JP7094949B2 - 転写後化学修飾二重鎖rna - Google Patents
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Description
本出願は、2016年11月7日出願の米国仮特許出願第62/418,581号及び2017年1月16日出願の米国仮特許出願第62/446,722号による優先権を主張するものであり、これら出願の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(a)30を超える塩基対を有するUdsRNAの混合物を、水及び非プロトン性溶媒を含む溶液中で形成することと、
(b)混合物に、適切な量の:
i)R2-X[式(II)]を含むアルキル化剤、(式中、R2は、R1であり、Xは、ヒドロキシル、ハロゲン又はシアノである)又は
ii)R3-X[式(III)]を含むアシル化剤、(式中、R3は、R1-(CO)であり、Xは、H、ONa、塩化物、シアン化物、アルカノイルオキシ又は環状無水物である)を加えることと、
(c)アルキル化剤又はアシル化剤がリボース2’ヒドロキシルと反応して、式(I)を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、混合物を約30℃~約95℃に加熱することによりMdsRNAを形成することと、
(d)場合により、式(I)を有する修飾ヌクレオチドを含むMdsRNAを単離又は精製することと、を含む。
a)30を超える塩基対を有する非修飾二重鎖RNAを含む非修飾dsRNA(UdsRNA)混合物を、水及び非プロトン性溶媒を含む溶媒中で形成することと、
b)前記UdsRNA混合物を約30~95℃に加熱することと、
c)反応関与体を約30~95°に加熱することであって、反応関与体は、:
i)R2-X[式(II)]を含むアルキル化剤(式中、R2は、R1であり、Xは、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノである)、又は
ii)R3-X[式(III)]を含むアシル化剤、(式中、R3は、R1-(CO)-であり、Xは、OH、ONa、OK、塩化物、シアン化物、イミダゾリド、アルカノイルオキシである)、又は
からなる群から選択される、加熱することと、
d)反応関与体をUdsRNA混合物に加えることと、
e)反応関与体がリボース2’ヒドロキシルを化学的に修飾して、式(I)を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、UdsRNA混合物及び反応関与体を約30~95℃に加熱することによりMdsRNAを形成することと、
f)場合によりMdsRNAを単離又は精製することと、を含む。
a)宿主動物、真菌、植物内の標的遺伝子を特定することと、
b)少なくとも30塩基対を有するdsRNAを発現するための発現ベクターを作製することであって、dsRNAは標的遺伝子に対する配列ホモロジーを含む、作製することと、
c)発現ベクターを使用して、UdsRNA転写産物を生成することと、
d)転写産物を転写後修飾して、MdsRNAを生成することと、
e)場合によりMdsRNAを精製することと、を含む。
いくつかの実施形態では、MdsRNAの塩基対ヌクレオチドの5%超がリボース2’-OH位において転写後化学修飾される。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、リボース2’-OH位に置換を含む。いくつかの実施形態では、記載されるMdsRNAは、バックボーンリボース2’-OH位において化学的に置換されたヌクレオチドを含み、化学的に置換されたヌクレオチドは、独立して式(I):
本発明者らは、化学反応関与体がリボースの2’-OH位の十分なヒドロキシルと反応して、記載されるMdsRNAを生成するように、UdsRNAを好適な範囲の反応条件下で好適な化学反応関与体と反応させることを記載する。記載される製剤は、改善された有効性を提供し、かつ拡張可能である。それらは、農業及び/又は都市使用のために経済的に製造されるように十分大きい体積で行うことができる。
(a)所望のUdsRNAを、水及び非プロトン性溶媒を含む溶媒混合物と約30℃~約80℃の温度で接触させることと、
(b)場合によりUdsRNA溶媒混合物を触媒と接触させることと、
(c)混合物を:
(i)R2-X[式(II)]を含むアルキル化剤、又は
(ii)R3-X[式(III)]を含むアシル化剤から選択される化学反応関与体と接触させることと、
(c)場合によりUdsRNA溶媒混合物を1つ以上の触媒と接触させることと、
(d)反応関与体がUdsRNAを所望の程度に修飾するのに必要な時間の間、約30℃~約95℃に加熱することにより、MdsRNAを形成することと、を含む。
本発明者らは、宿主生物における標的遺伝子の阻害に好適なMdsRNAの形成方法を記載し、該方法は:
a)宿主生物内でmRNA又は非翻訳RNAを発現している標的遺伝子を特定することと、
b)発現RNAの配列に相補的な配列を有するUdsRNAを発現するための発現ベクターを作製することと、
c)UdsRNA転写産物を生成することと、
d)転写産物を転写後修飾して、MdsRNAを生成することと、
e)場合によりMdsRNAを精製することと、を含む。
a)標的遺伝子を選択することであって、標的遺伝子は、宿主内でRNAを発現する、選択することと、
b)発現RNAの配列の少なくとも一部分をコードするdsRNA転写産物を生成することと、
c)dsRNA転写産物を転写後に化学修飾して、標的遺伝子の発現を阻害することが可能なMdsRNAを形成することと、
d)場合によりMdsRNAを精製することと、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、記載されるMdsRNAを含む組成物を記載する。いくつかの実施形態では、MdsRNA含有組成物は、農業用途用に配合される(農薬組成物)。
いくつかの実施形態では、MdsRNA又はMdsRNAを含む組成物を使用して農業有害生物を制御し又は農業有害生物侵入を処置する。MdsRNAは、有害生物に、又は有害生物により占められる範囲に、又は有害生物の食物源に投与され得る。
いくつかの実施形態では、本発明者らは、雑草以外の標的植物における標的遺伝子の発現を低減する方法を記載し、該方法は、記載されるMdsRNAの1つ以上を含む組成物を植物に適用することを含む。いくつかの実施形態では、植物は、作物植物である。作物植物は、植物、利益又は生存のために成長及び収穫され得る植物である。作物植物は、非限定的に、食物植物、園芸植物、花卉園芸植物又は工業用植物であり得る。いくつかの実施形態では、植物は、栽培植物である。植物は、研究室、温室、苗畑、田畑、果樹園又は他の農業環境、庭園又は他の天然若しくは都市環境内に存在し得る。いくつかの実施形態では、標的植物は、特定の状況又は位置に望ましいと見なされる植物である。
いくつかの実施形態では、動物は、昆虫である。いくつかの実施形態では、昆虫は、鞘翅類(Coleopteran)である。鞘翅類(Coleopteran)は、非限定的に、キクイムシ、ニレハムシ、ツヤハダゴマダラカミキリ、シバンムシ、アメリカマツノキクイムシ、キムネクロナガハムシ又はコロラドハムシであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、鱗翅類(Lepidopteran)である。鱗翅類(Lepidopteran)は、非限定的に、ヨトウムシ、コーンイヤーワーム、モンシロチョウ又はコットンボールワームであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、膜翅類(Hymenopteran)である。膜翅類(Hymenopteran)は、非限定的に、カミアリ、アルゼンチンアリ、オオアリ、ハキリアリ、サスライアリ、ウィートステムソーフライ(wheat stem sawfly)、カラマツハラアカハバチ、マツハバチ又はトコジラミであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、双翅類(Dipteran)である。双翅類(Dipteran)は、ハエ、蚊、ブヨ又は潜葉性昆虫であり得るがこれに限定される。いくつかの実施形態では、昆虫は、半翅類(Hemipteran)である。半翅類(Hemipteran)は、非限定的に、アブラムシ、ヨコバイ、害虫(bug)、コナジラミ、コナカイガラムシ又はノミであり得る。いくつかの実施形態では、昆虫は、西洋トウモロコシルートワームである。
いくつかの実施形態では、MdsRNAを使用して真菌感染を処置又は予防する。いくつかの実施形態では、真菌は、非限定的に、ベンチュリア属(Venturia)、ポドスフェラ属(Podosphaera)、エリシフェ属(Erysiphe)、モノリニア属(Monolinia)、ミコスフェレラ属(Mycosphaerella)、ウンシヌラ属(Uncinula);担子菌類(Basidiomycete)、ヘミレイア属(Hemileia)、リゾクトニア属(Rhizoctonia)、プッチニア属(Puccinia)、不完全菌(Fungi imperfecti)、ボトリティス属(Botrytis)、ヘルミントスポリウム属(Helminthosporium)、リンコスポリウム属(Rhynchosporium)、フザリウム属(Fusarium)、セプトリア属(Septoria)、セルコスポラ属(Cercospora)、アルテルナリア属(Alternaria)、ピリクラリア属(Pyricularia)、シュードセルコスポレラ属(Pseudocercosporella)、卵菌(Oomycete fungi)、フィトフトラ属(Phytophthora)、ペロノスポラ属(Peronospora)、ブレミア属(Bremia)、ピシウム属(Pythium)、プラスモパラ属(Plasmopara)、ダイズさび病菌(Phakopsora Pachyrhizi)、P・メイボミアエ(P.meibomiae)、スクレロフトラ・マクロスポラ(Scleropthora macrospora)、スクレロフトラ・レイイシエ(Sclerophthora rayissiae)、スクレロスポラ・グラミニコラ(Sclerospora graminicola)、ペロノスクレロスポラ・ソルギ(Peronosclerospora sorghi)、ペロノスクレロスポラ・フィリピネシス(Peronosclerospora philippinensis)、ペロノスクレロスポラ・サッカリ(Peronosclerospora sacchari)ペロノスクレロスポラ・メイディス(Peronosclerospora maydis)、フィソペラ・ゼアエ(Physopella zeae)、セルコスポラ・ゼアエ-メイディス(Cercospora zeae-maydis)、コレトトリチャム・グラミニコーラ(Colletotrichum graminicola)、ボタンタケ目(Hypocreale)、ジベレラ・ゼアエ(Gibberella zeae)、エクセロヒルム・ツルキクム(Exserohilum turcicum)、カバティエル・ゼアエ(Kabatiellu zeae)、ビポラリス・メイディス(Bipolaris maydis)、ギベレラ・アベナセア(Gibberella avenacea)、フサリウム・クルモラム(Fusarium culmorum)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrichioides)又はフサリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)であり得る。いくつかの実施形態では、フサリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)の処理は、マイコトキシンの産生、脱メチル化阻害剤(DMI)に基づく殺真菌剤に対する耐性の出現の危険性、又はテブコナゾールのような従来のDMIに関する発癌性の懸念を低減することができる。
本明細書で使用されるとき、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチド以外のリボヌクレオチド(2’-ヒドロキシルヌクレオチド)である。いくつかの実施形態では、MdsRNAにおけるヌクレオチドの少なくとも2%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%が、合成後修飾されている。修飾ヌクレオチドは、非限定的に、リボース2’-OH置換を有するヌクレオチドを含む。
本発明の態様として以下のものが挙げられる。
[1]転写後修飾二重鎖RNA(MdsRNA)を含む組成物であって、前記MdsRNAが、30を超えるヌクレオチド塩基対を有する二重鎖RNAを含み、前記ヌクレオチドの少なくとも5%は、独立して式(I):
(式中、nは、0又は1であり、R 1 は、ヒドロカルビル若しくは置換ヒドロカルビルであり又はそれを含み、塩基は、独立して、核酸塩基であり又はそれを含む。)
を含む、組成物。
[2]R 1 が、アルキル;置換アルキル;アルケニル;置換アルケニル;アルキニル;置換アルキニル;アリール;置換アリール;C1~C10アルキル、C1~C10アルケニル若しくはC1~C10アルキニル(アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状である);n=1の場合、水素;メチル;エチル;プロピル;イソプロピル;ブチル;イソブチル;tert-ブチル;ペンチル;ヘキシル;シクロヘキシル;ヘプチル;オクチル;ノニル;デシル;ビニル;アリル;エチニル;ベンジル;シンナミル;C6~C14アリール;C6~C14置換アリール;ヘテロシクリル;C5~C14ヘテロシクリル;フェニル;一若しくは二置換フェニル(前記置換基は、C1~C10アルキル、C1~C10アルケニル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される);2-ニトロフェニル;4-ニトロフェニル;2;4-ジニトロフェニル;2-トリフルオロメチルフェニル;4-トリフルオロメチルフェニル;スチリル;C8~C16置換スチリル;2-アミノフェニル;一若しくは二置換2-アミノフェニル(前記置換基は、C1~C10アルキル、C1~C10アルケニル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される);N-アルキル-2-アミノフェニル若しくはN-アリール-2-アミノフェニル(アルキルは、式-C m H 2m+1 (mは、12以下の整数である)を有し、アリールは芳香族部分である);2-アミノ-3-メチル-フェニル;2-アミノ-5-クロロフェニル;2-メチル-5-クロロフェニル;N-メチル-2-アミノフェニル;N-エチル-2-アミノフェニル;N-プロピル-2-アミノフェニル;N-ブチル2-アミノフェニル;N-ペンチル-2-アミノフェニル;N-メチル-2-アミノ-4-ニトロフェニル;2-メチル-3-フリル;2-メチルニコチル若しくはN-トリフルオロメチル-2-アミノフェニル;シラニル;置換シラニル;C1~C10アルキルシラニル;C3~C12トリアルキルシラニル;C2~C12アルコキシアルキル;C2~C12アルコキシアルケニル;C2~C12アルキルチオアルキル;アルキルスルホニル;C1~C10アルキルスルホニル;C1~C10ハロアルキル;C1~C10ハロアルケニル若しくはC1~C10アミノアルキル;-(CH 2 CH 2 O) p CH 3 、-(CH 2 CH 2 O) p H又は-(CH 2 CH 2 O) p COOR 4 (pは、2~8の整数であり、R 4 は、H、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである);-(CH 2 CH 2 O) 8 COOH;-CH 2 CH 2 OH;-(CH 2 CH 2 O) 4 OH;-(CH 2 CH 2 O) 6 OH;-(CH 2 CH 2 O) 8 OH;-(CH 2 CH 2 O) 8 COOMe;-(CH 2 CH 2 O) 4 OMe;-(CH 2 CH 2 O) 6 OMe;-(CH 2 CH 2 O) 8 OMe;-CH 2 OCH 3 ;-CH 2 OCH 2 CH 3 ;又は-CH 2 OCH 2 CH 2 OCH 3 である、[1]に記載の組成物。
[3](CO) n -R 1 が、2,4-ジニトロフェニル、ベンゾイル又はN-メチルアントラノイルである、[1]に記載の組成物。
[4]前記リボヌクレオチドの少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも60%又は少なくとも90%が、独立して式(I)を含む、[1]~[3]のいずれか一項に記載の組成物。
[5]前記MdsRNAが、標的宿主内の発現RNAに対してホモロジー及び/又は相補性を有する配列を含む、[1]~[4]のいずれか一項に記載の組成物。
[6]前記標的宿主が、動物、昆虫、真菌、植物、原生動物又は雑草である、[5]に記載の組成物。
[7]前記昆虫、真菌又は雑草が:鞘翅類(Coleopteran〉、鱗翅類(Lepidopteran)、双翅類(Dipteran)、半翅類(Hemipteran)、膜翅類(Hymenopteran)、コロラドハムシ、トウモロコシルートワーム、ヒアリ、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、コナガ、ミカンキジラミ(Asian citrus psyllid)、ボタンタケ目(Hypocreales)、フサリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フサリウム・アベナセア(Fusarium avenacea)、フサリウム・クルモラム(Fusarium culmorum)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrichioides)、オオホナガアオゲイトウ(Palmer Amaranth)、シロザ(Common Lambsquarters)、ヒメムカシヨモギ(Horseweed)、アサガオ(Morning Glory)、アマランサス(Waterhemp)、ショクヨウガヤツリ(Nutsedge)、ホウキギ(Kochia)、ブタクサ(Common Ragweed)、オオブタクサ(Giant Ragweed)及びベラドンナ(Nightshade)からなる群から選択される、[6]に記載の組成物。
[8]前記MdsRNAが、標的宿主内の遺伝子の発現を低減する、[1]~[7]のいずれか一項に記載の組成物。
[9]賦形剤、担体、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、肥料からなる群から選択される少なくとも1つの薬剤を更に含む、[1]~[8]のいずれか一項に記載の組成物。
[10]前記MdsRNAが、5重量%未満、約1重量%未満、約0.9重量%未満、約0.8重量%未満、約0.7重量%未満、約0.6重量%未満、約0.5重量%未満、約0.4重量%未満、約0.3重量%未満、約0.2重量%未満、約0.1重量%未満、約0.05重量%未満、約0.01重量%未満又は約0.001重量%未満の量で存在する、[9]に記載の組成物。
[11]MdsRNAを形成するための二重鎖RNAの転写後化学修飾方法であって、
a)30を超える塩基対を有する非修飾二重鎖RNAを含む非修飾dsRNA(UdsRNA)混合物を、水及び非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒の混合物を含む溶液中で形成することと、
b)前記UdsRNA混合物を約30~95℃に加熱することと、
c)反応関与体を約30~95°に加熱することであって、前記反応関与体は:
i)R 2 -X[式(II)]を含むアルキル化剤(式中、R 2 は、R 1 であり、Xは、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノである)、又は
ii)R 3 -X[式(III)]を含むアシル化剤(式中、R 3 は、R 1 -(CO)であり、Xは、OH、ONa、OK、塩化物、シアン化物、イミダゾリド、アルカノイルオキシである)、又は
からなる群から選択される、加熱することと、
d)前記反応関与体を前記UdsRNA混合物に加えることと、
e)前記組み合わせたUdsRNA混合物及び反応関与体を、前記反応関与体がリボース2’ヒドロキシルを化学修飾して式(I)を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、約30~95℃に加熱することにより前記MdsRNAを形成することと、
f)場合により前記MdsRNAを単離又は精製することと、を含む、方法。
[12]前記反応関与体が、NMIA、BzCN又はFDNBを含む、[11]に記載のプロセス。
[13]前記非プロトン性溶媒が:DMSO、DMF、ジメチルアセトアミド、THF、ジオキサン、アセトニトリル及びウレア又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、[11]又は[12]に記載のプロセス。
[14]前記UdsRNA混合物中の非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒の混合物の割合が、15%~95%、40%~95%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%又は約95%である、[11]~[13]のいずれか一項に記載のプロセス。
[15]前記UdsRNA混合物が、前記反応関与体を加える前に30~80℃で0~30分間インキュベートされる、[11]~[14]のいずれか一項に記載のプロセス。
[16]前記反応関与体を加える前又は後のいずれかに、前記UdsRNA混合物に触媒が加えられる、[11]~[15]のいずれか一項に記載のプロセス。
[17]前記触媒が:ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1,6-ジベンジル-1,3a,6,8-テトラアザ-1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロフェナレン(BnsDMAP)、1,6-ジエチル-1,3a,6,8-テトラアザ-1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロフェナレン(EtsDMAP)及び1,6-ジメチル-1,3a,6,8-テトラアザ-1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロフェナレン(MesDMAP)、アミジン、イソチオウレア、グアニジン、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)及び1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(azabentriazole)(HOAt)又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、[16]に記載のプロセス。
[18]UdsRNA:反応関与体のモル比が、約1:3~約1:300、約1:10、約1:10~約1:50、約1:50~約1:100又は約1:100~約1:200である、[11]~[17]のいずれか一項に記載のプロセス。
[19]動物、植物、原生動物又は真菌宿主における発現された遺伝子の発現を阻害する方法であって、有効量の[1]~[11]のいずれかの組成物を前記宿主に適用することを含む、方法。
[20]前記MdsRNAが、植物、種子、餌又は土壌に適用される、[19]に記載の方法。
Claims (19)
- 転写後修飾二重鎖RNA(MdsRNA)を含む組成物であって、前記MdsRNAが、30を超えるヌクレオチド塩基対を有する二重鎖RNAを含み、前記ヌクレオチドの少なくとも5%は、独立して式(I):
(式中、nが1であり、R1は、置換アルキル;アルケニル;置換アルケニル;アルキニル;置換アルキニル;アリール;置換アリール;C2~C10アルキル、C2~C10アルケニル若しくはC2~C10アルキニル(アルキル及びアルケニルは、直鎖状、分枝状又は環状であり得る);H;メチル;エチル;プロピル;イソプロピル;ブチル;イソブチル;tert-ブチル;ペンチル;ヘキシル;シクロヘキシル;ヘプチル;オクチル;ノニル;デシル;ビニル;アリル;エチニル;ベンジル;シンナミル;C6~C14アリール;C6~C14置換アリール;ヘテロシクリル;C5~C14ヘテロシクリル;フェニル;一若しくは二置換フェニル(前記置換基は、C1~C10アルキル、C2~C10アルケニル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される);2-ニトロフェニル;4-ニトロフェニル;2,4-ジニトロフェニル;2-トリフルオロメチルフェニル;4-トリフルオロメチルフェニル;スチリル;C8~C16置換スチリル;2-アミノフェニル;一若しくは二置換2-アミノフェニル(前記置換基は、C1~C10アルキル、C2~C10アルケニル、C1~C6アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、メチルスルホニル及びトリフルオロメチルから選択される);N-(CmH2m+1)-2-アミノフェニル若しくはN-アリール-2-アミノフェニル(式中、mは、12以下の整数であり、アリールは芳香族部分である);2-アミノ-3-メチル-フェニル;2-アミノ-5-クロロフェニル;2-メチル-5-クロロフェニル;N-メチル-2-アミノフェニル;N-エチル-2-アミノフェニル;N-プロピル-2-アミノフェニル;N-ブチル-2-アミノフェニル;N-ペンチル-2-アミノフェニル;N-メチル-2-アミノ-4-ニトロフェニル;2-メチル-3-フリル;2-メチルニコチル若しくはN-トリフルオロメチル-2-アミノフェニル;シラニル;置換シラニル;C1~C10アルキルシラニル;C3~C12トリアルキルシラニル;C2~C12アルコキシアルキル;C3~C12アルコキシアルケニル;C2~C12アルキルチオアルキル;アルキルスルホニル;C1~C10アルキルスルホニル;C1~C10ハロアルキル;C2~C10ハロアルケニル若しくはC1~C10アミノアルキル;-(CH2CH2O)pCH3、-(CH2CH2O)pH又は-(CH2CH2O)pCOOR4(pは、1~8の整数であり、R4は、H、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールである);-(CH2CH2O)8COOH;-CH2CH2OH;-(CH2CH2O)4OH;-(CH2CH2O)6OH;-(CH2CH2O)8OH;-(CH2CH2O)8COOMe;-(CH2CH2O)4OMe;-(CH2CH2O)6OMe;-(CH2CH2O)8OMe;-CH2OCH3;-CH2OCH2CH3;又は-CH2OCH2CH2OCH3であり、塩基は、独立して、核酸塩基であり又はそれを含む。)
を含む、組成物。 - (CO)n-R1が、ベンゾイル又はN-メチルアントラノイルである、請求項1に記載の組成物。
- 前記リボヌクレオチドの少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも60%又は少なくとも90%が、独立して式(I)を含む、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記MdsRNAが、標的宿主内の発現RNAに対してホモロジー及び/又は相補性を有する配列を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記標的宿主が、動物、昆虫、真菌、植物、原生動物又は雑草である、請求項4に記載の組成物。
- 前記昆虫、真菌又は雑草が:鞘翅類(Coleopteran)、鱗翅類(Lepidopteran)、双翅類(Dipteran)、半翅類(Hemipteran)、膜翅類(Hymenopteran)、コロラドハムシ、トウモロコシルートワーム、ヒアリ、ネッタイシマカ(Aedes aegypti)、コナガ、ミカンキジラミ(Asian citrus psyllid)、ボタンタケ目(Hypocreales)、フサリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フサリウム・アベナセア(Fusarium avenacea)、フサリウム・クルモラム(Fusarium culmorum)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・スポロトリチオイデス(Fusarium sporotrichioides)、オオホナガアオゲイトウ(Palmer Amaranth)、シロザ(Common Lambsquarters)、ヒメムカシヨモギ(Horseweed)、アサガオ(Morning Glory)、アマランサス(Waterhemp)、ショクヨウガヤツリ(Nutsedge)、ホウキギ(Kochia)、ブタクサ(Common Ragweed)、オオブタクサ(Giant Ragweed)及びベラドンナ(Nightshade)からなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
- 前記MdsRNAが、標的宿主内の遺伝子の発現を低減する、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。
- 賦形剤、担体、除草剤、殺真菌剤、殺虫剤、肥料からなる群から選択される少なくとも1つの薬剤を更に含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記MdsRNAが、5重量%未満、1重量%未満、0.9重量%未満、0.8重量%未満、0.7重量%未満、0.6重量%未満、0.5重量%未満、0.4重量%未満、0.3重量%未満、0.2重量%未満、0.1重量%未満、0.05重量%未満、0.01重量%未満又は0.001重量%未満の量で存在する、請求項8に記載の組成物。
- 請求項1に規定されるMdsRNAを形成するための二重鎖RNAの転写後化学修飾方法であって、
a)30を超える塩基対を有する非修飾二重鎖RNAを含む非修飾dsRNA(UdsRNA)混合物を、水及び非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒の混合物を含む溶液中で形成することと、
b)前記UdsRNA混合物を30~95℃に加熱することと、
c)反応関与体を30~95℃に加熱することと、ここで前記反応関与体は、R3-X[式(III)]を含むアシル化剤(式中、R3は、R1-(CO)であり、Xは、OH、ONa、OK、塩素原子、シアノ基、イミダゾリド、又はアルカノイルオキシである)である、
d)前記反応関与体を前記UdsRNA混合物に加えることと、
e)前記組み合わせたUdsRNA混合物及び反応関与体を、前記反応関与体がリボース2’ヒドロキシルを化学修飾して式(I)を含むヌクレオチドを形成するのに必要な時間の間、30~95℃に加熱することにより前記MdsRNAを形成することと、
f)場合により前記MdsRNAを単離又は精製することと、
を含む、方法。 - 前記反応関与体が、N-メチルイサト酸無水物(NMIA)又はシアン化ベンゾイル(BzCN)を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記非プロトン性溶媒が:DMSO、DMF、ジメチルアセトアミド、THF、ジオキサン、アセトニトリル及びウレア又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記UdsRNA混合物中の非プロトン性溶媒又は非プロトン性溶媒の混合物の割合が、15%~95%、40%~95%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%である、請求項10~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記UdsRNA混合物が、前記反応関与体を加える前に30~80℃で0~30分間インキュベートされる、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応関与体を加える前又は後のいずれかに、前記UdsRNA混合物に触媒が加えられる、請求項10~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記触媒が:ジメチルアミノピリジン(DMAP)、1,6-ジベンジル-1,3a,6,8-テトラアザ-1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロフェナレン(BnsDMAP)、1,6-ジエチル-1,3a,6,8-テトラアザ-1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロフェナレン(EtsDMAP)及び1,6-ジメチル-1,3a,6,8-テトラアザ-1,2,3,4,5,6-ヘキサヒドロフェナレン(MesDMAP)、アミジン、イソチオウレア、グアニジン、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)及び1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(azabentriazole)(HOAt)又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- UdsRNA:反応関与体のモル比が、1:3~1:300、1:10、1:10~1:50、1:50~1:100又は1:100~1:200である、請求項10~16のいずれか一項に記載の方法。
- 非ヒト動物、植物、原生動物又は真菌宿主における発現された遺伝子の発現を阻害する方法であって、有効量の請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物を前記宿主に適用することを含む、方法。
- 前記MdsRNAが、植物、種子、餌又は土壌に適用される、請求項18に記載の方法。
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