JP7082943B2

JP7082943B2 - 免疫抑制解除剤及びその利用

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Publication number: JP7082943B2
Application number: JP2018500166A
Authority: JP
Inventors: 章良浅井; 尚久小郷; 大輔村岡; 洋珠玖; 直純原田
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd; Pharma Valley Project Supporting Organization ISH
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd; Pharma Valley Project Supporting Organization ISH
Priority date: 2016-02-16
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2022-06-09
Anticipated expiration: 2037-02-15
Also published as: JP2020152731A; EP3417864A4; EP3417864A1; JP2022093655A; CN108697724A; WO2017141981A1; US11213538B2; US20190038645A1; JPWO2017141981A1

Description

本発明は、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除する免疫抑制解除剤及びその利用に関する。

制御性Ｔ細胞（ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ、以下「Ｔｒｅｇ」とも称する）は、免疫系において、免疫応答の抑制的制御を司るＴ細胞であり、過剰な免疫応答を抑制するためのブレーキ（負の制御機構）や、免疫の恒常性維持に重要な役割を果たしている。

一方、制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性は、がんや感染性細菌の罹患時における免疫応答の誘起を抑制する。例えば、制御性Ｔ細胞はｉｎｖｉｔｒｏにおいて腫瘍反応性Ｔ細胞の機能を抑制すること、制御性Ｔ細胞の集積が様々なタイプのがんで予後不良であること等が判明している。このため、がん免疫治療において、制御性Ｔ細胞の働きを制御する様々な試みがなされている。

制御性Ｔ細胞では、ＦＯＸＰ３の発現が確認されている。ＦＯＸＰ３は制御性Ｔ細胞の主要な転写因子であると考えられ、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を制御する機能を有している。このため、ＦＯＸＰ３の機能を阻害する物質は、制御性Ｔ細胞による免疫抑制の働きを解除し、がん免疫治療等に利用できる可能性がある。

ＦＯＸＰ３の機能を阻害する物質としては、ペプチドＰ６０（非特許文献１）や、イマチニブ（非特許文献２）等が知られている。

一方、アントラサイクリン系抗生物質は、ストレプトマイセス属微生物由来の、がん化学療法に用いられる一群の化合物であり、白血病、リンパ腫、乳がん、子宮がん、卵巣がん、肺がんを含む多くのがんの治療に用いられている。しかしながら、当該アントラサイクリン系抗生物質にＦＯＸＰ３の機能を阻害する作用や制御性Ｔ細胞の免疫抑制を解除する作用があることは全く知られていない。

Casares N, et. al., J Immunol. 185:5150-59, 2010 Larmonier N, et. al., J Immunol. 181: 6955-6963, 2008

本発明は、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除することが可能な免疫抑制解除剤を提供することに関する。

制御性Ｔ細胞による免疫抑制を調節する化合物について検討した結果、エピルビシンを始めとするアントラサイクリン系抗生物質がＦＯＸＰ３の機能を阻害する作用を有し、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除し得ることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～１８）に係るものである。
１）アントラサイクリン系抗生物質を有効成分とする免疫抑制解除剤。
２）アントラサイクリン系抗生物質を有効成分とするＦＯＸＰ３機能阻害剤。
３）アントラサイクリン系抗生物質が、エピルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシン、又はそれらの塩から選ばれる１種以上である１）の免疫抑制解除剤又は２）のＦＯＸＰ３機能阻害剤。
４）アントラサイクリン系抗生物質が、エピルビシン又はその塩である１）の免疫抑制解除剤又は２）のＦＯＸＰ３機能阻害剤。
５）アントラサイクリン系抗生物質が、がん細胞に対して細胞傷害活性を示す量よりも低用量で投与される１）の免疫抑制解除剤又は２）のＦＯＸＰ３機能阻害剤。
６）固形がん及び／又は血液がんに対して細胞傷害活性を示す量よりも低用量で投与される５）の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤。
７）アントラサイクリン系抗生物質として、１日あたり０．０１～１ｍｇ／ｋｇ投与される５）又は６）の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤。
８）アントラサイクリン系抗生物質として、固形がん及び／又は血液がんに対して細胞傷害活性を示す量の１／１００～４／５の量で投与される５）又は６）の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤。
９）他の抗がん療法と組み合わせて使用される１）～８）の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤。
１０）他の抗がん療法が、がん化学療法又はがん免疫療法である９）の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤。
１１）がん免疫療法が、免疫チェックポイント阻害療法、がんワクチン療法又はＴ細胞輸注療法である１０）の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤。
１２）アントラサイクリン系抗生物質を０．０１～４ｍｇ含有する医薬。
１３）免疫抑制解除剤として使用するための、アントラサイクリン系抗生物質。
１４）ＦＯＸＰ３機能阻害剤として使用するための、アントラサイクリン系抗生物質。
１５）免疫抑制解除剤を製造するための、アントラサイクリン系抗生物質の使用。
１６）ＦＯＸＰ３機能阻害剤を製造するための、アントラサイクリン系抗生物質の使用。
１７）アントラサイクリン系抗生物質の有効量を患者に投与することを特徴とする免疫抑制解除方法。
１８）アントラサイクリン系抗生物質の有効量を患者に投与することを特徴とするＦＯＸＰ３機能阻害方法。

本発明によれば、ＦＯＸＰ３の機能を阻害し、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除するために有用な医薬品を提供できる。本発明の免疫抑制解除剤又はＦＯＸＰ３機能阻害剤によれば、例えば腫瘍免疫抑制を解除して腫瘍免疫を賦活することができ、腫瘍に対する治療効果が得られる。

エピルビシンのＦＯＸＰ３機能阻害活性。（Ａ）ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞を使用した際の活性、（Ｂ）ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞を使用した際の活性。エピルビシンによるマウス制御性Ｔ細胞の免疫抑制解除作用。細胞傷害性Ｔ細胞であるＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖率を示す。エピルビシンによるマウス制御性Ｔ細胞の機能変化。（Ａ）ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３⁺の細胞数に対するＩＦＮ－γ陽性細胞の割合、（Ｂ）ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３^-の細胞数に対するＩＦＮ－γ陽性細胞の割合。

本発明において、アントラサイクリン系抗生物質としては、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシン、アムルビシン、アクラシノマイシン、アントラマイシン、ゾルビシン等の抗腫瘍剤として知られているアントラサイクリン系化合物又はそれらの塩が挙げられる。このうち、エピルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、イダルビシンが好ましく、エピルビシンがより好ましい。
塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に制限されず、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、シュウ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸のような無機酸及び有機酸の塩が例示でき、このうち、塩酸塩が好ましい。

アントラサイクリン系抗生物質は、ストレプトマイセス属微生物から単離すること、或いは公知の合成法により合成することにより取得でき、また市販医薬品を用いてもよい。

後述する実施例のとおり、ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞にＦＯＸＰ３遺伝子を安定導入した細胞において、ＴＮＦ－αはＮＦ－κＢを活性化し、ＮＦ－κＢと共にルシフェラーゼが発現されるが、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、イダルビシンの如きアントラサイクリン系抗生物質は、ＦＯＸＰ３の機能を阻害し、ＮＦ－κＢの活性化、ひいてはルシフェラーゼの発現上昇を引き起こす作用を有する。
ＦＯＸＰ３遺伝子は転写因子をコードしており、免疫抑制作用を有する制御性Ｔ細胞の分化とその作用を制御するマスター遺伝子であるとされている（Williams LM, et. al., Nat. Immunol. 8:277-284, 2007）。したがって、ＦＯＸＰ３の機能を阻害することにより、制御性Ｔ細胞の発生や機能を抑制することができ、ひいては、制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除することができる。実際に、エピルビシンは、既に知られている抗腫瘍効果を十分に発揮する濃度よりもより低い濃度で制御性Ｔ細胞の有する免疫抑制作用を解除する。
よって、アントラサイクリン系抗生物質は、ＦＯＸＰ３遺伝子の機能を抑制するＦＯＸＰ３機能阻害剤及び制御性Ｔ細胞による免疫抑制を解除する免疫抑制解除剤として用いることができる。

ここで、「制御性Ｔ細胞」とは、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制する機能を持ち、免疫寛容を担うＴ細胞を意味する。本発明において、制御性Ｔ細胞としては、典型的には、ＣＤ４陽性ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞（ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３⁺Ｔｒｅｇ）が挙げられる。

本発明において、「ＦＯＸＰ３機能阻害」とは、ＦＯＸＰ３の転写因子としての機能を阻害することを意味し、阻害の方法はＦＯＸＰ３に直接的又は間接的であることを問わない。例えば、ＦＯＸＰ３と他のタンパクとの相互作用を阻害すること等が包含される。
ここで、ＦＯＸＰ３の機能阻害活性は、ルシフェラーゼレポーターベクターを安定に導入したＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞）と、当該細胞にＦＯＸＰ３遺伝子を安定導入した細胞（ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞）を用意し、これらに、被験薬とＴＮＦ－ａｌｐｈａ（ＴＮＦ－α）を添加して培養し、各細胞における化学発光の強度の差により求めることができる。

本発明において、「免疫抑制解除」とは、制御性Ｔ細胞によって抑制される免疫応答の制御を解除して免疫応答を惹起させることを意味する。抗腫瘍免疫を抑制するメカニズムの多くは、制御性Ｔ細胞の活性化の結果であるとされる。したがって、制御性Ｔ細胞の数的減少や抑制能の減弱化により免疫応答の制御を解除することは、腫瘍免疫応答を惹起させ、腫瘍の治療的除去又は腫瘍の機能不活性化が可能となる。
また、近年、免疫抑制解除によるアルツハイマーの治療効果も報告されており（Nature Medicine 22: 135-137, 2016）、免疫抑制解除剤は、アルツハイマー治療への応用も可能である。

本発明の免疫抑制解除剤及びＦＯＸＰ３機能阻害剤（以下、「免疫抑制解除剤等」とする）は、医薬品の形態又は医薬品に配合して使用される素材として使用される。この場合における製剤形態としては特に制限は無く、治療目的に応じて適宜選択でき、具体的には経口剤（錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤など）、注射剤、坐剤、貼付剤、軟膏剤等が例示できる。

当該医薬製剤は、アントラサイクリン系抗生物質と薬理学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マルトース、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、イノシトール、デキストラン、ソルビトール、アルブミン、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム及びこれらの混合物等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール及びこれらの混合物等が挙げられる。結合剤としては、例えば、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖及びこれらの混合物等が挙げられる。希釈剤としては、例えば、水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類及びこれらの混合物等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、チオ乳酸及びこれらの混合物等が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ホウ酸、ブドウ糖、グリセリン及びこれらの混合物等が挙げられる。ｐＨ調整剤及び緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びこれらの混合物等が挙げられる。無痛化剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン及びこれらの混合物等が挙げられる。

尚、上記医薬製剤中におけるアントラサイクリン系抗生物質の含有量は、一般には、製剤中に０．０１～４ｍｇとするのが好ましく、０．１～１ｍｇであるのがより好ましい。

本発明の免疫抑制解除剤等の投与量は、アントラサイクリン系抗生物質がＦＯＸＰ３機能阻害作用又は免疫抑制解除作用を発揮できる量であればよく、アントラサイクリン系抗生物質が有する細胞傷害活性を発揮し得ない量であるのが好ましい。特に、アントラサイクリン系抗生物質が固形がん又は血液がんに対して通常使用される投与量よりも低い量であるのが好ましい。
当該投与量は、具体的には、患者の年齢、病期、治療暦などにより適宜設定されるが、アントラサイクリン系抗生物質として、１日あたり０.０１～１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０.１～０.２５ｍｇ／ｋｇが挙げられる。また、当該投与量は、固形がん又は血液がんに対して細胞傷害活性を示す量の１／１００～４／５、好ましくは１／２０～１／４であり得る。
尚、本発明の免疫抑制解除剤等の適用の対象は、制御性Ｔ細胞による免疫抑制の解除を必要とするヒト、好適には、腫瘍免疫抑制を解除し、腫瘍免疫の賦活を必要とするヒト等が挙げられる。
ここで、腫瘍としては特に限定されないが、例えば頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がん、肝臓がん、胆のう・胆管がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、睾丸がん、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、子宮頚がん、皮膚がん、脳腫瘍等が挙げられる。

本発明の免疫抑制解除剤等は、これらを単独で投与することも可能であるが、他の抗がん療法と併用して用いるのが好ましい。
単独で投与する場合には、本発明の免疫抑制解除剤等を同一濃度で投与を続けることも、濃度を変化させて投与することもできる。
また、他の抗がん療法としては、本発明とは異なる、既知のがん化学療法（細胞傷害性の化学療法）、外科手術、放射線療法、光線力学的療法、がん免疫療法等が挙げられる。

がん化学療法としては、細胞傷害活性を有する化合物を含む抗腫瘍剤の投与が挙げられる。
併用できる抗腫瘍剤としては、特に限定されないが、例えばサイクロフォスファミド、イフォスファミド、メルファラン、ブスルファン、カルボキノン、ダカルバジン等のアルキル化剤；６－メルカプトプリン、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、テガフール、エノシタビン、葉酸代謝拮抗剤（ペメトレキセド等）等の代謝拮抗剤；アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ペプレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクラルビシン、ネオカルチノスタチン等の抗癌性抗生物質；ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、タキサン系抗癌剤（タキソテール、タキソール等）等の植物アルカロイド；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン等の白金化合物等が挙げられ、また、イマチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ベムラフェニブ、トラメチニブ等の分子標的薬が挙げられる。これらを１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。また、本発明の免疫抑制解除剤同士を併用することも可能である。

抗腫瘍剤との併用投与は、本発明の免疫抑制解除剤等と抗腫瘍剤を１剤として投与するものでもよく、本発明の免疫抑制解除剤等と抗腫瘍剤を、同時に又は時間差をおいて２剤で投与することも併せて意味する。後者の場合、抗腫瘍剤と免疫抑制解除剤等との投与回数は同じであってもよいし、異なっていてもよい。

がん免疫療法としては、特に限定しないが、例えばがん細胞上に発現するリガンドであるＰＤ－Ｌ１（programmed death-ligand 1）及びＰＤ－Ｌ２（programmed death-ligand ２）と、Ｔ細胞上のレセプターであるＰＤ－１（programmed death-1）との結合を阻害する免疫チェックポイント阻害療法、Ｔ細胞の表面分子であるＣＴＬＡ－４を阻害する免疫チェックポイント阻害療法、がんワクチン療法（ペプチドワクチン療法、樹状細胞ワクチン療法等）、Ｔ細胞輸注療法が挙げられる。
免疫チェックポイント阻害療法に用いられる免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ－１に対するヒト型ＩｇＧ４モノクローナル抗体が挙げられ、具体的にはニボルマブ、ペンブロリズマブ等が挙げられる。

本発明の免疫抑制解除剤等を他の抗がん療法と併用する場合における本発明の免疫抑制解除剤等の投与量は、上述した投与量よりもさらに低用量とすることもできる。

実施例１エピルビシンのＦＯＸＰ３機能阻害活性
１．材料
（ａ）細胞
ｉ）ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞（ルシフェラーゼレポーターベクターを安定に導入したＨＥＫ２９３細胞）：
ヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３（理研セルバンク）にルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ）を導入し、０．２ｍｇ／ｍＬＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ含有培地で３週間培養することによりセレクションを行った。得られたシングルクローンを単離し、安定株として樹立した。培養には、１０％熱不活化ＦＢＳ及び０．２ｍｇ／ｍＬＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢを含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）を用いた。

ｉｉ）ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞（ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞にＦＯＸＰ３遺伝子を安定導入した細胞）：
ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞に、ＦＯＸＰ３遺伝子発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１－ＦＯＸＰ３（三重大学大学院医学系研究科がんワクチン治療学／遺伝子・免疫細胞治療学研究室）を導入し、０．５ｍｇ／ｍＬＧ４１８含有培地で３週間培養することによりセレクションを行った。得られたシングルクローンを単離し、安定株として樹立した。培養には、１０％熱不活化ＦＢＳ、０．２ｍｇ／ｍＬＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ及び０．５ｍｇ／ｍＬＧ４１８を含むＤＭＥＭを用いた。

（ｂ）被験薬
ＴＯＣＲＩＳ製のエピルビシンを使用した。エピルビシンの終濃度及びＴＮＦ－ａｌｐｈａの添加の有無を表１に示す。コントロールとして、エピルビシンを添加せず、ＴＮＦ－ａｌｐｈａを添加したものを使用した。

２．方法
ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞及びＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞のそれぞれについて、１０％熱不活性化ＦＢＳ含有フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（アッセイ用培地）を用いて１．８７５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。９６ｗｅｌｌ白色マイクロプレート（ｎｕｎｃ）に８０μＬ／ｗｅｌｌ（１．５×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で播種し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で一晩培養した。
終濃度の１０００倍濃度となる被験薬ＤＭＳＯ溶液をアッセイ用培地で１００倍希釈し、終濃度の１０倍濃度となる被験薬溶液（１０倍濃度被験薬溶液）を調製した。１０μＬの１０倍濃度被験薬溶液を、細胞懸濁液を播種した各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で１時間処理した（この時、Ｃｏｎｔｒｏｌには、１０μＬの１％ＤＭＳＯ溶液を添加した。）。
ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＴＮＦ－ａｌｐｈａ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにて１００μｇ／ｍＬとし、さらにアッセイ用培地で希釈することにより３ｎｇ／ｍＬＴＮＦ－ａｌｐｈａ溶液を調製した。１０μＬの３ｎｇ／ｍＬＴＮＦ－ａｌｐｈａ溶液を、上述の各ｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ₂の条件で２．５時間刺激した（ＴＮＦ－ａｌｐｈａ終濃度：０．３ｎｇ／ｍＬ）。
培養上清を除去し、１００μＬのアッセイ用培地にて１回洗浄した。１００μＬのアッセイ用培地を添加後、５０μＬのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。遮光してプレートシェーカーにて１０分間振とうした。振とう後、化学発光の強度をＡＲＶＯＬｉｇｈｔｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）にて測定した。尚、各試験は３回行った。ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞を使用した場合の結果を図１（Ａ）に、ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞を使用した場合の結果を図１（Ｂ）に示す。

３．結果
ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞では、エピルビシンの濃度依存的に化学発光強度が増していた（図１（Ａ））。特にエピルビシンを０．１μＭ暴露した溶液ではコントロールと比較してＰ＜０．０５で、０．３又は１μＭ暴露した溶液ではコントロールと比較してＰ＜０．０１で化学発光強度が有意に高かった。一方、ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞では濃度依存的な変化が確認されなかった（図１（Ｂ））。このことから、エピルビシンがＦＯＸＰ３の機能を選択的に阻害していることが確認された。

実施例２アントラサイクリン系抗生物質のＦＯＸＰ３機能阻害活性
複数のアントラサイクリン系抗生物質（エピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン及びイダルビシン）について、ＦＯＸＰ３機能阻害活性を確認した。
１．材料
ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞及びＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞、並びにエピルビシンは実施例１と同様のものを使用した。
ピラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン及びイダルビシンは、何れもＳＩＧＭＡＡＬＤＲＩＣＨ製のものを使用した。

２．方法
実施例１の被験薬を、それぞれエピルビシン、ピラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシンとして、同様の方法でＦＯＸＰ３阻害活性を評価した。各被験薬の終濃度は０．０１、０．０３、０．１、０．３、１μＭ（１μＭは、エピルビシン及びドキソルビシンのみ。またイダルビシンは０．０１、０．０３μＭのみ行った）とした。
化学発光強度は、被験薬に代えてＤＭＳＯを添加した条件（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の強度を１．０として倍数値で計算した。さらに化学発光強度比を下記〔式１〕により計算した。試験は３回行った。結果を表２に示す。

〔式１〕
化学発光強度比＝（ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ／ＦＯＸＰ３細胞を用いた際に測定された化学発光強度）／（ＨＥＫ２９３／ＮＦ－κＢ－ＲＥ細胞を用いた際に測定された化学発光強度）

３．結果
すべてのアントラサイクリン系抗生物質でＦＯＸＰ３阻害活性が見られた（表２）。特にエピルビシンは、濃度依存的に活性が増加し、ＦＯＸＰ３阻害剤として最も好ましいことが確認された。

実施例３エピルビシンによるマウス制御性Ｔ細胞の免疫抑制作用の解除－１
（１）材料
ＢＡＬＢ／ｃマウスは日本ＳＬＣより購入した。
（２）方法
抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ、ｅバイオサイエンス製）を１２ｗｅｌｌ平底プレートに添加し、４℃で一夜静置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を単離し、マウス制御性Ｔ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製）及びａｕｔｏＭＡＣＳｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製）を用いてＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔリンパ球を単離した。抗ＣＤ３抗体をコートした１２ウェル平底プレートに１ｗｅｌｌ当たり７０万個のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔリンパ球を添加し、抗ＣＤ２８抗体（ｅバイオサイエンス製）及びＩＬ－２（ノバルティス）をそれぞれ１μｇ／ｍＬ及び６０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。次いで種々の濃度でエピルビシンを添加し、３７℃インキュベーターで４８時間培養した後に１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。
抗ＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ、ｅバイオサイエンス製）を９６ｗｅｌｌ平底プレートに添加し、４℃で一夜静置した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した。ＢＡＬＢ／ｃマウスから脾臓を単離し、マウスＣＤ８⁺Ｔ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製）及びａｕｔｏＭＡＣＳｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製）を用いてＣＤ８⁺Ｔリンパ球を単離した。これをカルボキシフルオレセインスクシンイミドイルエステル（ＣＦＳＥ）で染色した後に洗浄した。抗ＣＤ３抗体をコートした９６
ｗｅｌｌ平底プレートに１ウェル当たり４万個のＣＤ８⁺Ｔリンパ球を添加し、さらに上記のＣＤ４⁺ＣＤ２５⁺Ｔリンパ球を添加し１ｗｅｌｌ当たり４万個で添加した。抗ＣＤ２８抗体（ｅバイオサイエンス製）を１μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃インキュベーターで７２時間培養した。細胞を回収し、０．５％ＢＳＡ入りＰＢＳで洗浄した後、抗ＣＤ８－ＡＰＣ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）で染色し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて分析した。

（３）結果
制御性Ｔ細胞の非存在下では、ＣＤ８⁺Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）の増殖率は高い値を示すが、制御性Ｔ細胞の存在下では、増殖率は４０％程度減少した（図２）。しかし、細胞傷害活性を示さない低用量のエピルビシンを添加すると、濃度依存的にＣＤ８⁺Ｔ細胞の増殖率は増加した（図２）。実施例３の結果より、低用量のエピルビシンの添加により、制御性Ｔ細胞による免疫抑制作用が解除されることが判明した。

実施例４エピルビシンによるマウス制御性Ｔ細胞の免疫抑制作用の解除－２
（１）材料
ＢＡＬＢ／ｃマウスは日本ＳＬＣより購入した。ＣＭＳ５ａ細胞はメモリアルスローンケタリングがんセンターより入手した。
（２）方法
０日目において、メスＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループあたり８匹）の後背部皮下にＣＭＳ５ａ細胞を移植した。エピルビシン（０．１，０．３，１ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水が３，５，７日に静注で与えられた（当該濃度では、エピルビシンは抗がん作用を示さない）。８日目に、マウスは安楽死され、腫瘍を回収した。ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ製）を説明書に従って使用し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を腫瘍から分離した。集められた細胞は、２４ｗｅｌｌプレートに播種され、ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）とｉｏｎｏｍｙｃｉｎで３７℃、１時間の条件で刺激され、その後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ^TM（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で６時間培養した。細胞を回収後、ＰｒｅＣＰ－ＣｙＴＭ５．５ｒａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＣＤ４抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ製）とＶ５００ｒａｔａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅＣＤ８ａ抗体（ＢＤＨｏｒｉｚｏｎ製）で、４℃で１５分間の条件で細胞を染色した。染色された細胞は、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅａｎｄＤｉｌｕｅｎｔ（１：３，ｅＢｉｏｓｃｉｎｃｅ製）で、４℃一晩の条件で固定された。洗浄後、Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）が加えられ、固定された細胞は、ＰＥ結合抗マウス／ラットＦＯＸＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）、抗マウスＩＦＮ－γ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）およびＰＥ結合抗マウスＩＬ－２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）抗体で染色された。染色された細胞は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて分析された。

（３）結果
ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３⁺，ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３^-の各細胞数に対するＩＦＮ－γ陽性細胞の割合を図３（Ａ）及び（Ｂ）に示す。ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３^-の群では、ＩＦＮ－γ陽性細胞の割合はエピルビシンの投与によって変化しないが、ＣＤ４⁺ＦＯＸＰ３⁺の群では、濃度依存的にＩＦＮ－γ陽性細胞の割合は増加し、免疫が活性化されていることが示された。

以上より、実施例１～３の結果からは、ｉｎｖｉｔｒоにおいて低用量のエピルビシンにより、ＦＯＸＰ３の機能が阻害されること及び制御性Ｔ細胞による免疫抑制作用が解除されること、実施例４の結果からは、ｉｎｖｉｖоにおいて低用量のエピルビシンの投与により、炎症性サイトカインであるＩＦＮ－γが産生されることが判明し、免疫が活性化されることが判明した。

Claims

エピルビシン又はその塩を有効成分とする、エピルビシン又はその塩が有する細胞傷害活性を発揮し得ない量で投与されるＦＯＸＰ３機能阻害剤であって、前記細胞傷害活性を発揮し得ない量は、固形がん又は血液がんに対して細胞傷害活性を示す量の１／１００～１／４の量、あるいは、がん細胞に対して細胞傷害活性を示す量よりも低用量である１日あたり０．０１～０．２５ｍｇ／ｋｇの用量である、ＦＯＸＰ３機能阻害剤。
他の抗がん療法と組み合わせて使用される請求項１記載のＦＯＸＰ３機能阻害剤。
他の抗がん療法が、がん化学療法又はがん免疫療法である請求項２記載のＦＯＸＰ３機能阻害剤。
がん免疫療法が、免疫チェックポイント阻害療法、がんワクチン療法又はＴ細胞輸注療法である請求項３記載のＦＯＸＰ３機能阻害剤。