна маса.
Фігура 7. Антитіло СМ тАбБ Епм КО1 (СМ КО) специфічно захищає людські нервові клітини від індукованої позаклітинним оболонковим білюоюм НЕКМ-К цитотоксичності: аналіз виживання клітин.
Нейрональні культури оброблялися диференціювальним середовищем (див. Приклад 2) і
Іо зразками СМ КО1 або контрольним неімунним Іде (Тпегто Ргодисі Ж МА 1-10418) у кінцевій концентрації З мкг/мл. Після закінчення 60 хвилинного періоду попередньої інкубації додавався рекомбінантний білок НЕКМ-К Епм (Му Віозошгсе, амінокислота 90-632, Са! Ж МВ51391552) до бо кінцевої концентрації 100 нМ. Один зразок СМ КО1 Ід зазнавав попередньої інкубації протягом
30 хвилин з НЕКМ-К Епм, а потім додавався до людських нейронів. У цьому експерименті через днів після обробки Епм нейрональні культури розглядалися за допомогою СЕ ІМсСеї! Апаїулег 2000 Віоїтадег для одержання зображень усіх комірок (по 4 зображення кожної комірки) у різні моменти часу. Підрахунок нейрональних клітин здійснювався за допомогою 5 многопараметричного програмного забезпечення для обробки зображень СЕ Іпмевіїдацог.
Стрілка нагорі стовпчика гістограмми вказує результати з антитілом ЗМ тАр Епм КОТ (ОМ
КО1).
Фігура 8. Антитіло СМ тАбБ Епм КО1 (СМ КО) специфічно захищає людські нервові клітини від індукованої позаклітинним оболонковим білком НЕКМ-К цитотоксичності: довжина нейриту.
Нейрональні культури оброблялися диференціювальним середовищем (описаної вище) і
Іо зразками СМ КО1 або контрольним неімунним до (Тпегто Ргодисі 2 МА 1-10418) у кінцевій концентрації З мкг/мл. Після закінчення 6б0О-хвилинного періоду попередньої інкубації додавався рекомбінантний білок НЕКМ-К Епм (Му Віозошгсе, амінокислота 90-632, Саї Ж МВ51391552) до кінцевої концентрації 100 нм. У цьому експерименті через 5 днів після Епи-обробки нейрональні культури розглядалися за допомогою СЕ ІМСеї! Апаулег 2000 Віойїтадег для одержання зображень усіх комірок (по 4 зображення кожної комірки) у різні моменти часу. Середня довжина волокон нейритів визначалася за допомогою многопараметричного програмного забезпечення для обробки зображень СЕ Іпмезіїдайог.
Фігура 9. Антитіло СМ тАбБ Епм КО1 (СМ КО) специфічно захищає людські нервові клітини від індукованої позаклітинним оболонковим білком НЕКМ-К цитотоксичності: загальна електрофізіологічна активність нейронів.
Електрофізіологічна активність, зафіксована за збільшенням імпульсної активності в комірках, суттєво зростала до 21 дня іп міго і відслідковувалася реєстрацією спонтанної електричної активності у всіх комірках по 5 хвилин на день. На цьому етапі нейрональні культури оброблялися диференціювальним середовищем (описаним вище) і ЗМ КОї або контрольним неімунним дос (Тпепто Ргодисі Ж МА 1-10418) у кінцевій концентрації З мкг/мл.
Після закінчення 60-хвилинного періоду попередньої інкубації додавався рекомбінантний білок
НЕВУ-К Епм (Му Віозоигсе) до кінцевої концентрації 100 нм. Після чого, починаючи з моменту 24 годин після обробки, спонтанна електрична активність реєструвалася в щоденному режимі.
Зо Для кожної групи обробки через 24 години після впливу НЕКМ-К Епм визначалася середня частота пульсації нейронів.
Стрілка зверху стовпчика гістограмми показує результати з антитілом ЗМ тАбБ Епм КО1 (ЗМ КОї). Стрілка зверху стовпчика гістограмми показує результати з антитілом
СМ тАБ Епм КОТ (СМ КОТ).
Приклади
Приклад 1. Одержання й характеристика антитіла ОМ тАБр Епм КО1 апібоду 1. Матеріали й методи 1.1. Одержання моноклонального антитіла. 1.1.1. Імунізація й виділення імунних клітин.
Три самки мишей (лінія Спагіеє5 Кімег) були імунізовані міченим піз-БОМО білком НЕКМ-К-
Епм (75 кДа) з Е.соїї, представленим МуВіобзоигсе (МВ51391552), згідно конфіденційного КАЮ (Наріа Апіроду демеІортепі - швидке одержання антитіла) протоколу компанії Віотет.
Коротко, у день 410 (04-10) проба крові імунізованої миші аналізувалася прямим ЕГІ5А на рекомбінантний білок НЕКМ-К Епм (МуВіозоигсе, МВ51391552) або лізат Е5сПегіспіа соїї як негативний контроль. В Ю-13 імунізованих мишей забивали і з лімфатичних вузлів відбирали імунні клітини й тричі промивалися 45 мл середовища ЮОшІрессо5 Моайеа Еадіеї5 теаїйт (ОМЕМ, 5ІСМА, 05671) з наступним центрифугуванням протягом 7 хвилин на 244 9 і рессуспендуванням в 20 мл ОМЕМ (5ІСМА, 05671). Імуноцити імунізованих мишей (420 х 105 клітин) були змішані із клітинами мієломи (107 х 106 клітин) в експонентній фазі росту в співвідношенні 1:3,9. Клітини центрифугувались протягом 7 хвилин на 244 д і потім осад ресуспендувався в 1 мл поліетиленгліколю (РЕС), який застосовувався як фактор злиття (БІСМА, Р7181). Після стадії відмивання, яка включає центрифугування на 108 д протягом 12 хвилин, клітини були рессуспендовані в 10 мл ОМЕМ (ЗІСМА, 05671), 1Х гіпоксантин- аміноптерин-тимідині (НАТ, БІСМА, НО262-10МІ), 20 95 ембріональній бичачій сироватці (ЕС5,
РАА, А15-251), 4 мМ І-глутаміні (БІСМА, 57513) і центрифугувались протягом 7 хвилин на 244 9. Клітини були рессуспендовані в ОМЕМ (ЗІСМА, 05671), 1Х НАТ (ЗІСМА, НО262-10ОМІ), 20 95
ЕС5 (РАА, А15-251), 4 мМ І-глутаміну (БІЗОМА, 7513) і витримувалися 2 години за кімнатної температури. 1.1.2. Злиття.
В 0-1 імунодефіцитним безтимусним мишам (ВІОТЕМ) були зроблені ін'єкції 5Ь мл ОМЕМ (ЗІСМА, 05671), яка містить 20 95 ЕС5 (РАА, А15-251), і через 2-4/-1 хвилини були відібрані макрофагоцити з перитонеальної рідини, які культивувалися в середовищі ОМЕМ (5ІСМА, роб671).
Клітини селезінки білих мишей ВАЇВ/с, імунізованих еритроцитами вівці, злитими із клітинною лінією мієломи РЗ х 6б3А9д8, були заздалегідь виділені, охарактеризовані й зберігалися в ВІОТЕМ. На 0-10 ці мієломні клітини були розморожені й культивувалися в середовищі ОМЕМ (5ІЗМА, 05671) - 8-азагуанін (А2А, ЗБІСМА, А5284) - 10 95 ЕС5 (РАА, А15- 251).
Макрофагоцити безтимусних мишей були підраховані й рессуспендовані в концентрації 107 макрофагоцитів на 1Т мл в ОМЕМ (5ІСМА, 05671), 1Х НАТ (БІСМА, НО2г62-10МІ), 20 95 ЕС5 (РАА, А15-251), 4 мМ І-глутаміну (БІСМА, 7513), 1 95 пеніцилін/стрептоміцин (ЗІСМА, РО781).
Далі 50 мкл суспензії макрофагоцитів (що відповідало 500 макрофагоцитів), які застосовувалися як фактор росту, були висіяні на 96-комірковому планшеті з 50 мкл суспензії гібридомних клітин.
Ці клітини культивувалися при 37 "С, 5 95 СО» протягом 21 дня. 1.1.3. Клонування.
Гібридомні клітини були розморожені й культивувалися з ЮОМЕМ (ЗІСМА, 05671), НТ (гіпоксантин 100 мкМ, тимідин 16 мкМ - 5БІСМА НО137), 2095 ЕС5 (РАА, А15-251), 2 95
Нубргідота Еппапсіпд Зирріетепі (НЕ5, 5БІОСМА, НбО20), 4 мМ /-глутамін (БІОМА, 57513), 1 Фо пеніцилін/стрептоміцин (5БІСМА, РО781) в 24-комірковому планшеті протягом 1 тижня при 37 "С, 5 95 СО». За один день перед клонуванням гібридомні клітини були розділені.
В ро після послідовних розбавлень в 107, 50, 25, 5 і 2,5 клітин/мл у культуральному середовищі, суспензія гібридоми була висіяна в кількості 5, 1 і 0,5 клітин/200 мкл у комірки 96- коміркового планшета. В Ю-6 100 мкл супернатанта з комірок, які містили клітини (відібраних при розгляді під оптичним мікроскопом) було замінено на свіже середовище ОМЕМ (ЗІСМА, 05671), НТ (гіпоксантин 100 мкм, тимідин 16 мкм - 5БІСМА НО137), 20 96 ЕС5 (РАА, А15-251), 2 У НЕЗ (БІСМА, НбОО), 1 95 пеніцилін/стрептоміцин (ЗІСМА, РО781).
Після виконання першого аналізу ЕГІЗА, який відповідав 0-10, Апі-НЕВМ-К-Епм позитивна гібридома була висіяна в 24-коміркові планшети (0,5 мл/комірка).
Після другого аналізу ЕГІ5А, який відповідав О--14, апіі-НЕНМУ-К Епм позитивна гібридома висіяна в планшети або культуральний флакон (Соппіпо) і 5 віал, які містять 4 при 5 х 105 клітин, були заморожені при -196 "С (рідкий азот) у середовищі ОМЕМ (5ІСМА, 05671), 15 95 ЕС5 (РАА,
А15-251), 4 мМ І-глутамін (ЗІЗМА, 57513), 195 НЕБ (5БІОМА, НбОг20), 195 пеніцилін/стрептоміцин (5ІЗМА, РО781), 20 96 диметилсульфоксид (ОМ50О, зЗідта, 02650). 1.2. Аналіз ЕГІЗБА АМТІ-НЕНМ-К-ЕМУ. 96-коміркові планшети тахізогр з конічним дном (МОМС, 449824) були покриті 50 мкл 1 мкг/мл білка НЕКМ-К Епм (МуВіозоигсе, МВ51391552), лізатом Е.Соїї (ХІ/1-бійе МАЕ,
Зігаїадепе), НЕК клітинним лізатом в 1Х фізіологічному розчині з фосфатним буфером (РВБ5,
ВІОТЕМ) протягом ночі за кімнатної температури. Планшети були промиті Х РВЗ-шО,05 95
Тмжшеєп20 (ММУВ, 28829.296)) відмивальним буфером (300 мкл/комірка). Неспецифічні зв'язувальні сайти були блоковані (1Х РВБ5шО0О,0595 Тмеєеп20-2,595 молоко (КедіаїюО блокувальним буфером (150 мкл/комірка) протягом однієї години за кімнатної температури.
Планшети були промиті (1 Х РВ5--0,05 95 Тмееп20| відмивальним буфером (300 мкл/комірка).
Зразки антитіла були розбавлені в (ХХ РВ5ш0,0595 Тмеєп20-0,595 ВА (УМ/В, 1.12018.0100) буфері для розбавлення. Зразки антитіла або очищеного Апіі-НЕНМУ-К-Епм від
АМЗВІО (1 мкг/мл) (50 мкл/комірка) інкубувались протягом двох годин за кімнатної температури.
Планшети були тричі промиті ИХ РВ5ш-0,05 95 Тм'ееп20| відмивальним буфером (300 мкл/комірка) і в них інкубувался в кількості 50 мкл/комірка поліклональний кон'югованний з пероксидазою айіпіРиге Е(ав)2 фрагмент козячого антимишачого Ідсжідт (Часкб5оп, 115-036- 068) (110000 в 1Х РВ5 0,05 95 Гмуееп20-0,5 95 ВЗА) протягом однієї години за кімнатної температури. Планшети тричі промивалися й протягом 10 хвилин за кімнатної температури виконувалася детекція з тетраметилбензидиновим (ТМВ, Еигобіо, 52-00-01) субстратним розчином (50 мкл/комірка). Реакція припинялася за допомогою 0,1М Небо»; (Мегск, 1.12080.1000) (50 мкл/комірка). Була обмірювана оптична щільність (ОО) на 450 нм за допомогою обладнання для визначення оптичної щільності (00) (бупех). 1.3. Одержання, очищення, діаліз.
Гібридомні клітини СМ тАр Епм КО1 були розморожені й культивувалися спочатку в Т75 сме, а потім в Т300 сме флаконах для тканинних культур (Согпіпд). У підсумку 10 по 12 х 106 клітин культивувалося в 500 мл середовища ОМЕМ (ЗІСМА, 05671), 15 95 ЕС5 (РАА, А15-251),
4 мМ І-глутамін (БІСМА, 57513), 1 95 НЕ5 (БІСМА НбОгО), 1 95 пеніцилін/стрептоміцин (ЗІСМА,
РО781) в Нурептахвк (Согпіпо, 10030) при 37 "С, 5 95 СО» протягом 10--/-1 днів.
Культуральний супернатант центрифугувався на 244 д протягом 7 хвилин і фільтрувався через 11 мкм сітчастий нейлоновий фільтр (БІСМА, МУ1104700). Хроматографічна колонка
Ргоївіп А (ЗЕ Неанйсаге, МАБ Зеїесі Хіга) була двічі промита демінералізованою водою й урівноважена 5 об'ємами 1Х РВ5 (Віоїет). Потім було завантажено 0,5 л культурального супернатанта, який не містив клітин. Колонка промивалася 5 об'ємами 1Х РВ5. При кислому рН з використанням 3,5-/-0,5 об'ємів оцтової кислоти (5БІСМА, Аб283) було виконано елюювання імуноглобуліну. Елюйовані фракції, які містять імуноглобуліни, були нейтралізовані 100 мкл 1М
Тгів-буфера з рН 8,8 (Віоїет) і зберігалися при 4 "С.
Очищені фракції дО були двічі діалізоовані на 0,5 мл капсулі для мікродіалізу Оціххерт (Во, Н4і48-1) з 10 кДа 5пакезкіп Оіаїувзіз Тиріпд, 22 мм (Тпегтоїїзспег, 68100) протягом 2 годин в 1Х РВ5 при 4 "С і сконцентровані центрифугуванням при 4 "С на Мімазріп 20 (30 кДа) (Запогій5, геї). Антитіла були відфільтровані на 0,22 мкм фільтрі МіпізагФф (Запогіив, гей і концентрація білка була визначена спектрофотометричним методом на 280 нм. 1.4. Аналіз чистоти за допомогою 505 РАСЕ (Се! електрофореза (електрофорез у поліакриламідному гелі).
Попередньо розбавлене в буфері Лемлі (Віоїет) антитіло (5 мкл у концентрації 0,2 мкг/мкл) нагрівалося протягом 5 хвилин при 95 "С і розділялося за допомогою електрофореза в 13,5 95 поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (50О5-РАСЕ), що містить концентруючий гель з 5 925 505-РАСЕ. Гель проганяли протягом 30 хвилин при 90 В і потім протягом 2 годин при 120 В. Детекція білка здійснювалася за допомогою фарбувального розчину (Віоїет), який застосовувався протягом 1 години при перемішуванні. Гель промивався деколоризуючим розчином (Віоїтет) протягом 1 години при перемішуванні. 1.5. Ізотипування. 1.5.1. Ізотипування за допомогою ЕГІЗА. 96-комірковий планшет тахізогр з конічним дном (МОМС, 449824) покривався протягом ночі за кімнатної температури 50 мкл 1 мг/мл мишачого імуноглобуліну (Сіїпізсіепсе5, 1010-01).
Планшети були промиті 1Х РВЗ 0,05 95 Тмееп20| відмивальним буфером (300 мкл/комірку).
Зо Неспецифічні зв'язувальні сайти блокувалися (Х РВ5ж0,05 95 Тиееп20-2,595 молоко) блокувальним буфером (150 мкл/комірка) протягом однієї години за кімнатної температури.
Планшети були промиті 1Х РВЗО,05 95 Тмееп20| відмивальним буфером (300 мкл/комірка).
Гібридомний супернатант був розбавлений 1:10 в ИХ РВ5З 0,05 95 Тмеєп20--0,5 95 ВБА|Ї буфері для розбавлення. Зразок (50 мкл/комірку) інкубувался протягом двох годин за кімнатної температури. Планшети однократно промивалися (1Х РВО5шО,05 95 Тмееп20| відмивальним буфером (300 мкл/комірку) і в них інкубувались у кількості 50 мкл/комірку кон'юговані з пероксидазою козячі антитіла проти мишачих важколанцюгових (ІдА, ІдС1, Ідсг2а, Ідс2Б, ІдОЗ,
ІМ) (Сіїпівсієпсе5, 5300-05) (1/2000 в 1Х РВ5 0,05 95 ПГиуєеп20--0,5 95 ВЗА) протягом однієї години за кімнатної температури. Планшети тричі промивалися й протягом 10 хвилин за кімнатної температури виконувалася детекція з ТМВ (Ешигобіо, 52-00-01) субстратним розчином (50 мкл/комірку). Реакція припинялася за допомогою 0,1М НебОх (МегскК, 1.12080.1000) стоп- реагенту (50 мкл/комірку). Була вимірювана оптична щільність (00) на 450 нм за допомогою обладнання для визначення оптичної щільності (00) (Оупех). 1.5.2. Ізотипування за допомогою імунохроматографичного аналізу.
Легкі ланцюги (каппа або лямбда) характеризувалися за допомогою імунохроматографичного аналізу (І атегаІ-Яом Іттипоавззау, І РІАХ ТНепторРівнетг, 26179). 1.6. НЕК трансфекція.
Ембріональні клітини людини (1.106 клітин/мл) були трансфіковані 1 мкг НЕКМ-К-Епм (номер доступу АМО37928.1) експресуючою плазмідою. Трансфіковані клітини культивувалися при 37 "С, 8 95 СО» при перемішуванні зі швидкістю 120 об./хв. 1.7. Вестерн-блотинг.
Рекомбінантний білок НЕКМ-К-Епм (МуВіобоигсе) у концентрації 12,5 нг/мкл і білковий лізат трансфікованих клітин НЕК при 1,5 мкг/мкл були розбавлені (1:1) в 2Х буфері Лемлі (ЗІСМА, 3401) і нагрівалися протягом 5 хвилин при 90 "С. Далі по 32 мкл зразків завантажувалося на електрофорез в 8-16 95 поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (З0О5-РАСЕ, Момех,
ЕСб60452ВОХ). Гелі проганялись протягом 1 години при 160 мА в 1Х трис-гліцин 505 рухливому буфері (Момех, І. С2675). Після переносу білків на 0,2 мкм нітроцелюлозну мембрану (Віогайд) в 1ТХ Трис-гліцин гібридизаційний буфер (Момех, ЇС3675) мембрана блокувалася протягом 1 години за допомогою (ЇХ РВО5 95 молоко (Іа Міе Сіаіге)| блокувального буфера на обертовій бо платформі за кімнатної температури. Клітинний супернатант із М тАБб Епм КО1 гібридоми розбавлявся 1:5 в І1Х РВ5--1 95 молоко) розріджувачі антитіл і використовувався як первинне антитіло з інкубацією протягом 1 години. Мембрана потім була тричі промита по 5 хвилин в Х
РВ5О--0,05 95 Тмееп20 (ЗІСМА, Р7949)| у відмивальному буфері й інкубувалась протягом 30 хвилин з розбавленим 1:1000 НКР-кон'югованним козячим антитілом проти мишачого до антитіла (аскзоп, 115035-146). Мембрана була тричі промита і потрібний білок детектувався за допомогою колориметричної реакції (Орії 4-СМ, Віогад) відповідно до наданого протоколу. 1.8. Картування епітопів.
Картування епітопів виконувалося в Рерзсап Ргезіо ВУ, (2цідегвіці5мед 2, 8243КС І еІучіаай,
Нідерланди). 1.8.1. Створення бібліотеки пептидів.
Для реконструкції епітопів цільової молекули була створена бібліотека пептидів. Була отримана амінофункціоналізована поліпропіленова основа щепленням патентованої гідрофільної полімерної рецептури, яка утворюється в результаті реакції із трет- бутилоксикарбонілгексаметилендиаміном (ВосНМОА) при використанні дициклогексилкарбодиіміду (ОСС) з М-гідроксибензотриазолом (НОВІ) і наступнім відщіпленні
Вос-груп трифтороцтовою кислотою (ТЕА). При одержанні пептидів на амінофункціоналізованій твердій основі використовувався стандартний Етос-синтез пептидів, що виконувався за допомогою модифікованої за спеціальним замовленням автоматизованої станції дозування
УАМИ5 (Регкіп ЕїІптег). Синтез імітаторів структури білків виконувався з використанням патентованої технології Рерзсап хімічно зв'язаних пептидів на каркасах (СпетісайПу Гіпкеа
Реріїде5 оп ЗсапоЇід5, СІ ІР5). Методика СІІР5 дозволяє задавати структуру білків у вигляді одинарної петлі, подвійної петлі, потрійної петлі, листоподібної структури, спіралевидної структури та їх комбінацій. Матриці СРО з'єднуються із цистеїновими залишками. Бічні ланцюги множинних цистеїнів у білках з'єднуються з однією або двома матрицями СІІРБЗ.
Наприклад, 0,5 мМ розчин Р2 СІІРЗ (2,6-біс(бромметил)піридин) розчиняється в суміші бікарбонат амонію (20 мМ, рН 7,8)/ацетонітрил (1:3 (за об'ємом)). Цей розчин наносився на пептидні матриці. Матриця СІ ІРБ5 зв'язується з бічними ланцюгами двох цистеїнів, які присутні в зв'язаних із твердою фазою пептидах пептидних матриць (455-комірковий планшет з З мкл комірками). Пептидні матриці злегка струшувалися в розчині протягом часу від 30 до 60 хвилин,
Зо перебуваючи при цьому в повністю покритому розчином стані. На завершення пептидні матриці були ретельно промиті надлишком НО і піддані ультразвуковій обробці протягом 30 хвилин при 707С у розщеплювальному буфері, який містить 1 95 505/0,1 95 бета-меркаптоетанолу РВЗ (рН 7,2), а потім ультразвуковій обробці в НгО протягом ще 45 хвилин. Аналогічним чином були приготовлені ТЗ СІ ІР5 несучі пептиди, але в цьому випадку - із трьома цистеїнами. 1.8.2. Тестування методом ЕЇГ ІБЗА.
Зв'язування антитіла з кожним із синтезованих пептидів тестувалося за допомогою метода
ЕГІ5А, який грунтується на способі Рерзсап. Пептидні матриці інкубувались при 4 "С протягом ночі з розчином, який містив первинне антитіло (ЗМ тАБ Епм КО1 у концентрації 1 мкг/мл у буфері Рерзсап). Після промивання дані пептидні матриці інкубувались протягом однієї години при 25"С з узятими в розбавленні 1/1000 кон'югованими з пероксидазою хріну кролячими антитілами проти мишачих ІдсС(НяЇ) (Зоцшійпегп Віоїесп; таблиця 4). Після промивання були додані пероксидазний субстрат 2,2'-азино-ди-3-етилбензтіазолін сульфонат (АВТ) і 20 мкл/мл
З-процентної НгО». Через одну годину оцінювався розвиток забарвлення. Розвиток забарвлення кількісно визначався за допомогою системи, що складається з обладнання із зарядовим зв'язком (спагде социріей демісе ССО): камери й системи обробки зображень. Величини, отримані за допомогою ССО-камери, перебували в діапазоні від О до 3000 мА, аналогічно до стандартного ЕГІЗА-зчитувача 96-коміркового планшета. 1.9. Секвенування.
Високоякісна РНК була виділена й очищена з гібридомних клітин за допомогою набору
Ригейпк КМА Міпі КИ (Се їесппоодіез, 12183018А) і проконтрольована на агарозному гелі.
Виходячи з очищеної загальної РНК, далі був використаний Бирегз5сгірі еплуте (Іпмігодеп, 18064022) для синтезу першого ланцюга комплементарної ДНК (кКДНК) відповідно до полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) за допомогою набору Ноїзіаг НігідеШшу РоїІутегазе Кії (Оіадеп, 202602) і вирожденних праймерів (Віоїет аезідп), специфічних до кКДНК, яка кодує важкі й легкі ланцюги мишачого антитіла. Продукти ПЛР контролювалися в агарозному гелі й зазнавали секвенування (секвенування дволанцюгових зразків). Отримані послідовності були проаналізовані для складання й контролю якості за допомогою спеціальних біоінформаційних інструментів (Віазі-СІиеїгам/) і транслювалися в пептидні послідовності. 1.10. Композиція буфера Віоїет. бо
Таблиця 1
Композиція буфера Віоїет. деіонізованої води 0,5 мл 2,5 М Тті5 рН 6,8 (ІСМ, 103133); 0,6 г 12 95 додецилсульфата
Б л (4 натрію (ІСМ, 102918); 0,01 г 0,2 95 бромфенолового синього; 2 мл уфер Лаемлі (4 х) 40 95 гліцерину (БІЖМА С17757); дер 5 мл НгО (відновнії умови: 1 мл 20 ую 2-меркаптоетанола (БІСМА М7154 9 мл 30 95 акриламіду (ЗІСМА АЗ699); 5 мл 1,5 М Ттгі5 рН 6,8 (ІСМ, 13,5 95 розділлючий 505 1103133); 200 мкл 10 95 додецилсульфата натрію (ІСМ, 102918); 5,8
РАСЕ мл НгО; 150 мкл персульфату амонію (АРС, ІСМ, 802811); 15 мкл
ТЕМЕО (ІСМ, 805615 1,6 мл 30 95 акриламіду (БІОМА АЗ699); 2,5 мл 1,5 М Ттгі5 рН 6,8 965, концентруючий 505 (ІСМ, 103133); 100 мкл 10 95 додецилсульфата натрію (СМ,
РАСЕ 102918); 5,8 мл НгО; 150 мкл персульфату амонію (АРС, ІСМ, 802811); 15 мкл ТЕМЕО (ІСМ, 805615 . 288 г гліцину (ФІМА (17126); Тгів-основа (ІСМ, 103133); 20 мл 505 мл Нео; 0,75 г реагенту брильянтовий синій (5І2МА, 87920
Деколоризуючий розчин мл НгО 2. Результати.
З використанням специфічних до імуноглобуліну антитіл, здатних до детекції різних важких і легких ланцюгів моноклональних антитіл, було показано, що ОМ тАр Епм КО1 детектувався 5 антитілами до легких каппа-ланцюгів (Фігура 1А) і до важких ланцюгів Ід26 (Фігура 18).
Були секвеновані важкі й легкі ланцюги М тАр Епм КО, що показало їх три СОК ділянки (Фігура 2) і підтвердило як ІдС265 важкі, так і каппа-легкі ланцюги. 21. М тАБ Епм КО1 розпізнає лінійний епітоп БІ ОКНКНККІ О5ЕУР з поверхневого блоку
НЕВУ-К-Епу.
Виконане за допомогою панелі з 529 пептидами з послідовності процесированого білка
НЕНУ-К-Епм від МуВіозЗоишгсе (без сигнального пептиду й процесированого трансмембранного домена) картуваня епітопа за умов високої твердості виявило, що антитіло бп-тАБ-Епм КО пов'язане з лінійним пептидом через БІ ОКНКНККГОЗЕУР серцевинну послідовність (Фігура 3, ліва панель). Цей епітоп міститься всередині позаклітинного домена білка НЕКМ-К-Епм (Фігура
З, права панель), відповідаючи області 298-312 білька НЕКМ-К-Епм відповідно до з опису
Оемжаппівих та ін. (Оеуаппіеих, Віаїєе і Неїййтапп 2005). Порівняння цього епітопа з використанням сервісу Віазір з бази даних Маїйопа! Сепіег тог ВіоїесппоЇоду Іптогтайоп (МОВІ) виявило, що він є високостабільною антигенною детермінантою, з 10095 гомологією відповідаючи в межах верхніх 100 бласт-хітів послідовностям НЕКМ-К-Епм (дані не показані). 2.2. ЗМ тАБ Епм КОТ розпізнає глікозильовані й неглікозильовані білою НЕКМ-К-Епм за неденатуруючих умов.
Автори також проаналізували здатність ЗМ тАбБ Епм КО1 розпізнавати глікозильований
НЕНМ-К-Епу. Із цією метою людські ембріональні клітини нирок (НЕК) були трансфіковані плазмідою, яка кодує білок НЕКМ-К-Епу. Незважаючи на декілька здійснених з різними буферами спроб, авторам не вдалося екстрагувати розчинний білок НЕКМ-К-Епм (дані не показані). Однак ця нерозчинна фракція глікозильованого білка НЕКМ-К-Епм з лізата трансфікованих клітин НЕК при використанні ЕГІЗБА змогла показати, що ЗМ тАр Епм КО1 специфічно розпізнає глікозильований антиген НЕКМ-К-Епм (Фігура 4, ліва панель). На противагу до цього, класичне комерційне моноклональне антитіло (птАбБ) до НЕКМ-К-Епу
Зо (НЕНМ-1821-5, Ід2Б) від АМЗВІО (Фігура 4, права панель) глікозильований НЕКМ-К-Епм не виявляло.
Дані результати показують, що (СМ тАр Епм КОї1 біологічно активний в ЕГІ5А і підтверджують те, що епітоп Б ОКНКНККГО5ЕТУР доступний за неденатуруючих умов.
Хоча й СМ тАБ Епм КО1, і тАБ АМТІ-НЕВМ-К-ЕММ (НЕВМ-1821-5, Ід02рБ) від АМ5ВІО розпізнавали нативний піє-ЗОМО мічений рекомбінантний НЕКМ-К-Епм з Е.Соїї (Фігура 5), виявилося, що М тАБ Епм КО1 продемонстрував набагато більш високу здатність до детекції в порівнянні з АМТІ-НЕВМ-К-ЕММ тАбр-еквівалентом від АМ5ВІО (Фігура 5), коли обидва перевірялися за однієї і тієї ж концентрації (1 мкг/мл). Це свідчить про більш високу афінність
СОМ тАБбБ Епм КО1 до НЕКУ-К Епу.
Як показано на Фігурі 6, і ЗМ тАБ Епм КОТ, тАБ АМТІ-НЕВМ-К-ЕММ (НЕВМ-1821-5, Ідс2Б) від АМЗВІО розпізнавали денатурований піє-БВОМО мічений рекомбінантний НЕКМ-К-Епм з
Е.Соїї, що спостерігалося у вигляді сигналу, який відповідає 75 кДа.
Важливо, що ОМ тАБр Епм КО1 також виявляє денатуровані НЕКМ-К-Епм глікозильовані білки із трансфікованих НЕК клітин, що спостерігалося як сигнал при 90 кДа, у той час як жодного сигналу з антитілом Апі-НЕВМ-К-Епм від АМЗВІО отримано не було. На додачу до попередніх результатів ЕГІЗА з неденатурованими білками, ЗМ тАбБ Епм КО біологічно активний при вестерн-блотингу. Тому антигенна детермінанта 5Б'ІЮОКНКНККІО5ЕУР також доступна за денатуруючих умов. 3. Висновки.
Даний звіт показує, що після імунізації миші, серологічного тестування й вибору моноклональної гібридоми було отримано моноклональне мишаче антитіло (назване
СМ тАБ ЕпуУкК-01), яке продемонструвало несподівані властивості і розпізнавало антигенну детермінанту НЕКМ-К-Епм 5І ОКНКНККІ ОЗЕР.
Біологічне порівняння з іншим тАб до НЕКМ-К Епм (НЕНМ-1821-5, Ідс25) від АМ5ВІО підтверджує, що, незважаючи на їхнє подібне походження (мишаче), ізотип (Ідс26, каппа) і білок-мішень (білок Негум-ж-епу), (М тАБ ЕпУК-01 кращий, оскільки, розпізнаючи як глікозильовані, так і неглікозильовані білкию, при цьому демонструє високу афінність і за нативних, і за денатуруючих умов. Крім того, з описаних у базах даних різних численних копій антитіла ЗМ тАБ Епмк-01 націлені на стійкий і консервативний епітоп у послідовностях оболонкового НЕКМ-К.
Тому ОМ тАбр ЕпуК-01 є корисним інструментом не тільки щодо імунологічних аналізів, але також і для терапевтичних застосувань проти білків НЕКМУ-К Епм як терапевтична мішень при, наприклад, БАС. Його стійка послідовність епітопа серед копій НЕВМ-К, його висока афінність і його ефективне зв'язування з нативними глікозильованими формами відповідають актуальним вимогам, які висуваються до діючого терапевтичного засобу для лікування, наприклад, хворих на БАС, при якому, очевидно, відбувається значима експресія різних копій НЕКМ-К.
Приклад 2. Антитіло (ЇМ тАБб Епм КОЇ (дп КО1) ефективно нейтралізує нейротоксичність оболонкового Пегу-К відносно людських нейронних клітин. 1. Методи й матеріали. 1.1. Людські нейронні клітини.
Були приготовлені отримані з людських нейрональних стовбурових клітин (пеншгаї! «їет сеї,
МС) нейронні культури, як описано (Епутіои, Зпайоикі та ін. 2014). Коротко, М5С були розподілені в 96-комірковому планшеті з покриттям з 0,002 95 полі-І -орнітину (5ідта, 5. І оців5,
МО) і 10 мкг/мл ламінина (І їе Тесппоіодіе5) у кількості від 7500 до 10,000 клітин/см: і через 24 години після посіву було додано нейронне диференціювальне середовище. Дане диференціювальне середовище містило ОМЕМ/Е12 з Сішатах, 1,895 альбуміну бичачої сироватки (ВБА), конглютинін 1 х біетРто МПЕБС (усі - Ме Тесппоодіе5), 10 нг/мл нейротрофічного фактора головного мозку (бгаіп-дегімей пеигоїгорпіс Тасіог, ВОМЕ) їі гліального нейротрофічного фактора (діїа! сеї! Іпе-дегімей пегоїорНніс Тасіої, СОМЕ; НаО бузіетв,
Міппеароїї5, ММ), клітини забезпечувалися свіжим середовищем і факторами росту раз на два дні. У випробуваннях нейротоксичності нейрони використовувалися в день 7-12 іп міо. 1.2. Випробування нейротоксичності. 1.2.1. Морфологія й життєздатність нейронів.
Культури людських нейронів (15-20000 клітин на комірку), які стабільно експресують флуоресцентний білок Та-Тотаїйо для мічення клітин, висівали на 96-комірковий планшет, як описано вище, і витримували при 37 "С у зволоженому інкубаторі для тканиних культур в атмосфері з 595 СО». Нейрональні культури оброблялися диференціювальним середовищем (описане вище) і (4 зразками СМ КО1 або контрольним неімунним до (Тпепто Ргодисі Ж МА 1- 10418) у кінцевій концентрації З мкг/мл. Після закінчення 60 хвилинного періоду попередньої інкубації додавався рекомбінантний білок НЕКМУ-К Епм (Му Віозоигсе, амінокислота 90-632, Саї й МВ51391552) до кінцевої концентрації 100 нм. Один зразок СМ КО1 Ід зазнав попередньої інкубації протягом 30 хвилин з НЕКМ-К Епму, а потім додавався до людських нейронів. бо Нейрональні культури розглядалися за допомогою СЕ ІМСеї! Апаїулег 2000 Віоїтадег для одержання зображень кожної комірки (по 4 зображення кожної комірки) у різні моменти часу через 24, 48, 72 години після обробки. Багатопараметричний аналіз/обробка зображень були забезпечені за допомогою аналітичного програмного забезпечення СЕ Іпмевіїдайог 1.93. Для кожного зразка було виконано кількісне визначення життєздатності нейронів, довжини нейритів та інших морфологічних параметрів. За допомогою програми Сгарпй Рай Ргізт 7.02 було виконане відображення даних у графічній формі. 1.2.2 Електрофізіологічний аналіз.
Електрофізіологічний аналіз, який виконувався за допомогою мікроелектродного масиву
Ахіоп Маеєзіго тісгоєїЇесігоде аітау (МЕА).
При посіві для аналізу культури людських нейронів застосовувалися 48-коміркові планшети
І-МЕА. Ці планшети містять по 16 активних відвідних електродів на комірку. У кожну комірку планшета ІЇ-МЕА було поміщено по 200 000 нейронів і культури підтримувалися при 37 "С у зволоженому інкубаторі для тканинних культур в атмосфері з 595 СО». Електрофізіологічна активність, яка відмічалась за збільшенням амплітуди імпульсів у комірках, суттєво зростала до 21 дня іп міїго і відслідковувалася реєстрацією спонтанної електричної активності у всіх комірках по 5 хвилин на день. На цьому етапі нейрональні культури оброблялися диференціювальним середовищем (описане вище) і Їд зразками СМ КО1 або контрольним неімунним до (Тпегто
Ргодисі Ж МА 1-10418) у кінцевій концентрації З мкг/мл. Після закінчення 60 хвилинного періоду попередньої інкубації додавався рекомбінантний білок НЕКМ-К Епм (Му ВіозЗоигсе) до кінцевої концентрації 100 нм. За цих умов спочатку до клітин додається антитіло без Епу, відтворюючи в такий спосіб умови пролікованих пацієнтів з наявністю в їхній мозковій тканині терапевтичного антитіла, що дифундував у неї. Після цього додається активний Епм білок (який не інкубувався передньо з антитілом, не зазнав попередньої нейтралізації, і який не додається у вигляді неактивного білка), відтворюючи в такий спосіб експресію патогенного білка з позаклітинною секрецією в екстрацелюлярному просторі. Один зразок СМ КО! Ід зазнав попередньої інкубації протягом 30 хвилин з НЕКМ-К Епм, а потім додавався до людських нейронів. Після чого, починаючи з моменту 24 годин після обробки, спонтанна електрична активність реєструвалася в щоденному режимі. Кількісна оцінка електричної активності була виконана за допомогою програмного забезпечення Ахіоп Ахіх5. Для кожної обробки були визначені такі параметри, як
Зо кількість спайків, середня частота пульсації й кількість пачок імпульсів. 2. Результати. 2.1. Позаклітинний оболонковий білок НЕКМ-К є токсичним стосовно нейронних клітин людини і його токсичність специфічно інгібується антитілом ЗМ тАбБ Епм КО1 (ОМ КОТ). 2.1.1. Життєздатність нейронів.
Культури нейронів людини, оброблені 100 нм рекомбінантного білка НЕКМ-К Епу, продемонстрували значиму нейротоксичність, приводячи до істотної втрати нейронних клітин у наступні дні. Ефекти НЕКМУ-К Епм були кількісно визначені на 5 день після впливу білка НЕКМ-К
Епу. Автори спостерігали, що нейрони, оброблені Епу-ОМ КО1 Ід (3 мкг/мл), мали підвищене виживання у порівнянні з нейронами, обробленими Епми. При аналізі через п'ять днів після додавання до культурального середовища оболонкового білка НЕКУ-К клітини, оброблені Епм плюс З мкг/мл контрольного неімунного до антитіла, продемонстрували аналогічну токсичність.
Нейрони, оброблені З мкг/мл ЗМ КОї або перед впливом НЕКМ-К Епм, або які попередньо інкубувалися з Епм, і які потім мали таку обробку, показали значно більш високу життєздатність, у такий спосіб підтверджуючи ефективність антитіла СМ КО1 відносно нейтралізації токсичності білка НЕКУ-К Епм (Фігура 7). 2.1.2. Довжина нейритів у нейронах.
Паралельно був проаналізований вплив НЕКМ-К Епм на середню довжину нейриту, і додавання СМ КО (3 мкг/мл) до нейронів, які зазнали впливу Епи, значно збільшило довжину нейриту в порівнянні з нейронами, обробленими Епм або Епм «т контрольне неімунне Ід (Фігура
БО 8). 2.1.3. Функціональна активність нейронів.
Були проведені електрофізіологічні дослідження із системою Ахіоп Маезіго МЕА для оцінки того, чи привела обробка НЕКМ-К Епм до функціональних змін спонтанної електричної активності, яка є головною ознакою нормальної нейронної діяльності. Після культивування культур нейронів людини на 48-коміркових планшетах МЕА протягом 21 дня ці культури були інкубовані в диференціюючому середовищі (описане вище) або з СМ КО, або з контрольним неімунним до (Тпепто Ргодисі Ж МА 1-10418) у кінцевій концентрації З мкг/мл. Після закінчення 60 хвилинного періоду попередньої інкубації був доданий рекомбінантний білок НЕКМУ-К Епм (Му
Віозошигсе, Саї Ж МВ51391552) до кінцевої концентрації 100 нм. Один зразок ЗМ КО1 Ід зазнав 60 попередньої інкубації протягом 30 хвилин з НЕКМ-К Епм, а потім додавався до людських нейронів. Після чого, починаючи з моменту 24 годин після обробки, реєструвалася спонтанна електрична активність. Через 24 години після обробки НЕКМ-К Епм кількість спайків і середня частота пульсації поменшалася на 40 95. Нейрони, які зазнали впливу НЕКМ-К Епм плюс обробка контрольним неімунним Ідс, показали зменшення кількості спайків і середньої частоти пульсації на величину близько 30 95. Найбільш цікавим було те, що нейрони, які зазнавали впливу до НЕКМ-К Епм плюс ЗМ КО1 показали кількість спайків і середню частоту пульсації, подібні до комірок, які інкубувалися тільки з контрольними поживниими, середовищами в такий спосіб демонструючи повне пригічення патогенного впливу НЕКМ-К Епм на загальну функціональну активність нейронів (Фігура 9). 3. Висновки.
Таким чином, ефективність антитіла ЗМ КОЇ була специфічною, а його позитивні ефекти проти патогенних наслідків впливу на нейрони білюьа НЕКМ К Епм були підтверджені його значимим (ї) стримуванням загибелі клітин, (ії) збереженням морфології клітини нейрона й довжини нейриту й (ії) повним відновленням функціональної активності нейронів за результатами вимірювань електрофізіологічної активності в присутності патогенного білка
НЕНВУ-К Епм проти такого ж впливу НЕКМ-К Епм з нерелевантним контрольним антитілом або без антитіла.
Тому (ї) з урахуванням специфічної детекції біле»а НЕКМ-К Епм у змінених нейронах усередині мозкової паренхіми хворих зі спорадичним БАС було показано й (ії) з урахуванням підтвердження ідеї про те, що цей білок НЕКМ-К Епм сам, як такий обумовлює патогенність, що проявляється в клінічній і гістологічній симптоматиці спорадичного БАС, відтвореної на трансгенних мишах, які експресують НЕКУ-К епу ген, який кодує цей унікальний білок (Гі, І ее та ін. 2015), специфічна ефективність антитіла ЗМ КО1, як демонструється авторами даного винаходу на релевантних клітинному й функціональному аспектах нейронів людини, це доводить його терапевтичну цінність при БАС, зокрема, при спорадичному БАС.
Специфічна активність такого антитіла, очевидно, нейтралізує (тобто лікує) патогенні ефекти оболонкового НЕКМ-К (Епу) білка, який, як було показано, безпосередньо пов'язаний з
БАС патогномонічними нейрональними ураженнями в мозку хворих зі спорадичним БАС і відтворює ті ж самі нейрональні альтерації при додаванні до культивованих нейронів або коли
Зо експресується як єдиний трансген в мишей у комплексі з такими ж клінічними симптомами, як при БАС. Крім того, додавання антитіла СМ КО1 у присутності патогенного білюа НЕКМ-К Епу демонструє його більш значиму ефективність, ніж преінкубація СМ КО1 з рекомбінантним білком
НЕВУ-К Епму іп міїго, що показує його оптимальну ефективність за фізіологічних умов а, отже, у терапевтичних застосуваннях.
Токсичність білка НЕКМ К передбачає не тільки відому раніше внутрішньоклітинну експресію в трансфікованих клітинах-мішенях або в нейронах трансгенних тварин, але також включає секретований позаклітинний білок НЕКМ-К, патогенний до наївних (нетрансфікованих
НЕНУ-К або гіперекспресуючих) нейронів. Тому запропоноване винаходом антитіло також захищає людські нейронні клітини від паракринного поширення цитотоксичності, спричиненої впливу на нейрони секретованого і/або екстрацелюлярного білка НЕКМ К Епу. Опосередковано це також відноситься до аутокринної цитотоксичності біль»а НЕКМ К Епум, продукованого в нейронах, експресуючих або гіперекспресуючих ген(-и), який кодує НЕКМ-К епу.
Наприкінець: запропоноване винаходом антитіло специфічно націлене на оболонковий білок
НЕВУ-К, здатне нейтралізувати його патофізіологічні властивості, які спостерігаються при БАС, зокрема, при спорадичному БАС, або на НЕКМ-К епм трансгенних мишачих моделях БАС, які відтворюють ці властивості.
Джерела інформації:
АГапнад, Т., апа АГапад.2013."Неїомігизе5 апа атуоїгорніс Іаїега! 5сіегов5ів", Апіїміга! Нев, 99: 180-7.
Апагемув, МУ. О., Р. М. Тике, А. АІ-Спа|арі, Р. Сацаїйп, 5. аг, М. У. Рапоп, апа у. А. Сагзоп. 2000. "Оєсїесііоп ої гемегзе ІГапзсгіріазе асіїміу іп Те зегит ої раїепів м/йй тоїог пешгопе адізеавзе",
У Меа Мігої, 61: 527-32.
Вигаці, Е., апа Б. Е. Вагаїє. 2009. "Те тоїесшаг ПнпК5 рейїхеєп ТОР-43 аувішпсіоп апа пешгодедепегаїййоп', Адм Сепеї, 66: 1-34.
Ремжаппієих, М., 5. Віаізе, апа Т. Неідтапп. 2005. "депійісайоп ої а їшпсіопаї! епмеІоре ргоївїіп їгот Ше НЕВУ-К Татіїу ої питап епдодепоиз геїгоміги5ев', У Мікої, 79: 15573-7.
Роиміне, А., У. Ми, У. Ноїй5бівїп, апа А. Майї. 2011. "депійісайоп ої асіїме осі ої а пПитап епдодепоиз геїгоміги5 іп пешгопв ої райепів м/п атуоїпорпіс Іаїега! 5сіІего5ів, Апп Меишгої, 69: 141- 51.
Бошмійе, В. М., апа А. Майї. 2014. "Нитап епдодепоив гейомігибе5 апа Ше пегуси5 5узівт',
Нападь Сіїп Мешгої, 123: 465-85.
ВБире!тау, А., О. Вате, с. Вадиєпе?, В. В. УУекзіег, І. А. Вотего, Р. О. Сошгаца, Н. Реїтоп, апа
Р. М. Магене. 2015. "пПаттайїйогу гезропз5е ої епаоїпеїйа! сеї5 ю а питап епдодепоиз геїгоміги5 аззосіаїей мій тийіріє 5сіеговів із тедіаїєйд ру ТІ В", Іпг Іттипої, 27: 545-53.
Епнгрутіои, А., А. Зпапоикі, у. Р. бівїпег, В. Упа, 5. М. Нетап-АскКан, А. Зм/івіомувкКі, Х. 7епа, М.
З. Вас апа М. Маїїк (2014). "Рипсійопа! зстеєпіпуд аззауз м/йп пешгоп5 депегаїєд їот рішгроїєпі 5ієет сеїІ-дегімейд пешгаї вієт сеїІв." У Віотої стееп 19(1): 32-43.
Сезег, Е., М. Мапйіпе?-І аде, І. К. Кмопа, М. М. Гееє, апа у. О. Тго)дапомувКкі. 2009. "Атуоїгорпіс
Іаїега! всіІеговів, Попіоїетрогаї! детепійа апа реуопа: Ше ТОР-43 аізеазев', У Мешгої, 256: 1205-14.
Нагаітан, 0О., І. Н. мап деп Вего, апа М. С. Кієтап. 2011. "Сііпіса! аїадповзів апа тападетепі ої атуоігорпіс Іаїега! всієгов5ів', Маї Нем Меигої, 7: 639-49.
Ї адієг- Тоигеппе, С., апа 0. МУ. Сіемеіапа. 2009. "КемпіпКіпд БАС: те РОБ ароші ТОР-43", Сеї!, 136: 1001-4.
Її, МУ., М. Н. І ее, І. Непаегзоп, В. Туаді, М. Васпапі, 9. 5івїпег, Е. Сатрапас, 0. А. Нойтап, а. моп СвІдет, К. Чдоппзоп, О. Магіс, Н. 0. Моїтіз, М. І епі, К. Рак, А. Маттеп, 1. Ов5ігому, у.
Воїпвіеїйп, апа А. Ма. 2015. "Нитап епдодепоив геїоміги5-К сопігіршез (о тоїог пешгоп адізеаве", зЗсі Ттапві Мед, 7: 307га153.
Масдожап, 0. 9У., 5. М. Зсеїіва, Т. Е. Ітрегаю, К. М. ім, Р. Вагоп, апа В. Рої5Ку. 2007. А сопігоПей віцау ої гемегзе Мапзсгіріазе іп зегит апа С5Е ої Нім-педайме райепів м/ййп БАС",
МешгоІоду, 68: 1944-6.
Маї!вї, Р., О. Вошоп, 5. Риішайоттае, М. Спеупеї, С. Опіої, В. Воппаца, а. І исойе, І. Юигеї, апа
В. Мапагапа. 2004. "Те епдодепои5 геїйоміга! осиз ЕВММ/ЕТ і5 а ропа їде депе іпмоїмей іп
Ппотіпоїа ріасепіаї! рпузіоіоду, Ргос Маї! Асай сі ОО 5 А, 101: 1731-6.
Мапдпега, М., У. Регдизоп-Рату, апа В. М. Юоимійе. 2016. "ТОР-43 гедшагев епдодепоийи5 геїгомігив5-К міка! ргоївіп асситиайоп', Мешгобіо! Оі5, 94: 226-36.
МесогтіскК, А. І., А. Н. Вгомлп, уУг., М. Е. СцакКоміс7, А. АІ-СНаїйарі, апа 9. А. Сагвзоп. 2008. "Оцапійсацйоп ої гемегбе ігапосогіріазе іп БАС апа еїйтіпайоп ої а помеї! геїгоміга! сапаїдаце",
Мепгоіоду, 70: 278-83.
Мопшіїдпіег, А., А. Мошопдиеї, с. Ріаірих, апа УУ. Колепрацт. 2001. "Кемегзіріє БАС-ійКе дізогаеєг іп НІМ іптесіоп', Мешигоіоду, 57: 995-1001.
Оіймоїе, 5. О., М. Мао, 5. Сопгаді, К. Кгівієпезоп, апа Н. Каїіззоп. 2007. "ЕІемаїєд Іємеї5 ої їапвстіріє епсодіпд а питап геїгомігаІ! епмеіоре ргоївїп (зупсуйп) іп тивсіє5 їот райепів мн тойог пешгоп дізєазе", Атуоїгорі! І аїега! Зсієг, 8: 67-72.
Ре!їтоп, Н., у. Р. Ретгіп, РЕ. Віведег, апа Р. М. АПіеї. 2000. "РапісіІє-аззосіаїей геїгомігта! ВМА апа їапдет ВОН/НЕНВМУ-МУ/ сорієз оп питап спготозоте 74: розвіріє сотропепів ої а "сНаіп-гтєеасійп'
ШМдсетгеа Бу іптесіїоив адепів іп тийіріє зсіеговів?", ) Мешцгомігої, 6 Зиррі 2: 567-75.
Роїутепідом, М., апа О. МУ. СіІемеіапа. 2011. "Те 5еедвь ої пеишгодедепегаїййоп: рііоп-йїке зргеадіпд іп БАС", Сеїї, 147: 498-508.
ВоїІапа, А., Е. Уойміп-Магсне, С. Мігеї, М. Рашйге, Н. Ретоп, апа Р. М. Магспе. 2006. "Те епмеіоре ргоївіп ої а питап епдодепоив гейоміги5-м/ Тату асіїмаїе5 іппаге іттипйу (год
СО14/1І ВА апа рготоїез ТН1-ЇїКе гезропзев', / Іттипої, 176: 7636-44.
Возеп, 0. В. 1993. "Мшиїайопв іп Сц/2п зирегохіде дівтиїазе депе аге аззосіаїей м/йй Татіїа! атуоігорпіс Іаїега! 5сієеговів", Маїиге, 364: 362. зіевіє, А. ., А. АІ-СНаїарі, К. Ретапіє, М. Е. СцаКоміс, В. Н. Вгомлп, .г., апа 9. А. Сагвоп. 2005. "Оеїесійоп ої зегит гемегзе Ігапоогіріазе асіїмпу іп райепіб5 м/йп БАС апа ипайесієй ріоса геІаймев', Мешигоіоду, 64: 454-8.
Тауїог, 9. Р., К. Н. Вгом/уп, г., апа О. МУ. СіІемеїапа. 2016. "Оесодіпд БАС: їот депез ї0 теспапізт"'", Майте, 539: 197-206.
Титег, с., М. Вагбиїєезси, М. Би, М. І. Уепзеп-5еатап, К. К. Кіда, апа 9. Гепг. 2001. "пвепіопа! роїутогрпівтв ої тшІ-Іепдій епдодепоиз геїгомігивев іп питапв', Ситт Віої, 11: 1531-5. моп Сіезеп, Н. 9., К. Каїзег, Н. КоїПег, К. Ууеї7еї, апа с. Агепаї. 2002. "Кемегзіріє БАС-іКе аїзогаег іп НІМ іптесіоп. Ап БАС-ІїКе вупаготе м/ййп пем/ НІМ іптесіоп апа сотрієїе гезропзе 0 апійгеїгоміга! Шегару, Мепгоіоду, 59: 474; ашог геріу 74-5.
Мисіс, 5., апа М. С. Кіегпап. 2009. "Райорпузіоіоду ої пеигодедепегаїйоп іп Татіїа! атуоїгорніс
Іаїега! зсієговів", Си Мої! Мед, 9: 255-72.

Claims (9)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Антитіло, яке розпізнає оболонковий білок людського ендогенного ретровіруса К (НЕКМ-К), при цьому зазначене антитіло зв'язується з епітопом, представленим в ЗЕО ІЮ МО: 9, і містить: - легкий ланцюг, який містить варіабельну область легкого ланцюга (МІ), яка містить три гіперваріабельні ділянки (СОБК-1 1, СОВ-12 і СОК-Ї 3), та - важкий ланцюг, який містить варіабельну область важкого ланцюга (МН), яка містить три гіперваріабельні ділянки (СОК-НІ, СОВ-Н2 ії СОБ-НЗ), де вказаний СОК-11 містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1, вказаний СОК-І2 містить амінокислотну послідовність 5ЕОО ІЮ МО: 2, вказаний СОК-Ї З містить амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮО МО: 3, вказаний СОК-НІ1 містить амінокислотну послідовність БЕО ІЮ МО: 4, вказаний СОК-Н2 містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 5 і вказаний СОК-НЗ містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 6.
2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що: - зазначена варіабельна область (МІ) легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 7; і - зазначена варіабельна область (МН) важкого ланцюга представлена в ЗЕО ІЮО МО: 8.
3. Антитіло за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що зазначене антитіло є моноклональним антитілом.
4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, в якому зазначене антитіло Є мишачим моноклональним антитілом, химерним моноклональним антитілом або гуманізованим моноклональним антитілом.
5. Антитіло за пунктом 1, яке відрізняється тим, що призначене для застосування в терапевтичних цілях.
6. Антитіло за пунктом 1, яке відрізняється тим, що призначене для застосування у способі терапії бічного аміотрофічного склерозу (БАС), бажано спорадичного БАС.
7. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за п. 1 ії фармацевтично прийнятний Зо наповнювач.
8. Іп міго спосіб детекції оболонкового білка НЕКМ-К у біологічному зразку, який передбачає стадію введення зазначеного біологічного зразка в контакт із антитілом до оболонкового НЕКМ- К, визначеним в п. 1.
9. Іп міо спосіб діагностування БАС у пацієнта, який включає етап уведення біологічного зразка, отриманого від зазначеного пацієнта, у контакт із антитілом до оболонкового НЕВМ-К, визначеним в п. 1. й - х СЯ Ще ща
В.В онасноненесооунтесстсосестссстесь ТИЙ несе» БА В бе ВЕ: ун с об Катших ква ВО ВО щелепу З в Леві панцюги Беж панк
Фіг.
UAA201909194A 2017-01-20 2018-01-19 Антитіло проти оболонкового herv-k і його застосування UA126677C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17305062.6A EP3351265A1 (en) 2017-01-20 2017-01-20 Anti-herv-k envelope antibody and uses thereof
PCT/US2018/014489 WO2018136775A1 (en) 2017-01-20 2018-01-19 Anti-herv-k envelope antibody and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126677C2 true UA126677C2 (uk) 2023-01-11

Family

ID=58018037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201909194A UA126677C2 (uk) 2017-01-20 2018-01-19 Антитіло проти оболонкового herv-k і його застосування

Country Status (15)

Country Link
US (2) US10723787B2 (uk)
EP (2) EP3351265A1 (uk)
JP (1) JP7139340B2 (uk)
KR (1) KR102599010B1 (uk)
CN (1) CN110678196B (uk)
AR (1) AR110949A1 (uk)
AU (1) AU2018210388C1 (uk)
BR (1) BR112019014773A8 (uk)
CA (1) CA3050286A1 (uk)
EA (1) EA039460B1 (uk)
IL (1) IL267955B1 (uk)
MX (1) MX2019008648A (uk)
TW (1) TWI793098B (uk)
UA (1) UA126677C2 (uk)
WO (2) WO2018136775A1 (uk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3351265A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-25 Geneuro SA Anti-herv-k envelope antibody and uses thereof
EP4025303A1 (en) * 2019-09-04 2022-07-13 Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE) Herv inhibitors for use in treating tauopathies
WO2023212587A1 (en) * 2022-04-28 2023-11-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant polypeptides comprising single-domain antibodies targeting herv-k subtype hml-2

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2273099A (en) * 1992-11-10 1994-06-08 Asta Medica Ag Glycoprotein encoded by a human endogenous retrovirus K envelope gene
EP1613263A4 (en) * 2003-01-31 2007-11-28 Pathologica Llc MONITORING AND TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
FR2865403B1 (fr) * 2004-01-23 2009-06-12 Biomerieux Sa Composition pour le traitement d'une pathologie associee a la msrv/herv-w
US20090297530A1 (en) * 2006-05-22 2009-12-03 Feng Wang-Johanning Herv-k antigens, antibodies, and methods
FR2912314B1 (fr) * 2007-02-09 2012-08-03 Geneuro Sa Composition pharmaceutique comprenant des anticorps diriges contre l'enveloppe de herv-w.
WO2013059426A1 (en) * 2011-10-21 2013-04-25 The Regents Of The University Of California Human endogenous retrovirus peptides, antibodies to the peptides, and methods of use thereof
US20150250864A1 (en) * 2012-06-25 2015-09-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cancer vaccines
UA119032C2 (uk) * 2012-10-02 2019-04-25 Женеро Са Фармацевтична композиція для лікування блокади ремієлінізації при захворюваннях, які пов'язані з експресією білка оболонки herv-w
CN103755805B (zh) * 2014-02-11 2015-08-12 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 HIV-1 Env特异性的全人单克隆抗体
WO2017059122A1 (en) * 2015-09-29 2017-04-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Methods of treating and preventing amyotrophic lateral sclerosis
WO2018044970A1 (en) * 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
EP3351265A1 (en) * 2017-01-20 2018-07-25 Geneuro SA Anti-herv-k envelope antibody and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
BR112019014773A2 (pt) 2020-05-19
WO2018136774A1 (en) 2018-07-26
WO2018136775A1 (en) 2018-07-26
AU2018210388B2 (en) 2024-05-23
TW201831518A (zh) 2018-09-01
AR110949A1 (es) 2019-05-22
KR102599010B1 (ko) 2023-11-06
MX2019008648A (es) 2019-12-02
US20190345232A1 (en) 2019-11-14
EA039460B1 (ru) 2022-01-28
IL267955B1 (en) 2024-09-01
CN110678196B (zh) 2024-03-12
KR20190119593A (ko) 2019-10-22
TWI793098B (zh) 2023-02-21
AU2018210388C1 (en) 2024-09-19
JP2020505383A (ja) 2020-02-20
US10981977B2 (en) 2021-04-20
AU2018210388A1 (en) 2019-08-01
EA201991736A1 (ru) 2019-12-30
BR112019014773A8 (pt) 2020-06-09
IL267955A (en) 2019-09-26
EP3570878A1 (en) 2019-11-27
EP3351265A1 (en) 2018-07-25
US20200308258A1 (en) 2020-10-01
CA3050286A1 (en) 2018-07-26
CN110678196A (zh) 2020-01-10
US10723787B2 (en) 2020-07-28
JP7139340B2 (ja) 2022-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017522043A (ja) ＦｃＲｎ特異的ヒト抗体及びこれを含む自己免疫疾患治療用組成物
US10981977B2 (en) Anti-HERV-K envelope protein antibodies and methods for detecting HERV-K envelope protein in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis
US12071474B2 (en) Monoclonal antibodies against alpha-synuclein fibrils
US20220041698A1 (en) Monoclonal Antibodies Against Pathological Alpha-Synuclein, and Methods Using Same
JP2022536613A (ja) ＡｐｏＥ抗体、融合タンパク質、およびその使用
JP6865581B2 (ja) 神経学的疾患又は神経変性疾患に有用な新規抗体
WO2023206609A1 (zh) 针对p-tau 217的抗体及其用途
US11999778B2 (en) VH4 antibodies and compositions comprising the same
US20240301040A1 (en) Anti-herv-w envelope protein antibody for use in the treatment of psychotic diseases
US20240109977A1 (en) Anti-cd38 antibodies and their uses
WO2024053719A1 (ja) コロナウイルス変異株に対するヒト抗体またはその抗原結合断片
NZ796415A (en) Anti-herv-k envelope antibody and uses thereof
TW202428602A (zh) Ｔａｕ結合化合物
JP2023502122A (ja) 抗α－シヌクレインモノクローナル抗体およびその使用法