JP7067189B2

JP7067189B2 - グリコヘモグロビン分析におけるデータ処理方法

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Publication number: JP7067189B2
Application number: JP2018061708A
Authority: JP
Inventors: 原一植松
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2022-05-16
Anticipated expiration: 2038-03-28
Also published as: JP2019174242A

Description

本発明は、液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定における、正確な定量計算結果を提供する方法に関する。

クロマトグラフィは多種の成分から成る試料を、分離、定量する目的で、多様な分野で用いられている。各成分ピークの面積または高さによる定量を目的として、クロマトグラフィを行う場合、正確にピーク面積を算出することが求められる。そのため、理想的には個別の成分を完全に分離することが望ましいが、現実的にはいくつかの成分は完全には分離できない場合がある。

ピークの形状が乱れる要因としては、目的成分とカラム、溶離液の関連性から生じる障害、カラムへの試料の過負荷、直接的な分離場以外のデッドボリュームの影響、カラム内の温度勾配などが挙げられる。また、グラジエント溶出を行う場合は、経時的に溶出力が変化することで、ピーク形状が左右対称とはならないことがある。特に、溶離液を段階的に切り返す「ステップワイズグラジエント溶出」では、本現象が顕著になる場合がある。これ以外にも、検出器由来で定量精度を悪化させる場合もある。何れの検出器においても、濃度に対して出力される信号が直線的に変化することが望ましいが、直線性が維持できる濃度範囲は限定され、それ以上の濃度では濃度に対する出力の変化率が大きく下がったり、変化しなくなる。直線性が大きく崩れた濃度では正確な定量分析を行うことができない。

前述の様々な要因から、グリコヘモグロビン分析の際も、各成分のピーク形状は、左右対称の形状をとることはない。また、健常人のＳ－Ａ１ｃ％は５～６％であり、Ａ０は全体の９０％程度を占めているため、Ａ０ピークの強度（ピーク高さ）が極端に大きくなっており、Ｓ－Ａ１ｃの面積％を正確に算出するには、微小なＳ－Ａ１ｃピークおよび巨大なＡ０ピークも正確に定量する必要がある。つまり、使用する検出器には検量域が広いことが求められるが、患者検体は個体差もあり、Ａ０ピークが検量域を逸脱し、測定結果の信頼性が低くなることもある。

本発明の課題は、液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、分離が不十分なピーク、検出器の直線性が劣った濃度領域で測定されたピークであっても、正確なピーク面積値が得られる処理方法を提供することである。

本発明は前記課題を解決する為になされたものであり、ピークの形状が理論的に正しい形状を示す領域を基に、それ以外の領域のピーク形状を数学的に算出し、ピーク全体の形状を正確に表現し、正確な定量計算を可能とする手法である。

すなわち、本発明は、液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、クロマトグラムのピークを構成する一部領域の出力データおよび前記クロマトグラムのベースラインを構成する一部領域の出力データに基づき、非正規分布でかつピーク形状を示す関数を用いてカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いて定量計算を行うことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法である。

非正規分布かつピーク形状となる関数（以下、「処理関数」ということがある）は、下記（数１）から（数５）のような公知の関数を使用することができるが、これらの関数に限定されるものではない。なお、ｙは出力、ｘは時間であり、ｘｃ、ｙ０、Ａ、ｗ、ｗ１、ｗ２、ｗ３はそれぞれ係数である。

まず、本発明の手順について説明する。
（工程１）
処理関数を選択し、対応する係数の初期値を指定する。初期値としては、ｘｃは処理を行うピークの頂点の時間、ｙ０は処理を行うピークのベース出力値、Ａは処理を行うピークの出力値（ピーク高さ）、ｗ，ｗ１，ｗ２，ｗ３は処理を行うピークの半値幅を目安として用いると良い。
（工程２）
処理対象であるクロマトグラムのピーク（ピーク群を含む）に対して、２以上のフィッティング区間を指定する。なお、前記工程１及び本工程の順番は逆でもよく、特に限定するものではない。
（工程３）
前記フィッティング区間での、前記工程１で初期値を指定した処理関数の計算値との差分、次いで差分の二乗を算出し、差分の二乗の総和（以下、「誤差」という）を求める。
（工程４）
誤差が最小になるように、処理関数の係数を順次変化させて、最適な係数を求める。本工程には、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社の表計算ソフトＥｘｃｅｌ２０１０に搭載されている「ソルバー」や、類似した機能を有するソフトを用いることで簡便に行える。
（工程５）
誤差が最小となった、処理関数の係数を用いて、ピーク群をフィッティングし、定量（面積）計算を実施する。

次に、本発明をＡ０ピークに適用する場合について説明する。

図１ｂに示すように、検出器の濃度に対する出力は、ある一定濃度から、濃度変化に対する出力変化が鈍化してくる場合がある。直線性が良好な状態では正規分布に近いピーク形状が得られるが、直線性が一定濃度から悪くなる場合は図１ａに示すようなピーク頂点部付近が鈍ったピーク形状となり、Ａ０ピークもまさにそのようなピークに該当する。

図２のように、ピーク出力（検出器出力）が７５以上で直線性が失われるような場合を想定すると、時間（横軸）が０～１．４分、２．５５～５．０分は濃度と出力は直線関係が得られ、１．４～２．５５分は濃度と出力は直線関係がないことになる。このような場合、図２ａの破線のようなピーク形状となるべきであるにも関わらず、実際に得られる信号は実線のようになる。実線の形状を基にしたピーク面積は、破線の形状を基にしたピーク面積より小さく算出されてしまう。そこで、実際に得られたピーク形状と理想的なピーク形状が同一になる領域（ピークの立ち上がり部分とピークの立ち下り部分のデータ点群）を使用して、ピーク全体の形状を計算で予測し、面積計算（定量計算）を実施する。

図２の場合、ピーク立ち上がり部分は最小で０分から１．４分までとなるが、ベースラインのドリフト等の影響を排除する目的で、実際にピークが立ち上がった時間０．７２分から出力の直線性が保てる上限付近１．４分までと規定する（斜線領域）。同様にピーク立ち下がり部分は２．５５分から最大で５．０分までとなるが、直線性が保てる上限付近２．５５分から、実際にピークが立ち下がった時間３．２分までと規定する（斜線領域）。更に、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点を規定する（図２ｂ）。これらのデータ群をフィッティング区間として、前述した手順によりフィッティングを行う。処理関数に非対称二重シグモイド関数を用いて、係数を順次変化させていくと表１のようになった。

図２ｃは前記操作を基に得られた最適パラメータ（ｔｒｙ３）での近似曲線を模式的に示した図である（図中、破線）。図３からも分かるようにフィッティング区間での乖離は殆どなく、最適なフィッティングがなされていることが分かる。ピークの頂点付近（１．５～２．０分）では計算された曲線と元のクロマトグラムとの乖離が逆に大きくなっており、このことからも、この領域では理想的なピーク形状を示していなかったことも分かる。

次に、本発明をＳ－Ａ１ｃピークに適用する場合について説明する。

Ｓ－Ａ１ｃピークは図４のような、主成分とそれ以外の複数成分から構成され、分離が不十分なピーク群である。

図４のように、２．０分に主成分（第１成分）となる大きなピーク、１．０分に微小成分（第２成分）となる小さなピーク、３．２分に微小成分（第３成分）となる小さなピークが存在するような場合を想定すると、０．５分～１．３分程度までは第１成分と第２成分、２．５分～３．９分程度までは第１成分と第３成分が混在している。その一方、ピークの頂点付近は主成分である第１成分の単一成分の領域となる。この場合、約１．５分～２．４５分は第一成分のみであることが推測される。

そこで、図５のように、実際に得られたピーク形状と理想的なピーク形状が同一になる領域、つまり、ピークの頂点付近のデータ点群を使用して、ピーク全体の形状を計算で予測し、面積計算（定量計算）を実施する。微小の第２成分の混入がないと推測される１．５分から、微小の第３成分の混入がないと推測される２．４５分までを計算領域として規定する（斜線領域）。更に、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点を規定する（図５ｂ）。これらのデータ群をフィッティング区間として、前述した手順によりフィッティングを行う。処理関数に非対称二重シグモイド関数を用いて、係数を順次変化させていくと表２のようになった。

図５ｃは前記操作を基に得られた最適パラメータ（ｔｒｙ３）での近似曲線を模式的に示した図である（図中、破線）。図６からも分かるように計算区間での乖離は殆どなく、最適なフィッティングがなされていることが分かる。ピークの裾野付近（０．８～１．３分、２．７～３．７分）では逆に計算された曲線と元のクロマトグラムとの乖離が大きくなっており、このことからも、この領域では主成分以外の微小成分が混入していることを示唆していることが分かる。

液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、分離が不十分なピーク、検出器の直線性が劣った濃度領域で測定されたピークであっても、正確なピーク面積値が得られる。

検出器出力が飽和した状態の単一ピークを模式的に示した図である。単一ピークに対して本発明の計算処理を実施する場合を説明した図である。単一ピークに対して本発明の計算処理を実施する場合の最終結果（誤差最小点）を示した図である。複数成分から成るピーク形状および、その構成ピーク群を模式的に示した図である。複数成分から成るピーク群に対して本発明の計算処理を実施する場合を説明した図である。複数成分から成るピーク群に対して計算処理を実施する場合の最終結果（誤差最小点）を示した図である。実施例１および２を行ったシステム構成を示した図である。実施例１および２で、比較のために用いた、標準的なグリコヘモグロビンの分離パターンおよびレポート出力を示した図である。実施例１で用いた検体のクロマトグラムである。実施例１における、希釈率１／４０でのクロマトグラムを示した図である。実施例１における、希釈率に対するＡ０ピークの面積値をプロットした図である。実施例２における、グリコヘモグロビン分離クロマトグラムにおける各成分の構成を簡易的に示した図である。実施例２における、Ｓ－Ａ１ｃピークの近似結果を示したクロマトグラムである。実施例２における、Ｓ－Ａ１ｃ面積％と、分離が良好である標準条件で一般的なピーク検出（縦切り）で得られたＳ－Ａ１ｃ面積％の相関を示した図である。

以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

フィッティングに用いる処理関数としては非対称二重シグモイド関数を用い、繰り返し計算により誤差を最小にする手段として、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社の表計算ソフトＥｘｃｅｌ２０１０を使用して計算を実施した。本表計算ソフトの機能の一種である「ソルバー」は、複数の変数を含む数式において、目標とする値を得るための、最適な変数の値を求めることができる機能である。ソルバー機能を使用して、誤差を最小化させるためのパラメータを検索した。

まず、関数の係数の初期値を入力した。ｘｃは大まかなピーク溶出時間を指定し、±１０％の範囲で変化させる制約を設けた。フィッティングを行うクロマトグラムの時間、出力を入力し、対応するｘ（時間）での解を求め、実際の出力と計算の解との差の二乗を計算した。各区間の差の二乗の総和（誤差）を計算し、ソルバー機能を使用して、誤差が最小となるように、係数を変化させ、繰り返し計算を行った。

（実施例１）
液体クロマトグラフィ法によるグリコヘモグロビンの測定を行い、Ａ０ピークに適用した。

測定装置として、東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ＧＶＩＩＩを使用した。図７に主なシステム構成を示す。

本装置の場合、３液ステップグラジエント方式で血液検体はカラムで分離され、分離されたヘモグロビン成分は波長４１５ｎｍの吸光度により検出される。３液ステップグラジエントとは、イオン交換カラムを用いて、３種類の溶離液をステップワイズに切り替え各成分を分離する方式であり、検体注入から０．１１分（Ｔ１）まで溶離液１、０．１１分（Ｔ１）から０．５３分（Ｔ２）まで溶離液２、０．５３分（Ｔ２）から０．６３分（Ｔ３）まで溶離液３を送液し、溶離液１に戻す。

図８ａは東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ－７２３ＧＶＩＩＩで得られる典型的なクロマトグラム（レポート）である。図８ｂはＳ－Ａ１ｃピーク付近を拡大、図８ｃは全体を示したクロマトグラムである。これらの図から分かるように、主目的であるＳ－Ａ１ｃピークとＡ０ピークでは、ピーク高さで５０倍程度の差異がある。

Ｓ－Ａ１ｃ測定においては、通常、血液検体（全血）を溶血／希釈液にて１／１５０程度に希釈して測定を行っている。本実施例では、血液検体（全血）を１／４０希釈、１／５０希釈、１／６０希釈、１／８０希釈、１／１００希釈、１／１５０希釈、１／２００希釈、１／２５０希釈し、測定を行った。得られたクロマトグラムを図９に示す。なお、左図はＳ－Ａ１ｃピーク付近を拡大した図、右図は出力軸を固定し、Ａ０ピーク形状、出力値が分かるように全体を示した図である。

最も濃度が高い希釈率１／４０（図９ａ）と一般的な濃度である希釈率１／１５０（図９ｂ）を比較すると、Ａ０のピーク形状が大きく異なることが分かる。一般的な濃度である希釈率１／１５０のＡ０ピークはシャープであるのに対して、最も濃度が高い希釈率１／４０のＡ０ピークは頂点付近が歪んでいる。

検出器信号が約１５００ｍＶまでは直線性が担保でき、それ以上では検出器信号が飽和に近づくと仮定し、Ａ０ピークの立ち上がり部の１５００ｍＶ以下のデータ点群、Ａ０ピークの立下り部の１５００ｍＶ以下のデータ点群、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点の４つの領域をフィッティング区間として、濃度が高い希釈率１／４０、希釈率１／５０、希釈率１／６０のクロマトグラムに対して、本発明を適用した。最適化された処理関数の係数はそれぞれ以下の通りとなった。

図１０ａは希釈率１／４０の試料の、クロマトグラムおよび計算対象となるデータ点、図１０ｂはＡ０付近を拡大した図である。図１０ｃは前記処理により得られたＡ０ピーク形状を示した図である。実線は未処理のクロマトグラム、破線は計算結果により得られたＡ０の形状を示している。図から分かるように、本計算処理により得られたＡ０ピークは未処理のＡ０ピークより出力（高さ）が５００ｍＶ程度大きくなり、ピーク形状の歪みも少なくなっていることが分かる。

図１１は前記で得られたＡ０ピーク形状を基にした面積と、未処理のクロマトグラムでのＡ０ピークの面積を希釈率に対してプロットした図である。ここからも分かるように、生データ（クロマトグラム）から得られるＡ０の面積は検体の希釈率が１／６０の濃度以上では直線性が担保できていないが、本発明の処理を行うことで直線性の改善が見られた。

これにより、本発明の処理を施したＡ０の面積を基にしたＳ－Ａ１ｃ％は、このような高濃度域であっても、より正確に算出できるようになる。

（実施例２）
実施例１と同様に液体クロマトグラフィ法によるグリコヘモグロビンの測定を行い、Ｓ－Ａ１ｃピークに適用した。

本実施例では、Ｌ－Ａ１ｃ～Ｓ－Ａ１ｃピーク、Ｓ－Ａ１ｃ～Ａ０ピークの分離が不十分な状態でも、正確にＳ－Ａ１ｃ％が算出できるか検証するために、前述の溶離液切り替えのステップワイズの時間、および流量を調整し、測定時間を４０％短縮したクロマトグラムを対象に行った。

図１２は本検証に使用したクロマトグラムの一例である。この条件では、約０．４２分にＳ－Ａ１ｃピーク、約０．５０分にＡ０ピークが溶出する。図９の標準条件のクロマトグラムと比較してわかるように、Ｌ－Ａ１ｃ～Ｓ－Ｓ１ｃピーク、Ｓ－Ｓ１ｃ～Ａ０ピークの分離が悪くなっていることが分かる。

Ｓ－Ａ１ｃピークトップを含む、０．４１０～０．４５３分まで（データ点：２５点）、および、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点を計算対象としたデータ点群をフィッティング区間として指定し、本発明を適用した（図１３参照）。

本処理を実施した場合の正確性を検証するため、臨床的にＡ１ｃ％を計測する条件で得られる値との比較を実施した。比較対象は東ソー（株）グリコヘモグロビン分析計ＧＨｂＶＩＩＩの標準モードでのＳ－Ａ１ｃ％を用いた（分析時間１．０分）。本実施例で使用した分離が不十分なクロマトグラム（分析時間約０．６分）に対して、本発明のデータ処理方法を施し算出したＳ－Ａ１ｃ％との相関を図１４に示す。横軸にＧＨｂＶＩＩＩ標準モードで得られたＳ－Ａ１ｃ％（分離良好でピーク縦切り処理）、本縦軸に本実施例で得られたＳ－Ａ１ｃ％をプロットした図である。なお、検体は全血７検体、コントロール（高値、低値）、標準（高値、低値）を使用した（各ｎ＝２測定）。

相関式はｙ＝０．９９２３ｘ－０．０００３、Ｒ＾２は０．９９９１であり、相関式の傾きはほぼ１であり、切片も極小であり、Ｒ＾２も１に極近いことから、両者の値は、相関が非常に良好であり、ほぼ同じ値が得られていることを示している。

以上のことから、本発明を、分離が良好ではないグリコヘモグロビンのクロマトグラムに対して適用しても、正確にＳ－Ａ１ｃ％を算出できることが確認された。

１．溶離液Ａ
２．溶離液Ｂ
３．溶離液Ｃ
４．溶血／希釈液
５．脱気装置
６．電磁弁
７．送液ポンプ
８．検体希釈／注入装置
９．予熱コイル
１０．プレフィルタ
１１．分析カラム
１２．オーブン
１３．可視検出器
１４．廃液

Claims

液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、クロマトグラムのピークを構成するＡ０ピークの立ち上がり部および立ち下がり部の出力データおよび前記クロマトグラムのベースラインを構成する一部領域の出力データに基づき、非正規分布でかつピーク形状を示す関数を用いてカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いて定量計算を行うことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法。
液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、クロマトグラムのピークを構成するＳ－Ａ１ｃピークの極大部の出力データおよび前記クロマトグラムのベースラインを構成する一部領域の出力データに基づき、非正規分布でかつピーク形状を示す関数を用いてカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いて定量計算を行うことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法。
液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、クロマトグラムのピークを構成するＡ０ピークの立ち上がり部および立ち下がり部と、Ｓ－Ａ１ｃピークの極大部の出力データおよび前記クロマトグラムのベースラインを構成する一部領域の出力データに基づき、非正規分布でかつピーク形状を示す関数を用いてカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いて定量計算を行うことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法。
前記非正規分布でかつピーク形状を示す関数が、非対称二重シグモイド関数であることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のデータ処理方法。