JP6995468B2

JP6995468B2 - ダームシジン誘導剤

Info

Publication number: JP6995468B2
Application number: JP2016168572A
Authority: JP
Inventors: 裕之稲川; 千恵河内; 源一郎杣
Original assignee: Biomedical Research Group Inc
Current assignee: Biomedical Research Group Inc
Priority date: 2016-08-30
Filing date: 2016-08-30
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2036-08-30
Also published as: JP2018035084A

Description

この発明は、特定の理化学的性質を有し、安全性が極めて高く、かつ生物活性の高い低分子量リポポリサッカライド(LMM-LPS)を配合してなるダームシジン誘導剤に関するものである。

ダームシジンは汗腺で産生し汗に含まれることが知られており、皮膚の抗菌作用に重要な働きを持つとされる。そこで、我々は、皮膚全体を覆うのは皮膚上皮細胞のケラチノサイトであることから、この細胞からダームシジンが誘導出来る物質を開発することができれば、汎用性が高く、常に皮膚の健康状態を維持出来ると考えた。

特許第４０４３５３３号公報

Rieg S、外４名、"Dermcidin is constitutively produced by eccrine sweat glands and isnot induced in epidermal cells under inflammatory skin conditions."、British Journal of Dermatology、２００４年９月、１５１（３）、ｐ．５３４－５３９ Kakurai M、外７名、"Vasoactive Intestinal Peptide and Cytokines Enhance Stem Cell FactorProduction From Epidermal Keratinocytes DJM-1."、JInvest Dermatol、２００２年１１月、１１９（５）、ｐ．１１８３－１１８８

しかしながら、ケラチノサイトからダームシジンは産生しないことが報告されている。さらに、文献ではLPSでも誘導しないことが記載されている（非特許文献１）。

ケラチノサイトからダームシジンを産生する課題について、我々は鋭意研究したところ、パントエア菌LPSから得られる分子量5000±2000の低分子量LPS (LMM-LPS)は、これまでの常識を覆してケラチノサイトからダームシジンを産生することを見出し、本発明を確立することが出来た。

皮膚全体を覆う皮膚上皮細胞のケラチノサイトからダームシジンが誘導出来る物質を開発したので、汎用性が高く、常に皮膚の健康状態を維持出来る。

本発明の結果を示す図である。

低分子量リポポリサッカライドがケラチノサイトからダームシジンを産生することを明らかにするために、ケラチノサイトから誘導されるメッセンジャーRNA (mRNA)を比較定量するリアルタイムPCR法を用いた。

本発明に使用した低分子量リポポリサッカライドは、パントエア・アグロメランスを常法により培養し、培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法、例えば、熱フェノール法［オー・ウエストファール（O．Westphal）編、メソッズ・イン・カーボハイドレート・ケミストリー（Methods in Carbohydrate Chemistry）、第５巻、第８３ページ、アカデミック・プレス（Academic Press）１９６５年］、により抽出し、さらに、陰イオン交換樹脂により精製して製造した。すなわち、パントエア菌の菌体を蒸留水に懸濁し、この懸濁液を蒸留水および等容量の熱フェノールの混合液に添加して撹拌し、次いで遠心分離して水層を回収し、この水層を透析してフェノールを除去し、限界濾過法により濃縮して粗ＬＰＳ画分を採取し、この画分を常法の陰イオン交換クロマトグラフィー（例えば、モノＱ－セファロースまたはＱ－セファロースを使用する）により精製し常法により脱塩して、精製LPSを得た。

得られた精製LPSは既報（特許文献１）に従い、デオキシコール酸ナトリウム等の界面活性剤の存在下でゲル濾過し、低分子量ＬＳＰを含有する画分のみを回収し、混在する高分子量ＬＳＰを除去することによって、高度に精製された低分子量リポポリサッカライドを得た(LMM-LPS)。

以上の方法により製造されたこの発明の新規な低分子量ＬＰＳは、
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり
ｂ）エルソン－モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１～３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２－ケト－３－デオキシオクトネート含量が１～３個／分子量５，０００であること
ｄ）リムラス活性が、少なくとも１０ＥＵ／ｎｇであること
ｅ）タンパク質含量が、１％以下であること
ｆ）核酸含量が、１％以下であること
という理化学的および生物学的性質を有し、かつ少なくとも９８％の純度を有している。

ケラチノサイトとしては、正常ヒト単離のケラチノサイトと同等の性質を示すDMJ-1細胞（非特許文献２）を理研バイオリソースセンターから購入した。DJM-1細胞は、培養液（10% FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含有するMEM培地）にて継代培養したものを用いた。

Escherichia coli LPSは、SIMA ALDRICHから購入したEscherichia coli 0111:B4株由来のもの（製品番号L2630-10MG）を用いた。

DJM-1細胞1×10⁶ cellを直径6cmのプラスチックディッシュに播種し、37℃の5％炭酸ガスインキュベーターで24時間培養した。24時間後に培養液を除き、LPSを含む培養液に交換し、6時間培養を行った、培養後、リン酸緩衝液でディッシュを洗浄後、RNA抽出バッファーを加え、細胞を懸濁した。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移し、RNeasy mini kit（キアゲン）を用いて全RNAを調整した。

抽出した全RNAに含まれるmRNAを増幅するための準備段階として、相補的DNA(cDNA)を合成した。cDNA合成にはReverTra Ace(R) qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）を用いた。合成した相補的DNAを鋳型にして、定量ポリメラーゼチェインリアクション(PCR)を実施した。定量PCRはサイバーグリーン（iQ(TM) SYBR(R) Green スーパーミックス（バイオラッド)）を用いて行った。ダームシジン（DCD、アクセッション番号NM_053283）遺伝子の発現量はβ-actinを標準としてΔΔCT法を用いて算出した。

結果
ヒトケラチノサイト細胞のDJM-1細胞を大腸菌LPS（LPSe）、パントエア菌由来の低分子量LPS(LMM-LPS)）で刺激した６時間後の結果を図１に示した。大腸菌LPSは一般的に使用されている高分子量を多く含むLPSとして用いた。図１に示されるように、10ng/mlの大腸菌LPSではダームシジンの誘導はほとんど起こらなかったが、LMM-LPSはダームシジンを誘導していた。

以上のことから、低分子量LPSはヒトケラチノサイトからダームシジンを誘導することを明らかにした。

Claims

微生物菌体から得られ、次のａ）～ｃ）の理化学的性質
ａ）タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で測定した分子量が５，０００±２，０００であり
ｂ）エルソン－モルガン法により測定したヘキソサミン含量が１～３個／分子量５，０００であること
ｃ）ジフェニルアミン法により測定した２－ケト－３－デオキシオクトネート含量が１～３個／分子量５，０００であること
を有する低分子量リポポリサッカライドを有効成分として含有しケラチノサイトからダームシジンを誘導することを特徴とするダームシジン誘導剤。
前記微生物菌体がパントエア属に属する微生物菌体であること特徴とする請求項１記載のダームシジン誘導剤。