JP7067189B2 - Data processing method in glycohemoglobin analysis - Google Patents
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Description
本発明は、液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定における、正確な定量計算結果を提供する方法に関する。 The present invention relates to a method for providing accurate quantitative calculation results in glycohemoglobin measurement by liquid chromatography.
クロマトグラフィは多種の成分から成る試料を、分離、定量する目的で、多様な分野で用いられている。各成分ピークの面積または高さによる定量を目的として、クロマトグラフィを行う場合、正確にピーク面積を算出することが求められる。そのため、理想的には個別の成分を完全に分離することが望ましいが、現実的にはいくつかの成分は完全には分離できない場合がある。 Chromatography is used in various fields for the purpose of separating and quantifying a sample composed of various components. When performing chromatography for the purpose of quantification based on the area or height of each component peak, it is required to accurately calculate the peak area. Therefore, ideally, it is desirable to completely separate the individual components, but in reality, some components may not be completely separated.
ピークの形状が乱れる要因としては、目的成分とカラム、溶離液の関連性から生じる障害、カラムへの試料の過負荷、直接的な分離場以外のデッドボリュームの影響、カラム内の温度勾配などが挙げられる。また、グラジエント溶出を行う場合は、経時的に溶出力が変化することで、ピーク形状が左右対称とはならないことがある。特に、溶離液を段階的に切り返す「ステップワイズグラジエント溶出」では、本現象が顕著になる場合がある。これ以外にも、検出器由来で定量精度を悪化させる場合もある。何れの検出器においても、濃度に対して出力される信号が直線的に変化することが望ましいが、直線性が維持できる濃度範囲は限定され、それ以上の濃度では濃度に対する出力の変化率が大きく下がったり、変化しなくなる。直線性が大きく崩れた濃度では正確な定量分析を行うことができない。 Factors that disturb the shape of the peak include damage caused by the relationship between the target component and the column and the eluent, sample overload on the column, the effect of dead volume other than the direct separation field, and the temperature gradient in the column. Can be mentioned. In addition, when gradient elution is performed, the peak shape may not be symmetrical due to changes in the melt output over time. In particular, this phenomenon may become remarkable in "stepwise gradient elution" in which the eluent is gradually cut back. In addition to this, there are cases where the quantification accuracy is deteriorated due to the origin of the detector. In any detector, it is desirable that the signal output with respect to the concentration changes linearly, but the concentration range in which the linearity can be maintained is limited, and at higher concentrations, the rate of change in the output with respect to the concentration is large. It goes down and doesn't change. Accurate quantitative analysis cannot be performed at concentrations where the linearity is greatly disrupted.
前述の様々な要因から、グリコヘモグロビン分析の際も、各成分のピーク形状は、左右対称の形状をとることはない。また、健常人のS-A1c%は5~6%であり、A0は全体の90%程度を占めているため、A0ピークの強度(ピーク高さ)が極端に大きくなっており、S-A1cの面積%を正確に算出するには、微小なS-A1cピークおよび巨大なA0ピークも正確に定量する必要がある。つまり、使用する検出器には検量域が広いことが求められるが、患者検体は個体差もあり、A0ピークが検量域を逸脱し、測定結果の信頼性が低くなることもある。 Due to the various factors mentioned above, the peak shape of each component does not take a symmetrical shape even in the glycohemoglobin analysis. Further, since S-A1c% of a healthy person is 5 to 6% and A0 occupies about 90% of the whole, the intensity (peak height) of the A0 peak is extremely large, and S-A1c. In order to accurately calculate the area% of, it is necessary to accurately quantify the minute S-A1c peak and the huge A0 peak. That is, although the detector to be used is required to have a wide calibration range, there are individual differences in the patient sample, and the A0 peak may deviate from the calibration range, resulting in low reliability of the measurement result.
本発明の課題は、液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、分離が不十分なピーク、検出器の直線性が劣った濃度領域で測定されたピークであっても、正確なピーク面積値が得られる処理方法を提供することである。 An object of the present invention is a process for obtaining an accurate peak area value even in a peak measured in a concentration region where separation is insufficient or the linearity of the detector is inferior in the measurement of glycohemoglobin by liquid chromatography. To provide a method.
本発明は前記課題を解決する為になされたものであり、ピークの形状が理論的に正しい形状を示す領域を基に、それ以外の領域のピーク形状を数学的に算出し、ピーク全体の形状を正確に表現し、正確な定量計算を可能とする手法である。 The present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and the peak shapes of other regions are mathematically calculated based on the region where the peak shape shows a theoretically correct shape, and the shape of the entire peak is formed. It is a method that accurately expresses and enables accurate quantitative calculation.
すなわち、本発明は、液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、クロマトグラムのピークを構成する一部領域の出力データおよび前記クロマトグラムのベースラインを構成する一部領域の出力データに基づき、非正規分布でかつピーク形状を示す関数を用いてカーブフィッティングを行い、前記カーブフィッティングの結果を用いて定量計算を行うことを特徴とするクロマトグラムのデータ処理方法である。 That is, the present invention has a non-normal distribution based on the output data of a part of the region constituting the peak of the chromatogram and the output data of the part of the region constituting the baseline of the chromatogram in the measurement of glycohemoglobin by liquid chromatography. Moreover, it is a chromatogram data processing method characterized in that curve fitting is performed using a function indicating a peak shape and quantitative calculation is performed using the result of the curve fitting.
非正規分布かつピーク形状となる関数(以下、「処理関数」ということがある)は、下記(数1)から(数5)のような公知の関数を使用することができるが、これらの関数に限定されるものではない。なお、yは出力、xは時間であり、xc、y0、A、w、w1、w2、w3はそれぞれ係数である。 As a function having a non-normal distribution and a peak shape (hereinafter, may be referred to as a "processing function"), known functions such as the following (Equation 1) to (Equation 5) can be used, but these functions Not limited to. Note that y is an output, x is a time, and xc, y0, A, w, w1, w2, and w3 are coefficients, respectively.
まず、本発明の手順について説明する。
(工程1)
処理関数を選択し、対応する係数の初期値を指定する。初期値としては、xcは処理を行うピークの頂点の時間、y0は処理を行うピークのベース出力値、Aは処理を行うピークの出力値(ピーク高さ)、w,w1,w2,w3は処理を行うピークの半値幅を目安として用いると良い。
(工程2)
処理対象であるクロマトグラムのピーク(ピーク群を含む)に対して、2以上のフィッティング区間を指定する。なお、前記工程1及び本工程の順番は逆でもよく、特に限定するものではない。
(工程3)
前記フィッティング区間での、前記工程1で初期値を指定した処理関数の計算値との差分、次いで差分の二乗を算出し、差分の二乗の総和(以下、「誤差」という)を求める。
(工程4)
誤差が最小になるように、処理関数の係数を順次変化させて、最適な係数を求める。本工程には、Microsoft社の表計算ソフトExcel2010に搭載されている「ソルバー」や、類似した機能を有するソフトを用いることで簡便に行える。
(工程5)
誤差が最小となった、処理関数の係数を用いて、ピーク群をフィッティングし、定量(面積)計算を実施する。
First, the procedure of the present invention will be described.
(Step 1)
Select a processing function and specify the initial value of the corresponding coefficient. As initial values, xc is the time of the apex of the peak to be processed, y0 is the base output value of the peak to be processed, A is the output value (peak height) of the peak to be processed, and w, w1, w2, w3 are. It is good to use the half width of the peak to be processed as a guide.
(Step 2)
Two or more fitting intervals are specified for the peaks (including the peak group) of the chromatogram to be processed. The order of the
(Step 3)
In the fitting section, the difference from the calculated value of the processing function for which the initial value is specified in the
(Step 4)
The coefficient of the processing function is sequentially changed so that the error is minimized, and the optimum coefficient is obtained. This step can be easily performed by using the "solver" installed in the spreadsheet software Excel2010 of Microsoft Corporation or software having a similar function.
(Step 5)
The peak group is fitted using the coefficient of the processing function with the minimum error, and the quantitative (area) calculation is performed.
次に、本発明をA0ピークに適用する場合について説明する。 Next, a case where the present invention is applied to the A0 peak will be described.
図1bに示すように、検出器の濃度に対する出力は、ある一定濃度から、濃度変化に対する出力変化が鈍化してくる場合がある。直線性が良好な状態では正規分布に近いピーク形状が得られるが、直線性が一定濃度から悪くなる場合は図1aに示すようなピーク頂点部付近が鈍ったピーク形状となり、A0ピークもまさにそのようなピークに該当する。 As shown in FIG. 1b, the output of the detector with respect to the concentration may slow down from a certain concentration to the change of concentration. When the linearity is good, a peak shape close to the normal distribution can be obtained, but when the linearity deteriorates from a certain concentration, the peak shape becomes dull near the peak apex as shown in FIG. 1a, and the A0 peak is exactly that. It corresponds to such a peak.
図2のように、ピーク出力(検出器出力)が75以上で直線性が失われるような場合を想定すると、時間(横軸)が0~1.4分、2.55~5.0分は濃度と出力は直線関係が得られ、1.4~2.55分は濃度と出力は直線関係がないことになる。このような場合、図2aの破線のようなピーク形状となるべきであるにも関わらず、実際に得られる信号は実線のようになる。実線の形状を基にしたピーク面積は、破線の形状を基にしたピーク面積より小さく算出されてしまう。そこで、実際に得られたピーク形状と理想的なピーク形状が同一になる領域(ピークの立ち上がり部分とピークの立ち下り部分のデータ点群)を使用して、ピーク全体の形状を計算で予測し、面積計算(定量計算)を実施する。 Assuming that the peak output (detector output) is 75 or more and the linearity is lost as shown in FIG. 2, the time (horizontal axis) is 0 to 1.4 minutes and 2.55 to 5.0 minutes. A linear relationship is obtained between the concentration and the output, and there is no linear relationship between the concentration and the output for 1.4 to 2.55 minutes. In such a case, although the peak shape should be as shown by the broken line in FIG. 2a, the signal actually obtained is as shown by the solid line. The peak area based on the shape of the solid line is calculated to be smaller than the peak area based on the shape of the broken line. Therefore, the shape of the entire peak is predicted by calculation using the region (data point cloud of the rising part of the peak and the falling part of the peak) where the actually obtained peak shape and the ideal peak shape are the same. , Carry out area calculation (quantitative calculation).
図2の場合、ピーク立ち上がり部分は最小で0分から1.4分までとなるが、ベースラインのドリフト等の影響を排除する目的で、実際にピークが立ち上がった時間0.72分から出力の直線性が保てる上限付近1.4分までと規定する(斜線領域)。同様にピーク立ち下がり部分は2.55分から最大で5.0分までとなるが、直線性が保てる上限付近2.55分から、実際にピークが立ち下がった時間3.2分までと規定する(斜線領域)。更に、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点を規定する(図2b)。これらのデータ群をフィッティング区間として、前述した手順によりフィッティングを行う。処理関数に非対称二重シグモイド関数を用いて、係数を順次変化させていくと表1のようになった。 In the case of Fig. 2, the peak rising part is from 0 minutes to 1.4 minutes at the minimum, but for the purpose of eliminating the influence of baseline drift etc., the linearity of the output starts from 0.72 minutes when the peak actually rises. It is specified to be up to 1.4 minutes near the upper limit that can be maintained (shaded area). Similarly, the peak falling part is from 2.55 minutes to 5.0 minutes at the maximum, but it is specified from 2.55 minutes near the upper limit where linearity can be maintained to 3.2 minutes when the peak actually falls (the peak falls). Diagonal area). Further, in order to specify the absolute position of the baseline, a plurality of points in the region before the peak and the region after the peak where the baseline does not fluctuate are defined (FIG. 2b). Fitting is performed by the above-mentioned procedure with these data groups as the fitting section. Table 1 shows the results when the coefficients are sequentially changed by using the asymmetric double sigmoid function as the processing function.
図2cは前記操作を基に得られた最適パラメータ(try3)での近似曲線を模式的に示した図である(図中、破線)。図3からも分かるようにフィッティング区間での乖離は殆どなく、最適なフィッティングがなされていることが分かる。ピークの頂点付近(1.5~2.0分)では計算された曲線と元のクロマトグラムとの乖離が逆に大きくなっており、このことからも、この領域では理想的なピーク形状を示していなかったことも分かる。 FIG. 2c is a diagram schematically showing an approximate curve with the optimum parameter (try3) obtained based on the above operation (broken line in the figure). As can be seen from FIG. 3, there is almost no deviation in the fitting section, and it can be seen that the optimum fitting is performed. In the vicinity of the peak peak (1.5 to 2.0 minutes), the dissociation between the calculated curve and the original chromatogram is conversely large, and this also shows the ideal peak shape in this region. You can also see that it wasn't.
次に、本発明をS-A1cピークに適用する場合について説明する。 Next, a case where the present invention is applied to the SA1c peak will be described.
S-A1cピークは図4のような、主成分とそれ以外の複数成分から構成され、分離が不十分なピーク群である。 The SA1c peak is a group of peaks as shown in FIG. 4, which is composed of a principal component and a plurality of other components and is insufficiently separated.
図4のように、2.0分に主成分(第1成分)となる大きなピーク、1.0分に微小成分(第2成分)となる小さなピーク、3.2分に微小成分(第3成分)となる小さなピークが存在するような場合を想定すると、0.5分~1.3分程度までは第1成分と第2成分、2.5分~3.9分程度までは第1成分と第3成分が混在している。その一方、ピークの頂点付近は主成分である第1成分の単一成分の領域となる。この場合、約1.5分~2.45分は第一成分のみであることが推測される。 As shown in FIG. 4, a large peak that becomes the main component (first component) at 2.0 minutes, a small peak that becomes a minute component (second component) at 1.0 minute, and a minute component (third component) at 3.2 minutes. Assuming that there is a small peak that becomes a component), the first component and the second component are from 0.5 minutes to 1.3 minutes, and the first component is from 2.5 minutes to 3.9 minutes. The component and the third component are mixed. On the other hand, the vicinity of the apex of the peak is a region of a single component of the first component which is the main component. In this case, it is estimated that about 1.5 to 2.45 minutes is only the first component.
そこで、図5のように、実際に得られたピーク形状と理想的なピーク形状が同一になる領域、つまり、ピークの頂点付近のデータ点群を使用して、ピーク全体の形状を計算で予測し、面積計算(定量計算)を実施する。微小の第2成分の混入がないと推測される1.5分から、微小の第3成分の混入がないと推測される2.45分までを計算領域として規定する(斜線領域)。更に、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点を規定する(図5b)。これらのデータ群をフィッティング区間として、前述した手順によりフィッティングを行う。処理関数に非対称二重シグモイド関数を用いて、係数を順次変化させていくと表2のようになった。 Therefore, as shown in FIG. 5, the shape of the entire peak is predicted by calculation using the region where the actually obtained peak shape and the ideal peak shape are the same, that is, the data point cloud near the peak peak. Then, perform area calculation (quantitative calculation). The calculation area is defined from 1.5 minutes, which is estimated to be free of the minute second component, to 2.45 minutes, which is estimated to be free of the minute third component (shaded area). Further, in order to specify the absolute position of the baseline, a plurality of points in the region before the peak and the region after the peak where the baseline does not fluctuate are defined (FIG. 5b). Fitting is performed by the above-mentioned procedure with these data groups as the fitting section. Table 2 shows the results when the coefficients are sequentially changed by using the asymmetric double sigmoid function as the processing function.
図5cは前記操作を基に得られた最適パラメータ(try3)での近似曲線を模式的に示した図である(図中、破線)。図6からも分かるように計算区間での乖離は殆どなく、最適なフィッティングがなされていることが分かる。ピークの裾野付近(0.8~1.3分、2.7~3.7分)では逆に計算された曲線と元のクロマトグラムとの乖離が大きくなっており、このことからも、この領域では主成分以外の微小成分が混入していることを示唆していることが分かる。 FIG. 5c is a diagram schematically showing an approximate curve with the optimum parameter (try3) obtained based on the above operation (broken line in the figure). As can be seen from FIG. 6, there is almost no dissociation in the calculation interval, and it can be seen that the optimum fitting is performed. In the vicinity of the base of the peak (0.8 to 1.3 minutes, 2.7 to 3.7 minutes), the dissociation between the curve calculated in reverse and the original chromatogram is large, which is also the reason for this. It can be seen that the region suggests that minute components other than the main component are mixed.
液体クロマトグラフィによるグリコヘモグロビン測定において、分離が不十分なピーク、検出器の直線性が劣った濃度領域で測定されたピークであっても、正確なピーク面積値が得られる。 In the glycohemoglobin measurement by liquid chromatography, accurate peak area values can be obtained even for peaks with insufficient separation and peaks measured in a concentration region where the linearity of the detector is poor.
以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically shown with reference to Examples, but the present invention is not limited to this Example.
フィッティングに用いる処理関数としては非対称二重シグモイド関数を用い、繰り返し計算により誤差を最小にする手段として、Microsoft社の表計算ソフトExcel2010を使用して計算を実施した。本表計算ソフトの機能の一種である「ソルバー」は、複数の変数を含む数式において、目標とする値を得るための、最適な変数の値を求めることができる機能である。ソルバー機能を使用して、誤差を最小化させるためのパラメータを検索した。 An asymmetric double sigmoid function was used as the processing function used for fitting, and the calculation was performed using the spreadsheet software Excel2010 manufactured by Microsoft as a means for minimizing the error by iterative calculation. "Solver", which is one of the functions of this spreadsheet software, is a function that can obtain the optimum value of a variable in order to obtain a target value in a mathematical formula including a plurality of variables. We used the solver function to search for parameters to minimize the error.
まず、関数の係数の初期値を入力した。xcは大まかなピーク溶出時間を指定し、±10%の範囲で変化させる制約を設けた。フィッティングを行うクロマトグラムの時間、出力を入力し、対応するx(時間)での解を求め、実際の出力と計算の解との差の二乗を計算した。各区間の差の二乗の総和(誤差)を計算し、ソルバー機能を使用して、誤差が最小となるように、係数を変化させ、繰り返し計算を行った。 First, the initial value of the coefficient of the function was input. For xc, a rough peak elution time was specified, and a constraint was set to change it within a range of ± 10%. The time and output of the chromatogram to be fitted were input, the solution at the corresponding x (time) was obtained, and the square of the difference between the actual output and the calculated solution was calculated. The sum of the squares (errors) of the differences in each interval was calculated, and the solver function was used to change the coefficients so that the errors were minimized, and repeated calculations were performed.
(実施例1)
液体クロマトグラフィ法によるグリコヘモグロビンの測定を行い、A0ピークに適用した。
(Example 1)
Glycohemoglobin was measured by liquid chromatography and applied to the A0 peak.
測定装置として、東ソー自動グリコヘモグロビン分析計 HLC-723GVIIIを使用した。図7に主なシステム構成を示す。 As a measuring device, Tosoh automatic glycohemoglobin analyzer HLC-723GVIII was used. FIG. 7 shows the main system configuration.
本装置の場合、3液ステップグラジエント方式で血液検体はカラムで分離され、分離されたヘモグロビン成分は波長415nmの吸光度により検出される。3液ステップグラジエントとは、イオン交換カラムを用いて、3種類の溶離液をステップワイズに切り替え各成分を分離する方式であり、検体注入から0.11分(T1)まで溶離液1、0.11分(T1)から0.53分(T2)まで溶離液2、0.53分(T2)から0.63分(T3)まで溶離液3を送液し、溶離液1に戻す。
In the case of this apparatus, the blood sample is separated by a column by a three-component step gradient method, and the separated hemoglobin component is detected by the absorbance at a wavelength of 415 nm. The three-component step gradient is a method in which three types of eluents are switched to stepwise using an ion exchange column to separate each component, and
図8aは東ソー自動グリコヘモグロビン分析計 HLC-723GVIIIで得られる典型的なクロマトグラム(レポート)である。図8bはS-A1cピーク付近を拡大、図8cは全体を示したクロマトグラムである。これらの図から分かるように、主目的であるS-A1cピークとA0ピークでは、ピーク高さで50倍程度の差異がある。 FIG. 8a is a typical chromatogram (report) obtained with the Tosoh automatic glycohemoglobin analyzer HLC-723GVIII. FIG. 8b is an enlarged chromatogram near the SA1c peak, and FIG. 8c is a chromatogram showing the whole. As can be seen from these figures, there is a difference of about 50 times in peak height between the S-A1c peak and the A0 peak, which are the main purposes.
S-A1c測定においては、通常、血液検体(全血)を溶血/希釈液にて1/150程度に希釈して測定を行っている。本実施例では、血液検体(全血)を1/40希釈、1/50希釈、1/60希釈、1/80希釈、1/100希釈、1/150希釈、1/200希釈、1/250希釈し、測定を行った。得られたクロマトグラムを図9に示す。なお、左図はS-A1cピーク付近を拡大した図、右図は出力軸を固定し、A0ピーク形状、出力値が分かるように全体を示した図である。 In the SA1c measurement, a blood sample (whole blood) is usually diluted with a hemolysis / diluted solution to about 1/150 for measurement. In this example, the blood sample (whole blood) is diluted 1/40, 1/50, 1/60, 1/80, 1/100, 1/150, 1/200, 1/250. Diluted and measured. The obtained chromatogram is shown in FIG. The figure on the left is an enlarged view of the vicinity of the S—A1c peak, and the figure on the right is a diagram showing the entire area so that the A0 peak shape and the output value can be understood by fixing the output axis.
最も濃度が高い希釈率1/40(図9a)と一般的な濃度である希釈率1/150(図9b)を比較すると、A0のピーク形状が大きく異なることが分かる。一般的な濃度である希釈率1/150のA0ピークはシャープであるのに対して、最も濃度が高い希釈率1/40のA0ピークは頂点付近が歪んでいる。
Comparing the highest
検出器信号が約1500mVまでは直線性が担保でき、それ以上では検出器信号が飽和に近づくと仮定し、A0ピークの立ち上がり部の1500mV以下のデータ点群、A0ピークの立下り部の1500mV以下のデータ点群、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点の4つの領域をフィッティング区間として、濃度が高い希釈率1/40、希釈率1/50、希釈率1/60のクロマトグラムに対して、本発明を適用した。最適化された処理関数の係数はそれぞれ以下の通りとなった。 Linearity can be guaranteed up to about 1500 mV of the detector signal, and it is assumed that the detector signal approaches saturation above that, and the data point group of 1500 mV or less at the rising part of the A0 peak and 1500 mV or less at the falling part of the A0 peak. In order to specify the absolute position of the data point group and baseline of the data point group, the four regions of multiple points, the region before the peak and the region after the peak, where there is no fluctuation in the baseline, are set as fitting sections, and the dilution rate with high concentration is 1/40. The present invention was applied to a chromatogram having a dilution rate of 1/50 and a dilution rate of 1/60. The coefficients of the optimized processing function are as follows.
図10aは希釈率1/40の試料の、クロマトグラムおよび計算対象となるデータ点、図10bはA0付近を拡大した図である。図10cは前記処理により得られたA0ピーク形状を示した図である。実線は未処理のクロマトグラム、破線は計算結果により得られたA0の形状を示している。図から分かるように、本計算処理により得られたA0ピークは未処理のA0ピークより出力(高さ)が500mV程度大きくなり、ピーク形状の歪みも少なくなっていることが分かる。 FIG. 10a is a chromatogram of a sample having a dilution ratio of 1/40 and data points to be calculated, and FIG. 10b is an enlarged view of the vicinity of A0. FIG. 10c is a diagram showing the A0 peak shape obtained by the above treatment. The solid line shows the untreated chromatogram, and the broken line shows the shape of A0 obtained by the calculation result. As can be seen from the figure, the output (height) of the A0 peak obtained by this calculation process is about 500 mV larger than that of the unprocessed A0 peak, and the distortion of the peak shape is also reduced.
図11は前記で得られたA0ピーク形状を基にした面積と、未処理のクロマトグラムでのA0ピークの面積を希釈率に対してプロットした図である。ここからも分かるように、生データ(クロマトグラム)から得られるA0の面積は検体の希釈率が1/60の濃度以上では直線性が担保できていないが、本発明の処理を行うことで直線性の改善が見られた。 FIG. 11 is a diagram in which the area based on the A0 peak shape obtained above and the area of the A0 peak in the untreated chromatogram are plotted against the dilution ratio. As can be seen from this, the area of A0 obtained from the raw data (chromatogram) cannot be guaranteed to be linear when the dilution ratio of the sample is 1/60 or more, but it is linear by performing the treatment of the present invention. Sexual improvement was seen.
これにより、本発明の処理を施したA0の面積を基にしたS-A1c%は、このような高濃度域であっても、より正確に算出できるようになる。 As a result, SA1c% based on the area of A0 treated with the present invention can be calculated more accurately even in such a high concentration range.
(実施例2)
実施例1と同様に液体クロマトグラフィ法によるグリコヘモグロビンの測定を行い、S-A1cピークに適用した。
(Example 2)
Glycohemoglobin was measured by liquid chromatography in the same manner as in Example 1 and applied to the SA1c peak.
本実施例では、L-A1c~S-A1cピーク、S-A1c~A0ピークの分離が不十分な状態でも、正確にS-A1c%が算出できるか検証するために、前述の溶離液切り替えのステップワイズの時間、および流量を調整し、測定時間を40%短縮したクロマトグラムを対象に行った。 In this embodiment, in order to verify whether SA1c% can be calculated accurately even in a state where the separation of the L-A1c to SA1c peaks and the SA1c to A0 peaks is insufficient, the above-mentioned eluent switching is performed. A chromatogram in which the stepwise time and the flow rate were adjusted and the measurement time was shortened by 40% was performed.
図12は本検証に使用したクロマトグラムの一例である。この条件では、約0.42分にS-A1cピーク、約0.50分にA0ピークが溶出する。図9の標準条件のクロマトグラムと比較してわかるように、L-A1c~S-S1cピーク、S-S1c~A0ピークの分離が悪くなっていることが分かる。 FIG. 12 is an example of the chromatogram used in this verification. Under this condition, the SA1c peak elutes at about 0.42 minutes and the A0 peak elutes at about 0.50 minutes. As can be seen in comparison with the chromatogram under the standard conditions of FIG. 9, it can be seen that the separation of the L-A1c to S-S1c peaks and the S-S1c to A0 peaks is poor.
S-A1cピークトップを含む、0.410~0.453分まで(データ点:25点)、および、ベースラインの絶対位置を特定させるため、ベースラインの変動がないピークの前領域およびピークの後ろ領域の複数点を計算対象としたデータ点群をフィッティング区間として指定し、本発明を適用した(図13参照)。 From 0.410 to 0.453 minutes (data points: 25 points), including the SA1c peak top, and to identify the absolute position of the baseline, the pre-region and peak of the peak with no baseline variation. The present invention was applied by designating a data point cloud in which a plurality of points in the rear region were calculated as a fitting section (see FIG. 13).
本処理を実施した場合の正確性を検証するため、臨床的にA1c%を計測する条件で得られる値との比較を実施した。比較対象は東ソー(株)グリコヘモグロビン分析計 GHbVIIIの標準モードでのS-A1c%を用いた(分析時間1.0分)。本実施例で使用した分離が不十分なクロマトグラム(分析時間約0.6分)に対して、本発明のデータ処理方法を施し算出したS-A1c%との相関を図14に示す。横軸にGHbVIII標準モードで得られたS-A1c%(分離良好でピーク縦切り処理)、本縦軸に本実施例で得られたS-A1c%をプロットした図である。なお、検体は全血7検体、コントロール(高値、低値)、標準(高値、低値)を使用した(各n=2測定)。 In order to verify the accuracy of this treatment, comparison with the value obtained under the condition of clinically measuring A1c% was carried out. As a comparison target, SA1c% of Tosoh Corporation glycohemoglobin analyzer GHbVIII in the standard mode was used (analysis time: 1.0 minute). FIG. 14 shows the correlation between the chromatogram with insufficient separation (analysis time of about 0.6 minutes) used in this example and SA1c% calculated by applying the data processing method of the present invention. The horizontal axis plots SA1c% obtained in the GHbVIII standard mode (separation is good and the peak vertical cutting process is performed), and the vertical axis plots the SA1c% obtained in this example. In addition, 7 whole blood samples, controls (high and low values), and standard (high and low values) were used (each n = 2 measurements).
相関式はy=0.9923x-0.0003、R^2は0.9991であり、相関式の傾きはほぼ1であり、切片も極小であり、R^2も1に極近いことから、両者の値は、相関が非常に良好であり、ほぼ同じ値が得られていることを示している。 Since the correlation formula is y = 0.9923x-0.003, R ^ 2 is 0.9991, the slope of the correlation formula is almost 1, the intercept is also extremely small, and R ^ 2 is also very close to 1. Both values indicate that the correlation is very good and that almost the same values are obtained.
以上のことから、本発明を、分離が良好ではないグリコヘモグロビンのクロマトグラムに対して適用しても、正確にS-A1c%を算出できることが確認された。 From the above, it was confirmed that even if the present invention is applied to a chromatogram of glycohemoglobin whose separation is not good, S-A1c% can be calculated accurately.
1.溶離液A
2.溶離液B
3.溶離液C
4.溶血/希釈液
5.脱気装置
6.電磁弁
7.送液ポンプ
8.検体希釈/注入装置
9.予熱コイル
10.プレフィルタ
11.分析カラム
12.オーブン
13.可視検出器
14.廃液
1. 1. Eluent A
2. 2. Eluent B
3. 3. Eluent C
4. Hemolysis /
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