JP7110124B2 - 心血管疾患を治療するための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
R1-X1-X2-X3-Trp-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2
式I
の化合物及び薬学的に許容されるその塩から選択されるPCSK9阻害剤に関し、
上式中、
R1はC1-C4アシルであるか、又はR1は存在せず;
X1は、TVFTSWEEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列であるか、又はX1は存在せず;
X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基であるか、又はX2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はX2は存在せず;
X3は、アラニン、2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、3-ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり;
X4は、アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり;
X5は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり;
X6は、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される1から5個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX6は存在せず;;かつ
R2はアミノであるか、又はR2は存在しない。
一態様において、本発明は、本明細書に記載のPCSK9阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、PCSK9を有効量の本明細書に記載のPCSK9阻害剤と接触させることを含む、PCSK9の活性を調節するための方法に関する。
一態様において、本発明は、治療的有効量の本明細書に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を個体に投与することを含む、必要とする個体におけるPCSK9のLDLRへの結合を阻害するための方法に関する。
一態様において、本発明は、療法によるヒト又は動物の体の治療の方法における使用のための、本明細書に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、PCSK9の活性を調節する方法における使用のための、本明細書に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、PCSK9のLDLRへの結合を阻害する方法における使用のための、本明細書に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物に関する。
一態様において、本発明は、PCSK9の活性を調節するための医薬の製造のための、本明細書に記載のPCSK9阻害剤の使用に関する。
一態様において、本発明は、PCSK9のLDLRへの結合を阻害するための医薬の製造のための、本明細書に記載のPCSK9阻害剤の使用に関する。
一態様において、本発明は、候補化合物を配列番号1のエピトープに結合するPCSK9阻害剤であると同定するための方法に関し、該エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも1つの残基を含み;該方法は、以下の工程:a)PCSK9を候補化合物と接触させる工程;b)PCSK9Δヘリックスを候補化合物と接触させる工程;c)候補化合物のPCSK9及びPCSK9Δヘリックスに対する結合アフィニティーを測定する工程;並びにd)候補化合物のPCSK9Δヘリックスに対する結合アフィニティーが候補化合物のPCSK9に対する結合アフィニティーよりも強いことを決定する工程を含み;前記決定は候補化合物が配列番号1のエピトープを結合するPCSK9阻害剤であることの示唆である。
別に規定されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形を含み、その逆の場合も同じである。本明細書で用いる用語は、特定の実施態様を説明するためのものであり、限定することを目的としていないことを理解すべきである。
PCSK9は、染色体1p32に見出され、22kbの長さであり、692アミノ酸タンパク質をコードする12個のエクソンを有する(Artenstein and Opal, N Engl J Med, 2011, 365(26):2507-2518)。それはプロテイナーゼK様酵素であり、分泌サブチラーゼファミリーに属し、主に肝細胞により合成され、分泌される(Maxwell and Breslow, Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(18):7100-7105; Seidah and Prat, Nat Rev Drug Discovery, 2012, 11(5): 367-383)。CSK9の合成は、遺伝子のプロモーター領域内のステロール調節エレメントに結合することによってPCSK9発現を調節する転写因子である、ステロール調節エレメント結合タンパク質2(SREBP-2)によってアップレギュレートされる(Jeong et al., J 脂質 Res 49(2):399-409)。SREBP-2はまた、HMG-CoAレダクターゼを含む、コレステロール恒常性に関与する重要な酵素をコードする遺伝子の活性を介して、LDLR及びコレステロール合成を増加させる(Goldstein and Brown (2009) Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(4):431-438)。それは、低い細胞内コレステロール濃度によって活性化される。コレステロールが豊富な食餌を与えた絶食マウスでは、SREBP-2及びPCSK9発現は抑制される(Kosenko et al. (2013) J Biol Chem 288(12):8279-8288)。しかし、動物及びヒトにおける長期の絶食はまた、PCSK9及びSREBP-2活性の低下を引き起こす(Browning and Horton (2010) J Lipid Res 51(11):3359-3363)。更に、in vivoのエビデンスは、インスリンがPCSK9の発現を増加させる役割を担っている可能性を示唆している(Costet et al. (2006) J Biol Chem 281(10):6211-6218)。
一態様において、本発明は、PCSK9阻害剤で得られた実験結果に一部基づいている。得られた結果は、PCSK9阻害剤でPCSK9の生物活性をブロックすることがLDLRの減少の防止につながることを示している。更に、結果は、PCSK9阻害剤の投与が対象において総LDL-Cレベルを減少させることを示している。したがって、本明細書に記載の本発明のPCSK9阻害剤は、PCSK9に関連する病理学的状態、例えばコレステロール関連障害の標的化における使用のための重要な治療剤及び診断剤を提供する。
特定の実施態様では、PCSK9又はその断片に結合するPCSK9阻害剤が提供され、PCSK9阻害剤はPCSK9の断片内のエピトープに結合する。特定の実施態様では、PCSK9又はその断片に結合するPCSK9阻害剤が提供され、PCSK9阻害剤は、PCSK9ΔCRDΔヘリックスの以下の部分、すなわちA239-V241、T339-D343、P364-I368、H391及びV441-L444によって囲まれたポケットの中で結合する。いくつかの実施態様では、PCSK9阻害剤は、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも1つの残基を含む、配列番号1のピトープに結合する。いくつかの実施態様では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも2つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも3つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも4つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも5つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも6つの残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1の残基V241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも11の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも12の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも13の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも14の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも15の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも16の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1の残基A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも11の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも12の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも13の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも14の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも14の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも16の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも17の残基を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1の残基A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のT339を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のD343を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のP364を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA442を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA443を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のL444を含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241と、配列番号1のA239、G240、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のT339と、配列番号1のA239、G240、V241、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のD343と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のP364と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA442と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA443と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のL444と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及びA443からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241と、配列番号1のA239、G240、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のT339と、配列番号1のA239、G240、V241、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のD343と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のP364と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA442と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、
A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA443と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のL444と、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及びA443からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のG240と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のN340と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA341と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のE366と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のD367と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のI368と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のI369と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のG370と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のH391と、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも1つの残基とを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、以下の残基、すなわち配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は全てを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、以下の残基、すなわち配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444のうちの11、12、13、14、15、16又は全てを含む。いくつかの実施様態では、エピトープは、以下の残基、すなわち配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444のうちの11、12、13、14、15、16、17又は全てを含む。いくつかの実施様態では、PCSK9阻害剤とエピトープ中の配列番号1の残基との間の距離は、10Å以下、9Å以下、8Å以下、7Å以下、6Å以下、5Å以下、4Å以下、3Å以下又は2Å以下である。
R1-X1-X2-X3-Trp-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2
式I
の化合物及び薬学的に許容されるその塩から選択され、
上式中、
R1はC1-C4アシルであるか、又はR1は存在せず;
X1は、TVFTSWEEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列であるか、又はX1は存在せず;
X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はX2は存在せず;
X3は、アラニン、2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、3-ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり;
X4は、アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり;
X5は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり;
X6は、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される1から5個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX6は存在せず;かつ
R2はアミノであるか、又はR2は存在しない。
いくつかの実施態様では、R1はC1-C4アシルである。
いくつかの実施態様では、R1はアセチルである。
いくつかの実施態様では、R1はバレリルである。
いくつかの実施態様では、R1は存在しない。
いくつかの実施態様では、X1は、TVFTSWEEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X1は、アミノ酸配列TVFTSWEEYLDWVである。
いくつかの実施態様では、X1は、アミノ酸配列TAFTSWEEYLDWVである。
いくつかの実施態様では、X1は存在しない。
いくつかの実施態様では、X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X2は、SG、GSG、GGSG、GSGG及びSGSGから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である。
いくつかの実施態様では、X2は、アミノ酸残基6-アミノヘキサン酸である。
いくつかの実施態様では、X2は、アミノ酸残基7-アミノヘプタン酸である。
いくつかの実施態様では、X2は、アミノ酸残基8-アミノオクタン酸である。
いくつかの実施態様では、X2は存在しない。
いくつかの実施態様では、X3は、P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP及びDLMPから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X3は存在しない。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基アラニンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基2,3-ジアミノプロピオン酸である。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基グルタミンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基グリシンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基リジンである。
いくつかの実施態様では、X4は、検出試薬で修飾されたアミノ酸残基リジンである。いくつかの実施態様では、検出試薬はビオチンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基バリンである。
いくつかの実施態様では、X5は、アミノ酸残基アルギニンである。
いくつかの実施態様では、X5は、アミノ酸残基ホモアルギニンである。
いくつかの実施態様では、X6は、L、S、LL、LAR、LGC、LLA、LLC、LLR、LPC、LTR、SQGC、SQCEY、SQCWF及びSQGCWから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X6は存在しない。
いくつかの実施態様では、R2はアミノである。
いくつかの実施態様では、PCSK9阻害剤は、表1に示す以下のペプチドから選択される化合物である。
表1
R1-X1-X2-X3-X7-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2
式II
の化合物及び薬学的に許容されるそれらの塩から選択され;上式中、
R1は、C1-C4アシル、アリールカルボニル、C3-C7シクロアルキルカルボニル及びヘテロアリールカルボニルから選択され;各々は、それぞれ独立に以下から選択される1又は2の置換基:
C1-C4アルキル;
アミノ;
C1-C4アルコキシ、アミノ、ハロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリール;
アリール-C1-C4アルキル;
C1-C4アルキル及びC1-C4アルキルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル;
C1-C4アシル、C1-C4アルコキシ、C1-C4アルキル、ハロ及びヒドロキシ-C1-C4アルキルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ;
アリール-C1-C4アルキルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
C3-C7シクロアルキル;
C1-C4アルキル及びアミノから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
C1-C4アルキル、C1-C4アルキルスルホニル、カルボキサミド、ヘテロアリール-C1-C4アルキル及びオキソから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
ヘテロシクリルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよく;
又はR1は存在せず;
X1は、TVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列であるか、又はX1は存在せず;
X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はX2は存在せず;
X3は、アラニン、2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、3-ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン及びチロシンから選択される1から6個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり;
X4は、アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり;
X5は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり;
X6は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される1から5個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX6は存在せず;
X7は、トリプトファン、6-フルオロトリプトファン、6-クロロトリプトファン、6-ブロモトリプトファン及び6-メチルトリプトファンから選択されるアミノ酸残基であり;かつ
R2はアミノであるか、又はR2は存在しない。
いくつかの実施態様では、R1はC1-C4アシルである。
いくつかの実施態様では、R1はアセチルである。
いくつかの実施態様では、R1はバレリル
である。
いくつかの実施態様では、R1は存在しない。
いくつかの実施態様では、R1は、C1-C4アシル、アリールカルボニル、C3-C7シクロアルキルカルボニル及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される1又は2の置換基:
C1-C4アルキル;
アミノ;
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリール;
アリール-C1-C4アルキル;
メチル及びメチルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル;
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ;
フェニルメチルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
C3-C7シクロアルキル;
メチル及びアミノから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
メチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
ヘテロシクリルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよい。
メチル及びt-ブチルから選択されるC1-C4アルキル;
アミノ;
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェニル;
フェニルメチル;
メチル及びメチルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいベンゾイル;
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェノキシ;
フェニルメチルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
シクロヘキシル;
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、それぞれ独立にメチル及びアミノから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
モルホリニルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよい。
メチル及びt-ブチルから選択されるC1-C4アルキル;
アミノ;
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェニル;
フェニルメチル;
メチル及びメチルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいベンゾイル;
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェノキシ;
フェニルメチルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
シクロヘキシルから選択され;
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、メチル及びアミノからそれぞれ独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
モルホリニルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよい。
いくつかの実施態様では、X1は、アミノ酸配列TVFTSWEEYLDWVである。
いくつかの実施態様では、X1は、アミノ酸配列TVFTS(W6fl)EEYLDWVである。
いくつかの実施態様では、X1は、アミノ酸配列TAFTSWEEYLDWVである。
いくつかの実施態様では、X1は存在しない。
いくつかの実施態様では、X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X2は、G、GG、SG、GSG、GGSG、GSGG及びSGSGから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である。
いくつかの実施態様では、X2は、アミノ酸残基6-アミノヘキサン酸である。
いくつかの実施態様では、X2は、アミノ酸残基7-アミノヘプタン酸である。
いくつかの実施態様では、X2は、アミノ酸残基8-アミノオクタン酸である。
いくつかの実施態様では、X2は存在しない。
いくつかの実施態様では、X3は、P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFI(Hyp)、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP、DLMP、DSYPG、ESFPG、ESYPG、MDSFPG、MESFPG及びSFAFPGから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X3は存在しない。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基アラニンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基2,3-ジアミノプロピオン酸である。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基グルタミンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基グリシンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基リジンである。
いくつかの実施態様では、X4は、アミノ酸残基バリンである。
いくつかの実施態様では、X5は、アミノ酸残基アルギニンである。
いくつかの実施態様では、X5は、アミノ酸残基ホモアルギニンである。
いくつかの実施態様では、X6は、L、S、LL、LAR、LDR、LER、LGC、LGR、LLA、LLC、LLQ、LLR、LPC、LPR、LSR、LTR、SQGC、SQCEY、SQCWF及びSQGCWから選択されるアミノ酸配列である。
いくつかの実施態様では、X6は存在しない。
いくつかの実施態様では、X7はトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、X7は6-フルオロトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、X7は6-クロロトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、X7は6-ブロモトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、X7は6-メチルトリプトファンである。
いくつかの実施態様では、R2はアミノである。
いくつかの実施態様では、R2は存在しない。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも3つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも4つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも5つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも6つの残基を含む。
いくつかの実施様態では、エピトープは、配列番号1のA239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及びL444からなる群から選択される少なくとも11の残基を含む。
いくつかの実施態様では、PCSK9及びPCSK9Δヘリックスがセンサーチップ上に提供される。
いくつかの実施態様において、結合アフィニティーは表面プラズモン共鳴を用いて決定される。
別の実施態様は、本発明の化合物及び治療上不活性な担体、希釈剤又は添加剤を含有する薬学的組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するための、本発明の化合物の使用方法を提供する。一例では、本明細書に記載のPCSK9阻害剤は、周囲温度で、適切なpH及び所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち、用いる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性の担体と混合することによりガレヌス(galenical)投与形態に製剤化されうる。製剤のpHは主に、特定の用途及び化合物の濃度に依存するが、好ましくは約3から約8までの範囲である。一例では、本明細書に記載のPCSK9阻害剤は、酢酸緩衝液中pH5で製剤化される。別の実施態様において、本明細書に記載のPCSK9阻害剤は無菌である。該化合物は、例えば、固体又は非晶質組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存されてもよい。
本発明の化合物は、PCSK9に結合するPCSK9阻害剤である。いくつかの実施態様では、PCSK9阻害剤は、LDLRに対するPCSK9 LDLR結合部位のアフィニティーを減少させ、LDLの、例えば肝細胞による、内部移行が増加する。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の化合物、組成物及び方法は、循環LDL-Cのレベルを下げるため、並びに高レベルの循環LDL-Cに関連する疾患及び障害(例えば高コレステロール血症及び心血管疾患)を治療するために有用である。
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防及び/又は診断に有用な材料を含む製造品又はキットが提供される。特定の実施態様において、製造品又はキットは、本明細書に記載の1以上のPCSK9阻害剤又は組成物を収容する容器を備える。特定の実施態様において、製造品又はキットは、容器と容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書とを備える。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されていてよい。容器は、単独の組成物、又は状態の治療、予防及び/若しくは診断に有用な別の組成物と組み合わせた組成物を保持する。該組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本発明のPCSK9阻害剤である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示す。更に、製造品又はキットは、(a)本発明のPCSK9阻害剤を含む組成物を中に収容する第1の容器、及び(b)更なる治療剤含む組成物を中に収容する第2の容器を備えうる。特定の実施態様において、第2の容器は第2の治療剤を含み、ここで第2の治療剤は「スタチン」クラスのコレステロール低下薬である。特定の実施態様において、スタチンは、アトルバスタチン(例えばリピトール(登録商標)又はトルバスト(Torvast))、フルバスタチン(例えばレスコール)、ロバスタチン(例えばメバコール(登録商標)、オルトコール(ALTOCOR)TM又はオルトプレブ(ALTOPREV)(登録商標))、メバスタチン(ピタバスタチン(例えばリバロ(登録商標)又はピタバ(登録商標))、プラバスタチン(例えばプラバコール(登録商標)、セレクチン(登録商標)、リポスタット(LIPOSTAT)(登録商標))、ロスバスタチン(例えばクレストール(登録商標))、シンバスタチン(例えばゾコル(登録商標)、リペックス(登録商標))、又はこれらの組み合わせ、例えばバイトリン(登録商標)、アドビコールアドビコール(登録商標)若しくはシムコ-ル(登録商標)であり、かつ/又はこれらを含む。
[Fab33:PCSK9複合体の結晶構造]
Fab33:PCSK9複合体の結晶構造は、Wuら(米国特許第9266961号)によって報告された。それは、Fab33がその重及び軽鎖を介してLDLR結合部位に結合することを示している(図1)。具体的には、CDR-H1、-H2、-H3、-L1及び-L3からの1つ以上のアミノ酸残基は、PCSK9の原子の4Å以内にある。更に、重鎖残基Thr73もPCSK9の4Å以内に見出される。ab33の任意の原子の4Å以内のPCSK9アミノ酸残基のセットは、LDLRのEGFAドメインの4Å以内にもある残基を含む(Kwon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12; 105(6): (1820-1825)。Fab33 CDR-H2ループは、PCSK9のEGFA結合部位 と相互作用しない(Kwon et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12; 105(6): 1820-1825)(重鎖残基Arg50を除く)が、図3に示すように、PCSK9触媒ドメインのN末端ヘリックスである「P’ヘリックス」(およそS153-T162残基)を通常有するPCSK9のN末端溝(図2)へと延びる。蛋白質構造(PDB)に寄託されたPCSK9の構造は、同じ立体構造(例えばPDB 2P4E、2PMW、2QTW、3BPS、GCW、3GCX、H42、3SQO、4K8R)でN末端溝に収納されているP’ヘリックスを揃って示す。Fab33:PCSK9構造では、P’ヘリックスの電子密度は見つからなかった。しかし、P’ヘリックスが通常位置するスペースの一部を占めるFab33 CDR-H2ループには、明らかな電子密度があった。この観察結果は、Fab33がいったんPCSK9に結合されると、大きな立体衝突のためにP’ヘリックスがもはやN末端溝に結合することができないことを明確に示した。Fab33はP’へリックスを置換し、高い結合アフィニティーでPCSK9と結合することができたため、P’へリックスは、N末端溝にしっかりと結合していないことが更に示唆された。抗体33/PCSK9の解離定数(Kd)値は、0.4nM(米国特許第9266961号)であった。N末端溝の方を向くCDR-H2ループは、結合エネルギーに寄与しているようには見えなかった。最も近いPCSK9溝残基はH391であり、CDR-H2残基N54から3.8Å離れており、この距離は水素結合とみなすには大きすぎる。分子解析プログラムPYMOLTMを用いて、4Åの基準を適用した。Fab33の任意の部分の4Å以内のPCSK9残基をエピトープとして決定した。分析に基づいて、エピトープは、ヒトPCSK9の残基R194、E195、D238、A239、G240、A341、Q342、E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379及びH391の1つ又は複数を含む。
結晶化条件が再現された生化学的アッセイでは、混入しているプロテアーゼがFab33:PCSK9複合体のP’ヘリックスを切断することがわかった。この切断は、48時間のインキュベーション時間にわたって高濃度のFab33:PCSK9複合体でのみ起こり、PCSK9それ自体は切断されなかったため、Fab33の存在に依存した。切断部位はN末端配列決定によってR165-Y166と同定され、これは、混入プロテアーゼが例えばトリプシン折り畳みセリンプロテアーゼファミリーのメンバーのようにArg特異性を有することを示唆する。したがって、セリンプロテアーゼ阻害剤を切断条件下で試験した。切断を容易に決定するために、合成N末端ペプチド153SIPWNLERITPPRYRA168に対して産生させたポリクローナルウサギ抗体を用いて、ウェスタンブロット法を実施した。この抗体は、インタクトなN末端ペプチド配列のみを検出し、切断型は検出しなかった。切断はセルピンアンチトロンビンIII(セルピンC1)によって防がれ、クニッツドメイン阻害剤アプロチニンによってある程度防がれたことが見出された(図4及び5)。よりエラスターゼ特異的なアルファ1-アンチトリプシン(セルピンA1)は切断を阻害しなかった(図4及び5)。
P’ヘリックスの固有の不安定性についての更なるエビデンスを提供するために、生化学的アッセイが設定された。トリプシン様セリンプロテアーゼパネルを試験し、結晶化条件下で観察されたものと同様の、P’ヘリックスを切断することができるプロテアーゼを同定した。プロテアーゼを抗体3D5の存在下又は非存在下で低濃度のFab33:PCSK9複合体と共にインキュベートした。3D5 Abは、PCSK9の「フリン切断ループ」に結合し、プロテアーゼ切断に非常に敏感な2つのアルギニン残基、R215とR218における切断を防止する(Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)。~55kDaバンドの出現によって示されるように、プロテアーゼヘプシン及びFXIaが「フリン切断ループ」を切断すること、また、この切断は3D5によって妨げられたことが見出された(図6)。更に3D5の存在下では、FXIaとヘプシンの双方が、イムノブロットで示されるように、P’ヘリックス又はその近辺で切断した(図6)。
[結晶化条件下でのPCSK9切断及びアンチトロンビンIIIによる阻害]
(表2に示すように)3つの異なる濃度のFab33:PCSK9複合体又はPCSK9単独を50mMのトリス(pH8.0)、150mMのNaCl、10%のグリセロール中で室温で48時間インキュベートした。試料のSDS-PAGE_の後、PCSK9触媒ドメインとCysリッチドメイン(CRD)とを含む60kDaのバンドをN末端配列決定によって分析し、結果を表2に報告した。
表2
プロテアーゼヘプシン(Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)、アルファ-トロンビン、FXa、FXIa、活性化プロテインC(バーモント州のHaematologic Technologies)及びFXIIa(Enzyme Research Laboratories)を、50mMのトリス(pH8.0)、150mMのNaCl、4mMのCaCl2中、抗体D5(4μM)の有無にかかわらず、Fab33(4μM)と複合体を形成した3μMのPCSK9と共に室温で6時間、50nMの濃度でインキュベートした。3D5抗体は、Lipariらによって記載されており(J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)、2つの残基R215及びR218を含む、PCSK9の表面に露出した「フリン切断ループ」に結合する。これらの2つの残基は、例えばフリン及びヘプシなどのArg特異的プロテアーゼによる切断をうけやすい(Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)。この部位におけるいかなる切断も防ぐために、3D5抗体をこの実験に含めた。試料のSDS-PAGE後、60kDaのPCSK9バンドをN末端配列決定により分析し、ウェスタンブロット法を上記のようにPCSK9N末端ペプチド抗体を用いて実施した。
PCSK9-R167A:R215A:R218A(=PCSK9-AAA)は、変異体PCSK9-R215A:R218A(Lipari et al. J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)に基づき、部位特異的突然変異誘発を用いて突然変異R167Aを加えることにより構築された。コンストラクトをCHO細胞において一過性に発現させ、公表されている手順に従って精製した(Zhang et al. J. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012; Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。EGFA-Fcの発現及び精製は、ZhangらJ. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012に記載された。ペプチドPep2-8(Ac-TVFTSWEEYLDWV-NH2)及びコントロールペプチドPep2-8-ctrl(Ac-TVATSAEEYLLWV-NH2)は、Zhangらにより2012J. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012に記載されている。
結果
以前は、PCSK9触媒ドメインの最初の13残基であり、溝結合P’ヘリックスを含むSIPWNLERITPPR(N13と称される)のナイーブファージペプチドライブラリー又はソフトランダム化ファージペプチドライブラリーのいずれかを用いてPCSK9Δヘリックスに対してパンニングすることが試みられた。しかしながら、こうしたあらゆる努力も、PCSK9又はPCSK9Δヘリックスに結合することができるいかなる溝結合ペプチドリガンドも生じさせることはできなかった。
[PCSK9Δヘリックスの構築、発現及び精製]
操作されたTEV部位(残基欠失Y166、R167;R165とA168間の挿入ENLYFQS配列、DNA750364)を有するヒトPCSK9コンストラクトM1-Q692を哺乳動物発現ベクター(pRK5)にクローニングした。発現タンパク質を含有する10リットルのCHO培地を、10000分子量カットオフ膜を有するMillipore接線流濃縮器を使用して濃縮した。濃縮物を2×1リットルのPBSを用いて2回濾過(di-filtered)した。最終容量は0.8L.であった。300mMのNaCl、50mMのトリス(pH7.5)、50mMのイミダゾール、10%のグリセロール中で平衡化し、0.3Mのイミダゾール、300mMのNaCl、50mMのトリス(pH7.5)を用いて溶出する5mL Niカラム(GE Healthcare)を使用して、PCSK9(250mL×4)を精製した。PCSK9を、0.15MのNaCl、25mMのトリス(pH8.0)、10%グリセロール中のSuperdex 200 16/60カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。(4回に分けて実行)SDS-PAGEを用いて画分をアッセイした。
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、標準的なクンケル突然変異誘発法を用いて構築された(Kunkel et al., Methods Enzymol 154, 367-82)。ランダム化ペプチドをアンカーペプチドPep2-8V2A及びGSGリンカー(TAFTSWEEYLDWVGSG)のC末端に融合させることによって、融合ペプチドライブラリーを構築した。ファージディスプレイライブラリーを作成するための標準的なプロトコールに従って融合ペプチドライブラリーをM13メジャーコートタンパク質のN末端にディスプレイした(Tonikian et al. Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86)。拡張プールは、連続した縮重コドン(N=A/C/G/Tで、K=G/TであるNNK)によりコードされた長さ8、10、12、14、16アミノ酸を有するランダムペプチドから構成された。長さの異なるライブラリーを個別に構築し、それぞれについて同じ濃度で一緒にプールした。ライブラリーの最終的な多様性は、1.3×1010であった。
融合ライブラリーのファージプールを、前述のように溶液中のビオチン化PCSK9及びビオチン化PCSK9Δヘリックスによる数ラウンドの結合選択を通して循環させた(Zhang et al. J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。ソフトランダム化ライブラリーのパンニングは、ラウンド2、3及び4に、それぞれ10nM、5nM及び2nMのビオチン化PCSK9及びビオチン化PCSK9Δヘリックスを使用したことを除いて、同じ方法で実施された。
選択したクローンの配列を、クンケル突然変異誘発法を用いてM13メジャーコートタンパク質(p8)のN末端に融合させた(Kunkel et al., Methods Enzymol 154, 367-82)。得られたコンストラクトを大腸菌に形質転換した。XL1ブルーの単一コロニーを、50μg/mLカルベニシリン、10μg/mLテトラサイクリン及びM13 KO7ヘルパーファージを補充した1mLの2YT中、37℃で2時間増殖させ、カナマイシンを25μg/mLの最終濃度まで添加し、増殖を37℃で6時間継続させた。培養物を50μg/mLカルベニシリン及び25μg/mLカナマイシンを補充した30mLの2YTに移し、37℃で一晩増殖させた。翌日、ファージを回収し、標準的なプロトコールを用いて精製した(Tonikian et al. Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86)。連続希釈したファージ溶液を、予め5μg/mLのニュートラアビジンでコーティングし、ブロック緩衝液でブロックした384ウェルMaxiSorp ImmunoPlateに15分間固定化したビオチン化PCSK9及びビオチン化PCSK9Δヘリックスに適用した。プレートを4℃で1時間インキュベートし、PT緩衝液(PBS、0.05%Tween(登録商標)20)で10回洗浄した。結合したファージを抗M13-HRPで検出し、ELISAシグナルをOD450nmで読み取った。バックグラウンドは、ファージがニュートラアビジンコートプレートに直接結合したELISAシグナルであった。データをプロットし、曲線をKaleidaGraphに当てはめた。最大結合シグナルの80%を与えた飽和以下のファージ濃度を結合曲線により決定した。
X線結晶解析をPCSK9 N末端溝結合ペプチドの研究に適用するために、当該ペプチドが「N末端溝」を占めるのに十分な空間を結晶格子に提供することが知られている結晶系を選択する必要があった。空間群P3221のPCSK9ΔCRDΔヘリックス/Pep2-8の結晶が選択された。このような結晶は製造するのが比較的容易であり、比較的高い分解能で回折し、さもなければ「N末端溝」に隣接するバルク溶媒によってのみ占められる実質的な体積を提供する。したがって、このような結晶中のPCSK9ΔCRDΔヘリックス:Pep2-8複合体の結晶充填は溝結合ペプチドを収納することができると予想された。
[PCSK9ΔCRDΔヘリックスの発現、精製及び結晶化]
操作されたTEV部位(残基欠失Y166、R167;R165とA168の間の挿入ENLYFQS配列、DNA766281、PCSK9ΔCRDTEV7)を有するヒトPCSK9コンストラクトR29-G452を有する組換えバキュロウイルスを、BaculoGoldTMシステム使用して、製造者(BD Biosciences)による記載の通りに生成した。発現は、10リットルのWave(登録商標)バイオリアクター内のバキュロウイルス培地中のSf9細胞内で72時間実施されたた。発現タンパク質を含有する培地を1mM塩化ニッケル、2mM塩化カルシウムで処理し、水酸化ナトリウムを使用してpH7.5に調整した。生じた沈殿物を低速遠心分離により除去した。上清を10kDa膜上のMillipore接線流を用いて濃縮し、緩衝液を10%グリセロールを含むPBSに交換して最終容量を1リットルにした。PCSK9ΔCRDTEV7を、10%グリセロールを含むPBSで平衡化したAKTA Explorerで5mLのHisTrap HPカラム(GE Healthcare)を用いて精製した。PCSK9ΔCRDTEV7を、0.25MのNaCl、50mMのトリス(pH8)、10%グリセロール中で平衡化したSuperdex 75 16/60カラム(GE Healthcare)に直接装填した10mLの0.3Mイミダゾール/PBS/10%グリセロールで溶出した。
切断型PCSK9ΔCRDΔヘリックスの全てのペプチド複合体は空間群P3221において結晶化した。各ケースにおいて、回折データは、波長約1ÅのX線を使用して110Kで単一の凍結保存結晶から収集され(表3-5)、HKL2000(Otwinowski and Minor, Methods in Enzymol, 1997. 276: p. 307-326)又はXDS (Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2): p. 125-32; Vonrhein et al., Acta. Crystallogr., 2011. D67: p. 293-302)のいずれか及びCCP4スイートの要素を使用して縮小された。第1の構造は、探索プローブであるPDBアクセションコード4NMX中の短形の(short-form)PCSK9(PCSK9ΔCRD)による分子置換を用いて解明された。RFREEの計算のための精密化から除外された一組の反射を全ての構造に対して使用した。精密化(Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67: p. 355-367; Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2): p. 213-21; Bricogne et al., BUSTER version 2.11.2. 2011, Global Phasing Ltd.: Cambridge, United Kingdom)には、高分解能構造のための水の自動配置及び置換係数のTLS処理が含まれる。Cootを用いて電子密度マップのモデル構築と検査を行った(Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 4): p. 486-501)。
表3
表4
表5
表6
結果
Pep2-8溝結合融合ペプチド、化合物2、化合物17、化合物19及び化合物20は、PCSK9とPCSK9Δヘリックスの双方に高アフィニティーで結合した(表7)。PCSK9Δヘリックス結合についてのナノモル以下の範囲のKd値に達する高アフィニティー(化合物17、化合物19及び化合物20;表7)は、融合ペプチドのPep2-8及び溝結合ペプチドの双方がPCSK9と相互作用するということを示した構造的結果と一致している(図20の化合物2;図22の化合物17;図21の化合物20)。
表7に示した溝結合ペプチドは全て、μM又はμM以下の範囲のKd値でPCSK9Δヘリックスに結合した。PCSK9Δヘリックスに対して最も高いアフィニティーを有する2つのペプチドは、化合物32(Kd0.21μM)及び化合物73(Kd0.167μM)であった。一般に、PCSK9Δヘリックスに対する結合アフィニティーは、PCSK9と比較してより強く、これはPCSK9Δヘリックスコンストラクト中にP’ヘリックスが存在しないためであり、PCSK9中のP’ヘリックスと競合することなくペプチドによる溝への直接アクセスを可能にする。更に、Pep2-8におけるW6のフルオロ-W6への置換(表7の化合物3)は、PCSK9及びPCSK9Δヘリックスに対する結合アフィニティーを数倍増加させた。
結果は、溝結合ペプチドがμM及びμM以下の範囲の結合アフィニティーでPCSK9およびPCSK9Δヘリックスの双方に結合することができることを実証している。
表7
[バイオセンサーに基づくアフィニティー分析]
全てのアッセイは、20℃の分析温度で行われた。PCSK9タンパク質の変性を防ぐために、試料を試料架内で10℃に保持した。GE HealthCareのbiacore T100及びSensiQ Pioneer FEを使用した。特記しない限り、全ての試薬は、Sigma-Aldrichから入手したものである。同等のアフィニティー/速度パラメーターを報告すると予想される3つの密接に関連したバイオセンサープロトコールを使用して、フルセットのペプチドを分析した。複数のプロトコールの必要性は、いくつかのペプチドの潜在的凝集能力に関連していた。緩衝液組成物は、例えばジメチルスルホキシド(DMSO)、10kDaのポリビニルピロリドン(PVP)及び10kDaのカルボキシメチル化デキストラン(CMデキストラン)などの可溶化剤の添加以外は、大部分保存された。
方法1を用いて、Pep2-8、並びに化合物19、20、26及び28を分析した。Series S NTAセンサーチップをBiacore T100バイオセンサーシステムにドッキングした。このシステムをランニング緩衝液(すなわち50mMのHEPES、0.15MのNaCl、0.005%のT20、pH7.5)中でプライミングした。ヘキサヒスチジンタグ化タンパク質(すなわちPCSK9又はPCSK9Δヘリックス)を、参照センシング表面として適用するために、少なくとも1つのセンシング表面がコーティングされていないままである別々のセンシングチャネル上にアフィニティー捕捉した。化合物試料をランニング緩衝液中で調製し、インジェクションした。その後、次の試料を試験するために、各タンパク質を再充填する前に、全てのアフィニティー結合複合体を除去した。したがって、各試料サイクルは、以下のように各試験試料について繰り返された5回の連続インジェクションから成っていた。
インジェクション1
0.25Mのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を、全てのセンシングチャネル上に30μL/分の流速で3分間インジェクションした。この曝露は、ポリヒスチジンとNi-NTA錯体との間のキレート結合を介して結合している全てのアフィニティー結合複合体を除去し、またあらゆる混入金属イオンも除去する。
インジェクション2
ニッケル溶液(脱イオン超純水中の1mMのNi)を、30秒間、30μL/分の流速で全てのセンシングチャネル上にインジェクションした。Niイオンは、ヒドロゲルベースのセンシング表面内に予め結合しているニトリロ三酢酸と錯体を形成する。Niを充填させると、得られる金属-NTA錯体は、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質への高アフィニティー結合を可能にする。
インジェクション3
ランニング緩衝液中3μg/mLの調製PCSK9Δヘリックスタンパク質を、単一のNi-NTA活性化センシングチャネル上に30μL/分の流速で80秒間インジェクションした。
インジェクション4
ランニング緩衝液中5μg/mLの調製PCSK9を、単一のNi-NTA活性化センシングチャネル上に30μL/分の流速で20秒間インジェクションした。試料をインジェクションする前に、ベースラインを5分間安定化させた。
インジェクション5
高水準インジェクションモードを使用して、試料をインジェクションした。化合物19及び化合物20を、6つの連続2倍希釈物として調製し、各々を50μL/分の流速で100秒間、全てのセンシングチャネル上に900秒の解離でインジェクションした。Pep2-8、化合物26及び化合物28を、8つの連続2倍希釈物として調製し、各々を50μL/分の流速で100秒間、全てのセンシングチャネル上に900秒の解離でインジェクションした。これらの化合物について、5回の連続インジェクションからなる全試料サイクルを各希釈物について繰り返した。この試料サイクルは、試料テーブルの各試料に対して得られる反復配列だった。
方法2を用いて、化合物2、化合物23及び化合物17を分析した。この方法は、単一化合物希釈物インジェクションを濃度上昇を伴う5回連続インジェクションに置き換えることによって各試料サイクル中に全希釈系列を完成させることを可能にする、単一サイクル速度と呼ばれる(製造業者による命名)代替インジェクションモードを用いた以外は、方法1と同じであった。得られたセンサーグラム(すなわち応答曲線)は、各々がインジェクションされた各化合物希釈物と会合した5つの結合-解離相を含んでいた。活性化、捕捉、及び再生インジェクションは、変化しないままだった。化合物17については100nMから、他の全ての化合物については100μMから化合物を希釈して、5つの連続2倍希釈物を作製した。表面への非特異的結合を更に低下させるために、アッセイ中の全ての緩衝液に、CMデキストラン(Sigma-Aldrich 製品番号86524)も2mg/mLの最終濃度まで添加した。しかし、このペプチドには非特異的結合が存在しないために必要とされなかったCMデキストランの省略以外は、同じ単一サイクル速度及び同じプロトコールを用いて、化合物17を分析した。記録された全ての結合曲線は、自動的に二重参照され、GE HealthCareのBIA評価分析ソフトウェアを用いて1:1モデルに当てはめられた。
化合物31、化合物32、化合物33、化合物34、化合物3、化合物73、化合物50、化合物52、化合物51、化合物55、化合物82、化合物45、化合物96、化合物53及び化合物97を、方法3を用いて分析した。いくつかのペプチドが凝集する傾向を考えると、SensiQ Pioneer FEとして市販されているもう一つのバイオセンサー技術を使用することによって、ペプチド分析が更に改善されるであろうと決定された。この機器は、表面化学、フローインジェクション分析及び使用できる方法論の点でBiacore ABバイオセンサーに類似しているが、センシング表面上で化合物を滴定する方法も提供する点が異なる。滴定は、キャピラリー(Quinn, Analytical Biochemistry 421: 391, 2012; Quinn, Analytical Biochemistry 421: 401, 2012)を使用して形成され、従来の表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサーと同様に結合速度及びアフィニティーを報告する結合応答曲線を生成するが、他の技術異なり、分子量に対する化合物勾配プロファイルの依存性のために化合物凝集の記述子を報告する。
結果
PCSK9受容体によるHepG2細胞の処理が、LDLR表面レベルを約75%減少させた(図29及び30)。Pep2-8はそれ自体で、約5-10μMの濃度でLDLRレベルを50%まで回復することができた。Fab33はより強力であり、0.1-0.2μMの濃度で50%のLDLR回復を達成した。2つの溝結合ペプチドPep2-8p4(化合物19:Ac-T V F T S W E E Y L D W V G S G C R L P W N L Q R I G L P C-NH2)及びPep2-8p7(化合物20:Ac-T V F T S W E E Y L D W V G S G D L M P W N L V R I G L L R-NH2)は、Pep2-8よりはるかに強力で、それぞれ約0.5μMの濃度、1-5μMの濃度で、LDLRレベルを50%まで回復させた(図29及び30)。
[HepG2細胞を用いた細胞表面LDLRアッセイ]
HepG2細胞(ATCC;バージニア州マナッサス)を、2mMのグルタミン(Sigma)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)及び10%FBS(Sigma;ミズーリ州セントルイス)を含有する高グルコース培地(DMEM,Gibco;カリフォルニア州カールスバッド)中、1ウェル当たり1×105細胞で48ウェルプレート(Corning;ニューヨーク州コーニング)播種し、一晩インキュベートした。その後、培地を10%リポタンパク質欠乏血清(LPDS、Sigma)を含有するDMEMに交換した。24時間後、15μg/mLのPCSK9をペプチド又はFab33と共に30分間インキュベートし、細胞に添加し、37℃で4時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、PBS中の細胞解離緩衝液(Gibco)を用いて脱離させた。遠心分離後、再懸濁細胞を1:20の抗LDLR抗体(Progen Biotechnik;ドイツ、ハイデルベルグ)と共に氷上で10分間インキュベートした。その後試料をPBSで洗浄し、1:200希釈ヤギ抗マウスIgG(H+L)Alexa Fluor 488(Invitrogen;カリフォルニア州カールスバッド)と共に氷上で5分間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、細胞を2.5μg/mLのヨウ化プロピジウムを含有するPBSに再懸濁させ、デュアルレーザーフローサイトメーター(FACScan,Becton Dickinson;ニュージャージー州フランクリンレイクス)で分析した。相対蛍光単位(RFU)を用いて、HepG2細胞表面上のLDLR発現レベルを定量した。細胞表面LDLRレベルは、PCSK9(=コントロール)の非存在下で測定されたLDLRレベルのパーセントとして表した。
結果
溝結合ペプチド化合物26と化合物29は、遊離N末端(化合物26)又はアセチル化N末端(化合物29)を有することのみが異なる。化合物26(実施例3)の決定された結晶構造は、ペプチドがPCSK9のN末端溝に結合することを示している(図23)。このペプチドは、SPR実験において決定されたように29μMのKd値でPCSK9に結合した(実施例4、表7)。図31の結果は、Fab33と同様に、双方の溝結合ペプチドが切断反応を加速させ、P’へリックスのほぼ完全な切断をもたらすことを示している。FXIaの非存在下では、2つのペプチドは効果がなかった(図31)。
別の実験では、直鎖状ペプチド化合物112(n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2)及びその誘導体化合物118(n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLTR-NH2)(これはアルギニンの代わりにホモアルギニンを有する)を使用した。FXIaのS1ポケットは修飾又は非天然アルギニン残基を収納することができないため、ホモアルギニンが、FXIaによる切断を防ぐために導入された。実際、FXIa切断の経時変化は、ホモアルギニン含有ペプチド化合物118が、LC-MSによって決定された通り、6時間にわたってインタクトなままであることを示した(図32)。対照的に、アルギニン含有ペプチド化合物112は、時間依存的に切断された。すなわち、LC-MSによって定量された通り、1時間後に34%、6時間後に76%が切断された(図33)。図34は、ペプチド化合物112と比較して、切断不可能なペプチド化合物118と共にK9-AAAをインキュベートすると、FXIaによるより高度のP’へリックス切断がもたらされたことを示す。
これらの結果は、試験したペプチド化合物26、化合物29、化合物112及び化合物118が、Fab33について示したのと同様に、R160-I161でのP’へリックスのFXIa媒介切断を増加させることができたことを示す。これらのペプチドのうちの1つの結晶構造(化合物26:図23)は、ペプチドが通常P’へリックスを有するN末端の溝部位を占めることを示している。したがって、Fab33と同様に、これらのペプチドは、放出された「アウト」立体構造(ejected “out” conformation)でP’へリックスを維持し、これはFXIa切断を受けやすくなる。これは、図12に示されているメカニズムと一致している。
[FXIa切断アッセイ]
2.6μMのPCSK9-R167A:R215A:R218A(PCSK9-AAA)を、50nMのFXIaと50μMの化合物26、50μMの化合物29、50μMの化合物112又は50μMの化合物118のいずれかとを含むトリス緩衝液中でインキュベートした。Fab33(2μM)又はPep2-8(4μM)をコントロールとして使用した。室温でのインキュベーションの20時間後(化合物26及び化合物29)又は6時間後(化合物112及び化合物118)、試料をSDS-PAGEにより分析し、iBlot(Invitrogen)を用いてニトロセルロース膜に転写した。その後タンパク質を、iBind(Invitrogen)を用い、PCSK9N末端ペプチド(153SIPWNLERITPPRYRA168)に対して産生させたポリクローナルウサギ抗体(1:3000)、続いてHRPコンジュゲートロバ抗ウサギ抗体(1:5000、GE Healthcare)でプローブした。PCSK9シグナルをECL(GE Healthcare)によって検出し、オートラジオグラフィーによって可視化した。
[溝結合ペプチドの切断を決定するための液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)]
ペプチド化合物112中のアルギニンの後ろ又はペプチド化合物118中のホモアルギニンの後ろのFXIa媒介性切断を決定するために、FXIa切断アッセイ(上記参照)からの10μlの反応試料を0、1、6時間目に採取し、PLRP-S逆相カラムを備えたAgilent 1260 Infinityシステムでの分析用LC-MSにより分析した。計算された分子量を使用することにより、かつ、曲線下面積を測定することによりペプチド切断を決定した。
結果
LDLR結合部位及びN末端結合溝への分子の結合を測定するためのアッセイを確立した。前者は、LDLRのEGF(A)ドメインのPCSK9への会合を測定するためのTF-FRETアッセイ(「PCSK9/EGF(A)結合アッセイ」)に基づき、後者は、PCSK9ΔヘリックスへのAb20の結合を測定するTR-FRETアッセイに基づいた(「PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイ」)。N末端にHisタグを有し、C末端にFcドメインを有するEGF(A)タンパク質を使用するカウンタースクリーニングアッセイにおいて、分子の非特異的結合効果についても試験し(「His-EGF(A)-Fcカウンタースクリーニング」)た。PCSK9への結合の真の阻害剤は、カウンタースクリーニングにおいてTR-FRETのいかなる減少も示さないはずである。
アンカーペプチド、リンカー、及びC末端伸長ペプチドを含有するファージ由来ペプチド配列を再現するために、ペプチドを最初に合成した。化合物1によって例示される連鎖(表8A)は、PCSK9/EGF(A)結合アッセイにおいてPep2-8と同等の活性を有するが、PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイにおいては勝った活性を有し、これは、C末端伸長がN末端溝部位を占めていることを示す。このペプチドの切断(化合物4-7))は、PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイにおける効力を徐々に減少させたが、これは、N末端溝とのより弱い相互作用を示す。PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイにおける効力を維持しながら、様々なペプチド及び非ペプチドリンカーを用いてアンカー及び伸長ペプチドを連結した。
ペプチド化合物20は、ファージディスプレイにより同定された異なる配列を例示する。この場合、PCSK9/EGF(A)結合アッセイにおける阻害は、Pep2-8と比較して有意に改善され、PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイにおける阻害は、低ナノモル濃度で生じた。
ジスルフィド結合C末端伸長を有するアンカーペプチドもまたアッセイした(表8B)。N末端システインと「PWNLxRIG」モチーフとの間に2残基を有するペプチド(化合物19、化合物25及び化合物38)は全て、PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイにおいて強力な阻害剤であったが、これは、実施例3に記載のN末端溝部位との相互作用がこれらのペプチドの結合に寄与していることを示す。化合物19はまた、PCSK9/EGF(A)結合アッセイの強力な阻害剤でもある。N末端システイン残基のすぐ後に続く「WNLxRIG」モチーフを有するペプチドも、表8Bに記載されている。4アミノ酸リンカー(化合物13及び化合物14)を用いた例は、PCSK9/EGF(A)及びPCSK9Δヘリックス/Ab20アッセイフォーマットにおける強力な阻害剤であった。非ペプチドリンカーは、両アッセイにおいて効力を維持した(化合物15、化合物17及び化合物24)。この連鎖では、ジスルフィド結合の除去がC末端切断の生成を促進し、これがPCSK9/EGF(A)アッセイにおける活性を低下させたが、PCSK9Δヘリックス/Ab20アッセイにおける活性は、WNLxRIGモチーフのイソロイシンを超える切断まで維持された。
C末端伸長ペプチドもまた、Pep2-8アンカー成分なしで合成し、生化学アッセイでも試験した。直鎖状伸長ペプチドを表8Cに列挙する。14残基ペプチド化合物35は、この連鎖の前駆体であり、50μMまで結合するPCSK9/EGF(A)アッセイにおいて阻害を全く示さないが、PCSK9Δヘリックス/Ab20アッセイにおいては4.8μMのIC50で阻害する。このペプチドにおける個々のアミノ酸のアラニンでの置換は、WNLxRIGモチーフの重要性を強調した。すなわち、これらのアラニン置換の全てが阻害を阻止した。同様に、このペプチドのN又はC末端のいずれかからの切断は、切断がWNLxRIGモチーフに近づくと、阻害レベルを劇的に減少させた。キャッピングアセチルを吉草酸部分で置換することにより、N末端切断において阻害を改善することができた。したがって、10残基ペプチド化合物111及び化合物112は双方とも、PCSK9Δヘリックス/Ab20において10μM未満のIC50値で阻害する。WNLxRIGモチーフ中のアルギニン側鎖をホモアルギニンで置換すると、阻害が5倍増強された(化合物118;vのPCSK9Δヘリックス/Ab20 IC50)。
ジスルフィド環化伸長ペプチドもまた、PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイにおいて測定可能な阻害を示した(表8D)。したがって、化合物32(N末端システインとWNLxRIGモチーフの間に3残基を有する伸長ペプチド連鎖の例)は、PCSK9Δヘリックス/Ab20アッセイにおいて~1μMのIC50を有した。この連鎖で行われたアラニン置換スキャンはまた、強力な阻害を維持するためのWNLxRIGモチーフ中の残基の重要性を示した。WNLxRIGモチーフ内のD立体化学のアミノ酸による置換もまた、阻害の喪失をもたらす。リジン残基はWNLxRIGモチーフの「x」位で許容され(化合物67;PCSK9Δヘリックス/Ab20 IC50 0.7μM)、ホモアルギニンによるこのモチーフの「R」の置換もまた、阻害の改善をもたらす(化合物117;PCSK9Δヘリックス/Ab20 IC50 0.33μM)。PCSK9Δヘリックス/Ab20アッセイにおいて、C末端システインの前の4残基の有機リンカーでの置換は阻害を除去する(化合物83、化合物84、化合物85及び化合物86)が、一方、C末端システインの前の3残基の有機リンカーでの置換は、弱いが検出可能な阻害を与える(化合物116、化合物121)。
最後に、N末端システインとWNLxRIGモチーフの間に残基を介在させない一連のジスルフィド環化ペプチドでは、PCSK9Δヘリックス/Ab20アッセイにおける阻害は、適切なN末端置換を用いて観察される(例えば化合物98;PCSK9Δhelix/Ab20アッセイ IC50 3.6μM)。
[ペプチド合成方法]
当業者に既知の標準的なフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)/tert-ブチル(tBu)固相法を用いて、ペプチドを合成及び精製した(Chan, W. C., White, P. D., Eds. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Oxford University Press: New York, 2000.; Albericio, Fernando; Tulla-Puche, Judit; Kates, Steven A. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry Volume 3, Pages 349-369, 2011)。
[PCSK9 TR-FRET結合アッセイ法]
化合物がPCSK9への結合を阻害する能力を、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)結合アッセイのパネルを用いて評価した。PCSK9/EGF(A)-Fc結合アッセイは、Hisタグ付き全長PCSK9への結合についてEGF(A)-Fcと競合する化合物の能力を評価した。PCSK9Δヘリックス/Ab20結合アッセイは、Hisタグ付きPCSK9Δヘリックスコンストラクト中のN末端溝領域への結合についてAb20と競合する化合物の能力を評価した。Ab20は、アフィニティー成熟Ab YW508.20.33の低アフィニティー前駆体抗体YW508.20である(Wuら、米国特許第9266961号)。His-EGF(A)-Fc結合アッセイは、アッセイ検出システムに干渉する化合物を同定するためのカウンタースクリーンとして役立った。PCSK9結合アッセイにおけるシグナル発生は、PCSK9上のHisタグとリガンド上のFcタグとを極めて接近させるための結合相互作用に依存していた。抗His-APCはHisタグに結合し、抗Fc-ユーロピウムはFcタグに結合した。これら2つの抗体が近接していて340nmの光を照射されたとき、ユーロピウムは励起され、615nmのエネルギーを放出した。このエネルギーはAPCによって吸収され、665nmの光として放出された。リガンドと競合した化合物は、エネルギー移動を、すなわち665nmで発光を減少させた。カウンタースクリーニングにおjけるHis-EGFA-Fc分子では2つのタグは常に近接していたため、665nmでの発光の減少は検出システムとの干渉によるものだった。
化合物を可溶化し、希釈物をDMSO中で調製した。40ナノメートルの試験化合物、参照化合物又はDMSOコントロールを1536ウェルCOCアッセイプレート(黒)(Aurora Microplates、モンタナ州ホワイトフィッシュ)に加え、続いて2μLの試験タンパク質(PCSK9、PCSK9Δヘリックス又はHis-EGF(A)-Fc)と、アッセイ緩衝液(50mMのトリス-HCl pH7.5、150mMのNaCl、2mMのCaCl2、0.01%のTween-20、0.1%のウシガンマグロブリン及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)中40nMの抗His-APC(PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム)を加えた。プレートを遠心分離してウェルの内容物を混合し、30分間インキュベートした。その後、4nMの抗Fc-ユーロピウム(PerkinElmer)を含む2μLのリガンド(アッセイ緩衝液中EGF(A)-Fc若しくはAb20又はカウンタースクリーニング用に緩衝液単独)を加え、プレートを2時間インキュベートし、続いて短い遠心分離でウェル内容物混合した。TR-FRETシグナルを、340nmでの励起と615及び665nmでの発光を用い、励起と発光の測定との間に50μ秒の時間遅延を設けて、ViewLuxリーダー(PerkinElmer)で読み取った。TR-FRET比率は、665nmでの蛍光発光を615nmでの蛍光発光で除して計算した。正規化TR-FRET比率を化合物濃度の関数としてプロットし、IC50値を4パラメーターロジスティック回帰を用いて決定した。特定のアッセイパラメーターを表9にまとめる。
表9
化合物35の最初の3残基(Asp/Leu/Met)の欠失は、Ab20アッセイ及びSPRによって決定されるようにPCSK9Δヘリックスへの結合にほとんど影響を及ぼさず(表10、化合物50~52)、化合物20の結晶構造中のAsp/Leuの無秩序状態と一致する(図21)。
表10
重要なEGF(A)安定化残基Pro 4の更なる除去は、10分の1に減少した結合アフィニティーを有する10残基ペプチドをもたらした(表10、化合物53)。ホモアルギニン置換は、結合アフィニティーを14倍改善させた(表10、化合物192)。2.20Åの分解能でPCSK9ΔCRDΔヘリックスに結合した化合物192の結晶構造は、ホモArgによるアフィニティーの改善を説明した(図35)。化合物20の天然Arg残基及び天然P’-ヘリックスと比較して、ホモArg側鎖が反転しており、グアニジニウム基がPCSK9残基Asp343との塩橋に係合するように最適に位置していた。
化合物53のN末端Trpから3-6アミノ酸伸長を有するファージライブラリーを構築した。N末端Trpに先行するEGF(A)安定化Pro残基の出現を回避し、そして伸長配列に最大の柔軟性を提供するために、Trp残基に先行するこの最初の位置をGly又はSer残基として固定した。ペプチドディスプレイファージをPCSK9Δヘリックスに対してパンニングし、5及び6個の伸長残基を有する、アフィニティーが改善された複数の結合剤を同定した。これらは全て、3つのアミノ酸モチーフPhe/Tyr-Pro-Glyを共有していた。ホモ-Arg置換を用いて5つのペプチドを合成し、それらの阻害効力を決定した(表11)。
表11
化合物192と比較して、化合物227-231は、Ab20アッセイの結果とEGF(A)-Fcに対する阻害活性に基づいて、結合アフィニティーが改善されていた(表11)。化合物228及び229は最も強力であり、EGF(A)-Fc及びLDLR-Fc結合を阻害した(図36、表11)。化合物229のより優れた力価は、SPR実験において決定されたPCSK9に対するそのより強い結合アフィニティーと一致していた(化合物229及び228についてそれぞれKD0.94±0.01μM vs KD2.8±0.05μM)。HepG2細胞において、化合物229は、濃度依存的にPCSK9媒介性LDLR分解を阻害し、表面LDLRレベルを最大70%まで回復させた(図37)。不完全な活性は、おそらく化合物の溶解度限界によるものであった。親ペプチド(化合物192)と比較して、MESFPG伸長(化合物229)は、PCSK9Δヘリックスに対するアフィニティーを6倍以上改善し(表11)、これはすなわちPCSK9Δヘリックスとの更なる相互作用によるか又はWNLV(hR)IGLLRペプチド部分のヘリックス構造による増加であるが、結合に対するエントロピーペナルティを減少させるであろう。この仮説を試験するために、溶液中の化合物192及び229双方の立体配座優先性を核磁気共鳴(NMR)分光法を用いて調べた。化合物229は溶液中で好ましい立体配座を採用しなかったが、残基7WNLV(hR)IGL14にまたがる領域にαヘリックス構造を形成する傾向があるようであった。αヘリックス構造の特徴的な少数の弱い中距離NOE接触、dNα(i,i+3)及びdαβ(i,i+3)の検出は、化合物229の小集団のみがこの配列のこの領域にあるαヘリックスを形成する傾向にあり、したがって弱い中距離NOEの検出に貢献していることを示した(図38)。化合物192についても同様のNOEパターンが観察され(図38)、これは、MESFPG伸長部がなくても化合物192がαヘリックス構造を形成する傾向を保持し、化合物229で観察されたアフィニティーの改善が恐らくMESFPGとPCSK9Δヘリックスの間の追加の接触に由来していたことを示している。
アフィニティー増加に対するMESFPG伸長部の役割及びその拮抗特性を理解するために、結合ペプチドの結晶構造を、PCSK9Δヘリックス及びCRD結合Fab7G7を用いたもう一つの結晶化系を使用することによって得た(図39-41)。この系内で成長した結晶はPep2-8が存在せず、ペプチドが溝部位に結合するのを妨げる分子間接触もなかった。2.90Å構造は、6つのN末端残基MESFPGが、「直線」方式でEGF(A)に向かって延びるのではなく、同定された「FPG」モチーフの3つの残基及びコアペプチドのそれに続くTrpについてI型αターンを採用したことを示した。Met1残基の主鎖カルボニル酸素原子からGln342へ、及びSer3側鎖からAsp367へと、PCSK9との2つの新しいH結合があった(図39)。更に、化合物229のN末端部分は、Met1、Phe4、Trp7、Val10及びhArg11由来の側鎖によって提供されるペプチド内疎水性接触の集積を含み、それは結合配座(bound conformation)を安定化した可能性があり(図40)、その全ては電子密度によって明確に示された(図42)。Met1の2つの役割(H結合、疎水性コア)は、N末端Met残基が存在しない、より短い化合物227の、およそ3分1に下がった阻害活性を説明しうる(表11)。ペプチドの拮抗作用はPro残基に由来し、これはモデル化実験に基づくEGF(A)残基Leu298、Asp299及びAsn300と立体的に衝突すると予測される(図41)。4つの更なる拮抗ペプチド中のFPG又はYPGモチーフの存在は、それらが全てMESPFGペプチドについて記載されたのと同じメカニズムによってPCSK9に結合する類似のαターン立体構造及び拮抗EGF(A)を採用することを示した。
[ファージディスプレイ融合ペプチドライブラリーの構築及び結合選択]
ライブラリーは、標準的なクンケル突然変異誘発法を用いて構築された(Kunkel et al., Methods Enzymol 154, 367-82 (1987)。WNLVRIGLLR融合ペプチドライブラリーは、2-5残基の範囲のランダム化ペプチドをペプチド(G/S)WNLVRLGLLRのN末端に融合させることによって構築された。ランダム化ペプチドは、連続的な縮重コドンNNKによってコードされ、Gly/SerはRGTによってコードされた(R=A/G)。ライブラリーの最終的な多様性は、2.5×1010であった。WNLVRIGLLR N末端伸長ライブラリーのファージプールをビオチン化PCSK9Δヘリックスに対してパンニングした。4ラウンドの結合選択の後、標的としてプレート固定化PCSK9又はPCSK9Δヘリックスを使用して個々のファージクローンをハイスループットスポットファージELISAで分析した(Tonikianet al., Nat Protoc 2, 1368-86 (2007))。同じファージ粒子のニュートラアビジンへの結合シグナルは、非特異的結合ノイズとして考慮された。PCSK9又はPCSK9Δヘリックスへの結合シグナルが0.4以上で、かつ、シグナル:ノイズ比が>2であるファージクローンを陽性とみなし、DNA配列分析に供した。
[その他のタンパク質試薬]
LDLR-Fc及びEGF(A)-Fc融合タンパク質をZhangら、Biol Chem 289, 942-55 (2014)及びZhangら, J Mol Biol 422, 685-96 (2012)に記載の通りに調製した。
[細胞表面LDL受容体を測定するためのHepG2アッセイ]
PCSK9媒介性LDL受容体分解に対する化合物229の効果を、以前に記載されたようにHepG2細胞アッセイにおいて測定した(Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)。細胞に添加する前に、様々な濃度のペプチドを、0.5% DMSOの存在下で15μg/mLのPCSK9と30分間プレインキュベートした。4時間インキュベートした後、細胞を記載のようにフローサイトメトリーによりLDL受容体表面レベルの測定のために処理した(Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55) (図37)。
[時間分解蛍光共鳴エネルギー移動(TR-FRET)アッセイ]
黒色の1536ウェルアッセイプレート(MaKO、Aurora(登録商標) Microplates、モンタナ州ホワイトフィッシュ)において、DMSO中40nLのペプチドを、アッセイ緩衝液 (50mMのトリス-HCl(pH7.5)、150mMのNaCl、2mMのCaCl2、0.01%Tween(登録商標)-20、0.1%のウシガンマグロブリン及びプロテアーゼ阻害剤カクテル)中Hisタグ付きPCSK9及び抗His-アロフィコシアニン2μLと共に30分間プレインキュベートした。その後、アッセイ緩衝液中Fcタグ付きリガンド及び抗Fc-ユーロピウム2μLを加え、2時間インキュベートした。各アッセイのPCSK9及びリガンド条件は以下の通り:EGF(A)アッセイについては、10nMのC末端(His)8タグ付きPCSK9及び12nMのEGF(A)-Fc、LDLRアッセイについては、10nMのC末端(His)8タグ付きPCSK9及び2.5nMのLDLR-Fc、Ab20アッセイについては、1.25nMのC末端(His)8タグ付きPCSK9Δヘリックス及び0.75nMのAb20、カウンタースクリーニングについては、2nMのHis-EGF(A)-Fc単独。全てのアッセイにおいて、抗His-アロフィコシアニン及び抗Fc-ユーロピウムをそれぞれ20nM、2nMで使用した。340nmでの励起及び671nmでの発光で蛍光度を測定した。TR-FRET比率は、671nmの蛍光/618nmの蛍光として計算された。この比率をコントロールに対して正規化し、ペプチド濃度に対してプロットしてIC50値を決定した(Screener Analyzer、スイス、バーゼル)。ペプチドをアッセイ当たり3回の別々の実験で10点滴定及び濃度当たりn=2で評価した。示された値は、3回の独立した実験の平均±標準偏差である。
[PCSK9Δヘリックス/Fab7G7の構造決定]
Fab7G7は、標準的な技術を使用するパパイン切断により抗体7G7(Lipari et al., J Biol Chem 287, 43482-91 (2012))から調製され、Protein G Sepharose(登録商標)アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された。Fab7G7及びPCSK9Δヘリックスを等モル濃度で混合し、複合体をSuperdexTM200サイズ排除クロマトグラフィーを用いて単離した。濃縮したPCSK9Δヘリックス/Fab7G7複合体(5mg/mL)をハイスループット結晶化スクリーニングに供した。2.8MのNaOAc、0.1Mのトリス(pH7.0)を含有する高塩条件から成長する結晶が観察された。18℃でのシッティングドロップにおける最適条件は、2μLの複合体から4M酢酸アンモニウム、0.1Mトリス(pH8.5及び3%(v/v)1,8ジアミノオクタン2μLを使用した。その後、PCSK9Δヘリックス/Fab7G7の結晶を、化合物229で飽和させたリザーバー溶液に5日間浸した。結晶を3.4Mのマロン酸ナトリウム(pH7.0)の溶液に通してスワイプし、液体窒素に急速に浸すことによって、データ収集用に保存した。ALSビームライン5.0.2で1.0000ÅのX線を使用して、110Kで回折データを収集し、標準的な方法によって2.90Åに縮小させた(表12)。
表12
構造は、PDBからのPCSK9(PDB アクセション 2QTW)及びマウスFab(アクセションコード5EOQ)を用いる分子置換によって空間群I222において解明され(McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007))、非対称単位に単一の複合体を含んでいた。ハイブリドーマ細胞由来のDNA配列を使用して、数個のコドンを定常領域に伸長させるFab7G7可変ドメイン配列を決定した。この配列及び電子密度の指標により、抗体7G7をIgG2b/Vκとして割り当てることができた。Fab7G7は、C末端システインリッチドメイン(CRD)においてPCSK9Δヘリックスに結合する。明確な電子密度によりペプチドの添加及び精製が可能になった(Bricogne, G. et al. BUSTER version 2.11.2. (Global Phasing Ltd., Cambridge, United Kingdom, 2011))(表12)。最終的な精密化モデルは、最も好ましいラマチャンドラン空間で主鎖のねじれ角の96%を有していた。
[PCSK9ΔCRDΔヘリックスとのペプチド複合体の構造決定]
TEVプロテアーゼ切断部位を、PCSK9Δヘリックスに関して上述したように、前述のバキュロウイルスコンストラクトPCSK9 Q31-G452(PCSK9ΔCRD)に操作して入れた(Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)。このコンストラクトを記載されているように(Zhang et al., J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)実質的に発現させて精製し、その後、PCSK9Δヘリックスについて上述したようにTEVプロテアーゼにより処理して、P’-ヘリックスを欠くPCSK9ΔCRDΔヘリックスを生成した。PCSK9ΔCRDΔヘリックス(0.2MのNaCl、40mMのトリス(pH8.0)、5%グリセロール中10mg/mL)及びペプチド(2倍モル過剰)を用いる共結晶化試験を、市販のスパースマトリックススクリーンで実施した。最良の結晶は、0.2Mの酢酸カルシウム、0.1Mのトリス(pH8.0)及び20%(w/v)のPEG6000を使用し、18℃でのシッティングドロップ法で、薄い六角形のプレートとして成長した。収集した結晶を、30%(v/v)グリセロールを補充した結晶化リザーバーで処理及び液体窒素への急速浸漬によってデータ収集用に保存した。
化合物192との複合体について、ビームラインSSRL12-2で0.97946ÅのX線を使用して、110KDで単一の凍結保存結晶から回折データを収集し(表12)、HKL2000(Otwinowski et al., Methods in Enzymol 276, 307-326 (1997))又はXDS(Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-32 (2010); Vonrhein et al., Acta. Crystallogr. D67, 293-302 (2011))のいずれか及びCCP4スイートの要素(Winn et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4): p. 235-242)を使用して縮小した。探索プローブであるPDBアクセションコード4NMX中のPCSK9ΔCRDでの分子置換(McCoy et al., J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007))を用いて構造を解明した。RFREEの計算のための精密化から隔離された一組の反射を使用した。精密化(Murshudov et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 355-367 (2011); Bricogne et al., BUSTER version 2.11.2. (Global Phasing Ltd., Cambridge, United Kingdom, 2011); Delaglio et al., J Biomol NMR 6, 277-93 (1995))には、高分解能構造のための水の自動配置及び置換係数のTLS処理が含まれる。最終的な精密化モデルは、最も好ましいラマチャンドラン空間で主鎖のねじれ角の97%を有していた。Cootを用いて電子密度マップのモデル構築と検査を行った(Emsley et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486-501 (2010))。
[表面プラズモン共鳴(SPR)によるPCSK9及びPCSK9Δヘリックスへのペプチド結合のアフィニティー測定]
BiacoreTM T100又はBiacoreTM 8Kを20℃に調整した。このシステムを、潜在的な非特異的結合を減らすために、25mMのHEPES(pH7.5)、0.15MのNaCl、0.005%(v/v)Tween(登録商標)20、0.2mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンから成り、任意選択的に0.1%(w/v)カルボキシメチル化デキストラン(平均MW10kDa)及び0.2%(w/v)PEG(平均MW 3450Da)を含有するアッセイ緩衝液中でプライミングした。各結合再生サイクルの後、ヒスチジンタグ及びNTAセンサーチップを利用することで新鮮なPCSK9又はPCSK9Δヘリックスを捕捉することにより、ペプチドをアッセイした。表面を(His)8タグ付きPCSK9で充填した(およそ800RUを捕捉)。化合物19及び化合物20を除いて、ペプチドの5つの連続3倍希釈物を、比較的低い効力のペプチドについては100μMから、強力なペプチドについては25μMからアッセイ緩衝液中で調製した。化合物19及び化合物20を100nMから3.1nMの6つの連続2倍希釈物でアッセイした。低濃度から高濃度までのペプチド希釈物の連続注入(1分間に50μL/分)によって、全てのペプチドを二連で分析した。その後、0.5MのEDTA(pH8.0)を注入することによって、表面から標的を取り除いた。この配列を各ペプチド結合サイクル及びブランクコントロールサイクルについて繰り返した。
SAセンサーチップ(製造者によりストレプトアビジンでプレコートされている)を用いた不可逆的捕捉は、化合物19及び化合物20を除く全てのペプチドについてインタクトなPCSK9(化学的ビオチン化形態)を試験するときに、より頑強であることが証明された。極めて低いフィッティングエラーを生じた2つの融合ペプチドを除いて、全てのSPRデータを5つ以上の連続希釈物について二重に記録した。多サイクルデータ(すなわち各濃度について別々の曲線)及び単一サイクルデータ(すなわち各濃度の連続注入を伴う単一曲線)を二重参照し、BIAevaluationソフトウェアを用いて相互作用モデルに当てはめた。PCSK9へのペプチド結合は、Kdの決定のために二状態モデルの適用を必要とする単純な1:1結合相互作用モデルからの逸脱を生じ、一方、PCSK9Δヘリックスとの相互作用は単純な1:1結合にうまく一致した。速度論的曲率(kinetic curvature)は、迅速に解離するペプチドについてはあまり定義されておらず、その場合、Kdは定常状態の用量反応プロットから推定された。Kd値は、関連する標準誤差、そのパラメーター値における信頼度の尺度と共に報告された。
[ペプチド合成]
ペプチドは、標準的なフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)/tert-ブチル(tBu)固相法を用いて合成された。ジスルフィド含有ペプチドについては、粗直鎖状ペプチドをヨウ素及び酢酸の存在下で環化した。この溶液を亜鉛粉末で処理して、過剰のヨウ素を除去した。溶液を水で希釈し、凍結乾燥させて粗環状ペプチドを得た。対イオンとしてトリフルオロ酢酸を使用するC18カラムでの分取HPLCにより、粗ペプチドを分析用LC-MSにより決定した>85%の純度まで精製した。
[NMR分光法]
核磁気共鳴実験は、三重共鳴凍結プローブを備えたBruker DRX-600で行われた。NMRの試料は、化合物192及び229をH2O/CD3CN(70:30)に最終濃度それぞれ0.52及び1.5mM,まで溶解することによって調製した。全てのNMRスペクトルは284Kで収集され、内部的にDS
S(4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸)を基準とした。プロトン共鳴の割り当ては、2D TOCSY、2D DQFCOSY及び2D NOESY実験の組み合わせを用いて達成された。TOCSY及びNOESYスペクトルの混合時間は、それぞれ60及び250msであった。NMRデータは、TOPSPIN及びNMRPipe/NMRDrawパッケージを用いて処理し(Delaglio et al., J Biomol NMR 6, 277-93 (1995))、NMRViewJ (Johnson et al., J Biomol NMR 4, 603-14 (1994))で分析した。
当業者であれば、本明細書に記載の例示的な実施例に対する様々な修正、追加、置換及び変形を本発明の主旨から逸脱することなく行うことができ、したがってそれらは本発明の範囲内と見なされることを認識するであろう。
Claims (105)
- 配列番号1のエピトープに結合するPCSK9阻害剤であって、
エピトープが配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも1つの残基を含み、
式I:
R1-X1-X2-X3-Trp-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2
の化合物
[式中、
R1はC1-C4アシルであるか、又はR1は存在せず;
X1は、TVFTSWEEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列であるか、又はX1は存在せず;
X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はX2は存在せず;
X3は、アラニン、2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、3-ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン及びトリプトファンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX3は、存在せず;
X4は、アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり;
X5は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり;
X6は、アラニン、アルギニン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される1から5個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX6は存在せず;かつ
R2はアミノであるか、又はR2は存在しない]
及び薬学的に許容されるその塩から選択される、PCSK9阻害剤。 - R1がC1-C4アシルである、請求項1に記載のPCSK9阻害剤。
- R1がアセチルである、請求項2に記載のPCSK9阻害剤。
- R1がバレリルである、請求項2に記載のPCSK9阻害剤。
- R1が存在しない、請求項1に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がTVFTSWEEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列である、請求項1から5のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がアミノ酸配列TVFTSWEEYLDWVである、請求項6に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がアミノ酸配列TAFTSWEEYLDWVである、請求項6に記載のPCSK9阻害剤。
- X1が存在しない、請求項1から5のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である、請求項1から9のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が、SG、GSG、GGSG、GSGG及びSGSGから選択されるアミノ酸配列である、請求項10に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である、請求項1から9のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X2がアミノ酸残基6-アミノヘキサン酸である、請求項12に記載のPCSK9阻害剤。
- X2がアミノ酸残基7-アミノヘプタン酸である、請求項12に記載のPCSK9阻害剤。
- X2がアミノ酸残基8-アミノオクタン酸である、請求項12に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が存在しない、請求項1から9のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X3が、P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP及びDLMPから選択されるアミノ酸配列である、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X3が存在しない、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基アラニンである、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基2,3-ジアミノプロピオン酸である、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基グルタミンである、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基グリシンである、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基リジンである、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基バリンである、請求項1から16のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X5がアミノ酸残基アルギニンである、請求項1から24のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X5がアミノ酸残基ホモアルギニンである、請求項1から24のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X6が、L、S、LL、LAR、LGC、LLA、LLC、LLR、LPC、LTR、SQGC、SQCWF及びSQGCWから選択されるアミノ酸配列である、請求項1から26のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X6が存在しない、請求項1から26のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- R2がアミノである、請求項1から28のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- R2が存在しない、請求項1から28のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- 以下の化合物:
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLGRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GGSG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Aoc)-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-SGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2;
SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
SG-DLMPWNLVRIGLLR;
Ac-SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2;
Ac-SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CFIPWNLQRIGLLC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-SG-CRL(Hyp)WNLQRIGLPC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CFLPWNLQRIGLLC-NH2;
Ac-CWNLKRIGSQGCW-NH2;
Ac-GSG-CWNLKRIGSQGCW-NH2;
Ac-DLMAWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLAPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DAMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-ALMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLL-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGL-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIG-NH2;
Ac-LMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-MPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-PWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-WNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLLA-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLAR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGALR-NH2;
Ac-DLMPWNLARIGLLR-NH2;
Ac-MCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
Ac-DCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
Ac-WCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
GCLWNLKRIGSQCWF;
Ac-CRLPWNLKRIGLPC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLAC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGAPC-NH2;
Ac-CRLPWNLARIGLPC-NH2;
Ac-CRLAWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CRAPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CALPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLGC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGGGC-NH2;
Ac-CRL(Ach)WNLQRIGLPC-NH2;
Ac-GCLWNLKRIGSQCWF-NH2;
Ac-GCLWNLARIGSQCWF-NH2;
Ac-FCLWNLARIGSQCWF-NH2;
GCLWNLKRIGSQCWF-NH2;
WCLWNLKRIGSQCWF-NH2;
Ac-GCLWNLKRIGSQCWF;
Ac-WCLWNLKRIGSQCWF;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIGS-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIG-NH2;
Ac-FCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
Ac-FCLWNLKRIGAQCWF-NH2;
Ac-GSG-CWNL(Dpr)RIGSQGC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLpC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGlPC-NH2;
Ac-CRLPWNLqRIGLPC-NH2;
Ac-CRLpWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CRlPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CrLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-cRLPWNLQRIGLPC-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLLR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGTTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGTLR-NH2;
Ac-CRLPWNLQ(ホモR)IGLPC-NH2;
n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLTR-NH2;及び
Ac-PWNLVRIGL-NH2
並びに薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項1から30のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。 - 配列番号1のエピトープに結合するPCSK9阻害剤であって、
エピトープが配列番号1のV241、T339、D343、P364、A442、A443及びL444からなる群より選択される少なくとも1つの残基を含み、
式II:
R1-X1-X2-X3-X7-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2
の化合物
[式中、
R1は、C1-C4アシル、アリールカルボニル、C3-C7シクロアルキルカルボニル、及びヘテロアリールカルボニルから選択され;各々は、それぞれ独立に以下から選択される1又は2の置換基:
C1-C4アルキル;
アミノ;
C1-C4アルコキシ、アミノ、ハロ、及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリール;
アリール-C1-C4アルキル;
C1-C4アルキル及びC1-C4アルキルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル;
C1-C4アシル、C1-C4アルコキシ、C1-C4アルキル、ハロ、及びヒドロキシ-C1-C4アルキルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ;
アリール-C1-C4アルキルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
C3-C7シクロアルキル;
C1-C4アルキル及びアミノから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
C1-C4アルキル、C1-C4アルキルスルホニル、カルボキサミド、ヘテロアリール-C1-C4アルキル及びオキソから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
ヘテロシクリルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよく;
又はR1は存在せず;
X1は、TVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列であるか、又はX1は存在せず;
X2は、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX2は、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基であるか、又はX2は存在せず;
X3は、アラニン、2-アミノシクロヘキサン-1-カルボン酸、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、3-ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン及びチロシンから選択される1から6個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、X3は、存在せず;
X4は、アラニン、2,3-ジアミノプロピオン酸、グルタミン、グリシン、リジン及びバリンから選択されるアミノ酸残基であり;
X5は、アルギニン及びホモアルギニンから選択されるアミノ酸残基であり;
X6は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン及びトリプトファンから選択される1から5個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であるか、又はX6は存在せず;
X7は、トリプトファン、6-フルオロトリプトファン、6-クロロトリプトファン、6-ブロモトリプトファン及び6-メチルトリプトファンから選択されるアミノ酸残基であり;かつ
R2はアミノであるか、又はR2は存在しない]
及び薬学的に許容されるその塩から選択される、
PCSK9阻害剤。 - R1がC1-C4アシルである、請求項32に記載のPCSK9阻害剤。
- R1がアセチルである、請求項33に記載のPCSK9阻害剤。
- R1がバレリルである、請求項33に記載のPCSK9阻害剤。
- R1が存在しない、請求項32に記載のPCSK9阻害剤。
- R1が、C1-C4アシル、アリールカルボニル、C3-C7シクロアルキルカルボニル、及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される1又は2の置換基:
C1-C4アルキル;
アミノ;
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリール;
アリール-C1-C4アルキル;
メチル及びメチルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいアリールカルボニル;
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいアリールオキシ;
フェニルメチルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
C3-C7シクロアルキル;
メチル及びアミノから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
メチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
ヘテロシクリルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよい、請求項32に記載のPCSK9阻害剤。 - R1が、C1-C4アシル、アリールカルボニル、C3-C7シクロアルキルカルボニル、及びヘテロアリールカルボニルから選択され、各々は、それぞれ独立に以下から選択される1又は2の置換基:
メチル及びt-ブチルから選択されるC1-C4アルキル;
アミノ;
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェニル;
フェニルメチル;
メチル及びメチルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいベンゾイル;
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェノキシ;
フェニルメチルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
シクロヘキシル;
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、それぞれ独立にメチル及びアミノから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
モルホリニルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよい、請求項32に記載のPCSK9阻害剤。 - R1が、アセチル、n-プロピオニル、n-ブタノイル、イソバレリル、バレリル、ベンゾイル、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニル、インドリルカルボニル、ピラゾリルカルボニル及びピリジニルカルボニルから選択され、各々が、それぞれ独立に以下から選択される1又は2の置換基:
メチル及びt-ブチルから選択されるC1-C4アルキル;
アミノ;
メトキシ、アミノ、フルオロ、クロロ及びヒドロキシから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェニル;
フェニルメチル;
メチル及びメチルスルホニルから選択される1の置換基で置換されていてもよいベンゾイル;
アセチル、メトキシ、メチル、エチル、ブロモ及びヒドロキシメチルから各々独立に選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいフェノキシ;
フェニルメチルから選択される1の置換基で置換されていてもよいカルボキシアミノ;
シクロヘキシル;
イミダゾリル、インドリル、ピラゾリル、ピリジニル及びトリアゾリルから選択されるヘテロアリールであって、各々が、それぞれ独立にメチル及びアミノから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピリミジニル、チオモルホリニルから選択されるヘテロシクリルであって、各々が、それぞれ独立にメチル、メチルスルホニル、カルボキサミド、ピリジニルメチル及びオキソから選択される1又は2の置換基で置換されていてもよいヘテロシクリル;
モルホリニルカルボニル;並びに
ウレイド
で置換されていてもよい、請求項32に記載のPCSK9阻害剤。 - R1が、アセチル、n-ブタノイル、3-(1,1-ジオキシドチオモルホリノ)プロパノイル、2-(1-メチル-1H-ピラゾール-4-イル)シクロプロパン-1-カルボニル、3-(2-オキソピロリジン-1-イル)プロパノイル、1-(1-メチルピロリジン-3-イル)-1H-ピラゾール-4-カルボニル、2-(1-(ピリジン-2-イルメチル)ピペリジン-4-イル)アセチル、3-(4-カルバモイルピペラジン-1-イル)プロパノイル、3-(1H-イミダゾール-4-イル)プロパノイル、2-(1-(メチルスルホニル)ピペリジン-4-イル)アセチル、6-モルホリノニコチノイル、3-(3,5-ジメチル-1H-ピラゾール-1-イル)プロパノイル、3-モルホリノプロパノイル、3-(ピリジン-3-イル)プロパノイル、2-(1,1-ジオキシドテトラヒドロチオフェン-3-イル)アセチル、3-(4-メチルピペラジン-1-イル)プロパノイル、3-ウレイドプロパノイル、3-(1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル)プロパノイル、2-(2,4-ジオキソ-3,4-ジヒドロピリミジン-1(2H)-イル)アセチル、3-ベンジルシクロブタン-1-カルボニル、[1,1’-ビフェニル]-4-カルボニル、5-フェニルペンタノイル、4-フェニルシクロヘキサン-1-カルボニル、5,5-ジメチルヘキサノイル、3,5,5-トリメチルヘキサノイル、5-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-3-カルボニル、3-シクロヘキシルプロパノイル、3-(4-アミノフェニル)プロパノイル、4-モルホリノブタノイル、4-(4-(メチルスルホニル)フェニル)-4-オキソブタノイル、3-(3-アミノフェニル)プロパノイル、4-オキソ-4-(p-トリル)ブタノイル、3-(4-メトキシフェニル)プロパノイル、4-モルホリノ-4-オキソブタノイル、3-(3-ヒドロキシフェニル)プロパノイル、4-(((ベンジルオキシ)カルボニル)アミノ)ブタノイル、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロパノイル、3-(6-アミノピリジン-3-イル)プロパノイル、4-(4-ブロモフェノキシ)ブタノイル、4-(4-アセチルフェノキシ)ブタノイル、3-(ピリジン-4-イル)-1H-ピラゾール-5-カルボニル、3-(1H-インドール-3-イル)プロパノイル、4-(1H-インドール-3-イル)ブタノイル、4-(4-フルオロフェニル)ブタノイル、3-(4-フルオロフェニル)プロパノイル、3-(4-クロロフェニル)プロパノイル、3-(3-メトキシフェニル)プロパノイル、3-(4-メトキシフェノキシ)プロパノイル、4-(4-(ヒドロキシメチル)-3-メトキシフェノキシ)ブタノイル、3-(4-アセチルフェノキシ)プロパノイル、4-(p-トリルオキシ)ブタノイル、4-フェノキシブタノイル、4-(4-エチルフェノキシ)ブタノイル、3-(p-トリルオキシ)プロパノイル、4-フェニルブタノイル、3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル)プロパノイル、4-(4-ヒドロキシフェニル)ブタノイル、2-(ピリジン-3-イル)シクロプロパン-1-カルボニル、1H-インドール-6-カルボニル、2-アミノ-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロパノイル、及び3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパノイルから選択される、請求項32に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がTVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及びTAFTSWEEYLDWVから選択されるアミノ酸配列である、請求項32から40のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がアミノ酸配列TVFTSWEEYLDWVである、請求項41に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がアミノ酸配列TVFTS(W6fl)EEYLDWVである、請求項41に記載のPCSK9阻害剤。
- X1がアミノ酸配列TAFTSWEEYLDWVである、請求項41に記載のPCSK9阻害剤。
- X1が存在しない、請求項32から40のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が、グリシン及びセリンから選択される1から4個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である、請求項32から45のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が、G、GG、SG、GSG、GGSG、GSGG及びSGSGから選択されるアミノ酸配列である、請求項46に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が、5-アミノペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、7-アミノヘプタン酸、8-アミノオクタン酸、9-アミノノナン酸、10-アミノデカン酸及び11-アミノウンデカン酸から選択されるアミノ酸残基である、請求項32から45のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X2がアミノ酸残基6-アミノヘキサン酸である、請求項48に記載のPCSK9阻害剤。
- X2がアミノ酸残基7-アミノヘプタン酸である、請求項48に記載のPCSK9阻害剤。
- X2がアミノ酸残基8-アミノオクタン酸である、請求項48に記載のPCSK9阻害剤。
- X2が存在しない、請求項32から45のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X3が、P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFI(Hyp)、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP、DLMP、DSYPG、ESFPG、ESYPG、MDSFPG、MESFPG及びSFAFPGから選択されるアミノ酸配列である、請求項32から52のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X3が存在しない、請求項32から52のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基アラニンである、請求項32から54のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基2,3-ジアミノプロピオン酸である、請求項32から54のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基グルタミンである、請求項32から54のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基グリシンである、請求項32から54のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基リジンである、請求項32から54のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X4がアミノ酸残基バリンである、請求項32から54のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X5がアミノ酸残基アルギニンである、請求項32から60のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X5がアミノ酸残基ホモアルギニンである、請求項32から60のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X6が、L、S、LL、LAR、LDR、LER、LGC、LGR、LLA、LLC、LLQ、LLR、LPC、LPR、LSR、LTR、SQGC、SQCWF及びSQGCWから選択されるアミノ酸配列である、請求項32から62のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X6が存在しない、請求項32から62のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X7がトリプトファンである、請求項32から64のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X7が6-フルオロトリプトファンである、請求項32から64のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X7が6-クロロトリプトファンである、請求項32から64のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X7が6-ブロモトリプトファンである、請求項32から64のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- X7が6-メチルトリプトファンである、請求項32から64のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- R2がアミノである、請求項32から69のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- R2が存在しない、請求項32から69のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。
- 以下の化合物:
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLGRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GGSG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Aoc)-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-CWNLKRIGSQGC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-SGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2;
SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
SG-DLMPWNLVRIGLLR;
Ac-SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2;
Ac-SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CFIPWNLQRIGLLC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-SG-CRL(Hyp)WNLQRIGLPC-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CFLPWNLQRIGLLC-NH2;
Ac-CWNLKRIGSQGCW-NH2;
Ac-GSG-CWNLKRIGSQGCW-NH2;
Ac-DLMAWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLAPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DAMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-ALMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLL-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGL-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIG-NH2;
Ac-LMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-MPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-PWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-WNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLLA-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLAR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGALR-NH2;
Ac-DLMPWNLARIGLLR-NH2;
Ac-MCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
Ac-DCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
Ac-WCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
GCLWNLKRIGSQCWF;
Ac-CRLPWNLKRIGLPC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLAC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGAPC-NH2;
Ac-CRLPWNLARIGLPC-NH2;
Ac-CRLAWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CRAPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CALPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLGC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGGGC-NH2;
Ac-CRL(Ach)WNLQRIGLPC-NH2;
Ac-GCLWNLKRIGSQCWF-NH2;
Ac-GCLWNLARIGSQCWF-NH2;
Ac-FCLWNLARIGSQCWF-NH2;
GCLWNLKRIGSQCWF-NH2;
WCLWNLKRIGSQCWF-NH2;
Ac-GCLWNLKRIGSQCWF;
Ac-WCLWNLKRIGSQCWF;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIGS-NH2;
Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIG-NH2;
Ac-FCLWNLKRIGSQCEY-NH2;
Ac-FCLWNLKRIGAQCWF-NH2;
Ac-GSG-CWNL(Dpr)RIGSQGC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGLpC-NH2;
Ac-CRLPWNLQRIGlPC-NH2;
Ac-CRLPWNLqRIGLPC-NH2;
Ac-CRLpWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CRlPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-CrLPWNLQRIGLPC-NH2;
Ac-cRLPWNLQRIGLPC-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLLR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGTTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGTLR-NH2;
Ac-CRLPWNLQ(ホモR)IGLPC-NH2;
n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLTR-NH2;
Ac-PWNLVRIGL-NH2;
Ac-SG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2;
n-PrC(O)-WNLVRIGLLR-NH2;
Ac-G-LMPWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-GG-MPWNLVRIGLLR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLLR;
Ac-MDSFPGWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-SFAFPGWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DSYPGWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-ESYPGWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-ESFPGWNLVRIGLLR-NH2;
Ac-DLMPWNLKRIGLLR-NH2;
n-BuC(O)-WNLKRIGLLR-NH2;
Ac-DLMPWNLVRIGLPR-NH2;
n-BuC(O)-(W6fl)NLVRIGLTR-NH2;
n-BuC(O)-(W6me)NLVRIGLTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLTR;
n-BuC(O)-WNLVRIGLER-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLDR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLGR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLAR-NH2;
n-BuC(O)-WNLVRIGLSR-NH2;
n-BuC(O)-(W6cl)NLVRIGLTR-NH2;
n-BuC(O)-(W6br)NLVRIGLTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-WNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLLR;
Ac-ESFPGWNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-SFAFPGWNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-MESFPGWNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-DSYPGWNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-ESYPGWNLV(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-SFAFPGWNLK(ホモR)IGLLR-NH2;
Ac-MESFPGWNLK(ホモR)IGLLR-NH2;
n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLTR-NH2;
n-BuC(O)-WNLV(ホモR)IGLTR;
WNLV(ホモR)IG-NH2;
WNLV(ホモR)IGLLQ-NH2;
Ac-TVFTS(W6fl)EEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2;及び
Ac-SG-CFI(Hyp)WNLQRIGLLC-NH2
並びに薬学的に許容されるその塩から選択される、請求項32から71のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤。 - PCSK9に結合する請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤を含む、阻害されたPCSK9。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の有効量とPCSK9を接触させることを含む、PCSK9の活性を調節するための方法。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体におけるPCSK9のLDLRへの結合を阻害するための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体におけるLDLRの利用能を増大させるための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体におけるLDL-Cレベルを低下させるための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体における血清LDL-Cレベルを低下させるための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体におけるコレステロール関連障害の治療のための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体におけるLDL-Cの異常なレベルに関連する障害の治療のための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体におけるLDL-Cのレベルの上昇に関連する状態の治療のための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体における脂質異常症の治療のための医薬。
- 請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物を含む、必要とする個体における高コレステロール血症の治療ための医薬。
- 療法によるヒト又は動物の体の治療の方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- PCSK9の活性を調節する方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- PCSK9のLDLRへの結合を阻害する方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- LDLRの利用能を増大させる方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- LDL-Cレベルを低下させる方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- 血清LDL-Cレベルを低下させる方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- コレステロール関連の障害の治療方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- LDL-Cの異常なレベルに関連する障害の治療方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- LDL-Cレベルの上昇に関連する状態の治療方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- 脂質異常症の治療方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- 高コレステロール血症の治療方法における使用のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤又はその薬学的組成物。
- PCSK9の活性の調節のための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- PCSK9のLDLRへの結合を阻害するための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- LDLRの利用能を増大させるための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- LDL-Cレベルを低下させるための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- 血清LDL-Cレベルを低下させるための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- コレステロール関連障害の治療のための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- LDL-Cの異常なレベルに関連する障害の治療のための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- LDL-Cレベルの上昇に関連する状態の治療のための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
- 脂質異常症の治療のための医薬の製造のための、請求項1から72のいずれか一項に記載のPCSK9阻害剤の使用。
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