TWI769165B - 治療心血管疾病之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供PCSK9抑制劑、包括該等PCSK9抑制劑之組合物，及鑑別及使用該等PCSK9抑制劑之方法。

Description

治療心血管疾病之組合物及方法
本發明係關於可用於治療及/或預防哺乳動物之有機化合物及尤其抑制9型前蛋白轉化酶枯草菌蛋白酶/可欣蛋白酶(PCSK9)之化合物及用於鑑別其之分析、包括PCSK9及PCSK9抑制劑之複合物及抑制PCSK9之方法，其可用於 治療心血管疾病。
動脈粥樣硬化心血管疾病(CVD)係全世界之主要死亡病因(Mendis等人(2011) World Health Organization, Geneva)。動脈粥樣硬化係因動脈壁之代謝及發炎變化而發生，該等變化促進了促動脈粥樣硬化性低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)之巨噬球調介之內膜沈積，從而有助於斑塊形成，限制血液至重要器官之流動且增加動脈血栓形成性及動脈栓塞性後遺症之風險。血脂異常已成為在一級及二級預防CVD中所靶向之重要風險因子。隨著抑制3-羥基-3-甲基戊二醯基-輔酶A (HMG-CoA)還原酶之他汀(statin)之出現，已可達成持續減少LDL-C。大規模臨床試驗證實，降低40 mg/dL (1 mmol/L) LDL-C使得不良心血管事件減少22% (Baigent等人，Lancet, 2010, 376(9753):1670-1681；Mihaylova等人，Lancet, 2012 380(9841):581-590)。他汀之臨床效能及成本有效性之大量證據已將其確立為血脂異常之一線治療劑(Koo, Diabetes Metab J, 2014, 38(1):32-34)。然而，即使使用最佳他汀療法，可預防小於一半之復發性心血管事件。實際上，在某些患者中不能達成血脂異常之滿意控制，即使使用組合降脂療法。 受對其他脂質管控策略之需要之驅使，最新注意力集中於新種類藥劑，即9型前蛋白轉化酶枯草菌蛋白酶/可欣蛋白酶(PCSK9)抑制劑。該等藥劑顯示較大前景，尤其用於(例如)因不良效應或藥物-藥物相互作用而不能服用他汀者(Corrao等人，Clin Ther, 2010 32(2):300-310)。基於PCSK9之療法之發現始於2003年對一個法國家庭之敏銳的臨床觀察，該家庭顯示家族性高膽固醇血症(FH)之特徵，且以下基因中無同時識別為引起FH之突變：LDL受體基因(LDLR，佔FH缺陷之95%)；或編碼結合至LDLR之蛋白質之載脂蛋白B基因(ApoB，佔FH缺陷之4%) (Abifadel等人，Nat Genet, 2003, 34(2):154-156；Graham等人，Atherosclerosis, 2005, 182(2):331-340)。該等發現使得可鑑別兩種增加絲胺酸蛋白酶(最初稱為神經細胞凋亡調控之轉化酶1 (NARC-1)且隨後重命名為9型前蛋白轉化酶枯草菌蛋白酶/可欣蛋白酶)之活性之新穎錯義突變(Seidah等人，Proc Natl Acad Sci, 2003, 100(3):928-933)。此發現產生脂質管控中之新穎治療選擇(Lambert等人，J Lipid Res, 2010, 53(12):2515-2524；Vogel, J Am Coll Cardiol, 2012, 59(25):2354-2355)。 最近，批准結合循環PCSK9之單株抗體用於治療應用以降低LDL-C濃度，從而控制高膽固醇血症。阿裡羅單抗(alirocumab) (Praluent®, Sanofi/Regeneron)在美國由FDA於2015年7月批准，且歐洲由EMA於2015年9月批准(Robinson等人，N. Engl. J. Med., 372 (16) (2015年4月16日)，第1489-1499頁)，而依伏庫單抗(evolocumab) (Repatha®, Amgen)在歐洲於2015年7月批准，且在美國於2015年8月批准(M.S. Sabatine等人，N. Engl. J. Med., 372 (16) (2015年4月16日)，第1500-1509頁)。另一抗PCSK9抗體-YW508.20.33b (Ab33)揭示於美國專利第9,266,961號中。其他研發中單株抗體包含波西株抵抗(bococizumab) (RN316, Pfizer/Rinat)、LGT-209 (Novartis)及1D05-IgG2 (Merck)。經受臨床及臨床前評估之其他種類之PCSK9抑制劑包含siRNA寡核苷酸，例如ALN-PCS02 (Alnylam Pharmaceuticals/The Medicines Group)；單抗體，例如BMS-962476 (Bristol-Myers Squibb/Adnexus)；反義寡核苷酸(Idera Pharmaceuticals)；模擬肽，例如LDL-EGF-AB肽片段(Schering-Plough)；及疫苗，例如ATH-04及ATH-06 (Affiris)。亦已知PCSK9之小分子抑制劑，例如揭示於PCT專利公開案第WO2016040305號、第WO2016029037號、第WO2014170786號、第WO2014150395號、第WO 2014150326號、第WO2014139008號、第WO2014127316號、第WO2013177536號及第WO2011051961號中者。選擇性抑制PCSK9 mRNA至PCSK9蛋白之轉譯之化合物揭示於WO2014170786中。 需要調節PCSK9活性及PCSK9在各種疾病及病症中所發揮之相應作用之替代治療劑。本文所闡述之化合物、組合物及方法幫助滿足該等需要及其他需要。
本發明係關於結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑，其中該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一態樣中，本發明係關於選自式I化合物之PCSK9抑制劑： R1 -X1 -X2 -X3 -Trp-Asn-Leu-X4 -X5 -Ile-Gly-X6 -R2 ， 式I 及其醫藥上可接受之鹽； 其中， R1 係C1 -C4 醯基；或R1 不存在； X1 係選自TVFTSWEEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列；或X1 不存在； X2 係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列；或X2 係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸；或X2 不存在； X3 係包括1至4個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、2-胺基環己烷-1-甲酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、3-羥基脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸及色胺酸； X4 係選自以下之胺基酸殘基：丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸及纈胺酸； X5 係選自以下之胺基酸殘基：精胺酸及高精胺酸； X6 係包括1至5個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、精胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及色胺酸；或X6 不存在；且 R2 係胺基；或R2 不存在。 在一態樣中，本發明係關於包括本文所闡述結合至PCSK9之PCSK9抑制劑之經抑制PCSK9。 在一態樣中，本發明係關於包括本文所闡述之PCSK9抑制劑及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。 在一態樣中，本發明係關於調節PCSK9活性之方法，其包括使PCSK9與有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑接觸。 在一態樣中，本發明係關於抑制有需要之個體中PCSK9結合至LDLR之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。 在一態樣中，本發明係關於本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物，其用於藉由療法治療人類或動物身體之方法。 在一態樣中，本發明係關於本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物，其用於調節PCSK9活性之方法中。 在一態樣中，本發明係關於本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物，其用於抑制PCSK9與LDLR結合之方法中。 在一態樣中，本發明係關於本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於調節PCSK9活性之藥劑。 在一態樣中，本發明係關於本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於抑制PCSK9結合至LDLR之藥劑。 在一態樣中，本發明係關於鑑別候選化合物為結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑之方法，其中該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基；該方法包括以下步驟：a)使PCSK9與候選化合物接觸；b)使PCSK9Δ螺旋與候選化合物接觸；c)量測候選化合物對PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合親和力；及d)測得候選化合物對PCSK9Δ螺旋之結合親和力強於候選化合物對PCSK9之結合親和力；其中該測定指示候選化合物係結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑。
應瞭解，本發明為清楚起見而在單獨實施例上下文中闡述之某些特徵亦可在單一實施例中提供。與之相反，為簡便起見在單個實施例上下文中闡述之本發明之各種特徵亦可單獨或以任何適宜子組合提供。定義 除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解相同之含義。出於闡釋本說明書之目的，將應用下列定義，且若適宜，以單數使用之術語亦將包含複數，且反之亦然。應理解，本文所用之術語僅係出於闡述特定實施例之目的，且並不意欲具有限制性。 本文所用之術語「C1 -C4 醯基」係指基團C1 -C4 烷基-C(O)-。 本文所用之術語「親和力」係指分子之單一結合位點與其結合配偶體間之非共價相互作用總和的強度。除非另外指示，否則本文所用之「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員之間之1:1相互作用。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd )表示。親和力可藉由業內已知之常用方法(包含本文所闡述者)來量測。 本文所用之術語「C1 -C4 烷氧基」係指基團C1 -C4 烷基-O-，其中C1 -C4 烷基係如本文所定義。 本文所用之術語「C1 -C4 烷基」係指含有1至4個碳原子之直鏈或具支鏈烴基團。 本文所用之術語「C1 -C4 烷基磺醯基」係指C1 -C4 烷基-S(O)2 -。 本文所用之術語「胺基」係指基團-NH2 。 本文所用之術語「錨定肽」係指結合至PCSK9且肽延伸集合庫或「延伸肽」可C-末端附接之肽。在一些實施例中，延伸肽可經由連接體附接至錨定肽。在一些實施例中，連接體係GSG連接體。在一些實施例中，錨定肽係Pep2-8。在一些實施例中，錨定肽係Pep2-8V2A。 本文所用之術語「芳基」係指單環、雙環或三環碳環系統(包含含有融合之環系統)，其中系統中之至少一個環係芳香族。術語「芳基」可與術語「芳基環」互換使用。在一實施例中，芳基包含具有6-20個碳原子之基團(C6 -C20 芳基)。在另一實施例中，芳基包含具有 6-10個碳原子之基團(C6 -C10 芳基)。芳基之實例包含苯基、萘基、蒽基、聯苯基、菲基、1,2,3,4-四氫萘基、1H -茚基、2,3-二氫-1H -茚基(二氫茚基)及諸如此類。在一些實施例中，芳基係苯基。在一些實施例中，芳基係二氫茚基。 本文所用之術語「芳基羰基」係指芳基-C(O)-。 本文所用之術語「芳基-C1 -C4 烷基」係指「芳基-C1 -C4 烷基-」。 本文所用之術語「芳基氧基」係指芳基-O-。 本文所用之術語個體之「基線」值(例如LDL-C濃度之基線值)係指在向個體投與本文所闡述之PCSK9抑制劑之前的值。在某些實施例中，基線可為在投與PCSK9抑制劑之前所獲得之兩個或更多個量測之平均值(mean或average)。 本文所用之術語「接觸」係指PCSK9抑制劑與PCSK9之間之相互作用。在一些實施例中，相互作用包括一或多個氫鍵、共價鍵、離子鍵、疏水性接觸及/或凡得瓦(van der Waals)接觸。在一些實施例中，一或多個氫鍵、共價鍵、離子鍵、疏水性接觸及/或凡得瓦接觸出現於PCSK9抑制劑與PCSK9之間10 Å或更小、9 Å或更小、8 Å或更小、7 Å或更小、6 Å或更小、5 Å或更小、4 Å或更小、3 Å或更小或2 Å或更小之距離。 本文所用之術語「羧醯胺」係指-C(O)NH2 。 本文所用之術語「羧基胺基」係指-NHCO2 H。 本文所用之術語「C3 -C7 環烷基」係指含有3至7個碳之飽和環基團。一些實施例含有3至6個碳。一些實施例含有3至5個碳，一些實施例含有5至7個碳。一些實施例含有3至4個碳。實例包含環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及諸如此類。 本文所用之術語「C3 -C7 環烷基羰基」係指C3 -C7 環烷基-C(O)-。 本文所用之術語「富Cys結構域」 (CRD)係指PCSK9中由SEQ ID NO: 1之殘基455-692組成之富半胱胺酸C-末端結構域(Holla等人，J Lipid Res. 2011 Oct; 52(10): 1787-1794)。 本文所用之術語「血脂異常」係指患者在血液中具有異常量之脂質之病狀(或病狀群)。大部分血脂異常係高脂血症，包含高膽固醇血症、高甘油酯血症、高脂蛋白血症及組合高脂血症。血脂異常可表現為血液中總膽固醇、LDL-C及三甘油酯之增加及高密度脂蛋白(HDL)膽固醇之降低。 本文所用之術語藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。 本文所用之術語「延伸肽」係指C-末端附接至錨定肽且結合至PCSK9之N-末端溝(其通常含有N-末端P’螺旋)之肽。 本文所用之術語「Fab33」係指美國專利第9,266,961號中所揭示抗PCSK9抗體YW508.20.33b之抗原結合片段。 本文所用之術語「FAM」係指5-羧基螢光黃。 本文所用之術語「Fmoc」係指茀基甲基氧基羰基。 本文所用之術語「融合肽」係指結合至PCSK9且包括C-末端附接至「錨定肽」之「延伸肽」之肽。在一些實施例中，延伸肽可經由連接體附接至錨定肽。在一些實施例中，連接體係GSG連接體。在一些實施例中，錨定肽係Pep2-8。在一些實施例中，錨定肽係Pep2-8V2A。 本文所用之術語「鹵基」及「鹵素」係指選自氟(fluorine、fluoro、-F)、氯(chlorine、chloro、-Cl)、溴(bromine、bromo、-Br)及碘(iodine、iodo、-I)之原子。 本文所用之術語「雜芳基」係指具有5至14個環原子之單環、雙環或三環環系統(包含含有稠合環之系統)，其中至少一個環係芳香族且其中至少一個環原子係雜原子。雜原子之實例包含氮、氧及硫。在一些實施例中，雜芳基包含5-6員單環芳香族基團，其中一或多個環原子係氮、氧或硫。在一些實施例中，雜芳基係C1 -C20 雜芳基，其中雜芳基環含有1-20個碳原子且剩餘環原子包含一或多個氮、硫或氧原子。任一氮原子可視情況經氧化(例如NO)。實例性雜芳基包含噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、異噻唑基、噁唑基、異噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、吡啶基N -氧化物、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、三嗪基、四嗪基、四唑并[1,5-b ]噠嗪基、咪唑[1,2-a]嘧啶基、嘌呤基、苯并噁唑基、2-側氧基-2,3-二氫苯并[d]噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基、吲哚基、二氫吲哚基、1,3-噻唑基、1,2,3-三唑基、1,3,4-三唑基、1,3-噁唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,3,4-噻二唑基、1H -四唑基、吡唑并[4,3-c]吡啶基、異吲哚基、異二氫吲哚基、1-側氧基-異二氫吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、1-側氧基-異喹啉基、1-側氧基-3,4-二氫-異喹啉基、㖕啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H -喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氫喹啉基及四氫異喹啉基。 本文所用之術語「雜芳基-C1 -C4 烷基」係指雜芳基-C1 -C4 烷基-。 本文所用之術語「雜芳基羰基」係指雜芳基-C(O)-。 本文所用之術語「雜環基」係指具有3至20個環原子之單環、雙環或三環、飽和或部分地不飽和、非芳香族環系統(包含含有稠合環之系統)，其中至少一個環原子係雜原子。雜原子之實例包含氮、氧及硫。在一些實施例中，雜環基係指飽和環系統，例如3至12員飽和雜環基環系統或3至8員飽和雜環基環系統。在一些實施例中，雜環基係指5至8員飽和雜環基環系統。在一些實施例中，雜環基係指5至6員飽和雜環基環系統。在一些實施例中，雜環基包含1至4個雜原子。在一些實施例中，雜環基包含具有一或多個選自氮、氧及硫之雜原子3員至7員單環。在一些實施例中，雜環基包含具有一或多個選自氮、氧及硫之雜原子之4員至6員單環。在另一實例中，雜環基包含3員單環。在另一實例中，雜環基包含4員單環。在另一實例中，雜環基包含5-6員單環。在一實例中，雜環基包含0至3個雙鍵。實例性雜環基包含環氧乙烷基、氮丙啶基、硫雜環丙基、氮雜環丁基、氧雜環丁基、硫雜環丁基、1,2-二硫雜環丁基、1,3-二硫雜環丁基、吡咯啶基、二氫-1H -吡咯基、二氫呋喃基、四氫呋喃基、二氫苯硫基、四氫苯硫基、咪唑啶基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、二氫吡喃基、四氫吡喃基、六氫噻喃基、六氫嘧啶基、噁嗪烷基、噻嗪烷基、噻噁烷基、高六氫吡嗪基、高六氫吡啶基、氮雜環庚烷基、氧雜環庚烷基、硫雜環庚烷基、氧氮呯基、氧氮雜環庚烷基、二氮雜環庚烷基、1,4-二氮雜環庚烷基、二氮呯基、硫氮呯基、硫氮雜環庚烷基、四氫噻喃基、噁唑啶基、噻唑啶基、異噻唑啶基、噁唑啶酮基、四氫苯并咪唑基、噻嗪基、噁嗪基、噻二嗪基、噁二嗪基、二噻嗪基、二噁嗪基、噁噻嗪基、噻三嗪基、噁三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氫嘧啶基、四氫嘧啶基、吡咯啉基、吡咯啉基、噻吡喃基、吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊環基、吡唑啉基、吡唑啶基、二噻烷基、1,3-二硫戊環基、3-氮雜二環[3.1.0]己烷基、3,6-二氮雜二環[3.1.1]庚烷基、6-氮雜二環[3.1.1]庚烷基、3-氮雜二環[3.1.1]庚烷基、3-氮雜二環[4.1.0]庚烷基、氮雜二環[2.2.2]己烷基、2-氮雜二環[3.2.1]辛烷基、8-氮雜二環[3.2.1]辛烷基、2-氮雜二環[2.2.2]辛烷基、8-氮雜二環[2.2.2]辛烷基、7-氧雜二環[2.2.1]庚烷、氮雜螺[3.5]壬烷基、氮雜螺[2.5]辛烷基、氮雜螺[4.5]癸烷基、氮雜螺[5.5]十一烷基、四氫吲哚基、八氫吲哚基、四氫異吲哚基、四氫吲唑基及諸如此類。 本文所用之術語「雜環基羰基」係指雜環基-C(O)-。 本文所用之術語「羥基」係指-OH。 本文所用之術語「羥基-C1 -C4 烷基」係指-C1 -C4 烷基-OH。 本文所用之術語「高膽固醇血症」係指膽固醇濃度升高至高於期望濃度之病狀。在某些實施例中，LDL膽固醇濃度升高至高於期望濃度。在某些實施例中，血清LDL膽固醇濃度升高至高於期望濃度。 本文所用之術語「個體(individual或subject)」係指哺乳動物。哺乳動物包含(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual或subject)係人類。 本文所用之術語「N-末端溝」係指PCSK9催化結構域中通常含有N-末端P’螺旋之N-末端溝。 本文所用之術語「側氧基」係指=O。 本文所用之術語「P’螺旋」或「N-末端P’螺旋」係指PCSK9催化結構域之N-末端α螺旋，如Bottomley等人，J Biol Chem. 2009 Jan 9;284(2):1313-23中所定義。在一些實施例中，P’螺旋係由PCSK9之殘基S153-T162組成。 本文所用之術語「包裝插頁」係指通常包含於治療性產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該等治療性產品之使用之警告之資訊。 本文所用之術語「PCSK9抑制劑」係指能夠以足夠親和力結合PCSK9之有機化合物，從而該化合物可用作靶向PCSK9之診斷劑及/或治療劑。在一實施例中，PCSK9抑制劑至不相關、非PCSK9蛋白之結合程度小於PCSK9抑制劑至PCSK9之結合的約10%，如藉由業內已知之常用方法(包含本文所闡述者)所量測。在某些實施例中，結合至PCSK9之PCSK9抑制劑具有≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更小，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)之解離常數(Kd )。 本文所用之術語「PCSK9Δ螺旋」係指缺乏P’螺旋(該術語定義於本文中)之PCSK9。 本文所用之術語「PCSK9ΔCRDΔ螺旋」係指缺乏富Cys結構域及P’螺旋(彼等術語定義於本文中)之PCSK9。 本文所用之術語「Pep2-8」係指下列序列Ac-TVFTSWEEYLDWV-NH2 之肽。 本文所用之術語「Pep2-8-ctrl」係指具有下列序列Ac-TVATSAEEYLLWV-NH2 之肽。 本文所用之術語「Pep2-8V2A」係指具有下列序列Ac-TAFTSWEEYLDWV-NH2 之肽。 本文所用之術語「醫藥調配物」或「醫藥組合物」係指呈容許其中所含活性成分之生物活性有效之形式且不含其他對投與調配物之受試者具有不可接受毒性之組分的製劑。 本文所用之術語「醫藥上可接受之載劑」係指除活性成分外醫藥調配物中對受試者無毒之成分。醫藥上可接受之載劑包含(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。 除非另外指示，否則本文所用之術語「9型前蛋白轉化酶枯草菌蛋白酶/可欣蛋白酶」、「PCSK9」或「NARC-1」係指來自任一脊椎動物來源之任一自然PCSK9，該脊椎動物來源包含哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋「全長」未處理PCSK9以及自細胞之處理產生之任一形式之PCSK9或其任一片段。該術語亦涵蓋PCSK9之天然變體，例如剪接變體或對偶基因變體。在一些實施例中，PCSK9係具有SEQ ID NO: 1中所展示序列之人類PCSK9。 本文所用之術語「PCSK9活性」或PCSK9之「生物活性」係指PCSK9之任一生物效應。在某些實施例中，PCSK9活性包含PCSK9與受質或受體相互作用或結合之能力。在某些實施例中，PCSK9之生物活性係PCSK9結合至LDL-受體(LDLR)之能力。在某些實施例中，PCSK9結合至LDLR且催化涉及LDLR之反應。在某些實施例中，PCSK9活性包含PCSK9降低或減小LDLR之可用率之能力。在某些實施例中，PCSK9之生物活性包含PCSK9增加個體中之LDL量之能力。在某些實施例中，PCSK9之生物活性包含PCSK9降低可用於結合至個體中之LDL之LDLR之量的能力。在某些實施例中，PCSK9之生物活性包含PCSK9降低可用於結合至LDL之LDLR之量的能力。在某些實施例中，PCSK9之生物活性包含源自PCSK9信號傳導之任一生物活性。 本文所用之術語「脲基」係指-NHC(O)NH2 。 本文所用之術語「治療(treatment)」 (及其語法變化形式，例如「治療(treat或treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然過程之臨床幹預，且可出於預防目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包含(但不限於)預防疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態以及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之PCSK9抑制劑係用於延緩疾病發生或減緩疾病進展。 除非另外指示，否則本文所用之單數形式「一(a、an)」及「該」包含複數個提及物。本文所用之術語「約」係指此技術領域中之熟習此項技術者易於已知之各別值之常規誤差範圍。本文中在提及「關於」某值或參數時包含(且闡述)與該值或參數本身有關之實施例。應理解，本文所闡述本發明之態樣及實施例包含「包括」態樣及實施例、「由其組成」及「基本上由其組成」。胺基酸縮寫 除非另外指示，否則胺基酸序列係自左至右以胺基至羧基定向來書寫。
Figure 106121106-A0304-0001
 *大寫= L-胺基酸；小寫= D-胺基酸PCSK9 之結構及功能 PCSK9 (發現於染色體1p32處)長22 kb，且具有12個編碼692-胺基酸蛋白質之外顯子(Artenstein及Opal, N Engl J Med, 2011, 365(26):2507-2518)。其係蛋白質酶K樣酶，屬分泌性枯草桿菌酶家族且主要由肝細胞合成及分泌(Maxwell及Breslow, Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(18):7100-7105；Seidah及Prat, Nat Rev Drug Discovery, 2012, 11(5): 367-383)。PCSK9之合成由固醇調控元件結合蛋白-2 (SREBP-2)上調，後者係藉由結合至基因之啟動子區中之固醇調控元件來調控PCSK9表現之轉錄因子(Jeong等人，J Lipid Res 49(2):399-409)。SREBP-2亦經由活化編碼涉及膽固醇穩態之關鍵酶(包含HMG-CoA還原酶)之基因來增加LDLR及膽固醇合成(Goldstein及Brown (2009) Arterioscler Thromb Vasc Biol 29(4):431-438)。其係在低細胞內膽固醇濃度下活化。SREBP-2及PCSK9表現在餵養富膽固醇飲食之禁食小鼠中被阻抑(Kosenko等人(2013) J Biol Chem 288(12):8279-8288)。然而，動物及人類中之延長禁食亦導致PCSK9及SREBP-2活性有所降低(Browning及Horton (2010) J Lipid Res 51(11):3359-3363)。另外，活體內證據表明，胰島素可用於增加PCSK9之表現(Costet等人(2006) J Biol Chem 281(10):6211-6218)。 PCSK9蛋白產物包括N-末端信號肽、前結構域、催化結構域、鉸鏈區及富半胱胺酸C-末端結構域(Seidah及Prat (2012) Nat Rev Drug Discovery 11(5): 367-383；Benjannet等人(2004) J Biol Chem 279(47):48865-48875)。在去除信號肽結構域後，將PCSK9合成為約74 kDa酶原，該酶原在內質網中發生自催化裂解以生成保持彼此強烈締合之前結構域片段及約62 kDa成熟蛋白質(Park等人(2004) J Biol Chem 279(48):50630-50638；Nassoury等人(2007) Traffic 8(6):718-732；Lambert (2007) Current opinion in lipidology 18(3):304-309)。 PCSK家族之前8個成員PCSK 1-8係涉及處理惰性前體蛋白以生成功能及生物活性肽、多肽及激素(其在調控生長及代謝中發揮重要作用)之絲胺酸蛋白酶(Turpeinen等人(2013) Current genomics 14(7):453；Desai等人(2013) Circulation 128(9):962-969；Couture等人(2011) Biomol Concepts 2(5):421-438)。與之相比，PCSK9在LDLR再循環之調控中發揮關鍵作用(Cariou等人(2011) Atherosclerosis 216(2):258-265)。PCSK9結合至LDLR之表皮生長因子A (EGF-A)結構域。在胞吞作用下，將PCSK9:LDLR複合物引導至溶酶體中用於降解，從而減小LDLR濃度且減小循環LDL-C之清除。PCSK9之肝外作用包含增強乳糜微粒分泌及調控腸細胞膽固醇平衡(Seidah及Prat, Nat Rev Drug Discovery, 2012, 11(5): 367-383)。此外，來自實驗模型之數據表明， PCSK9之作用擴展至超過脂質穩態；其涉及作為葡萄糖代謝、肝再生及C型肝炎病毒感染易感性之調控劑(Levy等人(2013) Atherosclerosis 227(2):297-306 28；Farnier (2014) Archives of cardiovascular diseases 107(1):58-66 29；Farnier (2013) Curr Opin Lipidol 24(3): 251-258 30；及Bridge等人(2015) J Hepatol 62(4):763-770)。 在小鼠模型中，膽固醇基酯在主動脈動脈粥樣硬化病灶中之累積由PCSK9不活化顯著減小(Denis等人(2012) Circulation 125(7):894-901)。與之相反，PCSK9之過度表現誘導過量負荷之動脈粥樣硬化。在LDLR缺陷型小鼠中，PCSK9之敲低或過度表現對膽固醇基酯累積或粥樣斑塊大小並無顯著效應。此研究強烈表明，PCSK9增強動脈粥樣硬化之過程主要係由其對LDLR之作用來調介(Denis等人(2012) Circulation 125(7):894-901)。 在人類研究中，PCSK9功能損失突變與LDL-C及心血管事件之減少有關(Cohen等人(2006) N Engl J Med 354(12):1264-1272)。與之相反，PCSK9上之功能獲得突變與嚴重形式之常染色體顯性高膽固醇血症(其在表型上與由LDLR突變所致之FH不可區分)有關(Cohen等人(2006) N Engl J Med 354(12):1264-1272)。 PCSK9濃度顯示與膽固醇合成同步之每日節律，其自平均值改變±15% (Persson等人(2010) Arterioscler Thromb Vasc Biol 30(12):2666-2672)。PCSK9合成亦由胰島素誘導且由齧齒類動物中之升糖素抑制(Costet等人(2006) J Biol Chem 281(10):6211-6218)。在健康人類中，PCSK9濃度隨禁食可論證地減小(在36 h內降低60%)，且在膳食後時段中有所增加，從而表明類似效應(Persson等人(2010) Arterioscler Thromb Vasc Biol 30(12):2666-2672；Browning and Horton (2010) J Lipid Res 51(11):3359-3363)。另外，PCSK9由氧化固醇活化之肝X受體(LXR)正性控制(Costet等人(2006) J Biol Chem 281(10):6211-6218；Maxwell等人(2003) J Lipid Res 44(11):2109-2119)。 PCSK9以三種主要形式循環於血漿中(Tavori等人(2013) Circ Res 113(12):1290-1295)。在分泌時，PCSK9以單體形式存在，但可在催化結構域之促進下自我締合成二聚體及三聚體複合物。其以游離形式及結合蛋白質之形式存在於人類血漿中，其中40%之循環PCSK9排他性地與LDL締合(Kosenko等人(2013) J Biol Chem 288(12):8279-8288)。結合LDL之PCSK9具有減弱之LDLR結合活性。已提出，此係調控機制，較高血漿濃度之LDL藉此產生較大比例之結合LDL之PCSK9，由此抑制PCSK9調介之LDLR降解(Kosenko等人(2013) J Biol Chem 288(12):8279-8288)。活體外證據表明，與單體形式相比，自我締合之二聚體/三聚體具有增強之LDLR結合及降解活性(Fan等人(2008) Biochemistry 47(6):1631-1639)。PCSK9亦以55 kDa弗林蛋白酶(furin)裂解之惰性片段(源自62 kDa蛋白質之裂解)形式循環：成熟PCSK9蛋白中之突變與增加或降低之弗林蛋白酶裂解有關，從而產生PCSK9功能損失及功能獲得表型(Lambert (2007) Current opinion in lipidology 18(3):304-309)。 PCSK9主要用作可溶性蛋白質以藉由細胞外結合經由重新路由至至溶酶體路徑來靶向膜結合LDLR之降解(Horton等人(2007) Trends Biochem Sci 32(2):71-77)。在分子層面下，PCSK9阻斷呈延伸(開放)構形之LDLR。此達成於PCSK9之催化結構域(aa153-421)及LDLR之EGF-A結構域(aa314-355)發生結合時(Leren (2014) Atherosclerosis 237(1):76-81)。受體在此情形下不能採用閉合構形使得減緩至血漿膜之再循環及後續降解。LDLR (PCSK9受體)尤其大量存在於肝(負責清除血漿LDL之主要器官)中。因LDLR在肝細胞表面上之數量決定了LDL自血流之去除速率，PCSK9呈現有益調節脂質穩態之有吸引力靶。 PCSK9誘導LDLR降解之兩個單獨途徑，如藉由若干機械性研究所指示。在「LDLR降解之細胞內途徑」中，新形成PCSK9結合至LDLR，且然後將其自反式高爾基體網絡(trans-Golgi network)引導至溶酶體中以用於降解。此途徑之存在已經由HepG2細胞中之研究來展示，其中網格蛋白輕鏈小干擾RNA (其去除自反式高爾基體網絡至溶酶體之細胞內輸送)以PCSK9依賴性方式快速增加LDLR濃度，且並不影響外源性PCSK9增強LDLR降解之能力(Poirier等人，J. Biol. Chem. 284 (42) (2009年10月16日) 28856-28864)。 在LDLR降解之第二途徑中，所分泌PCSK9在細胞表面上結合至LDLR之第一表皮生長因子樣重複(EGFA)以引導PCSK9-LDLR複合物之內化。在內化後，LDLR之胞吞再循由所結合PCSK9抑制，此促進了兩種蛋白質之溶酶體降解(Lo等人，EMBO Rep.12 (12) (2011年12月) 1300-1305)。PCSK9之單株抗體(mAB)去除了EGFA結構域處之PCSK9-LDLR相互作用，從而指示第二或細胞表面途徑對人類中之肝LDLR濃度施加主要效應(Stein等人，Curr. Atheroscler. Rep. 15 (3) (2013年3月) 310)。 Tavori等人(Circulation 127 (24) (2013年6月18日) 2403-2413)之研究指示，LDLR用作消除PCSK9之主要途徑，且該兩種蛋白質之間之相互控制機制調控血清PCSK9濃度、肝中之LDLR表現及血清LDL-C濃度。 PCSK9抑制亦可減小脂蛋白(a)濃度。高濃度之脂蛋白(a)係心血管死亡之獨立預測因子，即使在具有低LDL-C之他汀治療患者(Khera等人(2014) Circulation 129(6): 635-642)。PCSK9抑制劑將脂蛋白(a)減小大約30%。使用他汀或依折麥布(ezetimibe)調介之LDLR活性上調未觀察到此一效應(Rader等人(1994) J Clin Invest 93(6):2758-2763)。因此，作為治療策略之PCSK9抑制具有超出LDL-C降低之理論優點，從而增加了心血管結果可額外有益之可能性。組合物及方法 在一態樣中，本發明部分地係基於使用PCSK9抑制劑獲得之實驗結果。所獲得結果指示，使用PCSK9抑制劑阻斷PCSK9之生物活性使得可防止LDLR之減少。另外，結果顯示，投與PCSK9抑制劑會減小個體中之總LDL-C濃度。因此，如本文所闡述之本發明之PCSK9抑制劑提供用於靶向與PCSK9有關之病理學病狀(例如膽固醇相關病症)的重要治療劑及診斷劑。 在某些實施例中，「膽固醇相關病症」包含下列疾病中之任一者或多者：高膽固醇血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠狀動脈心臟病、中風、心血管疾病、阿茲海默氏病(Alzheimer’s disease)及通常血脂異常，其可表現為(例如)總血清膽固醇升高、LDL升高、三甘油酯升高、VLDL升高及/或低HDL。可使用PCSK9抑制劑(單獨或與一或多種其他藥劑組合)治療之原發性及繼發性血脂異常之一些非限制性實例包含代謝症候群、糖尿病、家族性組合高脂血症、家族性高甘油三酯血症、家族性高膽固醇血症(包含異型高膽固醇血症、同型高膽固醇血症)、家族性載脂蛋白B-100缺陷症；多基因高膽固醇血症；殘粒去除障礙病、肝脂肪酶缺陷；繼發於下列情形中之任一者之血脂異常：飲食不慎重、甲狀腺功能減退、藥物(包含雌激素及助孕素療法、β-阻斷劑及噻嗪型利尿劑)；腎病症候群、慢性腎衰竭、庫興氏症候群(Cushing’s syndrome)、一級膽管肝硬化、糖原貯積病、肝細胞瘤、膽汁淤積、肢端肥大症、胰島素瘤、單純性生長激素缺陷及酒精誘導性高甘油三酯血症。本文所闡述之PCSK9抑制劑亦可用於預防或治療動脈粥樣硬化疾病，例如冠狀動脈心臟病、冠狀動脈疾病、周邊動脈疾病、中風(缺血及出血)、心絞痛或腦血管疾病及急性冠狀動脈症候群、心肌梗塞。在某些實施例中，本文所闡述之PCSK9抑制劑可用於減小以下風險：非致命性心臟攻擊、致命性及非致命性中風、某些類型之心臟手術、心臟衰竭住院、患有心臟病之患者之胸痛及/或由確立心臟病所致之心血管事件(例如先前心臟病發作、先前心臟手術及/或具有堵塞動脈證據之胸痛)。在某些實施例中，本文所闡述之PCSK9抑制劑及方法可用於減小復發性心血管事件之風險。PCSK9 抑制劑 在某些實施例中，提供結合至PCSK9或其片段之PCSK9抑制劑，其中PCSK9抑制劑結合至PCSK9之片段內之表位。在某些實施例中，提供結合至PCSK9或其片段之PCSK9抑制劑，其中PCSK9抑制劑係與排列在袋中之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之下列部分結合：A239-V241、T339-D343、P364-I368、H391及V441-L444。在一些實施例中，PCSK9抑制劑結合SEQ ID NO: 1之表位，該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括至少兩個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括至少三個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括至少4個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括至少5個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括至少6個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之殘基V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少11個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少12個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少13個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少14個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少15個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少16個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之殘基A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少11個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少12個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少13個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少14個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少15個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少16個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括至少17個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之殘基A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之V241。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之T339。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之D343。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之P364。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A442。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A443。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之V241及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之T339及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之D343及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1 P364之及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1 A442之及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A443及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之L444及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及A443。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之V241及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之T339及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之D343及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之P364及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A442及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A443及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及L444。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之L444及至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442及A443。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A239及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之G240及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之N340及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之A341及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之E366及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之D367及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之I368及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之I369及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之G370及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括SEQ ID NO: 1之H391及至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。在一些實施例中，該表位包括下列殘基中之1、2、3、4、5、6者或全部：SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括下列殘基中之11、12、13、14、15、16者或全部：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，該表位包括下列殘基中之11、12、13、14、15、16、17或全部：SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、Q342、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444。在一些實施例中，PCSK9抑制劑與表位中之SEQ ID NO: 1殘基之間之距離為10 Å或更小、9 Å或更小、8 Å或更小、7 Å或更小、6 Å或更小、5 Å或更小、4 Å或更小、3 Å或更小或2 Å或更小。 在一些實施例中，PCSK9抑制劑係選自式I化合物： R1 -X1 -X2 -X3 -Trp-Asn-Leu-X4 -X5 -Ile-Gly-X6 -R2 ， 式I 及其醫藥上可接受之鹽； 其中， R1 係C1 -C4 醯基；或R1 不存在； X1 係選自TVFTSWEEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列；或X1 不存在； X2 係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列；或X2 係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸；或X2 不存在； X3 係包括1至4個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、2-胺基環己烷-1-甲酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、3-羥基脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸及色胺酸； X4 係選自以下之胺基酸殘基：丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸及纈胺酸； X5 係選自以下之胺基酸殘基：精胺酸及高精胺酸； X6 係包括1至5個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、精胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及色胺酸；或X6 不存在；且 R2 係胺基；或R2 不存在。 在一些實施例中，R1 係C1 -C4 醯基。 在一些實施例中，R1 係乙醯基。 在一些實施例中，R1 係戊醯基。 在一些實施例中，R1 不存在。 在一些實施例中，X1 係選自TVFTSWEEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列。 在一些實施例中，X1 係胺基酸序列TVFTSWEEYLDWV。 在一些實施例中，X1 係胺基酸序列TAFTSWEEYLDWV。 在一些實施例中，X1 不存在。 在一些實施例中，X2 係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列。 在一些實施例中，X2 係選自SG、GSG、GGSG、GSGG及SGSG之胺基酸序列。 在一些實施例中，X2 係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸。 在一些實施例中，X2 係胺基酸殘基6-胺基己酸。 在一些實施例中，X2 係胺基酸殘基7-胺基庚酸。 在一些實施例中，X2 係胺基酸殘基8-胺基辛酸。 在一些實施例中，X2 不存在。 在一些實施例中，X3 係選自以下之胺基酸序列：P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP及DLMP。 在一些實施例中，X3 不存在。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基丙胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基2,3-二胺基丙酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基麩醯胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基甘胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基離胺酸。 在一些實施例中，X4 係經檢測試劑修飾之胺基酸殘基離胺酸。在一些實施例中，檢測試劑係生物素。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基纈胺酸。 在一些實施例中，X5 係胺基酸殘基精胺酸。 在一些實施例中，X5 係胺基酸殘基高精胺酸。 在一些實施例中，X6 係選自以下之胺基酸序列：L、S、LL、LAR、LGC、LLA、LLC、LLR、LPC、LTR、SQGC、SQCEY、SQCWF及SQGCW。 在一些實施例中，X6 不存在。 在一些實施例中，R2 係胺基。 在一些實施例中，PCSK9抑制劑係選自表1中所展示下列肽之化合物。表 1
Figure 106121106-A0304-0002
 在一些實施例中，PCSK9抑制劑係選自下列化合物及其醫藥上可接受之鹽：Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLGRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GGSG-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Aoc)-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-KLWNLGRV-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-CWNLKRIGSQGC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-SGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2 ；SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；SG-DLMPWNLVRIGLLR；Ac-SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2 ；Ac-SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CFIPWNLQRIGLLC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-SG-CRL(Hyp)WNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CFLPWNLQRIGLLC-NH2 ；Ac-CWNLKRIGSQGCW-NH2 ；Ac-GSG-CWNLKRIGSQGCW-NH2 ；Ac-DLMAWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-DLAPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-DAMPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-ALMPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIGLL-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIGL-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIG-NH2 ；Ac-LMPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-MPWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-PWNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-WNLVRIGLLR-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIGLLA-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIGLAR-NH2 ；Ac-DLMPWNLVRIGALR-NH2 ；Ac-DLMPWNLARIGLLR-NH2 ；Ac-MCLWNLKRIGSQCEY-NH2 ；Ac-DCLWNLKRIGSQCEY-NH2 ；Ac-WCLWNLKRIGSQCEY-NH2 ；GCLWNLKRIGSQCWF；Ac-CRLPWNLKRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLAC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGAPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLARIGLPC-NH2 ；Ac-CRLAWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRAPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CALPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLGC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGGGC-NH2 ；Ac-CRL(Ach)WNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-GCLWNLKRIGSQCWF-NH2 ；Ac-GCLWNLARIGSQCWF-NH2 ；Ac-FCLWNLARIGSQCWF-NH2 ；GCLWNLKRIGSQCWF-NH2 ；WCLWNLKRIGSQCWF-NH2 ；Ac-GCLWNLKRIGSQCWF；Ac-WCLWNLKRIGSQCWF；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIGS-NH2 ；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIG-NH2 ；Ac-FCLWNLKRIGSQCEY-NH2 ；Ac-FCLWNLKRIGAQCWF-NH2 ；Ac-GSG-CWNL(Dpr)RIGSQGC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLpC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGlPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLqRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRLpWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CRlPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-CrLPWNLQRIGLPC-NH2 ；Ac-cRLPWNLQRIGLPC-NH2 ；n-BuC(O)-WNLVRIGLLR-NH2 ；n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2 ；n-BuC(O)-WNLVRIGTTR-NH2 ；n-BuC(O)-WNLVRIGTLR-NH2 ；Ac-CRLPWNLQ(homoR)IGLPC-NH2 ；n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLTR-NH2 ；及Ac-PWNLVRIGL-NH2 。 在一些實施例中，PCSK9抑制劑係選自式II化合物： R1 -X1 -X2 -X3 -X7 -Asn-Leu-X4 -X5 -Ile-Gly-X6 -R2 ， 式II 及其醫藥上可接受之鹽；其中， R1 係選自C1 -C4 醯基、芳基羰基、C3 -C7 環烷基羰基及雜芳基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代： C1 -C4 烷基； 胺基； 芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1 -C4 烷氧基、胺基、鹵基及羥基之取代基取代； 芳基-C1 -C4 烷基； 芳基羰基，其視情況經一個選自C1 -C4 烷基及C1 -C4 烷基磺醯基之取代基取代； 芳基氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1 -C4 醯基、C1 -C4 烷氧基、C1 -C4 烷基、鹵基及羥基-C1 -C4 烷基之取代基取代； 羧基胺基，其視情況經一個選自芳基-C1 -C4 烷基之取代基取代； C3 -C7 環烷基； 雜芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1 -C4 烷基及胺基之取代基取代； 雜環基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1 -C4 烷基、C1 -C4 烷基磺醯基、甲醯胺、雜芳基-C1 -C4 烷基及側氧基之取代基取代； 雜環基羰基；及 脲基； 或R1 不存在； X1 係選自TVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列；或X1 不存在； X2 係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列；或X2 係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸；或X2 不存在； X3 係包括1至6個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、2-胺基環己烷-1-甲酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、3-羥基脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、色胺酸及酪胺酸； X4 係選自以下之胺基酸殘基：丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸及纈胺酸； X5 係選自以下之胺基酸殘基：精胺酸及高精胺酸； X6 係包括1至5個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及色胺酸；或X6 不存在； X7 係選自以下之胺基酸殘基：色胺酸、6-氟色胺酸、6-氯色胺酸、6-溴色胺酸及6-甲基色胺酸；且 R2 係胺基；或R2 不存在。 在一些實施例中，R1 係C1 -C4 醯基。 在一些實施例中，R1 係乙醯基。 在一些實施例中，R1 係戊醯基。 在一些實施例中，R1 不存在。 在一些實施例中，R1 係選自C1 -C4 醯基、芳基羰基、C3 -C7 環烷基羰基及雜芳基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代： C1 -C4 烷基； 胺基； 芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲氧基、胺基、氟、氯及羥基之取代基取代； 芳基-C1 -C4 烷基； 芳基羰基，其視情況經一個選自甲基及甲基磺醯基之取代基取代； 芳基氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自乙醯基、甲氧基、甲基、乙基、溴及羥甲基之取代基取代； 羧基胺基，其視情況經一個選自苯基甲基之取代基取代； C3 -C7 環烷基； 雜芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基及胺基之取代基取代； 雜環基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基、甲基磺醯基、甲醯胺、吡啶基甲基及側氧基之取代基取代； 雜環基羰基；及 脲基。 在一些實施例中，R1 係選自C1 -C4 醯基、芳基羰基、C3 -C7 環烷基羰基及雜芳基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代： C1 -C4 烷基，其選自甲基及第三丁基； 胺基； 苯基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲氧基、胺基、氟、氯及羥基之取代基取代； 苯基甲基； 苯甲醯基，其視情況經一個選自甲基及甲基磺醯基之取代基取代； 苯氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自乙醯基、甲氧基、甲基、乙基、溴及羥甲基之取代基取代； 羧基胺基，其視情況經一個選自苯基甲基之取代基取代； 環己基； 雜芳基，其選自咪唑基、吲哚基、吡唑基、吡啶基及三唑基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基及胺基之取代基取代； 雜環基，其選自嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、吡咯啶基、四氫噻吩基、四氫嘧啶基、硫嗎啉基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基、甲基磺醯基、甲醯胺、吡啶基甲基及側氧基之取代基取代； 嗎啉基羰基；及 脲基。 在一些實施例中，R1 係選自乙醯基、正丙醯基、正丁醯基、異戊醯基、戊醯基、苯甲醯基、環丙基羰基、環丁基羰基、環己基羰基、吲哚基羰基、吡唑基羰基及吡啶基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代： C1 -C4 烷基，其選自甲基及第三丁基； 胺基； 苯基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲氧基、胺基、氟、氯及羥基之取代基取代； 苯基甲基； 苯甲醯基，其視情況經一個選自甲基及甲基磺醯基之取代基取代； 苯氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自乙醯基、甲氧基、甲基、乙基、溴及羥甲基之取代基取代； 羧基胺基，其視情況經一個選自苯基甲基之取代基取代； 環己基； 雜芳基，其選自咪唑基、吲哚基、吡唑基、吡啶基及三唑基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基及胺基之取代基取代； 雜環基，其選自嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、吡咯啶基、四氫噻吩基、四氫嘧啶基、硫嗎啉基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基、甲基磺醯基、甲醯胺、吡啶基甲基及側氧基之取代基取代； 嗎啉基羰基；及 脲基。 在一些實施例中，R1 係選自乙醯基、正丁醯基、3-(1,1-二氧離子基硫嗎啉基)丙醯基、2-(1-甲基-1H -吡唑-4-基)環丙烷-1-羰基、3-(2-側氧基吡咯啶-1-基)丙醯基、1-(1-甲基吡咯啶-3-基)-1H -吡唑-4-羰基、2-(1-(吡啶-2-基甲基)六氫吡啶-4-基)乙醯基、3-(4-胺甲醯基六氫吡嗪-1-基)丙醯基、3-(1H -咪唑-4-基)丙醯基、2-(1-(甲基磺醯基)六氫吡啶-4-基)乙醯基、6-嗎啉基菸鹼醯基、3-(3,5-二甲基-1H -吡唑-1-基)丙醯基、3-嗎啉基丙醯基、3-(吡啶-3-基)丙醯基、2-(1,1-二氧離子基四氫噻吩-3-基)乙醯基、3-(4-甲基六氫吡嗪-1-基)丙醯基、3-脲基丙醯基、3-(1H -1,2,4-三唑-1-基)丙醯基、2-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H )-基)乙醯基、3-苄基環丁烷-1-羰基、[1,1'-聯苯]-4-羰基、5-苯基戊醯基、4-苯基環己烷-1-羰基、5,5-二甲基己醯基、3,5,5-三甲基己醯基、5-(吡啶-4-基)-1H -吡唑-3-羰基、3-環己基丙醯基、3-(4-胺基苯基)丙醯基、4-嗎啉基丁醯基、4-(4-(甲基磺醯基)苯基)-4-側氧基丁醯基、3-(3-胺基苯基)丙醯基、4-側氧基-4-(對甲苯基)丁醯基、3-(4-甲氧基苯基)丙醯基、4-嗎啉基-4-側氧基丁醯基、3-(3-羥基苯基)丙醯基、4-(((苄基氧基)羰基)胺基)丁醯基、3-(4-羥基苯基)丙醯基、3-(6-胺基吡啶-3-基)丙醯基、4-(4-溴苯氧基)丁醯基、4-(4-乙醯基苯氧基)丁醯基、3-(吡啶-4-基)-1H -吡唑-5-羰基、3-(1H -吲哚-3-基)丙醯基、4-(1H -吲哚-3-基)丁醯基、4-(4-氟苯基)丁醯基、3-(4-氟苯基)丙醯基、3-(4-氯苯基)丙醯基、3-(3-甲氧基苯基)丙醯基、3-(4-甲氧基苯氧基)丙醯基、4-(4-(羥甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁醯基、3-(4-乙醯基苯氧基)丙醯基、4-(對甲苯基氧基)丁醯基、4-苯氧基丁醯基、4-(4-乙基苯氧基)丁醯基、3-(對甲苯基氧基)丙醯基、4-苯基丁醯基、3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙醯基、4-(4-羥基苯基)丁醯基、2-(吡啶-3-基)環丙烷-1-羰基、1H -吲哚-6-羰基、2-胺基-3-(4-羥基苯基)丙醯基及3-(3,4-二羥基苯基)丙醯基。 在一些實施例中，X1 係選自TVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列。 在一些實施例中，X1 係胺基酸序列TVFTSWEEYLDWV。 在一些實施例中，X1 係胺基酸序列TVFTS(W6fl)EEYLDWV。 在一些實施例中，X1 係胺基酸序列TAFTSWEEYLDWV。 在一些實施例中，X1 不存在。 在一些實施例中，X2 係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列。 在一些實施例中，X2 係選自G、GG、SG、GSG、GGSG、GSGG及SGSG之胺基酸序列。 在一些實施例中，X2 係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸。 在一些實施例中，X2 係胺基酸殘基6-胺基己酸。 在一些實施例中，X2 係胺基酸殘基7-胺基庚酸。 在一些實施例中，X2 係胺基酸殘基8-胺基辛酸。 在一些實施例中，X2 不存在。 在一些實施例中，X3 係選自以下之胺基酸序列：P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFI(Hyp)、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP、DLMP、DSYPG、ESFPG、ESYPG、MDSFPG、MESFPG及SFAFPG。 在一些實施例中，X3 不存在。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基丙胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基2,3-二胺基丙酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基麩醯胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基甘胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基離胺酸。 在一些實施例中，X4 係胺基酸殘基纈胺酸。 在一些實施例中，X5 係胺基酸殘基精胺酸。 在一些實施例中，X5 係胺基酸殘基高精胺酸。 在一些實施例中，X6 係選自以下之胺基酸序列：L、S、LL、LAR、LDR、LER、LGC、LGR、LLA、LLC、LLQ、LLR、LPC、LPR、LSR、LTR、SQGC、SQCEY、SQCWF及SQGCW。 在一些實施例中，X6 不存在。 在一些實施例中，X7 係色胺酸。 在一些實施例中，X7 係6-氟色胺酸。 在一些實施例中，X7 係6-氯色胺酸。 在一些實施例中，X7 係6-溴色胺酸。 在一些實施例中，X7 係6-甲基色胺酸。 在一些實施例中，R2 係胺基。 在一些實施例中，R2 不存在。 在一些實施例中，PCSK9抑制劑係選自表1A中所展示之化合物及其醫藥上可接受之鹽。表 1A
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在某些實施例中，本發明提供包括如本文所闡述結合至PCSK9之PCSK9抑制劑之經抑制PCSK9。 在一態樣中，本發明係關於將候選化合物鑑別為結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑之方法，其中該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基；該方法包括以下步驟：a)使PCSK9與候選化合物接觸；b)使PCSK9Δ螺旋與候選化合物接觸；c)量測候選化合物對PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合親和力；及d)測得候選化合物對PCSK9Δ螺旋之結合親和力強於候選化合物對PCSK9之結合親和力；其中該測定指示候選化合物係結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑。 一種將候選化合物鑑別為結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑之方法，其中該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基；該方法包括以下步驟：a)使PCSK9與候選化合物接觸；b)量測候選化合物對PCSK9之結合親和力；c)使PCSK9Δ螺旋與候選化合物接觸；d)量測候選化合物對PCSK9Δ螺旋之結合親和力；及e)測得候選化合物對PCSK9Δ螺旋之結合親和力強於候選化合物對PCSK9之結合親和力；其中該測定指示候選化合物係結合SEQ ID NO: 1之表位之PCSK9抑制劑。 在一些實施例中，該表位包括至少兩個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一些實施例中，該表位包括至少三個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一些實施例中，該表位包括至少4個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一些實施例中，該表位包括至少5個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一些實施例中，該表位包括至少6個選自由SEQ ID NO: 1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一些實施例中，該表位包括至少11個選自由SEQ ID NO: 1之A239、G240、V241、T339、N340、A341、D343、P364、E366、D367、I368、I369、G370、H391、A442、A443及L444組成之群之殘基。 在一些實施例中，將PCSK9及PCSK9Δ螺旋提供於感測器晶片上。 在一些實施例中，使用表面電漿共振測定結合親和力。醫藥組合物 另一實施例提供含有本發明化合物及治療惰性載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物或藥劑以及使用本發明化合物製備該等組合物及藥劑之方法。在一實例中，本文所闡述之PCSK9抑制劑可藉由在室溫下在適當pH下且以期望純度與生理上可接受之載劑(亦即在所用劑量及濃度下對接受者無毒之載劑)混合成蓋倫製劑(galenical)投與形式來調配。調配物之pH主要取決於化合物之特定用途及濃度，但較佳係在約3至約8之範圍內。在一實例中，在pH 5之乙酸鹽緩衝液中調配本文所闡述之PCSK9抑制劑。在另一實施例中，本文所闡述之PCSK9抑制劑無菌。化合物可以(例如)固體或非晶型組合物形式、以凍乾調配物形式或以水溶液形式儲存。 組合物係以與良好醫療實踐一致之方式調配、投用及投與。在此上下文中需考慮之因素包含所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床病狀、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。擬投與化合物之「有效量」或「治療有效量」取決於該等考慮，且係改變PCSK9構形且由此降低PCSK9 LDLR結合位點對LDLR之親和力(從而藉由肝細胞達成之LDL內化有所增加且循環LDL-C之濃度有所減小)所需之最小量。舉例而言，該量可小於對正常細胞或哺乳動物整體有毒之量。 在一實例中，每劑量中非經腸投與之本發明化合物之醫藥上有效量將在約0.001至1,000 (例如0.01-100) mg/kg患者體重/天或者約0.1 mg/kg患者體重/天至20 mg/kg患者體重/天之範圍內，其中所用化合物之典型初始範圍為0.3 mg/kg/天至15 mg/kg/天。在另一實施例中，口服單位劑型(例如錠劑及膠囊)較佳地含有約1至約1,000 mg (例如25-100)之本發明化合物。 本發明化合物可藉由任何適宜方式來投與，包含經口、局部(包含經頰及舌下)、經直腸、經陰道、經真皮、非經腸、皮下、腹膜腔內、肺內、真皮內、鞘內及硬膜外及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包含肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。 本發明化合物可以任何方便投與形式投與，例如錠劑、粉劑、膠囊、溶液、分散液、懸浮液、糖漿、噴霧劑、栓劑、凝膠、乳液、貼劑等。該等組合物可含有醫藥製劑中之習用組分，例如稀釋劑、載劑、pH改良劑、甜味劑、膨脹劑及其他活性劑。 典型調配物係藉由將本發明化合物與載劑或賦形劑混合來合成。適宜載劑及賦形劑為熟習此項技術者所熟知且詳細闡述於(例如)以下文獻中：Ansel, Howard C.等人，Ansel’s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004；Gennaro, Alfonso R.等人，Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2000；及Rowe, Raymond C. Handbook of Pharmaceutical Excipients. Chicago, Pharmaceutical Press, 2005。調配物亦可包含一或多種緩衝劑、穩定劑、表面活性劑、潤濕劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、助流劑、處理助劑、著色劑、甜味劑、芳香劑、矯味劑、稀釋劑及其他已知添加劑，從而提供藥物(亦即本發明化合物或其醫藥組合物)之美觀呈現或幫助製造醫藥產品(亦即藥劑)。 適宜口服劑型之一實例係含有以下部分之錠劑：約1 mg至約1,000 mg (例如25 mg、50 mg、100 mg、250 mg或500 mg)本發明化合物以及與其複合之約10至1,000 (例如90-300) mg無水乳糖、約1至100 (例如5-40) mg交聯羧甲基纖維素鈉、約1 mg至100 mg (例如5-30 mg)聚乙烯基吡咯啶酮(PVP) K30及約0.1 mg至100 mg (例如1-10 mg)硬脂酸鎂。首先，將粉末狀成分混合在一起，且然後與PVP溶液混合。可將所得組合物乾燥，粒化，與硬脂酸鎂混合並使用習用設備壓縮成錠劑形式。氣溶膠調配物之一實例可藉由將本發明化合物(例如1 mg至1,000 mg (例如5-400 mg))溶於適宜緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝液)中並視需要添加等張劑(tonicifier) (例如諸如氯化鈉等鹽)來製備。可使用(例如) 0.2微米過濾器來過濾溶液以去除雜質及污染物。 一實施例由此包含包括本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥上可接受之鹽之醫藥組合物。在另一實施例中包含含有本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥上可接受之鹽以及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。 另一實施例包含含有本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於藉由療法治療人類或動物身體之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於抑制PCSK9結合至LDLR之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於增加LDLR之可用率之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於降低LDL-C濃度之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於降低血清LDL-C濃度之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於治療膽固醇相關病症之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於治療與異常LDL-C濃度有關之病症之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於治療與升高之LDL-C濃度有關之病狀之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於治療血脂異常之方法中。在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑之醫藥組合物，其用於治療高膽固醇血症之方法中。適應症及治療方法 本發明化合物係結合至PCSK9之PCSK9抑制劑。在一些實施例中，PCSK9抑制劑降低PCSK9 LDLR結合位點對LDLR之親和力，從而藉由(例如)肝細胞達成之LDL內化有所增加。因此，在一些實施例中，本發明之化合物、組合物及方法可用於減小循環LDL-C之濃度，且用於治療與高濃度之循環LDL-C有關之疾病及病症(例如高膽固醇血症及心血管疾病)。 本文所提供之任一PCSK9抑制劑皆可用於治療方法中。 在一態樣中，提供用作藥劑之PCSK9抑制劑。在另一態樣中，提供用於治療與膽固醇相關病症有關之病狀之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，提供用於治療與升高之LDL-C濃度有關之病狀之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，提供用於治療方法中之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有與升高之LDL-C濃度有關之病狀之個體之方法中的PCSK9抑制劑，該方法包括向個體投與有效量之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，本文所闡述之方法及用途進一步包括向個體投與有效量之至少一種另一治療劑(例如他汀)。在某些實施例中，本發明提供用於減小個體中之LDL-C濃度之PCSK9抑制劑。在其他實施例中，本發明提供用於降低個體中之血清LDL-C濃度之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，本發明提供用於增加個體中之LDLR可用率之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，本發明提供用於抑制個體中之PCSK9結合至LDLR之PCSK9抑制劑。在某些實施例中，本發明提供用於減小個體中之LDL-C濃度之方法中之PCSK9抑制劑，該方法包括向個體投與有效量之PCSK9抑制劑以降低LDL-C濃度。在某些實施例中，本發明提供用於降低個體中之血清LDL-C濃度之方法中之PCSK9抑制劑，其包括向個體投與有效量之PCSK9抑制劑以降低血清LDL-C濃度。在某些實施例中，本發明提供用於增加個體中之LDLR可用率之方法中之PCSK9抑制劑，其包括向個體投與有效量之PCSK9抑制劑以增加LDLR可用率。在某些實施例中，本發明提供用於抑制個體中之PCSK9結合至LDLR之方法中之PCSK9抑制劑，其包括向個體投與有效量之PCSK9抑制劑以抑制PCSK9結合至LDLR。 根據本文所闡述之任一實施例，「個體(individual或subject)」較佳地係人類。 在另一態樣中，本發明提供PCSK9抑制劑在製造或製備藥劑中之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療膽固醇相關病症。在某些實施例中，膽固醇相關病症係高膽固醇血症。在另一實施例中，該藥劑係用於治療高膽固醇血症之方法中，該方法包括向患有高膽固醇血症之個體投與有效量之藥劑。 在某些實施例中，本發明提供包括本文所闡述之PCSK9抑制劑及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供調節PCSK9活性之方法，其包括使PCSK9與有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑接觸。在某些實施例中，本發明提供抑制有需要之個體中PCSK9與LDLR結合之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供增加有需要之個體中LDLR可用率之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供減小有需要之個體中LDL-C濃度之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供減小有需要之個體中血清LDL-C濃度之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供治療有需要個體之膽固醇相關病症之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體與異常LDL-C濃度有關之病症之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供治療有需要之個體與升高之LDL-C濃度有關之病狀之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供治療有需要個體之血脂異常之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供治療有需要個體之高膽固醇血症之方法，其包括向個體投與治療有效量之本文所闡述之PCSK9抑制劑或其醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於藉由療法治療人類或動物身體之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於調節PCSK9活性之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於抑制PCSK9與LDLR結合之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於增加LDLR可用率之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於降低LDL-C濃度之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於降低血清LDL-C濃度之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於治療膽固醇相關病症之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於治療與異常LDL-C濃度有關之病症之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於治療與升高之LDL-C濃度有關之病狀之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於治療血脂異常之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑，其用於治療高膽固醇血症之方法中。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於調節PCSK9活性之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於抑制PCSK9與LDLR結合之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於增加LDLR可用率之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於降低LDL-C濃度之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於降低血清LDL-C濃度之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於治療膽固醇相關病症之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於治療與異常LDL-C濃度有關之病症之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於治療與升高之LDL-C濃度有關之病狀之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於治療血脂異常之藥劑。在某些實施例中，本發明提供本文所闡述之PCSK9抑制劑之用途，其用以製造用於治療高膽固醇血症之藥劑。 在某些實施例中，所治療病症係藉由去除、抑制或減小PCSK9活性來改良、改善、抑制或預防之任一疾病或病狀。在某些實施例中，亦可治療通常可經由使用他汀來解決(可治療或可預防)之疾病或病症。在某些實施例中，亦可藉由本發明之PCSK9抑制劑來治療可受益於預防膽固醇合成或增加之LDLR表現之病症或疾病。在某些實施例中，可藉由本發明之PCSK9抑制劑及治療方法治療之個體包含指定用於LDL血球分離之個體、具有PCSK9活化突變(功能獲得突變，「GOF」)之個體、患有異型家族性高膽固醇血症(heFH)之個體、含有原發性高膽固醇血症且為他汀不耐受或他汀不受控之個體及處於發生高膽固醇血症之風險下且可預防性治療之個體。其他適應症包含與諸如以下等二級病因有關之血脂異常：2型糖尿病、膽汁鬱積性肝病(原發性膽管肝硬化)、腎病症候群、甲狀腺功能減退、肥胖症及動脈粥樣硬化及心血管疾病之預防及治療。在某些實施例中，可藉由本文所闡述之PCSK9抑制劑及治療方法治療之個體包含LDL-C濃度為90-250 mg/dL且具有冠狀動脈心臟病(CHD)或CHD風險等效物之個體。 在某些實施例中，本文所闡述之方法包括向患有冠狀動脈心臟病之個體投與PCSK9抑制劑。在某些實施例中，患有冠狀動脈心臟病之個體具有記載心肌梗塞之歷史。在某些實施例中，患有冠狀動脈心臟病之個體係指進行先前冠狀動脈血管重建程序(例如經皮冠狀動脈幹預或冠狀動脈旁路移植)之個體。在某些實施例中，患有冠狀動脈心臟病之個體係指具有至少一個具有50%直徑狹窄之冠狀動脈動脈粥樣硬化病灶(例如如藉由冠狀動脈血管造影術(包含侵襲性冠狀動脈血管造影術或心臟電腦化斷層攝影術冠狀動脈血管造影術)所測定)之個體。 在某些實施例中，本文所闡述之方法包括向具有至少一種CHD風險等效物之個體投與PCSK9抑制劑。在某些實施例中，具有CHD風險等效物之個體係患有一或多種形式之諸如以下等臨床動脈粥樣硬化疾病之個體：周邊動脈疾病(例如踝/臂血壓指數＜ 0.85、先前經皮或手術周邊動脈血管重建程序、先前非創傷性下肢切除術(因周邊動脈疾病)或先前血管成像上之≥ 50%直徑狹窄)、頸動脈疾病(例如具有≥ 50%直徑狹窄之頸動脈動脈粥樣硬化病灶或先前皮膚或手術頸動脈血管重建程序)、先前缺血性中風或腹部主動脈瘤。在某些實施例中，具有CHD風險等效物之個體係患有II型糖尿病之個體。在某些實施例中，具有CHD風險等效物之個體係患有I型糖尿病以及器官損害(例如視網膜病變、神經病變或腎病變(包含微白蛋白尿))之個體。在某些實施例中，具有CHD風險等效物之個體係患有中等至嚴重慢性腎病之個體。 在某些實施例中，本文所闡述之方法包括向具有下列風險因子中之一或多者之個體投與PCSK9抑制劑：年齡(≥ 45歲(對於男性)或≥ 55歲(對於女性))、抽煙(在1個月內)、高血壓(收縮壓≥ 140 mmHg，舒張壓≥ 90 mmHg，或服用抗高血壓藥劑)、低HDL膽固醇(＜ 40 mg/dL)或過早CHD家族史。 在某些實施例中，本文所闡述之方法及用途進一步包括向個體投與有效量之至少一種另一治療劑(例如他汀)。在某些實施例中，另一治療劑係用於預防及/或治療動脈粥樣硬化及/或心血管疾病。在某些實施例中，另一治療劑係用於減小復發性心血管事件之風險之方法中。在某些實施例中，另一治療劑係用於升高個體中之HDL膽固醇濃度。 在另一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包括本文所提供之任一PCSK9抑制劑以供(例如)用於上述治療方法中之任一者中。在一實施例中，醫藥調配物包括本文所提供之任一PCSK9抑制劑及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包括本文所提供之任一PCSK9抑制劑及至少一種另一治療劑(例如他汀)。 PCSK9抑制劑可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，PCSK9抑制劑可與至少一種另一治療劑共投與。在某些實施例中，該另一治療劑升高LDLR濃度。在某些實施例中，另一治療劑係LDL-C降低藥物，例如他汀，例如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、斯伐他汀(simvastatin)或其任一組合(例如VYTORIN®、ADVICOR®或SIMCOR®)。在某些實施例中，另一治療劑係HDL-膽固醇升高藥物。 上文所提及之該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或兩種以上治療劑包含於同一或單獨調配物中)及單獨投與(在此情形下，本發明之PCSK9抑制劑之投與可在投與另一治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行)。 在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度自基線減小至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%。在一些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度自基線減小至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%，且在最後投藥之後至少兩週、至少一個月、至少兩個月或三個月維持於減小濃度。在一些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約1週、約10天或約2週內自基線減小至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%。在一些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約1週、約10天或約2週內自基線減小至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%，且在最後投藥之後至少兩週、至少一個月、至少兩個月或三個月維持於減小濃度。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約45%且維持於減小濃度至少約6週、至少約7週或至少約1.5個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約1週內減小至少約45%且維持於減小濃度至少約6週、至少約7週或至少約1.5個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約50%且維持於減小濃度至少約4週或至少約1個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約10天內減小至少約50%且維持於減小濃度至少約4週或至少約1個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約50%且維持於減小濃度至少約8週或至少約2個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約10天內減小至少約50%且維持於減小濃度至少約8週或至少約2個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約55%且維持於減小濃度至少約兩週。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約2週內減小至少約55%且維持於減小濃度至少約兩週。 在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度自基線減小至少約60 mg/dL、至少約70 mg/dL、至少約75 mg/dL、至少約80 mg/dL或至少約90 mg/dL。在一些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度自基線減小至少約60 mg/dL、至少約70 mg/dL、至少約75 mg/dL、至少約80 mg/dL或至少約90 mg/dL，且在最後投藥之後至少兩週、至少一個月、至少兩個月或三個月維持於減小濃度。在一些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約1週、約10天或約2週內自基線減小至少約60 mg/dL、至少約70 mg/dL、至少約75 mg/dL、至少約80 mg/dL或至少約90 mg/dL。在一些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約1週、約10天或約2週內自基線減小至少約60 mg/dL、至少約70 mg/dL、至少約75 mg/dL、至少約80 mg/dL或至少約90 mg/dL，且在最後投藥之後至少兩週、至少一個月、至少兩個月或三個月維持於減小濃度。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約60 mg/dL或70 mg/dL且維持於減小濃度至少約6週、至少約7週或至少約1.5個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度自初始劑量約1週內減小至少約60 mg/dL或70 mg/dL且維持於減小濃度至少約6週、至少約7週或至少約1.5個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約80 mg/dL且維持於減小濃度至少約4週或至少約1個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度自初始劑量約10天內減小至少約80 mg/dL且維持於減小濃度至少約4週或至少約1個月。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度減小至少約90 mg/dL且維持於減小濃度至少約兩週。在某些實施例中，藉由本文所闡述方法治療之個體中之LDL-C濃度在初始劑量之約2週內減小至少約90 mg/dL且維持於減小濃度至少約兩週。 在某些實施例中，投藥之間之LDL-C濃度之減小維持於某一範圍內。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度自基線減小至至少約45%、至少約50%、至少約55%或至少約60%之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約40%、45%、50%、55%或60%。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度自基線減小至至少約45%之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約40%或45%。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度自基線減小至至少約50%之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約40%、45%或50%。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度自基線減小至至少約55%之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約40%、45%、50%或55%。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度自基線減小至至少約60%之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約40%、45%、50%、55%或60%。 在某些實施例中，投藥之間之LDL-C濃度之減小維持於某一範圍內。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度減小至低於基線至少約60 mg/dL、至少約70 mg/dL、至少約75 mg/dL、至少約80 mg/dL或至少約90 mg/dL之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約55 mg/dL、60 mg/dL、65 mg/dL、70 mg/dL、75 mg/dL、80 mg/dL或90 mg/dL。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度減小至低於基線至少約60 mg/dL之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約55 mg/dL或60 mg/dL。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度減小至低於基線至少約70 mg/dL之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約55 mg/dL、60 mg/dL、65 mg/dL或70 mg/dL。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度減小至低於基線至少約75 mg/dL之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約55 mg/dL、60 mg/dL、65 mg/dL、70 mg/dL或75 mg/dL。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度減小至低於基線至少約80 mg/dL之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約55 mg/dL、60 mg/dL、65 mg/dL、70 mg/dL、75 mg/dL或80 mg/dL。在某些實施例中，在投與PCSK9抑制劑之劑量後，LDL-C濃度減小至低於基線至少約90 mg/dL之最低值且在PCSK9抑制劑之下一投藥之前不增加至超過低於基線約55 mg/dL、60 mg/dL、65 mg/dL、70 mg/dL、75 mg/dL、80 mg/dL或90 mg/dL。製品及套組 在本發明之另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料之製品及套組。在某些實施例中，製品或套組包括含有本文所闡述之PCSK9抑制劑或組合物中之一或多者之容器。在某些實施例中，該製品或套組包括容器及位於該容器上或與伴隨該容器提供之標記或包裝插頁。容器可自諸如玻璃或塑膠等各種材料形成。容器容納組合物本身或其與另一有效用於治療、預防及/或診斷病狀之組合物之組合。該組合物中之至少一種活性劑係本發明之PCSK9抑制劑。標記或包裝插頁指示，組合物用於治療所選病狀。此外，該製品或套組可包括(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包括本發明之PCSK9抑制劑；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包括另一治療劑。在某些實施例中，第二容器包括第二治療劑，其中第二治療劑係「他汀」種類之膽固醇降低藥物。在某些實施例中，他汀係及/或包括阿托伐他汀(例如LIPITOR®或Torvast)、氟伐他汀(例如LESCOL)、洛伐他汀(例如MEVACOR®、ALTOCOR™或ALTOPREV®)、美伐他汀(匹伐他汀(例如LIVALO®或PITAVA®)、普伐他汀(例如PRAVACHOL®、SELEKTINE®、LIPOSTAT®)、瑞舒伐他汀(例如CRESTOR®)、斯伐他汀(例如ZOCOR®、LIPEX®)或其任一組合(例如VYTORIN®、ADVICOR®或SIMCOR®)。 本發明之此實施例中之製品或套組可進一步包括包裝插頁，該包裝插頁指示該組合物可用於治療特定病狀。實例 藉由參考下列實例來更全面地理解本發明。然而，不應將該等實例視為限制本發明範圍。實例 1 ： 毗鄰 LDLR 結合位點之 PCSK9 催化結構域上之可及溝 ( 「 N- 末端溝 」 ) 之鑑別。 Fab33:PCSK9 複合物之晶體結構 Fab33:PCSK9複合物之晶體結構係由Wu等人(美國專利第9,266,961號)所報導。其展示，Fab33經由其重鏈及輕鏈結合至LDLR結合位點(圖1)。具體而言，來自CDR-H1、-H2、-H3、-L1及-L3之一或多個胺基酸殘基位於PCSK9原子之4 Å內。另外，重鏈殘基Thr73亦發現於PCSK9之4 Å內。在Fab33之任一原子之4Å內之PCSK9胺基酸殘基組包含亦在LDLR中EGFA結構域的4 Å內的殘基(Kwon等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12；105(6): 1820-1825)。Fab33 CDR-H2環不與PCSK9之EGFA結合位點相互作用(Kwon等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12；105(6): 1820-1825) (除重鏈殘基Arg50外)，但延伸至PCSK9之N-末端溝中(圖2)，該溝通常含有PCSK9催化結構域之N-末端螺旋-「P’螺旋」(大約為殘基S153-T162)，如圖3中所展示。寄存於蛋白質資料庫(PDB)中之PCSK9之結構一致展示，P’螺旋以相同構形容納於N-末端溝中(例如PDB 2P4E、2PMW、2QTW、3BPS、3GCW、3GCX、3H42、3SQO、4K8R)。在Fab33:PCSK9結構中，未發現關於P’螺旋之電子密度。然而，存在關於Fab33 CDR-H2環之清晰電子密度，該環佔用通常定位P’螺旋之一些空間。此觀察明確指示，在Fab33結合至PCSK9後，P’螺旋因重大空間衝突而不再可能結合至N-末端溝。其進一步表明，P’螺旋並不牢固結合至N-末端溝，此乃因Fab33能夠置換P’螺旋且以高結合親和力結合至PCSK9。抗體33/PCSK9解離常數(Kd )值為0.4 nM (美國專利第9,266,961號)。指向N-末端溝之CDR-H2環似乎並不有助於結合能。最近PCSK9溝殘基係H391，其距CDR-H2殘基N54 3.8 Å，此距離過大以致不能視為氫鍵。使用分子分析程式PYMOL™應用4 Å準則。將Fab33之任一部分之4 Å內之PCSK9殘基確定為表位。基於該分析，表位包括下列殘基中之一或多者：人類PCSK9之R194、E195、D238、A239、G240、A341、Q342、E366、D367、I369、S376、T377、C378、F379及H391。藉由污染性蛋白酶裂解 P’ 螺旋 在複製結晶條件之生物化學分析中發現，污染性蛋白酶裂解Fab33:PCSK9複合物中之P’螺旋。此裂解僅在48 h培育期中發生於高濃度之Fab33:PCSK9複合物下且依賴於Fab33之存在 ，此乃因PCSK9本身並不裂解。藉由N-末端測序將裂解位點鑑別為R165-Y166，從而表明，污染性蛋白酶具有Arg特異性(例如胰蛋白酶摺疊之絲胺酸蛋白酶家族之成員)。因此，在裂解條件下測試絲胺酸蛋白酶抑制劑。為容易地測定裂解，使用針對合成N-末端肽153 SIPWNLERITPPRYRA168 產生之多株兔抗體來實施西方印漬(Western blotting)。此抗體僅檢測完整N-末端肽序列，但不檢測裂解形式。可發現，藉由塞爾潘抗凝血酶III (塞爾潘C1)及在較小程度上藉由Kunitz結構域抑制劑抑肽酶來防止裂解(圖4及5)。更具彈性蛋白酶特異性之α1-抗胰蛋白酶(塞爾潘A1)不抑制裂解(圖4及5)。 Ab33以遠低於觀察到P’螺旋裂解之濃度(＞ 14.5 mg/mL Fab33 = 290 μM，表2中)之濃度(Kd 為0.4 nM；美國專利第9,266,961號)結合至PCSK9。因此，可推斷出，Fab33之結合並不依賴於P’螺旋裂解或在其後。而是，結果表明，P’螺旋裂解係Fab33結合之結果且並非其前提。該等發現另外暗示，P’螺旋固有地不穩定且可在溝結合(「入」)及噴射(「出」)構形之間轉變。FXIa 裂解分析 設置生物化學分析以提供關於P’螺旋之固有不穩定性之其他證據。測試一組胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶以鑑別可類似於在結晶條件下所觀察裂解P’螺旋之蛋白酶。將蛋白酶與低濃度之Fab33:PCSK9複合物在存在或不存在抗體3D5下一起培育。3D5 Ab結合至PCSK9之「弗林蛋白酶裂解環」且防止高度易於蛋白酶裂解之兩個精胺酸殘基R215及R218處之裂解(Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)。可發現，蛋白酶海普森及FXIa裂解「弗林蛋白酶裂解環」，如藉由約55 kDa帶之消失所展示；藉由3D5防止此裂解(圖6)。另外，在3D5存在下，FXIa及海普森在P’螺旋處或接近該螺旋處進行裂解，如免疫印漬上所展示(圖6)。 在其他實驗中，使用先前所闡述PCSK9突變體PCSK9-R215A:R218A (=PCSK9-AA) (Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91) (其中「弗林蛋白酶裂解環」殘基已變為丙胺酸)來防止易感殘基R215及R218處之蛋白酶裂解。可發現，在與Fab33:PCSK9-AA複合物一起培育時，FXIa實際上不再裂解「弗林蛋白酶裂解環」。N-末端測序揭示，FXIa在R160-I161處之P’螺旋內及R167-Ala168處之P’螺旋下游進行裂解。因此，為將FXIa裂解特異性引導至P’α螺旋殘基R160處，產生三元突變體PCSK9-R167A:R215A:R218A (= PCSK9-AAA)。藉由生物層干涉術測定PCSK9-AAA及PCSK9-AA至LDLR胞外結構域(R & D Systems)之結合親和力，如所闡述(Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)。PCSK9-AAA以214 nM之Kd 值進行結合，此類似於針對PCSK9-AA所測得之260 nM之Kd (圖7)。該等值接近使用相同生物層干涉術方法針對野生型PCSK9之先前報導Kd 值130 nM及170 nM (Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)。因此，引入三個突變並不顯著損害LDLR結合。 在使用PCSK9-AAA之FXIa分析中，P’螺旋以時間依賴性方式裂解且在48 h之後達成完全裂解(圖8)。N端測序證實，裂解發生於R160-I161處。此外，PCSK9-AAA並不經由已使用FPR-氯甲基酮處理而不活化之FXIa裂解，指示使用活性FXIa形式在R160-I161處所觀察之裂解具有特異性。R160識別為P1殘基(根據Schechter及Berger, Biochem Biophys Res Commun. 1968 Sep 6;32(5):898-902命名)與已知FXIa作為胰蛋白酶摺疊絲胺酸蛋白酶之特異性一致。PCSK9晶體結構(例如PDB 2QTW)顯示R160位於P’螺旋中且部分地埋入，且因此不可接近FXIa之活性位點。因此，對於FXIa催化R160-I161裂解，P’螺旋必須移出溝且採取完全不同之構形。根據胰蛋白酶摺疊絲胺酸蛋白酶之已確立受質識別範例，將受質P4-P1殘基(亦即在PCSK9之157NLER160)呈遞至伸展之β-鏈構形中之活性位點，其中P1-P4殘基參與蛋白酶S1-S4亞位點之β鏈H鍵相互作用(Perona及Craik, Protein Sci. 1995 Mar;4(3):337-60)。此相互作用用以適當定位用於催化裂解之易裂鍵(亦即PCSK9中之R160-I161)。此暗示一旦P’螺旋位於溝外，當與FXIa之活性位點相互作用時，P’螺旋可採取伸展之非螺旋構形。 另外，向PCSK9-AAA添加Fab33顯著加速藉由FXIa之裂解反應。裂解在0.5 h時接近完成且在6 h時完成(圖9)。Fab33:PCSK9複合物之結構提供闡釋此結果之基礎：在N端溝位點由CDR-H2環佔據時，所結合之Fab33使P’螺旋保持於易受蛋白水解之「出」構形。以正交方式，在暴露於FXIa之前，將PCSK9-AAA與EGFA-Fc或與Pep2-8一起培育。EGFA結構域及Pep2-8皆參與P’螺旋之結合相互作用，使其穩定。PCSK9-Ser153與EGFA-Asp299側鏈產生2.9 Å鹽橋相互作用且PCSK9-Pro155與EGFA-Leu298產生凡得瓦接觸(Bottomley等人，J Biol Chem. 2009 Jan 9;284(2):1313-23；Kwon等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Feb 12；105(6): 1820-1825)。類似地，Pep2-8殘基W6與PCSK9-Pro155產生凡得瓦接觸(Zhang等人，J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)。因此，藉由以溝結合之「入」構形穩定P’螺旋，如見於寄存晶體結構(例如PDB 2P4E、2PMW、2QTW、3BPS、3GCW、3GCX、3H42、3SQO、4K8R)中，螺旋殘基R160將抵抗FXIa裂解，因其保持部分地埋入。實際上，兩種試劑皆大大防止FXIa裂解P’螺旋(圖10及11)。即使在48 h培育下，大部分PCSK9仍保持完整(圖10及11)。對照肽不抑制裂解且與緩衝液對照(亦即不添加試劑之單獨FXIa)得到類似結果(圖11)。 該等發現支持P’螺旋固有地不穩定且在「入」狀態及「出」狀態之間處於平衡(如在圖12中之模型中所繪示)之觀點。「出」構形變得易於由FXIa裂解。FXIa本身能夠裂解R160-I161肽鍵處之P’螺旋(儘管速率較為緩慢)，從而表明，平衡主要呈「入」狀態。然而，藉由添加Fab33來使平衡移向「出」狀態可顯著增加裂解反應之速率。重要的是，該模型暗示，N-末端溝可易於由化合物(例如肽或有機分子)接近。在結合至溝時，該等化合物可使P’螺旋保持於「噴射」構形，如針對Fab33所觀察。此可使得LDLR結合去穩定，如由在P’螺旋區中具有突變之PCSK9變體之減小之LDLR結合所證實(Bottomley等人，J Biol Chem． 2009 Jan 9;284(2):1313-23)。重要的是，因N-末端溝鄰近LDLR結合位點，故溝結合化合物可藉由直接拮抗LDLR結合至PCSK9 (因化合物與LDLR-EGFA結構域之間之空間撞擊)而變為競爭性抑制劑 (圖12)。方法 結晶條件下之 PCSK9 裂解及抗凝血酶 III 抑制 將三種不同濃度之Fab33:PCSK9複合物或單獨PCSK9 (如表2中所指示)在室溫下於50 mM pH 8.0 Tris、150 mM NaCl、10%甘油中培育48 h。在試樣之SDS-PAGE之後，藉由N-末端測序分析包括PCSK9催化結構域及富Cys結構域(CRD)之60 kDa帶且結果報告於表2中。表 2
Figure 106121106-A0304-0003
 對於抑制實驗而言，將Fab33:PCSK9複合物(19.8 mg/mL Fab33, 13.2 mg/mL PCSK9)與塞爾潘抗凝血酶III及α1-抗胰蛋白酶(各自150 μM) (Calbiochem)或與Kunitz結構域抑制劑抑肽酶(1.5 mM) (Roche)在室溫下於50 mM pH 8.0 Tris、150 mM NaCl、10%甘油中一起培育9天。藉由SDS-PAGE分析試樣且使用iBlot (Invitrogen)轉移至硝基纖維素膜中。然後使用iBind (Invitrogen)利用針對PCSK9 N-末端肽(153 SIPWNLERITPPRYRA168 )產生之多株兔抗體(1:3000)、隨後利用HRP偶聯驢抗兔抗體(1:5000, GE Healthcare)探測蛋白質。藉由ECL (GE Healthcare)檢測PCSK9信號且藉由自動射線攝影術進行觀察。藉由使用合成肽CSIPWNLERITPPRYRA (其在N-末端含有額外Cys殘基以用於偶聯至KLH)對兔實施免疫來生成針對PCSK9 N-末端肽153 SIPWNLERITPPRYRA168 之多株兔抗體。使用親和力層析利用樹脂固定肽CSIPWNLERITPPRYRA (YenZym Antibodies, LLC, San Francisco, CA)自兔血清來純化多株抗體IgG。藉由絲胺酸蛋白酶組裂解 PCSK9 將蛋白酶海普森(Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)、α-凝血酶、FXa、FXIa、活化蛋白質C (Haematologic Technologies, Vermont)及FXIIa (Enzyme Research實驗室)在50 nM之濃度下與3 μM PCSK9與Fab33 (4 μM)複合物且與或不與抗體3D5 (4 μM)在室溫下於50 mM pH 8.0 Tris、150 mM NaCl、4 mM CaCl2 中一起培育6 h。3D5抗體由Lipari等人(J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)闡述且結合至PCSK9之表面暴露之「弗林蛋白酶裂解環」 (其含有兩個Arg殘基R215及R218)。該兩個殘基易於由Arg特異性蛋白酶(例如弗林蛋白酶及海普森)裂解(Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)。為防止此位點處之任何裂解，將3D5抗體包含於此實驗中。在試樣之SDS-PAGE之後，藉由N-末端測序分析60 kDa PCSK9帶且使用如上文所闡述之PCSK9 N-末端肽抗體實施西方印漬。FXIa 裂解分析 基於突變體PCSK9-R215A:R218A (Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)藉由使用定點誘變添加突變R167A來構築PCSK9-R167A:R215A:R218A (=PCSK9-AAA)。將構築體瞬時表現於CHO細胞中並根據公開程序進行純化(Zhang等人，J. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012；Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。EGFA-Fc之表現及純化闡述於Zhang等人，J. Mol. Biol. 422: 685-96, 2012中。肽Pep2-8 (Ac-TVFTSWEEYLDWV-NH2 )及對照肽Pep2-8-ctrl (Ac-TVATSAEEYLLWV-NH2 )藉由Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014予以闡述。 將PCSK9-AAA突變體(2.6 μM)與50 nM FXIa (Haematologic Technologies)在室溫下於Tris緩衝液(50 mM Tris、150 mM NaCl、4 mM CaCl2 ，pH 8.0)中一起培育指示時間段。在使用Fab33、EGFA-Fc及Pep2-8之實驗中，將5.2 μM PCSK9-AAA與100 nM FXIa一起在Fab33 (8 μM)或EGFA-Fc (8 μM)或Pep2-8 (8 μM)或對照肽Pep2-8-ctrl (8 μM)存在下於Tris緩衝液中培育指示時間段。在試樣之SDS-PAGE之後，使用iBlot (Invitrogen)將蛋白質轉移至硝基纖維素膜中。然後使用iBind (Invitrogen)利用針對PCSK9 N-末端肽(153 SIPWNLERITPPRYRA168 )產生之多株兔抗體(1:3000)、隨後利用HRP偶聯驢抗兔抗體(1:5000, GE Healthcare)探測蛋白質。藉由ECL (GE Healthcare)檢測PCSK9信號且藉由自動射線攝影術進行觀察。實例 2 ： 藉由噬菌體顯示法改造 PCSK9 溝結合肽。 結果 過去曾試圖使用原始噬菌體肽集合庫或SIPWNLERITPPR (稱為N13，其係PCSK9催化結構域的第一段13個殘基且包括溝結合性P’螺旋)之軟隨機化噬菌體肽集合庫針對PCSK9Δ螺旋進行淘選。然而，所有該等努力皆不能產生任何可結合PCSK9或PCSK9Δ螺旋之溝結合性肽配體。 在尋找結合至PCSK9之N-末端溝之肽之另一方式中，基於過去所發現會結合至PCSK9上之LDLR結合位點之Pep2-8來進行延伸肽策略。Pep2-8係模擬EGF(A)結構域與PCSK9之間之相互作用之最小肽配體(Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。PCSK9上之N-末端溝正緊鄰EGF(A)結合位點。Pep2-8之C-末端指向N-末端溝之方向且Pep2-8之C-末端與PCSK9催化結構域(S153)之N-末端之間之距離約為9 Å。採用藉由胺基酸連接體融合至Pep2-8之C-末端之完全隨機化噬菌體肽集合庫，使用Pep2-8來尋找延伸至溝中之肽。發現Pep2-8與肽集合庫之間之最佳連接體為「GSG」之三殘基鏈(數據未展示)。 Pep2-8以0.7 μM之Kd 結合至PCSK9 (Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。噬菌體顯示之Pep2-8 (在p8上)極緊密地結合至PCSK9及PCSK9Δ螺旋，從而無法使用擴展集合庫達成親和力改良。為減弱相互作用，將單一纈胺酸2轉成丙胺酸之突變引入Pep2-8中(Pep2-8V2A)，過去已發現此舉會將使親和力下降約10倍(Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。與之一致，噬菌體顯示之Pep2-8V2A以減小之親和力結合至PCSK9，從而有空間可以檢測親和力之改良(圖13)。然而，此噬菌體不能結合至PCSK9Δ螺旋(圖13)。因此，使用Pep2-8V2A作為用於噬菌體集合庫之錨定序列。噬菌體集合庫係長度介於8-16個胺基酸之間且經由「GSG」連接體融合至Pep2-8V2A之C-末端之完全隨機化肽集合庫(TAFTSWEEYLDWV-GSG-(NNK)8-16 )。 遵循用於溶液分選之標準方案，針對PCSK9及PCSK9Δ螺旋將噬菌體集合庫淘選4輪(Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。與單獨Pep2-8V2A相比，發現數百種結合劑具有改良親和力。該等肽可基於序列基序保守性分成若干種類(圖14及15)。一種基序種類與N13具有高度同源性(圖14)。 藉由刪除錨定序列(Pep2-8V2A)加上連接體中之第一Gly來再次編排100種以上噬菌體融合結合劑，且將其顯示於M13噬菌體主要外殼蛋白 p8上。大部分該等噬菌體純系損失與PCSK9及PCSK9Δ螺旋結合之信號。17種噬菌體源肽保持至PCSK9及PCSK9Δ螺旋之弱結合(圖16)。使用先前所闡述之軟隨機化策略使該等肽進一步親和力成熟。彙集所有17種肽之軟隨機化集合庫且遵循標準方案針對PCSK9及PCSK9Δ螺旋進行淘選(Tonikian等人，Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86)。在4輪淘選之後，觀察到5倍富集且可藉由斑點噬菌體ELISA篩選鑑別出10種具有強結合信號之陽性純系(圖17)。該10種肽中之7種含有同源於N13之核心序列之PWNLXRIX基序，從而表明，該等融合肽之改良之結合親和力實際上係源於延伸肽之新產生溝相互作用。同樣，10種採樣中之7種含有二硫鍵。 合成該等肽中之6種(圖18中之K9gvpep1、4、5、6、7及8)且在標準噬菌體競爭ELISA中進行測試。具有保守PWNLXRIX基序之4種肽能夠與其噬菌體對應體針對PCSK9及PCSK9Δ螺旋以低μM或亞微莫耳範圍內之IC50 進行競爭(圖18)。與至N-末端溝之預測結合一致，該4種肽(K9gvpep1、K9gvpep4、K9gvpep7、K9gvpep8)不與噬菌體顯示之Pep2-8競爭結合至PCSK9 (圖18)。 將兩種噬菌體源肽合成為與N-末端Pep2-8加上GSG連接體之30殘基融合肽。該兩種肽(Pep2-8_K9gvpep4及Pep2-8_K9gvpep7)皆強力抑制噬菌體顯示延伸肽K9gvpep4以及噬菌體顯示Pep2-8之PCSK9結合，IC50 值在低毫微莫耳範圍內(圖19)。此與該兩種合成肽(化合物19 = Pep2-8_K9gvpep4；化合物20 = Pep2-8_K9gvpep7)在表面電漿共振實驗中之所測定低nM及亞nM Kd 值一致(實例4，表7)。該兩種融合肽亦能夠在HepG2細胞分析中強力恢復LDLR (實例5，圖29及30)。該等肽中之一種(化合物20)之晶體結構展示於實例3、圖21中。方法 PCSK9 Δ 螺旋之構築、表現及純化 將具有改造TEV位點(殘基缺失Y166、R167；R165與A168之間之插入ENLYFQS序列，DNA 750364)之人類PCSK9構築體M1-Q692選殖至哺乳動物表現載體(pRK5)中。使用具有10,000分子量截止膜之Millipore切向流濃縮器濃縮10公升含有表現蛋白之CHO培養基。使用2 ×1公升PBS二次過濾濃縮物。最終體積為0.8 L。藉由使用在300 mM NaCl、50 mM pH 7.5 Tris、50 mM咪唑、10%甘油中平衡且使用0.3 M咪唑、300 mM NaCl、50 mM pH 7.5 Tris洗脫之5 mL Ni管柱(GE Healthcare)來純化PCSK9 (250 mL × 4)。藉由粒徑篩析層析使用Superdex 200 16/60管柱在0.15 M NaCl、25 mM pH 8.0 Tris、10%甘油中進一步純化PCSK9。使用SDS-PAGE分析各部分(4個單獨運行)。 然後使用透析(Slidelyzer 10K (Thermo Scientific))針對1 M NaCl、50 mM pH 8.0 Tris、10%甘油及3 mM還原麩胱甘肽/0.3 mM氧化麩胱甘肽利用TEV蛋白酶(100 μL，2.5 mg/mL/10 mg蛋白質)將PCSK9在4℃下處理24小時。將TEV蛋白酶裂解PCSK9濃縮至2 mL且通過Superdex 200 16/60管柱中之250 mM NaCl、25 mM pH 8.0 Tris、10%甘油。彙集對應於PCSK9Δ螺旋之部分且使用質譜及SDS PAGE表徵。蛋白質係均質的且具有預期質量，此與N-末端序列153 SIPWNLERITPPR165 ENLYFQ (ENLYFQ係TEV裂解序列)之損失一致。PCSK9催化結構域之新N-末端係S168 A (絲胺酸係來自TEV裂解序列)，其可藉由MS來證實。因此，PCSK9Δ螺旋構築體失去其自然N-末端序列之前15個殘基(153 SIPWNLERITPPRYR167 )且具有暴露之「開放」 N-末端溝。集合庫構築 使用標準Kunkel誘變方法來構築噬菌體顯示肽集合庫(Kunkel等人，Methods Enzymol 154, 367-82)。藉由將隨機化肽融合至錨定肽Pep2-8V2A之C-末端加上GSG連接體來構築融合肽集合庫(TAFTSWEEYLDWVGSG)。遵循用於製備噬菌體顯示集合庫之標準方案將融合肽集合庫顯示於M13主要外殼蛋白之N-末端(Tonikian等人，Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86)。延伸池係由長8、10、12、14、16個胺基酸且由連續簡並密碼子(NNK，其中N=A/C/G/T且K=G/T)編碼之隨機肽組成。個別地構築具有不同長度之集合庫且以相同濃度彙集每一者。集合庫之最終多樣性為1.3 × 1010 。 使用利用核苷酸鹼基之70-10-10-10混合物合成之簡並寡核苷酸來構築軟隨機化集合庫，其中野生型鹼基過量。此使得野生型胺基酸以大約50%頻率出現於靶向位置。針對 PCSK9 之融合配體選擇及所選肽集合庫純系之親和力成熟 如前文所闡述在溶液中使用生物素化PCSK9及生物素化PCSK9Δ螺旋使融合集合庫之噬菌體池循環進行數輪結合選擇(Zhang等人，J. Biol. Chem. 289:942-55, 2014)。以相同方式淘選軟隨機化集合庫，只是分別使用10 nM、5 nM及2 nM生物素化PCSK9及生物素化PCSK9Δ螺旋進行第2、3及4輪。 在4輪結合選擇之後，在高通量斑點噬菌體ELISA中使用板固定PCSK9作為靶來分析個體噬菌體純系(Tonikian等人，Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86)。將相同噬菌體顆粒至NeutrAvidin之結合信號檢測為非特異性結合雜訊。噬菌體靶結合信號超過0.5且信號/雜訊比＞ 5之純系可視為陽性純系且實施DNA序列分析。藉由噬菌體競爭 ELISA 進行 PCSK9 肽配體之 IC50 分析 使用Kunkel誘變方法將所選純系之序列融合至M13主要外殼蛋白(p8)之N-末端(Kunkel等人，Methods Enzymol 154, 367-82)。將所得構築體轉變至大腸桿菌(E. Coli .) XL1藍中，使單一群落在37℃下於1 mL補充有50 μg/mL卡本西林(carbenicillin)、10 μg/mL四環素(Tetracycline)及M13 KO7輔助噬菌體之2YT中生長2 h，添加卡那黴素(Kanamycin)直至最終濃度為25 μg/mL，在37℃下繼續生長6 h。將培養液轉移至30 mL補充有50 μg/mL卡本西林及25 μg/mL卡那黴素之2YT中且在37℃下生長過夜。第二天，收穫噬菌體並使用標準方案純化(Tonikian等人，Nat Protoc. 2007;2(6):1368-86)。將連續稀釋之噬菌體溶液施加至在預先使用5 μg/mL NeutrAvidin塗覆且使用阻斷緩衝液阻斷之384孔MaxiSorp ImmunoPlate上固定15 min之生物素化PCSK9及生物素化PCSK9Δ螺旋中。將板在4℃下培育1 h，使用PT緩衝液(PBS, 0.05% Tween® 20)洗滌10次。使用抗M13-HRP檢測結合噬菌體且在OD450nm下讀取ELISA信號。背景為噬菌體直接結合至NeutrAvidin塗覆板之ELISA信號。將數據繪圖且使用KaleidaGraph擬合曲線。藉由結合曲線測定得到80%最大結合信號之亞飽和噬菌體濃度。 藉由在PBT緩衝液中混合固定亞飽和濃度之肽顯示噬菌體與合成肽之連續稀釋液來實施IC50 量測。將混合物添加至經PCSK9及PCSK9Δ螺旋塗覆之板中且在室溫下培育1 h。然後使用PBT緩衝液將板洗滌10次且藉由抗M13-HRP檢測結合噬菌體。將數據繪圖，擬合曲線且藉由使用KaleidaGraph來推導IC50 。所有量測皆獨立地重複3次。實例 3 ： 溝結合肽之晶體結構 出於應用X射線結晶學以研究PCSK9 N-末端溝結合肽之目的，需要選擇已知在晶格中提供用於該等肽之足夠空間以佔據「N-末端溝」之晶體系統。選擇空間群P32 21中之PCSK9ΔCRDΔ螺旋/Pep2-8之晶體。該等晶體相對易於產生，其繞射至相對較高解析度，且提供另外僅由緊鄰「N-末端溝」之本體溶劑佔據之較大體積。因此，預計該等晶體中之PCSK9ΔCRDΔ螺旋:Pep2-8複合物之晶體堆積可容納溝結合肽。 測定肽與PCSK9ΔCRDΔ螺旋之複合物之總共9個晶體結構且具有介於1.9 Å與2.9 Å之間之良好解析度。其包括三個融合肽(圖20-22)及5個與Pep2-8共結晶之溝結合肽(圖23及25-28)。另外，解析與具有經修飾Pep2-8之氟-W6 (化合物3)共結晶之溝結合肽之結構(圖24)。X射線結構結果展示於表3-5中。 針對化合物2所獲得之結構(圖20)清晰展示融合肽之結合模式。融合肽之Pep2-8部分在PCSK9表面上佔據與先前所報導Pep2-8:PCSK9複合物結構相同之位置(Zhang等人，J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55；PDB登錄號4NMX)。特定而言：F3之肽主鏈與PCSK9 F379之主鏈形成兩種氫鍵相互作用；肽V2之側鏈與PCSK9 C378及V380之側鏈形成非鍵結接觸；肽W6之側鏈與PCSK9 D238、A239及F379之側鏈形成非鍵結接觸，而肽Y9之側鏈與PCSK9 I369之側鏈形成非鍵結接觸。在圖20中所展示結構之蛋白質座標與4NMX之蛋白質座標疊加時，對應於Pep2-8之肽部分之主鏈原子之座標位置具有0.36 Å之均方根變化。 轉向化合物2之C-末端融合部分，G14-S15-G16連接體大大延伸且與PCSK9ΔCRDΔ螺旋不形成特定接觸。兩個半胱胺酸殘基(C17及C28)明確發生二硫化物鍵結且儘管與PCSK9ΔCRDΔ螺旋不形成接觸，但涉及針對肽之Pep2-8部分之凡得瓦堆積(W6及Y9)。化合物2之殘基W18-I23採用容許該等殘基之側鏈與PCSK9ΔCRDΔ螺旋形成氫鍵相互作用(W18 Nε1H及N19側鏈CONH2 )、離子相互作用(R22胍)及凡得瓦接觸(W18、N19、L20及I23)之螺旋構形。此部分融合肽明確佔據與N-末端肽通常在野生型PCSK9結構中所佔據相同之位點。此新形成袋內襯有PCSK9ΔCRDΔ螺旋之下列部分：A239-V241、T339-D343、P364-I368、H391及V441-L444。融合肽至此袋之具體相互作用列示於表6中。Gly24之主鏈二面角(包含正φ角)將肽部分自G24至C28引導回C17。此區域大大延伸且與PCSK9ΔCRDΔ螺旋不接觸。因此，融合肽之C-末端部分(包含二硫鍵)似乎用作系鏈來限制構形撓性且促進插入部分(W18-I23)與PCSK9ΔCRDΔ螺旋之具體接觸。 亦獲得PCSK9ΔCRDΔ螺旋與化合物17之間之複合物之結構(圖22)。在此肽中，藉由6-胺基己酸代替化合物2之「GSG」連接體。此融合體之Pep2-8及延伸部分與PCSK9ΔCRDΔ螺旋之相互作用與化合物2嚴格相同。在此情形下，同樣，6-胺基己酸連接體不與蛋白質具有任何直接接觸。 化合物20亦適於與PCSK9ΔCRDΔ螺旋共結晶(圖21)。此肽之電子密度明確界定N-末端部分(對應於Pep2-8)及C-末端延伸體M19-R29，但並無連接體殘基G14、S15、G16、D17及L18之清晰電子密度。PCSK9之N-末端溝位點與肽延體伸中之殘基W21、N22、L23、R25及I16發生關鍵相互作用。至該等殘基之非鍵結接觸與化合物2表面上相同(表6)。在肽殘基P20與PCSK9中I369之側鏈及肽殘基L28與PCSK9中L444之側鏈之間觀察到其他凡得瓦相互作用。儘管此肽不含二硫鍵，但存在一組疏水性殘基(M19、V24及L29)，其一起群集於肽之頂表面(遠離PCSK9)且可負責C-末端延伸肽摺疊之成核或穩定，由此改良肽對PCSK9之結合親和力。 由延伸肽所利用之序列基序及相互作用暗示了P’螺旋與N-末端溝之自然相互作用。舉例而言，在化合物20中，延伸肽殘基P20、W21、N22、L23、R25及I26直接對應於自然PCSK9 P’螺旋之P155、W156、N157、L158、R160及I161。在PCSK9ΔCRDΔ螺旋與化合物20之複合物之座標與野生型PCSK9之彼等座標重疊時，對應於該6個胺基酸之主鏈原子之座標位置具有0.18 Å之均方根變化。此指出了「PWNxLRI」基序對於PCSK9之N-末端溝相互作用(經由自然P’螺旋或佔據此位點之其他外源性配體)之重要性。對於肽而言，C-末端甘胺酸殘基係對此基序之重要補充以將肽鏈引導回N-末端(以形成二硫鍵或上文針對化合物20所列示之疏水性團簇)；此幾何結構所需之主鏈φ角之正值在能量上不利於非甘胺酸殘基。 藉由PCSK9ΔCRDΔ螺旋與Pep2-8之複合物所形成之晶格亦使得可能形成具有佔據N-末端溝位點之額外肽之晶體。此情形之一該實例係化合物21 (圖25)；此12-殘基肽對應於化合物2及化合物17之C-末端部分。即使在不存在至Pep2-8肽之共價系鏈下，化合物21能夠與N-末端溝位點具有相同非鍵結接觸。實際上，在PCSK9之座標疊加於化合物21與化合物2共晶體結構之間時，接觸PCSK9之肽殘基之位置相差小於0.3 Å且該等殘基之主鏈均方根偏差為0.07 Å。化合物21之非接觸殘基(例如S9、Q10及G11)之一些原子與化合物2之等效原子移位多達2 Å，從而證實，非接觸殘基形成撓性連接體以限制肽構形。儘管在化合物21與Pep2-8之間並無共價鍵，但前者之半胱胺酸殘基與後者之W6及Y9存在凡得瓦接觸。另外，自化合物21之N-末端胺至Pep2-8之Y9之酚系羥基觀察到氫鍵。 藉由結晶學展示結合至N-末端溝位點之另一組肽含有二硫化物約束大環，在該二硫化物約束大環內係側接有兩個N-末端及兩個C-末端殘基之PWNLxRIG基序(例如化合物26，圖23；化合物30，圖26；化合物31，圖27；及化合物32，圖28)。對應於化合物31之L7之疏水性殘基涉及與肽之其他殘基之凡得瓦接觸且由此可幫助穩定結合構形。對應於化合物31之L12之白胺酸殘基涉及與PCSK9 之疏水性接觸(V241及L444)。對應於化合物31之L13之殘基不與PCSK9具有特定接觸；針對此殘基及兩個半胱胺酸殘基所觀察之變化構形指示作為連接體限制PWNLxRIG基序之構形之作用。 化合物26與化合物31相同，只是使用「SG」代替N-末端乙醯基。在使化合物26與PCSK9ΔCRDΔ螺旋及化合物3 (W6由6-氟色胺酸殘基代替之Pep2-8之經修飾形式)共結晶時，在化合物31與PCSK9ΔCRDΔ螺旋之間發現之相同相互作用亦觀察於化合物26與PCSK9之間(圖24)。相對於Pep2-8，添加氟會將化合物3對PCSK9之結合改良約3倍(表7)，此最可能係源於氟與PCSK9之A239、I369及P155之間之額外疏水性接觸。方法 PCSK9 Δ CRD Δ 螺旋之表現、純化及結晶 使用BaculoGold™系統如由製造商(BD Biosciences)所闡述生成具有人類PCSK9構築體R29-G452且具有改造TEV位點(殘基缺失Y166、R167；R165與A168之間之插入ENLYFQS序列，DNA 766281，PCSK9ΔCRDTEV7)之重組桿狀病毒。在10公升Wave®生物反應器中，於桿狀病毒培養基中之Sf9細胞中實施表現72小時。使用1 mM氯化鎳、2 mM氯化鈣處理含有所表現蛋白質之培養基且使用氫氧化鈉調節至pH 7.5。藉由低速離心去除所得沈澱物。使用Millipore切向流在10 kDa膜上濃縮上清液且緩衝液交換成含有10%甘油之PBS直至最終體積為1公升。使用5 mL HisTrap HP管柱(GE Healthcare)在平衡於含有10%甘油之PBS之AKTA Explorer上純化PCSK9ΔCRDTEV7。使用10 mL 0.3 M咪唑/PBS/10%甘油洗脫PCSK9ΔCRDTEV7，將該洗脫劑直接加載於在0.25 M NaCl、50 mM pH 8 Tris、10%甘油中平衡之Superdex 75 16/60管柱(GE Healthcare)上。 然後使用透析(Slidelyzer 10K (Thermo Scientific))針對0.15 M NaCl、50 mM pH 8.0 Tris、10%甘油及3 mM還原麩胱甘肽/0.3 mM氧化麩胱甘肽利用TEV蛋白酶(100 μL，2.5 mg/mL/10 mg蛋白質)將PCSK9ΔCRDTEV7在4℃下處理24小時。將所得PCSK9ΔCRDΔ螺旋PCSK9濃縮至2 mL且通過Superdex 75 16/60管柱中之1 M NaCl、25 mM pH 8.0 Tris。使用質譜及SDS PAGE分析蛋白質。然後將最終池緩衝液交換(NAP5, GE Healthcare)至0.2 M NaCl、40 mM pH 8.0 Tris、5%甘油中並針對結晶試驗使用10 kDa截止選擇濃縮器濃縮至10 mg/mL。 藉由將儲備PCSK9ΔCRDΔ螺旋蛋白質與2倍莫耳過量之肽在4℃下一起培育過夜來開始使用PCSK9ΔCRDΔ螺旋及一或兩種肽之共結晶試驗。結晶試驗採用市售稀疏矩陣篩選及Mosquito液體處置器(Labtech)。最佳晶體在18℃下於坐滴中使用0.2 M乙酸鈣、0.1 M pH 8.0 Tris及20% (w/v) PEG 6000生長為薄六角形片。使用經30% (v/v)甘油強化之結晶儲槽處理所收穫晶體且突然浸漬於液氮中，然後收集數據。PCSK9ΔCRDΔ 螺旋與肽之複合物之結構測定 截短PCSK9ΔCRDΔ螺旋之所有肽複合物結晶於空間群P32 21中。在每一情形下，在110 K下使用約1 Å波長之X射線自單一冷凍保藏晶體收集繞射數據(表3-5)且使用HKL2000 (Otwinowski及Minor, Methods in Enzymol, 1997. 276:第307-326頁)或XDS (Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2):第125-32頁；Vonrhein等人，Acta. Crystallogr., 2011. D67:第293-302頁)及CCP4套組之元件(Winn等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4):第235-242頁)簡化。使用分子代替利用PDB登錄代碼為4NMX之短形式PCSK9 (PCSK9ΔCRD)作為搜尋探針來解析第一結構。所有結構使用來自用於RFREE計算之細化分離之單組反射。細化(Murshudov等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67:第355-367頁；Adams等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2):第213-21頁；Bricogne等人，BUSTER 2.11.2版，2011, Global Phasing Ltd.: Cambridge, United Kingdom)包含用於較高解析度結構之自動化水佈置及位移因子之TLS處理。使用Coot實施電子密度圖之模型構建及檢查(Emsley等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 4):第486-501頁)。表 3
Figure 106121106-A0304-0004
 表 4
Figure 106121106-A0304-0005
 表 5
Figure 106121106-A0304-0006
 表 6
Figure 106121106-A0304-0007
 實例 4 ：藉由表面電漿共振 (SPR) 測定之溝結合肽之結合親和力。 結果 Pep2-8-溝結合融合肽-化合物2、化合物17、化合物19及化合物20以高親和力結合至PCSK9及PCSK9Δ螺旋(表7)。PCSK9Δ螺旋結合之高親和力(Kd 值達到亞毫微莫耳範圍) (化合物17、化合物19及化合物20；表7)與展示融合肽之Pep2-8及溝結合肽與PCSK9相互作用之結構結果(圖20中之化合物2；圖22中之化合物17；圖21中之化合物20)一致。 表7中所繪示之溝結合肽皆以μM或亞μM範圍內之Kd 值結合至PCSK9Δ螺旋。兩種對PCSK9Δ螺旋具有最高親和力之肽係化合物32 (Kd 0.21 μM)及化合物73 (Kd 0.167 μM)。一般而言，對PCSK9Δ螺旋之結合親和力強於 PCSK9，此乃因在PCSK9Δ螺旋構築體中不存在P’螺旋，從而使得肽能夠直接接近溝且並不與PCSK9中之P’螺旋具有任何競爭。另外，在Pep2-8中將W6代替為氟-W6 (表7中之化合物3)使得對PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合親和力增加數倍。 結果顯示，溝結合肽能夠以μM及亞μM範圍內之結合親和力結合至PCSK9及PCSK9Δ螺旋。表 7
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 方法 基於生物感測器之親和力分析 在20℃之分析溫度下實施所有分析。將試樣在10℃下保持於試樣架中以防止PCSK9蛋白變性。採用來自GE Healthcare之biacore T100及SensiQ Pioneer FE。除非另外陳述，否則所有試劑皆係自Sigma-Aldrich獲得。使用三個預計報告等效親和力/動力學參數之密切相關生物感測器方案來分析整個肽組。多個方案之需要與一些肽之聚集可能相關。緩衝液組合物極為保守，只是添加諸如二甲基亞碸(DMSO)、10 kDa聚乙烯基吡咯啶酮(PVP)及10 kDa羧基甲基化右旋糖酐(CM右旋糖酐)等增溶劑。方法 1 使用方法1分析Pep2-8及化合物19、20、26及28。將S NTA感測器晶片系列銜接至Biacore T100生物感測器系統中。將該系統置於運行緩衝液(亦即50 mM HEPES、0.15 M NaCl、0.005% T20，pH 7.5)中。將加六組胺酸標籤之蛋白質(亦即PCSK9或PCSK9Δ螺旋)親和力捕獲於單獨感測通道上，其中至少一個感測表面保持未塗覆以用作參考感測表面。在運行緩衝液中製備化合物試樣且注射。然後取出所有親和力結合複合物，隨後重新加載每一蛋白質以測試下一試樣。每一試樣循環由此係由5個如下所述針對每一測試試樣重複之依序注射。注射 1 將0.25 M乙二胺四乙酸(EDTA)經三分鐘以30 μL/分鐘之流速注射於所有感測通道中。此暴露會去除經由多組胺酸與Ni-NTA複合物之間之螯合鏈接結合之所有親和力複合物且亦去除任何污染金屬離子。注射 2 將鎳溶液(於去離子超純水中之1 mM Ni)經30秒以30 μL/分鐘之流速注射於所有感測通道中。Ni離子與預結合於基於水凝膠之感測表面內之氮基三乙酸形成複合物。在裝填Ni時，所得金屬-NTA複合物能夠以高親和力結合至加多組胺酸標籤之蛋白質。注射 3 將所製備PCSK9Δ螺旋蛋白質(3 μg/mL，於運行緩衝液)經80秒以30 μL/分鐘之流速注射於單一Ni-NTA活化感測通道中。注射 4 將所製備PCSK9 (5 μg/mL，於運行緩衝液中)經20秒以30 μL/分鐘之流速注射於單一Ni-NTA活化感測通道中。在注射試樣之前，使基線穩定5分鐘。注射 5 使用高品質注射模式注射試樣。將化合物19及化合物20製備為6個連續雙倍稀釋液且將每一化合物以50 μL/分鐘之流速經100秒(900秒解離)注射於所有感測通道中。將Pep2-8、化合物26及化合物28製備為8個連續雙倍稀釋液且將每一者以50 μL/分鐘之流速經100秒(900秒解離)注射於所有感測通道中。對於該等化合物而言，整個試樣循環係由5個針對每一稀釋重複之連續注射組成。此試樣循環係在試樣台中針對每一試樣執行之重複序列。方法 2 使用方法2分析化合物2、化合物23及化合物17。此方與方法1相同，只是採用指定為單一循環動力學之替代注射模式(由製造商命名)，從而使得在每一試樣循環期間藉由使用5個增加濃度之依序注射液代替單一化合物稀釋注射液來完成全部稀釋系列。所得感測圖(亦即反應曲線)含有5個結合-解離期，每一期與每一注射化合物稀釋液有關。活化、捕獲及再生注射保持不變。稀釋化合物以自100 nM (對於化合物17)及100 μM (對於所有其他化合物)製備5份連續雙倍稀釋液。另外，在分析中向所有緩衝液中添加CM右旋糖酐(Sigma-Aldrich產品號86524)直至最終濃度為2 mg/mL以進一步降低至表面之非特異性結合。然而，使用及相同方案相同單一循環動力學分析化合物17，只是省略CM右旋糖酐，其因此肽不存在非特異性結合而非所需。自動雙重參照所記錄所有結合曲線且利用1:1模型使用來自GE Healthcare之BIAevaluation分析軟體進行擬合。方法 3 使用方法3分析化合物31、化合物32、化合物33、化合物34、化合物3、化合物73、化合物50、化合物52、化合物51、化合物55、化合物82、化合物45、化合物96、化合物53及化合物97。考慮到一些肽往往發生聚集，故決定藉由採用以SensiQ Pioneer FE銷售之替代生物感測器技術來進一步改良肽分析。此儀器在可採用之表面化學、流動注射分析及方法方面類似於Biacore AB生物感測器，只是其亦提供在感測表面上滴定化合物之方法。使用毛細管(Quinn, Analytical Biochemistry 421: 391, 2012；Quinn, Analytical Biochemistry 421: 401, 2012)及類似習用表面電漿共振基生物感測器來進行滴定，其產生報告結合動力學及親和力之結合反應曲線，但不同於其他技術，其報告由化合物梯度特徵對分子量之依賴性所致之化合物聚集之說明。 在此情形下，藉由標準直接胺偶合根據製造商推薦將PCSK9及PCSK9Δ螺旋固定於COOHV感測器晶片上，從而使共價結合至單獨感測通道之每一者過量2000RU。再調配運行緩衝液以進一步減小聚集及至感測表面之非特異性結合且含有50 mM pH 7.2 HEPES (含有0.15 M NaCl、3 mg/mL PVP、1 mM EDTA、0.005% Tween® 20、1 mg/mL CM右旋糖酐及5% DMSO)。在運行緩衝液中以20 μM製備每一化合物，超音波處理15 min，且然後製備每一者5 μM試樣，注意使最終試樣之二甲基亞碸之濃度與運行緩衝液相匹配。藉由梯度注射分析每一化合物之20 μM及5 μM稀釋液。使用一步驟(OneStep)注射模式在100 μL/min之流速及200秒解離時間下實施注射。所有結合曲線皆展現快速動力學，從而暗示結合曲線代表穩態反應。因此，雙重參照所有記錄結合曲線且利用1:1親和力模型使用來自 SensiQ Pioneer Inc之Qdat數據分析軟體進行擬合。實例 5 ： 溝結合肽恢復 HepG2 細胞上之 LDLR 。 結果 使用rec.PCSK9處理HepG2細胞可將LDLR表面濃度減小約75% (圖29及30)。Pep2-8本身能夠在約5-10 μM濃度下將LDLR濃度恢復至50%。Fab33更為強力，其在介於0.1-0.2 μM之間之濃度下即達成50% LDLR恢復。兩種溝結合肽Pep2-8p4 (化合物19：Ac-T V F T S W E E Y L D W V G S G C R L P W N L Q R I G L P C-NH2 )及Pep2-8p7 (化合物20：Ac-T V F T S W E E Y L D W V G S G D L M P W N L V R I G L L R-NH2 )之功效遠大於Pep2-8，其分別在約0.5 μM及1-5 μM之濃度下將LDLR濃度恢復至50% (圖29及30)。方法 使用 HepG2 細胞之細胞表面 LDLR 分析 將HepG2細胞(ATCC；Manassas, VA)以1 × 105 個細胞/孔接種至48孔板(Corning；Corning, NY)中之高葡萄糖培養基(DMEM, Gibco；Carlsbad, CA，含有2 mM麩醯胺酸(Sigma)、青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin) (Gibco)及10% FBS (Sigma；St. Louis, MO))中且培育過夜。然後將培養基更換為含有10%脂蛋白缺失血清之DMEM (LPDS, Sigma)。在24 h之後，將15 μg/mL PCSK9與肽或Fab33一起培育30 min，添加至細胞中且在37℃下培育4 h。使用PBS沖洗細胞且使用於PBS中之細胞解離緩衝液(Gibco)剝離。在離心之後，將再懸浮細胞與1:20抗LDLR抗體(Progen Biotechnik；Heidelberg, Germany)在冰上一起培育10 min。然後使用PBS洗滌試樣並與1:200稀釋之山羊抗小鼠IgG (H + L) Alexa Fluor 488 (Invitrogen；Carlsbad, CA)在冰上一起培育5 min。在兩次PBS洗滌之後，將細胞再懸浮於含有2.5 μg/mL碘化丙啶之PBS中且在雙重雷射流式細胞儀(FACScan, Becton Dickinson；Franklin Lakes, NJ)上分析。使用相對螢光單位(RFU)量化HepG2細胞表面上之LDLR表現程度。將細胞表面LDLR濃度表示為在不存在PCSK9 (=對照)下所量測LDLR濃度之百分比。實例 6 ： 溝結合肽增加 FXIa 調介之 P’ 螺旋蛋白水解 結果 溝結合肽化合物26及化合物29之不同之處僅在於具有游離N-末端(化合物26)或乙醯化N-末端(化合物29)。化合物26之所測定晶體結構(實例3)展示，肽結合至PCSK9之N-末端溝(圖23)。此肽以29 μM之Kd 值結合至PCSK9，如在SPR實驗中所測定(實例4，表7)。圖31中之結果顯示，類似於Fab33，兩種溝結合肽皆加速裂解反應，從而幾乎完全裂解P’螺旋。在不存在FXIa下，兩種肽並無效應(圖31)。 在另一實驗中，使用線性肽化合物112 (n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2 )及其衍生物化合物118 (n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLTR-NH2 )，後者具有高精胺酸代替精胺酸。引入高精胺酸以防止藉由FXIa進行裂解，此乃因FXIa之S1袋不能容納經修飾或非天然精胺酸殘基。實際上，FXIa裂解之時程展示，含有高精胺酸之肽化合物118在6 h時程中保持完整，如藉由LC-MS所測定(圖32)。與之相比，含有精胺酸之肽化合物112以時間依賴性方式發生裂解：在1 h之後裂解34%且在6 h之後裂解76%，如藉由LC-MS所量化(圖33)。圖34展示，與肽化合物112相比，將K9-AAA與不可裂解肽化合物118一起培育使得FXIa較高程度地裂解P’螺旋。 結果顯示，所測試肽化合物26、化合物29、化合物112及化合物118能夠以類似方式增加在R160-I161處P’螺旋之FXIa調介之裂解，如Fab33所展示。該等肽中之一者(化合物26；圖23)之晶體結構展示，肽佔據通常含有P’螺旋之N-末端溝位點。因此，類似於Fab33，該等肽使P’螺旋保持於噴射「出」構形，此變得易於FXIa裂解。此與圖12中所繪示之機制一致。方法 FXIa 裂解分析 將2.6 μM PCSK9-R167A:R215A:R218A (PCSK9-AAA)與50 nM FXIa及50 μM化合物26、50 μM化合物29、50 μM化合物112或50 μM化合物118在Tris緩衝液中一起培育。使用Fab33 (2 μM)或Pep2-8 (4 μM)作為對照。在在室溫下培育20 h (化合物26及化合物29)或6 h (化合物112及化合物118)之後，藉由SDS-PAGE分析試樣且使用iBlot (Invitrogen)轉移至硝基纖維素膜中。然後使用iBind (Invitrogen)利用針對PCSK9 N-末端肽(153 SIPWNLERITPPRYRA168 )產生之多株兔抗體(1:3000)、隨後利用HRP偶聯驢抗兔抗體(1:5000, GE Healthcare)探測蛋白質。藉由ECL (GE Healthcare)檢測PCSK9信號且藉由自動射線攝影術進行觀察。用以測定溝結合肽之裂解之液相層析 - 質譜 (LC-MS) 為測定在肽化合物112中之精胺酸之後或在肽化合物118中之高精胺酸之後FXIa調介之裂解，在0 h、1 h、6 h獲取10 μl來自FXIa裂解分析(參見上文)之反應試樣且藉由分析型LC-MS 在配備有PLRP-S反相管柱之Agilent 1260 infinity系統上分析。藉由使用所計算分子量且藉由量測曲線下面積來測定肽裂解。實例 7 ： 溝結合肽之合成及基於 TR-FRET 之分析中之活性 結果 確立分析以量測分子至LDLR結合位點亦及至N-末端結合溝之結合。前者係基於TF-FRET分析以量測LDLR之EGF(A)結構域至PCSK9之締合(「PCSK9/EGF(A)結合分析」)，而後者係基於TR-FRET分析以量測Ab20至PCSK9Δ螺旋之結合(「PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析」)。亦在反向篩選分析中使用在N-末端具有His標籤且在C-末端具有Fc結構域之EGF(A)蛋白測試分子之非特異性結合效應(「His-EGF(A)-Fc反向篩選」)；PCSK9結合之真正抑制劑應在反向篩選中不展示TR-FRET之任何減小。 首先合成肽以重現含有錨定肽、連接體及C-末端延伸肽之噬菌體源肽序列。例示為化合物1之系列(表8A)在PCSK9/EGF(A)結合分析中對Pep2-8具有相當活性，但在PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析中具有優良活性，從而指示C-末端延伸佔據N-末端溝位點。此肽之截短物(化合物4-7)在PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析中遞增地減小功效，從而指示與N-末端溝具有較弱相互作用。使用各種肽及非肽連接體來連結錨定肽及延伸肽，同時維持PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析中之功效。 肽化合物20例示藉由噬菌體顯示所鑑別之不同序列。在此情形下，PCSK9/EGF(A)結合分析中之抑制相對於Pep2-8顯著改良且PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析中之抑制發生於低毫微莫耳濃度下。 亦分析具有二硫化物連接C-末端延伸之錨定肽(表8B)。在N-末端半胱胺酸與「PWNLxRIG」基序之間具有2個殘基之肽(化合物19、化合物25及化合物38)皆係PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析中之強力抑制劑，從而指示與實例3中所闡述N-末端溝位點之相互作用有助於該等肽之結合。化合物19亦係PCSK9/EGF(A)結合分析之強力抑制劑。緊接N-末端半胱胺酸殘基具有「WNLxRIG」基序之肽亦闡述於表8B中。使用4-胺基酸連接體之實例(化合物13及化合物14)係PCSK9/EGF(A)及PCSK9Δ螺旋/Ab20分析形式中之強力抑制劑。非肽連接體在兩個分析中維持功效(化合物15、化合物17及化合物24)。去除二硫鍵會促進此系列中C-末端截短之產生；此減小PCSK9/EGF(A)分析中之活性，但PCSK9Δ螺旋/Ab20分析中之活性得以維持，直至截短超出WNLxRIG基序之異白胺酸為止。 亦在無Pep2-8錨定組分下合成C-末端延伸肽且亦測試於生物化學分析中。線性延伸肽列示於表8C中。14殘基肽化合物35係此系列之先祖且在PCSK9/EGF(A)分析中不展現任何抑制(結合高達50 μM)，但在PCSK9Δ螺旋/Ab20分析中以4.8 μM之IC50 進行抑制。在此肽中使用丙胺酸代替個別胺基酸強調了WNLxRIG基序之重要性—所有該等丙胺酸取代皆廢除抑制。類似地，在自此肽之N-或C-末端之截短接近WNLxRIG基序時，該等截短顯著減小抑制程度。可藉由使用戊酸部分代替封端乙醯基來改良N-末端截短中之抑制。因此，10殘基肽化合物111及化合物112皆在PCSK9Δ螺旋/Ab20中以小於10 μM之IC50 值進行抑制。使用高精胺酸代替WNLxRIG基序中之精胺酸側鏈會將抑制增加5倍(化合物118；PCSK9Δ螺旋/Ab20，IC50 為1.4 μM)。 二硫化物環化之延伸肽亦在PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析中展示可量測抑制(表8D)。因此，化合物32 (在N-末端半胱胺酸與WNLxRIG基序之間具有3個殘基之延伸肽系列之實例)在PCSK9Δ螺旋/Ab20分析中具有約1 μM之IC50 。針對此系列實施之丙胺酸代替掃描亦指示WNLxRIG基序中之殘基對於維持強力抑制之重要性。代替WNLxRIG基序內之D立體化學胺基酸亦使得損失抑制。離胺酸殘基耐受於WNLxRIG基序之「x」位置(化合物67；PCSK9Δ螺旋/Ab20，IC50 為0.7 μM)，且使用高精胺酸代替基序之「R」亦使得改良抑制(化合物117；PCSK9Δ螺旋/Ab20，IC50 為0.33 μM)。使用有機連接體代替C-末端半胱胺酸前面之4個殘基可去除抑制(化合物83、化合物84、化合物85及化合物86)，而使用有機連接體代替C-末端半胱胺酸前面之3個殘基在PCSK9Δ螺旋/Ab20分析中得到較弱但可檢測之抑制(化合物116、化合物121)。 亦發現一系列在N-末端半胱胺酸與WNLxRIG基序之間具有單一殘基之二硫化物環化肽在PCSK9Δ螺旋/Ab20分析中以低微莫耳範圍內之IC50 值進行抑制，例如參見化合物63。使用適當環外取代時，來自此系列之化合物亦在PCSK9/EGF(A)分析中具有弱抑制(例如化合物88；PCSK9/EGF(A)分析，IC50 為17.9 μM)，但該等化合物亦在His-EGF(A)-Fc反向篩選分析中展示一定弱反應，從而表明其效應中可存在某一非特異性結合要素。 最後，對於在N-末端半胱胺酸與WNLxRIG基序之間不插入殘基之二硫化物環化肽之系列而言，使用適當N-末端取代觀察到PCSK9Δ螺旋/Ab20分析中之抑制(例如化合物98；PCSK9Δ螺旋/Ab20分析，IC50 為3.6 μM)。表 8A
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 表 8B
Figure 106121106-A0304-0010
 表 8C
Figure 106121106-A0304-0011
 表 8D
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 *一些抑制可見於最高濃度下，但不足以容許擬合IC50 。 製備如表8E中所展示之其他化合物且測試。表 8E
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方法 肽合成方法 使用熟習此項技術者已知之標準茀基甲氧基羰基(Fmoc)/第三丁基(tBu)固相方法合成肽且純化(Chan, W. C., White, P. D.編輯，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; Oxford University Press: New York, 2000.；Albericio, Fernando; Tulla-Puche, Judit; Kates, Steven A. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry，第3卷，第349-369頁，2011)。PCSK9 TR-FRET 結合分析方法 使用一組時間解析螢光共振能量轉移(TR-FRET)結合分析評估化合物抑制至PCSK9之結合之能力。PCSK9/EGF(A)-Fc結合分析評價化合物與EGF(A)-Fc競爭結合至加His標籤之全長PCSK9之能力。PCSK9Δ螺旋/Ab20結合分析評估化合物與Ab20競爭結合至加His標籤之PCSK9Δ螺旋構築體中之N-末端溝區域之能力。Ab20係親和力成熟Ab YW508.20.33之低親和力前體抗體YW508.20 (Wu等人，美國專利第9,266,961號)。His-EGF(A)-Fc結合分析用作反向篩選來鑑別干擾分析檢測系統之化合物。PCSK9結合分析中之信號生成取決於使PCSK9上之His標籤與配體上之Fc標籤緊密相鄰之結合相互作用。抗His-APC結合至His標籤，且抗Fc-銪結合至Fc標籤。在該兩種抗體緊密相鄰且使用340 nm下光輻照時，銪得以激發且發射615 nm下能量。此能量由APC吸收且發射為665 nm下光。與配體競爭之化合物減小能量轉移且由此在665 nm下發射。在反向篩選中之His-EGFA-Fc分子中，兩種標籤總是緊密相鄰，由此665 nm下發射之任何減小係由檢測系統之干擾所致。 溶解化合物且在DMSO中製備稀釋液。將40 nl測試化合物、參考化合物或DMSO對照添加至1536孔黑色COC分析板(Aurora微量板，Whitefish, MT)之孔中，隨後添加於分析緩衝液(50 mM pH 7.5 Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2 、0.01% Tween-20、0.1%牛γ球蛋白及蛋白酶抑制劑混合劑)中之2 μL測試蛋白質(PCSK9、PCSK9Δ螺旋或His-EGF(A)-Fc)加上40 nM抗His-APC (PerkinElmer, Waltham, MA)。將板離心以混合孔內容物且培育30 min。然後添加2 μL配體(於分析緩衝液中之EGF(A)-Fc或Ab20或單獨緩衝液，用於反向篩選)與4 nM抗Fc-銪(PerkinElmer)，且在短暫離心以混合孔內容物後將板培育2 h。在ViewLux讀數儀(PerkinElmer)上讀取TR-FRET信號，其中使用340 nm下激發及615及665 nm下發射且在激發與發射量測之間具有50-μs時間延遲。將TR-FRET比率計算為665 nm下之螢光發射除以615 nm下之螢光發射。將隨化合物濃度而變化之正規化TR-FRET比率進行繪圖，且使用4參數邏輯回歸測定IC50 值。某些分析參數匯總於表9中。表 9
Figure 106121106-A0304-0013
 實例 8 ：將溝結合肽轉化成 PCSK9 拮抗劑。 缺失化合物35之前三個殘基(Asp/Leu/Met)對至PCSK9Δ螺旋之結合具有極小影響，如在Ab20分析中及藉由SPR所測定(表10，化合物50-52)，此與化合物20之晶體結構中之Asp/Leu之無序狀態一致(圖21)。表 10
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 重要EGF(A)穩定殘基Pro4之額外消除產生具有10倍減小之結合親和力之10殘基肽(表10，化合物53)。高精胺酸取代將結合親和力改良14倍(表10，化合物192)。結合至PCSK9ΔCRDΔ螺旋之化合物192在2.20 Å解析度下之晶體結構圖解說明藉由高精胺酸達成之親和力改良(圖35)。與化合物20中之天然Arg殘基及自然P’-螺旋相比，高精胺酸側鏈發生倒轉且胍鎓基團此時經最佳定位以與PCSK9殘基Asp343嚙合成鹽橋。 構築自化合物53之N-末端Trp具有3-6個胺基酸延伸之噬菌體集合庫。為避免出現位於N-末端Trp前面之EGF(A)穩定Pro殘基且為提供最大延伸序列之撓性，Trp殘基前面之此第一位置固定為Gly或Ser殘基。針對PCSK9Δ螺旋淘選肽顯示噬菌體且鑑別出若干具有5及6個延伸殘基之親和力改良結合劑。其皆共有三個胺基酸基序Phe/Tyr-Pro-Gly。使用高精胺酸取代合成5種肽且測定其抑制功效(表11)。表 11
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 與化合物192相比，化合物227-231具有改良之結合親和力(基於Ab20分析結果)及針對EGF(A)-Fc之抑制活性(表11)。化合物228及229最強力且抑制EGF(A)-Fc以及LDLR-Fc結合(圖36，表11)。化合物229之較佳功效與在SPR實驗中所測得其對PCSK9具有較強結合親和力一致(對化合物229及228，分別為KD 0.94 ± 0.01 μM對KD 2.8 ± 0.05 μM)。在HepG2細胞中，化合物229以濃度依賴性方式抑制PCSK9調介之LDLR降解，從而將表面LDLR濃度恢復至最大70% (圖37)。不完整活性很可能係由化合物之溶解性限制所致。與親代肽(化合物192)相比，MESFPG延伸(化合物229)將對PCSK9Δ螺旋之親和力改良6倍以上(表11)，此增加可歸因於與PCSK9Δ螺旋之額外相互作用或歸因於WNLV(hR)IGLLR肽部分之螺旋構形之穩定化，此將減小對結合之熵懲罰。為測試此假設，使用核磁共振(NMR)光譜研究化合物192及229在溶液中之構形偏好。儘管化合物229不在溶液中採用較佳構形，但其似乎傾向於在跨越殘基7WNLV(hR)IGL14之區域中形成α螺旋結構。較少弱中等範圍NOE接觸dNα(i,i+3)及dαβ(i,i+3) (其係α螺旋結構之特性)之檢測表明，僅少量化合物229往往在序列之此區域中形成α螺旋，由此有助於弱中等範圍NOE之檢測(圖38)。亦針對化合物192觀察到類似NOE圖案(圖38)，從而表明，即使在並無MESFPG延伸下，化合物192亦保留其形成α螺旋結構之傾向且針對化合物229所觀察之親和力改良很可能源自MESFPG與PCSK9Δ螺旋之間之額外接觸。 為理解MESFPG延伸對於親和力增加之作用以及其拮抗性質，藉由使用替代結晶系統利用PCSK9Δ螺旋及CRD結合Fab7G7來獲得結合肽之晶體結構(圖39-41)。此系統中之晶體生長不存在任何Pep2-8且並不存在干擾肽至溝位點之結合之分子間接觸。2.90 Å結構展示，6個N-末端殘基MESFPG並非以「直線」方式朝向EGF(A)結合位點延伸，而是對於所鑑別「FPG」基序之三個殘基及隨後核心肽之Trp採用I型α-轉角。自Met1殘基之主鏈羰基氧原子至Gln342及自Ser3側鏈至Asp367存在與PCSK9之兩個新H鍵(圖39)。另外，化合物229之N-末端部分包含由來自Met1、Phe4、Trp7、Val10及hArg11之側鏈所提供之肽內疏水性接觸之集合體，該集合體可穩定結合構形(圖40)且其皆由電子密度充分指示(圖42)。Met1之雙重作用(H-鍵結、疏水性核心)可闡釋不存在N-末端Met殘基之較短化合物227之大約低3倍之抑制活性(表11)。肽之拮抗作用源於Pro殘基，該Pro殘基殘基基於建模實踐預計在空間上撞擊EGF(A)殘基 Leu298、Asp299及Asn300 (圖41)。4種其他拮抗肽中之FPG或YPG基序之存在指示，其皆採用類似α-轉角構形且藉由與針對MESPFG肽所闡述相同之機制拮抗EGF(A)至PCSK9之結合。方法 噬菌體顯示融合肽集合庫之構築及結合選擇 使用標準Kunkel誘變方法來構築集合庫(Kunkel等人，Methods Enzymol 154, 367-82 (1987))。藉由將2-5個殘基之隨機化肽融合至肽(G/S)WNLVRLGLLR之N-末端來構築WNLVRIGLLR融合肽集合庫。藉由連續簡並密碼子NNK來編碼隨機化肽，藉由RGT (R=A/G)編碼Gly/Ser。集合庫之最終多樣性為2.5 × 1010 。針對生物素化PCSK9Δ螺旋淘選WNLVRIGLLR N-末端延伸集合庫之噬菌體池。在4輪結合選擇之後，在高通量斑點噬菌體ELISA中使用板固定PCSK9或PCSK9Δ螺旋作為靶來分析個別噬菌體純系(Tonikian等人，Nat Protoc 2, 1368-86 (2007))。相同噬菌體顆粒至NeutrAvidin之結合信號可視為非特異性結合(「雜訊」)。至PCSK9或PCSK9Δ螺旋之結合信號超過0.4且信號:雜訊比率＞ 2之噬菌體純系可視為陽性且實施DNA序列分析。其他蛋白質試劑 如Zhang等人，J Biol Chem 289, 942-55 (2014)及Zhang等人，J Mol Biol 422, 685-96 (2012)中所闡述來製備LDLR-Fc及EGF(A)-Fc融合蛋白。用於量測細胞表面 LDL 受體之 HepG2 分析。 如先前所闡述在HepG2細胞分析中量測化合物229對PCSK9調介之LDL受體降解之效應(Zhang等人，J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)。在添加至細胞中之前，將各種濃度之肽與15 μg/mL PCSK9在0.5% DMSO存在下一起預培育30 min。在4 h培育之後，處理細胞以用於如(Zhang等人，J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)所闡述藉由流式細胞術量測LDL受體表面濃度(圖37)。時間解析螢光共振能量轉移 (TR-FRET) 分析。 在黑色1536孔分析板(MaKO, Aurora®微量板，Whitefish, MT)中，將40 nL於DMSO中之肽與2 μL加His標籤之PCSK9加上抗His-別藻藍蛋白在分析緩衝液(50 mM pH 7.5 Tris-HCl、150 mM NaCl、2 mM CaCl2 、0.01% Tween®-20、0.1%牛γ球蛋白及蛋白酶抑制劑混合劑)一起預培育30 min。然後添加2 μL於分析緩衝液中之加Fc標籤配體及抗Fc-銪且培育2 h。每一分析之PCSK9及配體條件如下：將10 nM C-末端加(His)8 標籤PCSK9及12 nM EGF(A)-Fc用於EGF(A)分析，將10 nM C-末端加(His)8 標籤PCSK9及2.5 nM LDLR-Fc用於LDLR分析，將1.25 nM C-末端加(His)8 標籤PCSK9Δ螺旋及0.75 nM Ab20用於Ab20分析，且將單獨之2 nM His-EGF(A)-Fc用於反向篩選。在所有分析中，分別使用20 nM及2 nM之抗His-別藻藍蛋白及抗Fc-銪。使用340 nm下激發及671 nm及618 nm下發射來量測螢光。將TR-FRET比率計算為671 nm下之螢光/618 nm下之螢光。將該等比率正規化至對照且針對肽濃度繪圖以測定IC50 值(Screener分析儀，Genedata, Basel, CH)。在三個單獨實驗中評估肽，且每一分析使用10點滴定且在每一濃度中n = 2。所呈現值係三個獨立實驗之平均值± S.D.。用於 PCSK9Δ 螺旋 /Fab7G7 之結構測定 藉由木瓜蛋白酶裂解使用標準技術自抗體7G7 (Lipari等人，J Biol Chem 287, 43482-91 (2012))來製備Fab7G7並使用蛋白質G Sepharose®親和力層析純化。以等莫耳濃度混合Fab7G7及PCSK9Δ螺旋且使用Superdex™ 200粒徑篩析層析分離複合物。對濃縮之PCSK9Δ螺旋/Fab7G7複合物(5 mg/mL)實施高通量結晶篩選。據觀察，晶體自含有2.8 M NaOAc、0.1 M pH 7.0 Tris之高鹽條件生長。18℃下之坐滴中之最佳化條件使用2 μL複合物與2 μL 4 M乙酸銨、0.1 M pH 8.5 Tris及3% (v/v) 1,8 二胺基辛烷。然後將PCSK9Δ螺旋/Fab7G7之晶體浸泡於經化合物229飽和之儲槽溶液中5天。經由3.4 M pH 7.0丙二酸鈉溶液吹掃晶體且藉由突然浸漬於液氮中來保留用於數據收集。在110 K下使用1.0000 Å X射線在ALS光束線5.0.2下收集繞射數據且藉由標準方法簡化至2.90 Å(表12)。表 12
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 在空間群I222中藉由分子代替(McCoy等人，J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007))使用PCSK9 (PDB登錄號2QTW)及來自PDB之小鼠Fab (登錄代碼5EOQ)來解析結構且在不對稱單元中含有單一複合物。使用衍生自雜交瘤細胞之DNA序列測定少數密碼子延伸至恆定區中之Fab7G7可變結構域序列。此序列及電子密度之指示允許將抗體7G7分配為IgG2b/Vκ。Fab7G7結合富C-末端半胱胺酸結構域中之PCSK9Δ螺旋(CRD)。清晰電子密度允許添加肽及細化(Bricogne, G.等人，BUSTER 2.11.2版。(Global Phasing Ltd., Cambridge, United Kingdom, 2011)) (表12)。最終細化模型在最有益Ramachandran空間中具有96%之主鏈扭轉角。肽與 PCSK9ΔCRDΔ 螺旋之複合物之結構測定。 如上文針對PCSK9Δ螺旋所闡述，將TEV蛋白酶裂解位點改造至先前所闡述桿狀病毒構築體PCSK9 Q31-G452中(PCSK9ΔCRD) (Zhang等人，J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)。表現此構築體且基本上如(Zhang等人，J Biol Chem. 2014 Jan 10;289(2):942-55)所闡述進行純化，且然後藉由TEV蛋白酶如上文針對PCSK9Δ螺旋所闡述進行處理以產生缺乏P’-螺旋之PCSK9ΔCRDΔ螺旋。利用市售稀疏矩陣篩選使用PCSK9ΔCRDΔ螺旋(10 mg/mL，於0.2 M NaCl、40 mM pH 8.0 Tris、5%甘油中)及肽(2倍莫耳過量)實施共結晶試驗。最佳晶體在18℃下於坐滴中使用0.2 M乙酸鈣、0.1 M pH 8.0 Tris及20% (w/v) PEG 6000生長為薄六角形片。藉由使用經30% (v/v)甘油強化之結晶儲槽進行處理且突然浸漬於液氮中來保存收穫晶體以用於數據收集。 對於含有化合物192之複合物(表12)而言，在110 K下使用0.97946 Å X射線在光屬線SSRL 12-2下自單一冷凍保藏晶體收集繞射數據且使用HKL2000 (Otwinowski等人，Methods in Enzymol 276, 307-326 (1997))或XDS (Kabsch, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-32 (2010)；Vonrhein等人，Acta. Crystallogr. D67, 293-302 (2011))及CCP4套組之元件(Winn等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2011. 67(Pt 4):第235-242頁)簡化。使用分子代替(McCoy等人，J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007))利用PDB登錄代碼為4NMX之PCSK9ΔCRD作為搜尋探針來解析結構。使用自用於RFREE計算之細化分離之單組反射。細化(Murshudov等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 355-367 (2011)；Bricogne等人，BUSTER 2.11.2版。(Global Phasing Ltd., Cambridge,United Kingdom, 2011)；Delaglio等人，J Biomol NMR 6, 277-93 (1995))包含自動化水佈置及位移因子之TLS處理。在最有益之Ramachandran空間中，最終細化模型具有97%之主鏈扭轉角。使用Coot實施電子密度圖之模型構建及檢查(Emsley等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486-501 (2010))。藉由表面電漿共振 (SPR) 量測肽結合至 PCSK9 及 PCSK9Δ 螺旋之親和力。 將Biacore™ T100或Biacore™ 8K調節至20℃。將系統置於由25 mM pH 7.5 HEPES、0.15 M NaCl、0.005% (v/v) Tween® 20、0.2 mM 參(2-羧基乙基)膦且視情況含有0.1% (w/v)羧基甲基化右旋糖酐(平均MW為10 kDa)及0.2% (w/v) PEG (平均MW為3450 Da)之分析緩衝液中以減小潛在非特異性結合。在每一結合再生循環之後，藉由捕獲新PCSK9或PCSK9Δ螺旋且藉由利用組胺酸標籤及NTA-感測器晶片來分析肽。向表面裝填加(His)8 標籤PCSK9 (捕獲大約800個RU)。除化合物19及化合物20外，在100 μM (對於較小功效肽)及25 μM (對於強力肽)之分析緩衝液中製備肽之5份連續三倍稀釋液。在100 nM至3.1 nM之6份連續兩倍稀釋中分析化合物19及化合物20。藉由自低濃度至高濃度連續注射(50 μL/min，1 min)肽稀釋液來一式兩份分析所有肽。然後藉由注射0.5 M pH 8.0 EDTA自靶剝離表面。針對每一肽結合循環及空白對照循環重複此序列。 在針對所有肽(除化合物19及化合物20外)測試完整PCSK9 (化學生物素化形式)時，使用SA-感測器晶片(經鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)由製造商預塗覆)之不可逆捕獲證實其較為穩健。一式兩份記錄5份或更多份連續稀釋液之所有SPR數據，兩種融合肽除外，其產生極低之擬合誤差。雙重參照多循環數據(亦即每一濃度之單獨曲線)及單一循環數據(亦即使用每一濃度之連續注射之單一曲線)且使用BIAevaluation軟體擬合至相互作用模型。至PCSK9之肽結合會自簡單1:1結合相互作用模型產生偏差，此需要應用二態模型來測定Kd ，而與PCSK9Δ螺旋之相互作用證實充分吻合簡單1:1結合。針對快速解離肽之動力學曲率之定義較差且在該等情形下自穩態劑量反應繪圖來估計Kd 。使用相關標準誤差(該參數值之置信度之量度)來報告Kd 值。肽合成。 使用標準茀基甲氧基羰基(Fmoc)/第三丁基(tBu)固相方法來合成肽。對於含有二硫化物之肽而言，在碘及乙酸存在下環化粗製線性肽。使用鋅粉處理溶液可去除過量碘。使用水稀釋溶液且凍乾以得到粗製環狀肽。藉由製備型HPLC在C18管柱上使用三氟乙酸作為相對離子純化粗製肽直至純度＞ 85%，如藉由分析型LC-MS所測定。NMR 光譜。 在配備有三線共振低溫探針之Bruker DRX‑600上實施核磁共振實驗。藉由將化合物192及229溶於H2 O/CD3 CN (70:30)中直至最終濃度分別為0.52 mM及1.5 mM來製備用於NMR研究之試樣。在284 K下收集所有NMR光譜且內部參照至DSS (4,4-二甲基-4-矽雜戊烷-1-磺酸)。使用2D TOCSY、2D DQFCOSY及2D NOESY實驗之組合來分配質子共振。TOCSY及NOESY光譜之混合時間分別為60 ms及250 ms。使用TOPSPIN及NMRPipe/NMRDraw包處理NMR數據(Delaglio等人，J Biomol NMR 6, 277-93 (1995))且使用NMRViewJ進行分析(Johnson等人，J Biomol NMR 4, 603-14 (1994))。 熟習此項技術者應認識到，可對本文所陳述之闡釋性實例作出各種修改、添加、代替及改變，此並不背離本發明精神且由此可視為屬本發明範圍內。 序列表
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圖1展示Fab33:PCSK9複合物之晶體結構。 圖2展示，在Fab33:PCSK9複合物中，Fab33 CDR-H2環突出至PCSK9之N-末端溝中，從而指示PCSK9之P’螺旋已移動至N-末端溝外面。 圖3展示PCSK9之晶體結構(蛋白質資料庫編號：2QTW)，其中N-末端溝含有PCSK9之P’螺旋。 圖4展示，塞爾潘(serpin)抗凝血酶III (ATIII)及(在較小程度上) Kunitz結構域抑制劑抑肽酶(Aprotinin) (AP)能夠防止Fab33:PCSK9複合物之P’螺旋之蛋白水解裂解(13.2 mg/mL PCSK9, 19.8 mg/mL Fab33)。塞爾潘α1-抗胰蛋白酶(A1AT)不抑制裂解。藉由免疫印漬使用針對PCSK9 N-末端肽(153 SIPWNLERITPPRYRA168 )產生之多株兔抗體檢測裂解。 圖5展示對應於圖4中之免疫印漬之考馬斯(Coomassie)染色之SDS-PAGE。2個左泳道係不存在及存在DMSO之對照。 圖6展示，在與Fab33:PCSK9複合物一起培育時，絲胺酸蛋白酶FXIa及海普森(hepsin)裂解P’螺旋。所測試蛋白酶組包含海普森、α-凝血酶、FXa、FXIa、FXIIa及活化蛋白C (APC)。僅FXIa及海普森能夠在P’螺旋處裂解PCSK9。其亦在含有蛋白酶易感殘基R215及R218之「弗林蛋白酶(furin)裂解環」處發生裂解，如藉由出現約55 kDa帶所指示。添加阻斷抗體3D5 (Lipari等人，J Biol Chem. 2012 Dec 21;287(52):43482-91)可防止此後一裂解。 圖7展示測定PCSK9突變體PCSK9-R215A:R218A (K9-AA)及 PCSK9-R167A:R215A:R218A (K9-AAA)至LDLR之結合親和力之生物層干涉術實驗。感測圖展示分析物(PCSK9突變體)至固定LDLR胞外結構域之締合期及解離期。PCSK9-AA及PCSK9-AAA之所測定Kd 值分別為260 nM及214 nM。 圖8展示FXIa對PCSK9-R167A:R215A:R218A (K9-AAA)之時間依賴性裂解。K9-AAA在實驗時間段期間緩慢裂解，在48 h時達成完全裂解。每一時間點下之N-末端測序證實了R160-I161醯胺鍵處之裂解。 圖9展示FXIa對K9-AAA與Fab33之複合物之時間依賴性裂解。Fab33之存在可加速裂解反應。 圖10展示FXIa對K9-AAA與EGFA-Fc之複合物之時間依賴性裂解。藉由EGFA-Fc穩定N-末端溝中之P’螺旋可防止裂解。 圖11展示FXIa對K9-AAA與Pep2-8之複合物之時間依賴性裂解。藉由Pep2-8穩定N-末端溝中之P’螺旋可防止裂解。對照肽(Pep2-8-ctrl)並不防止裂解。 圖12展示固有不穩定P’螺旋之「平衡模型」，其可在「入」及「出」構形狀態之間轉變。在「出」狀態中，P’螺旋採用變得易於蛋白水解裂解(例如藉由FXIa)之非螺旋構形。該模型暗示，N-末端溝可易於由化合物(例如肽或有機分子)接近。在結合至溝後，該等化合物可使P’螺旋保持「噴射」構形。因N-末端溝鄰近LDLR結合位點，故溝結合化合物可藉由直接拮抗LDLR結合至PCSK9 (因化合物與LDLR-EGFA結構域之間之空間撞擊)而變為競爭性抑制劑。 圖13展示顯示Pep2-8或Pep2-8(V2A)之噬菌體至PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合。纈胺酸2至丙胺酸之單一突變會減小至兩種PCSK9構築體之結合親和力。Pep2-8(V2A)之減小但仍可檢測之至PCSK9之結合適於其作為錨定肽之應用，其係經由GSG連接體錨定至C-末端附接肽延伸集合庫。 圖14展示延伸肽之序列，該等延伸肽呈與Pep2-8(V2A)之融合肽形式且在噬菌體斑點ELISA分析中改良至PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合。未展示GSG連接體。 圖15展示其他延伸肽之序列，該等延伸肽呈與Pep2-8(V2A)之融合肽形式且在噬菌體斑點ELISA分析中改良至PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合。未展示GSG連接體。 圖16展示17種延伸肽之序列，在藉由缺失錨定序列(Pep2-8V2A)加上連接體中之第一Gly來再格式化圖14及15中所展示之融合肽之後，其保留至PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合。來自噬菌體斑點ELISA分析之結果展示於右側。 圖17展示自圖16中所展示17種延伸肽之所彙集軟隨機化集合庫之親和力成熟實驗所獲得具有強結合信號之10種陽性純系的序列。來自噬菌體斑點ELISA分析之結果展示於右側。兩個最左殘基係融合肽中之GSG連接體之一部分。 圖18展示使用來自圖17中列表之6種合成肽之標準噬菌體競爭ELISA之結果。4種肽以亞微莫耳或低微莫耳範圍內之IC50 值與噬菌體顯示肽競爭結合至PCSK9及PCSK9Δ螺旋。然而，該4種合成肽皆不與噬菌體顯示之Pep2-8競爭結合(圖形)，從而指示其不結合至PCSK9上之Pep2-8結合位點。對於陽性對照而言，使用合成Pep2-8，其以濃度依賴性方式抑制噬菌體顯示之Pep2-8至PCSK9之結合。n.d. =未檢測到抑制。 圖19展示來自兩種合成30胺基酸融合肽之競爭結合實驗之IC50 值。使圖18中所展示之兩種肽K9gvpep4及K9gvpep7經由GSG連接體(K9gvpep4及K9gvpep7之兩個N-末端殘基係「GSG」連接體之「SG」部分)融合至Pep2-8以產生合成肽Pep2-8_K9gvpep4及Pep2-8_K9gvpep7。該兩種融合肽以單數位毫微莫耳範圍內之IC50 值抑制顯示肽K9gvpep4及Pep2-8之噬菌體至PCSK9及PCSK9Δ螺旋之結合。 圖20展示結合有融合肽化合物2 (由經由GSG連接體連接至延伸肽CWNLKRIGSQGC之Pep2-8組成)之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖21展示結合有融合肽化合物20 (由經由GSG連接體連接至延伸肽DLMPWNLVRIGLLR之Pep2-8組成)之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構(未解析)。 圖22展示結合有融合肽化合物17 (由經由胺基己酸(Ahx)連接體連接至延伸肽CWNLKRIGSQGC之Pep2-8組成)之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖23展示結合有與Pep2-8共結晶之延伸肽化合物26之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖24展示結合有與Pep2-8(W6fl) (化合物3)共結晶之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之延伸肽化合物26之晶體結構。 圖25展示結合有與Pep2-8共結晶之延伸肽化合物21之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖26展示結合有與Pep2-8共結晶之延伸肽化合物30之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖27展示結合有與Pep2-8共結晶之延伸肽化合物31之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖28展示結合有與Pep2-8共結晶之延伸肽化合物32之PCSK9ΔCRDΔ螺旋之晶體結構。 圖29展示融合肽化合物19 (Pep2-8p4)對HepG2細胞上之LDLR恢復之效應。將HepG2細胞暴露於重組PCSK9 (P)可將表面暴露LDLR之濃度減小約75%，如藉由FACS所量測。添加化合物19 (0.1-5.0 μM)以濃度依賴性方式將LDLR濃度恢復至100%，且EC50 值約為0.5 μM。該實驗包含對照肽Pep2-8 (1.0-50 μM)及Fab33 (0.1-0.5 μM)。 圖30展示融合肽化合物20 (Pep2-8p7)對HepG2細胞上之LDLR恢復之效應。將HepG2細胞暴露於重組PCSK9 (P)可將表面暴露LDLR之濃度減小約80%，如藉由FACS所量測。添加化合物20 (1.0-50 μM)以濃度依賴性方式將LDLR濃度恢復至100%，且EC50 值約為1-5 μM。兩個實驗皆包含對照肽Pep2-8 (1.0-50 μM)及Fab33 (0.1-0.5 μM)。 圖31展示兩種溝結合肽-化合物26及化合物29對PCSK9-R167A:R215A:R218A (K9-AAA)之FXIa調介之裂解之效應。選擇條件，從而藉由單獨FXIa發生K9-AAA之最小裂解(左側第二泳道)。類似於使用Fab33之結果，兩種肽皆強烈加速P’螺旋之裂解，如藉由使用多株抗N-末端肽抗體所達成之減小信號所展示。將K9-AAA與兩種肽在不存在FXIa下一起培育並無效應(右側兩個泳道)。 圖32展示LC-MS結果以證實在肽化合物112中使用高精胺酸取代精胺酸殘基(化合物118)可防止肽由FXIa裂解。將PCSK9-R167A:R215A:R218A (K9-AAA)與化合物118一起培育且使用FXIa處理1 h及6 h。藉由LC-MS分析試樣且藉由完整肽峰之消失來量化肽裂解。在長達6 h時檢測到化合物118並無裂解。 圖33展示液相層析-質譜光譜(LC-MS)結果以證實化合物112由FXIa裂解。將PCSK9-R167A:R215A:R218A (K9-AAA)與化合物112一起培育且使用FXIa處理1 h及6 h。藉由LC-MS分析試樣且藉由完整肽峰之消失來量化肽裂解。化合物112在1 h時裂解34%且在6 h時裂解76%。 圖34展示，高精胺酸含有肽化合物118對K9-AAA之P’螺旋之FXIa調介之裂解的效應強於肽化合物112。使用Fab33及Pep2-8陽性對照及陰性對照。 圖35展示結合至PCSK9ΔCRDΔ螺旋之化合物192及化合物20在2.20 Å解析度下之晶體結構。化合物20之Arg25及其在其他延伸肽及自然P’-螺旋中之結構類似物接觸具有非最佳幾何結構之PCSK9 Ala341之羰基氧原子。化合物192中之Homo-Arg5具有長於一個碳原子之側鏈。因此，此側鏈與具有接近最佳幾何結構之PCSK9 Asp343形成鹽橋。 圖36展示TR-FRET分析之結果，該等分析展示化合物229對EGF(A)-Fc及LDLR-Fc至PCSK9之結合及Ab20至「開放溝」 PCSK9Δ螺旋之結合之抑制，且在反向篩選中並無干擾。 圖37展示在HepG2細胞分析中化合物229對LDLR降解之濃度依賴性抑制。 圖38展示在284K下於H2 O/CD3 CN (70:30)中針對化合物192及229所觀察之依序及中等範圍NOE。條厚度與NOE信號之強度成正比。弱中等範圍NOE之檢測指示MESFPGWNL(hR)IGLLR肽之殘基W7-L14及WNL(hR)IGLLR肽之殘基W1-L8的螺旋傾向。 圖39展示結合至PCSK9Δ螺旋之化合物229之結構。PCSK9之H鍵展示為點。殘基FPGW與F4與W7之間之主鏈H鍵形成I型b-轉角。 圖40展示結合至PCSK9Δ螺旋之化合物229之結構。涉及來自新殘基M1及F4及殘基W7、V10及hR11之側鏈之疏水性接觸幫助決定N-末端延伸之構形。以點表面展示來自該等側鏈之碳(及硫)原子。 圖41展示結合至PCSK9Δ螺旋之化合物192及229之結構。化合物229之拮抗作用源自P5殘基與EGF(A)之L298-D299-N300區段之間之預測空間衝突。相對於化合物192，化合物229之螺旋區段基本上不變地進行結合。 圖42展示針對結合至PCSK9Δ螺旋之化合物229之原子子組所展示且以1×rmsd所描繪之電子密度2mFo-DFc圖。
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Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (72)

  1. 一種結合SEQ ID NO：1之表位(epitope)之PCSK9抑制劑，其中該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO：1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基，該PCSK9抑制劑選自式I化合物：R1-X1-X2-X3-Trp-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2，式I及其醫藥上可接受之鹽；其中，R1係C1-C4醯基；或R1不存在；X1係選自TVFTSWEEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列；或X1不存在；X2係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列；或X2係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸；或X2不存在；X3係包括1至4個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、2-胺基環己烷-1-甲酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、3-羥基脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸及色胺酸；X4係選自以下之胺基酸殘基：丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸及纈胺酸；X5係選自以下之胺基酸殘基：精胺酸及高精胺酸；X6係包括1至5個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、精 胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及色胺酸；或X6不存在；且R2係胺基；或R2不存在。
  2. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中R1係C1-C4醯基。
  3. 如請求項2之PCSK9抑制劑，其中R1係乙醯基。
  4. 如請求項2之PCSK9抑制劑，其中R1係戊醯基。
  5. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中R1不存在。
  6. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X1係選自TVFTSWEEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列。
  7. 如請求項6之PCSK9抑制劑，其中X1係胺基酸序列TVFTSWEEYLDWV。
  8. 如請求項6之PCSK9抑制劑，其中X1係胺基酸序列TAFTSWEEYLDWV。
  9. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X1不存在。
  10. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X2係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列。
  11. 如請求項10之PCSK9抑制劑，其中X2係選自SG、GSG、GGSG、GSGG及SGSG之胺基酸序列。
  12. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X2係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸。
  13. 如請求項12之PCSK9抑制劑，其中X2係胺基酸殘基6-胺基己酸。
  14. 如請求項12之PCSK9抑制劑，其中X2係胺基酸殘基7-胺基庚酸。
  15. 如請求項12之PCSK9抑制劑，其中X2係胺基酸殘基8-胺基辛酸。
  16. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X2不存在。
  17. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X3係選自以下之胺基酸序列：P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP及DLMP。
  18. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X3不存在。
  19. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基丙胺酸。
  20. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基2,3-二胺基丙酸。
  21. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基麩醯胺酸。
  22. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基甘胺酸。
  23. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基離胺酸。
  24. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基纈胺酸。
  25. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X5係胺基酸殘基精胺酸。
  26. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X5係胺基酸殘基高精胺酸。
  27. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X6係選自以下之胺基酸序列：L、S、LL、LAR、LGC、LLA、LLC、LLR、LPC、LTR、SQGC、SQCEY、SQCWF及SQGCW。
  28. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中X6不存在。
  29. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中R2係胺基。
  30. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其中R2不存在。
  31. 如請求項1之PCSK9抑制劑，其選自下列化合物及其醫藥上可接受之鹽：Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLGRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GGSG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Aoc)-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-KLWNLGRV-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-SGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2；SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；SG-DLMPWNLVRIGLLR； Ac-SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2；Ac-SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CFIPWNLQRIGLLC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-SG-CRL(Hyp)WNLQRIGLPC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CFLPWNLQRIGLLC-NH2；Ac-CWNLKRIGSQGCW-NH2；Ac-GSG-CWNLKRIGSQGCW-NH2；Ac-DLMAWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLAPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DAMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-ALMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLL-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGL-NH2；Ac-DLMPWNLVRIG-NH2；Ac-LMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-MPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-PWNLVRIGLLR-NH2；Ac-WNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLLA-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLAR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGALR-NH2； Ac-DLMPWNLARIGLLR-NH2；Ac-MCLWNLKRIGSQCEY-NH2；Ac-DCLWNLKRIGSQCEY-NH2；Ac-WCLWNLKRIGSQCEY-NH2；GCLWNLKRIGSQCWF；Ac-CRLPWNLKRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLAC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGAPC-NH2；Ac-CRLPWNLARIGLPC-NH2；Ac-CRLAWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRAPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CALPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLGC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGGGC-NH2；Ac-CRL(Ach)WNLQRIGLPC-NH2；Ac-GCLWNLKRIGSQCWF-NH2；Ac-GCLWNLARIGSQCWF-NH2；Ac-FCLWNLARIGSQCWF-NH2；GCLWNLKRIGSQCWF-NH2；WCLWNLKRIGSQCWF-NH2；Ac-GCLWNLKRIGSQCWF；Ac-WCLWNLKRIGSQCWF；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIGS-NH2； Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIG-NH2；Ac-FCLWNLKRIGSQCEY-NH2；Ac-FCLWNLKRIGAQCWF-NH2；Ac-GSG-CWNL(Dpr)RIGSQGC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLpC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGlPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLqRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLpWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRlPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CrLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-cRLPWNLQRIGLPC-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLLR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGTTR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGTLR-NH2；Ac-CRLPWNLQ(homoR)IGLPC-NH2；n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLTR-NH2；及Ac-PWNLVRIGL-NH2。
  32. 一種結合SEQ ID NO：1之表位(epitope)之PCSK9抑制劑，其中該表位包括至少一個選自由SEQ ID NO：1之V241、T339、D343、P364、A442、A443及L444組成之群之殘基如請求項1至7中任一項之PCSK9抑制劑，該PCSK9抑制劑選自式II化合物：R1-X1-X2-X3-X7-Asn-Leu-X4-X5-Ile-Gly-X6-R2，式II及其醫藥上可接受之鹽；其中，R1係選自C1-C4醯基、芳基羰基、C3-C7環烷基羰基及雜芳基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代：C1-C4烷基；胺基；芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1-C4烷氧基、胺基、鹵基及羥基之取代基取代；芳基-C1-C4烷基；芳基羰基，其視情況經一個選自C1-C4烷基及C1-C4烷基磺醯基之取代基取代；芳基氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1-C4醯基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、鹵基及羥基-C1-C4烷基之取代基取代；羧基胺基，其視情況經一個選自芳基-C1-C4烷基之取代基取代；C3-C7環烷基；雜芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1-C4烷基及胺基之取 代基取代；雜環基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自C1-C4烷基、C1-C4烷基磺醯基、甲醯胺(carboxamide)、雜芳基-C1-C4烷基及側氧基(oxo)之取代基取代；雜環基羰基；及脲基；或R1不存在；X1係選自TVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列；或X1不存在；X2係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列；或X2係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸；或X2不存在；X3係包括1至6個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、2-胺基環己烷-1-甲酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、甘胺酸、3-羥基脯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、色胺酸及酪胺酸；X4係選自以下之胺基酸殘基：丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸及纈胺酸；X5係選自以下之胺基酸殘基：精胺酸及高精胺酸；X6係包括1至5個選自以下之胺基酸殘基之胺基酸序列：丙胺酸、精胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及色胺酸；或X6不存在； X7係選自以下之胺基酸殘基：色胺酸、6-氟色胺酸、6-氯色胺酸、6-溴色胺酸及6-甲基色胺酸；且R2係胺基；或R2不存在。
  33. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R1係C1-C4醯基。
  34. 如請求項33之PCSK9抑制劑，其中R1係乙醯基。
  35. 如請求項33之PCSK9抑制劑，其中R1係戊醯基。
  36. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R1不存在。
  37. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R1係選自C1-C4醯基、芳基羰基、C3-C7環烷基羰基及雜芳基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代：C1-C4烷基；胺基；芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲氧基、胺基、氟、氯及羥基之取代基取代；芳基-C1-C4烷基；芳基羰基，其視情況經一個選自甲基及甲基磺醯基之取代基取代；芳基氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自乙醯基、甲氧基、甲基、乙基、溴及羥甲基之取代基取代； 羧基胺基，其視情況經一個選自苯基甲基之取代基取代；C3-C7環烷基；雜芳基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基及胺基之取代基取代；雜環基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基、甲基磺醯基、甲醯胺、吡啶基甲基及側氧基之取代基取代；雜環基羰基；及脲基。
  38. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R1係選自C1-C4醯基、芳基羰基、C3-C7環烷基羰基及雜芳基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代：C1-C4烷基，其選自甲基及第三丁基；胺基；苯基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲氧基、胺基、氟、氯及羥基之取代基取代；苯基甲基；苯甲醯基，其視情況經一個選自甲基及甲基磺醯基之取代基取代；苯氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自乙醯基、甲氧基、甲基、乙基、溴及羥甲基之取代基取代；羧基胺基，其視情況經一個選自苯基甲基之取代基取代；環己基；雜芳基，其選自咪唑基、吲哚基、吡唑基、吡啶基及三唑基，每一 者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基及胺基之取代基取代；雜環基，其選自嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、吡咯啶基、四氫噻吩基、四氫嘧啶基、硫嗎啉基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基、甲基磺醯基、甲醯胺、吡啶基甲基及側氧基之取代基取代；嗎啉基羰基；及脲基。
  39. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R1係選自乙醯基、正丙醯基、正丁醯基、異戊醯基、戊醯基、苯甲醯基、環丙基羰基、環丁基羰基、環己基羰基、吲哚基羰基、吡唑基羰基及吡啶基羰基；每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自以下之取代基取代：C1-C4烷基，其選自甲基及第三丁基；胺基；苯基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自甲氧基、胺基、氟、氯及羥基之取代基取代；苯基甲基；苯甲醯基，其視情況經一個選自甲基及甲基磺醯基之取代基取代；苯氧基，其視情況經一或兩個各自獨立地選自乙醯基、甲氧基、甲基、乙基、溴及羥甲基之取代基取代；羧基胺基，其視情況經一個選自苯基甲基之取代基取代；環己基；雜芳基，其選自咪唑基、吲哚基、吡唑基、吡啶基及三唑基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基及胺基之取代基取代； 雜環基，其選自嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基、吡咯啶基、四氫噻吩基、四氫嘧啶基、硫嗎啉基，每一者視情況經一或兩個各自獨立地選自甲基、甲基磺醯基、甲醯胺、吡啶基甲基及側氧基之取代基取代；嗎啉基羰基；及脲基。
  40. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R1係選自乙醯基、正丁醯基、3-(1,1-二氧離子基硫嗎啉基)丙醯基、2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)環丙烷-1-羰基、3-(2-側氧基吡咯啶-1-基)丙醯基、1-(1-甲基吡咯啶-3-基)-1H-吡唑-4-羰基、2-(1-(吡啶-2-基甲基)六氫吡啶-4-基)乙醯基、3-(4-胺甲醯基六氫吡嗪-1-基)丙醯基、3-(1H-咪唑-4-基)丙醯基、2-(1-(甲基磺醯基)六氫吡啶-4-基)乙醯基、6-嗎啉基菸鹼醯基、3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)丙醯基、3-嗎啉基丙醯基、3-(吡啶-3-基)丙醯基、2-(1,1-二氧離子基四氫噻吩-3-基)乙醯基、3-(4-甲基六氫吡嗪-1-基)丙醯基、3-脲基丙醯基、3-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丙醯基、2-(2,4-二側氧基-3,4-二氫嘧啶-1(2H)-基)乙醯基、3-苄基環丁烷-1-羰基、[1,1'-聯苯]-4-羰基、5-苯基戊醯基、4-苯基環己烷-1-羰基、5,5-二甲基己醯基、3,5,5-三甲基己醯基、5-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-3-羰基、3-環己基丙醯基、3-(4-胺基苯基)丙醯基、4-嗎啉基丁醯基、4-(4-(甲基磺醯基)苯基)-4-側氧基丁醯基、3-(3-胺基苯基)丙醯基、4-側氧基-4-(對甲苯基)丁醯基、3-(4-甲氧基苯基)丙醯基、4-嗎啉基-4-側氧基丁醯基、3-(3-羥基苯基)丙醯基、4-(((苄基氧基)羰基)胺基)丁醯基、3-(4-羥基苯基)丙醯基、3-(6-胺基吡啶-3-基)丙醯基、4-(4-溴苯氧基)丁醯基、4-(4-乙醯基苯氧基)丁醯基、3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-5-羰基、3- (1H-吲哚-3-基)丙醯基、4-(1H-吲哚-3-基)丁醯基、4-(4-氟苯基)丁醯基、3-(4-氟苯基)丙醯基、3-(4-氯苯基)丙醯基、3-(3-甲氧基苯基)丙醯基、3-(4-甲氧基苯氧基)丙醯基、4-(4-(羥甲基)-3-甲氧基苯氧基)丁醯基、3-(4-乙醯基苯氧基)丙醯基、4-(對甲苯基氧基)丁醯基、4-苯氧基丁醯基、4-(4-乙基苯氧基)丁醯基、3-(對甲苯基氧基)丙醯基、4-苯基丁醯基、3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)丙醯基、4-(4-羥基苯基)丁醯基、2-(吡啶-3-基)環丙烷-1-羰基、1H-吲哚-6-羰基、2-胺基-3-(4-羥基苯基)丙醯基及3-(3,4-二羥基苯基)丙醯基。
  41. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X1係選自TVFTSWEEYLDWV、TVFTS(W6fl)EEYLDWV及TAFTSWEEYLDWV之胺基酸序列。
  42. 如請求項41之PCSK9抑制劑，其中X1係胺基酸序列TVFTSWEEYLDWV。
  43. 如請求項41之PCSK9抑制劑，其中X1係胺基酸序列TVFTS(W6fl)EEYLDWV。
  44. 如請求項41之PCSK9抑制劑，其中X1係胺基酸序列TAFTSWEEYLDWV。
  45. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X1不存在。
  46. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X2係包括1至4個選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸殘基之胺基酸序列。
  47. 如請求項46之PCSK9抑制劑，其中X2係選自G、GG、SG、GSG、GGSG、GSGG及SGSG之胺基酸序列。
  48. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X2係選自以下之胺基酸殘基：5-胺基戊酸、6-胺基己酸、7-胺基庚酸、8-胺基辛酸、9-胺基壬酸、10-胺基癸酸及11-胺基十一烷酸。
  49. 如請求項48之PCSK9抑制劑，其中X2係胺基酸殘基6-胺基己酸。
  50. 如請求項48之PCSK9抑制劑，其中X2係胺基酸殘基7-胺基庚酸。
  51. 如請求項48之PCSK9抑制劑，其中X2係胺基酸殘基8-胺基辛酸。
  52. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X2不存在。
  53. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X3係選自以下之胺基酸序列：P、MP、LMP、ALMP、CALP、CFI(Hyp)、CFIP、CFLP、CRAP、CRL(Hyp)、CRLP、DAMP、DLAP、DLMP、DSYPG、ESFPG、ESYPG、MDSFPG、MESFPG及SFAFPG。
  54. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X3不存在。
  55. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基丙胺酸。
  56. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基2,3-二胺基丙酸。
  57. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基麩醯胺酸。
  58. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基甘胺酸。
  59. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基離胺酸。
  60. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X4係胺基酸殘基纈胺酸。
  61. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X5係胺基酸殘基精胺酸。
  62. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X5係胺基酸殘基高精胺酸。
  63. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X6係選自以下之胺基酸序列：L、S、LL、LAR、LDR、LER、LGC、LGR、LLA、LLC、LLQ、LLR、LPC、LPR、LSR、LTR、SQGC、SQCEY、SQCWF及SQGCW。
  64. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X6不存在。
  65. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X7係色胺酸。
  66. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X7係6-氟色胺酸。
  67. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X7係6-氯色胺酸。
  68. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X7係6-溴色胺酸。
  69. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中X7係6-甲基色胺酸。
  70. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R2係胺基。
  71. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其中R2不存在。
  72. 如請求項32之PCSK9抑制劑，其選自下列化合物及其醫藥上可接受之鹽：Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CWNLGRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GGSG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Aoc)-CWNLKRIGSQGC-NH2； Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-KLWNLGRV-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-GSG-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahp)-CWNLKRIGSQGC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-SGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2；SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；SG-DLMPWNLVRIGLLR；Ac-SG-CFIPWNLQRIGLLC-NH2；Ac-SG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CFIPWNLQRIGLLC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-SG-CRL(Hyp)WNLQRIGLPC-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-GSGG-CFLPWNLQRIGLLC-NH2；Ac-CWNLKRIGSQGCW-NH2；Ac-GSG-CWNLKRIGSQGCW-NH2；Ac-DLMAWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLAPWNLVRIGLLR-NH2； Ac-DAMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-ALMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLL-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGL-NH2；Ac-DLMPWNLVRIG-NH2；Ac-LMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-MPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-PWNLVRIGLLR-NH2；Ac-WNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLLA-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLAR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGALR-NH2；Ac-DLMPWNLARIGLLR-NH2；Ac-MCLWNLKRIGSQCEY-NH2；Ac-DCLWNLKRIGSQCEY-NH2；Ac-WCLWNLKRIGSQCEY-NH2；GCLWNLKRIGSQCWF；Ac-CRLPWNLKRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLAC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGAPC-NH2；Ac-CRLPWNLARIGLPC-NH2；Ac-CRLAWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRAPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CALPWNLQRIGLPC-NH2； Ac-CRLPWNLQRIGLGC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGGGC-NH2；Ac-CRL(Ach)WNLQRIGLPC-NH2；Ac-GCLWNLKRIGSQCWF-NH2；Ac-GCLWNLARIGSQCWF-NH2；Ac-FCLWNLARIGSQCWF-NH2；GCLWNLKRIGSQCWF-NH2；WCLWNLKRIGSQCWF-NH2；Ac-GCLWNLKRIGSQCWF；Ac-WCLWNLKRIGSQCWF；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIGS-NH2；Ac-TVFTSWEEYLDWV-(Ahx)-AWNLKRIG-NH2；Ac-FCLWNLKRIGSQCEY-NH2；Ac-FCLWNLKRIGAQCWF-NH2；Ac-GSG-CWNL(Dpr)RIGSQGC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLpC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGlPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLqRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CRLpWNLQRIGLPC-NH2； Ac-CRlPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-CrLPWNLQRIGLPC-NH2；Ac-cRLPWNLQRIGLPC-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLLR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLTR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGTTR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGTLR-NH2；Ac-CRLPWNLQ(homoR)IGLPC-NH2；n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLTR-NH2；Ac-PWNLVRIGL-NH2；Ac-SG-DLMPWNLVRIGLLR-NH2；n-PrC(O)-WNLVRIGLLR-NH2；Ac-G-LMPWNLVRIGLLR-NH2；Ac-GG-MPWNLVRIGLLR-NH2；
    Figure 106121106-A0305-02-0168-1
    Figure 106121106-A0305-02-0168-2
    Figure 106121106-A0305-02-0168-3
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    Figure 106121106-A0305-02-0169-5
    Figure 106121106-A0305-02-0170-17
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    Figure 106121106-A0305-02-0170-21
    Figure 106121106-A0305-02-0170-22
    Figure 106121106-A0305-02-0170-23
    Figure 106121106-A0305-02-0170-24
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    Figure 106121106-A0305-02-0170-26
    Figure 106121106-A0305-02-0170-16
     n-BuC(O)-WNLVRIGLLR；Ac-MDSFPGWNLVRIGLLR-NH2； Ac-SFAFPGWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DSYPGWNLVRIGLLR-NH2；Ac-ESYPGWNLVRIGLLR-NH2；Ac-ESFPGWNLVRIGLLR-NH2；Ac-DLMPWNLKRIGLLR-NH2；n-BuC(O)-WNLKRIGLLR-NH2；Ac-DLMPWNLVRIGLPR-NH2；
    Figure 106121106-A0305-02-0172-28
    Figure 106121106-A0305-02-0172-29
    Figure 106121106-A0305-02-0172-30
    Figure 106121106-A0305-02-0172-31
    Figure 106121106-A0305-02-0172-32
    Figure 106121106-A0305-02-0172-33
    Figure 106121106-A0305-02-0172-34
    Figure 106121106-A0305-02-0172-35
    Figure 106121106-A0305-02-0172-27
    Figure 106121106-A0305-02-0173-37
    Figure 106121106-A0305-02-0173-38
    Figure 106121106-A0305-02-0173-39
    Figure 106121106-A0305-02-0173-36
     n-BuC(O)-(W6fl)NLVRIGLTR-NH2；n-BuC(O)-(W6me)NLVRIGLTR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLTR；n-BuC(O)-WNLVRIGLER-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLDR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLGR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLAR-NH2；n-BuC(O)-WNLVRIGLSR-NH2；
    Figure 106121106-A0305-02-0174-41
    Figure 106121106-A0305-02-0174-42
    Figure 106121106-A0305-02-0174-43
    Figure 106121106-A0305-02-0174-40
     n-BuC(O)-(W6cl)NLVRIGLTR-NH2；n-BuC(O)-(W6br)NLVRIGLTR-NH2；
    Figure 106121106-A0305-02-0174-44
    Figure 106121106-A0305-02-0174-45
    Figure 106121106-A0305-02-0174-46
     n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLLR-NH2；Ac-WNLV(homoR)IGLLR-NH2；
    Figure 106121106-A0305-02-0174-47
    Figure 106121106-A0305-02-0174-48
     n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLLR；
    Figure 106121106-A0305-02-0175-50
    Figure 106121106-A0305-02-0175-51
    Figure 106121106-A0305-02-0175-52
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    Figure 106121106-A0305-02-0177-71
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    Figure 106121106-A0305-02-0177-76
    Figure 106121106-A0305-02-0177-77
    Figure 106121106-A0305-02-0177-78
    Figure 106121106-A0305-02-0177-79
     Ac-ESFPGWNLV(homoR)IGLLR-NH2； Ac-SFAFPGWNLV(homoR)IGLLR-NH2；Ac-MESFPGWNLV(homoR)IGLLR-NH2；Ac-DSYPGWNLV(homoR)IGLLR-NH2；Ac-ESYPGWNLV(homoR)IGLLR-NH2；Ac-SFAFPGWNLK(homoR)IGLLR-NH2；Ac-MESFPGWNLK(homoR)IGLLR-NH2；n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLTR-NH2；n-BuC(O)-WNLV(homoR)IGLTR；WNLV(homoR)IG-NH2；WNLV(homoR)IGLLQ-NH2；
    Figure 106121106-A0305-02-0178-80
    Figure 106121106-A0305-02-0178-81
    Figure 106121106-A0305-02-0178-82
     Ac-TVFTS(W6fl)EEYLDWV-GSG-CRLPWNLQRIGLPC-NH2；及Ac-SG-CFI(Hyp)WNLQRIGLLC-NH2。
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