JP6992952B2 - 血管石灰化の治療 - Google Patents
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Description
式[III]
(式中、R4はC1~3アルキルであり、R5及びR6は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5員又は6員のヘテロシクリル基を形成する)。
式[IV]
(式中、L1は、6員のアリール又はヘテロアリール基であり、R7及びR8は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、5員又は6員のヘテロシクリル基を形成する)。
式[VI]
(式中、X7は、ハロゲンであり、L3は、6員のシクロアルキル又はヘテロシクリル基であり、R10及びR11は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、3~6員のシクロアルキル基を形成する)。
であることがより好ましい。R10及びR11は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロプロピル、シクロブチル、又はシクロペンチルを形成することが好ましく、シクロプロピル又はシクロブチルを形成することがより好ましく、シクロプロピルを形成することが最も好ましい。
式[I]
(式中、X1は、H、Cl、又はN(CH3)2であり、R1はH若しくはCH3であり、かつX2はH若しくはOHであるか、又はR1はCH2であり、かつX1は存在せず、X3は、OH又はHであり、X4は、OHであり、R2は、H、
、
、
又は
であり、X5は、H又は
である)。
本明細書(添付の特許請求の範囲、要約書、及び図面のいずれも含む)に記載された全ての特徴及び/又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの全ての工程は、そのような特徴及び/又は工程の少なくともいくつかが互いに排他的である組み合わせを除いて、上記の任意の態様のいずれとの組み合わせで組み合わせることができる。
実施例1:ポリ(ADPリボース)(PAR)と血管石灰化との間の生理学的関連の提示;
実施例2:PARP阻害剤/テトラサイクリンのウシ血管平滑筋細胞に対する毒性の検討;
実施例3:PARP阻害剤/テトラサイクリンのヒト単球マクロファージに対する毒性の検討;
実施例4:インビトロウシ血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるPARP阻害剤/テトラサイクリンの初期試験;
実施例5:インビトロウシ血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおける石灰化レベルに対する被験阻害剤の用量依存性;
実施例6:pk濃度相関を用いた被験阻害剤の例示用量の提示;
実施例7:インビトロヒト血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるPARP阻害剤/テトラサイクリンの初期試験;
実施例8:試験化合物リスト中のオラパリブ、ルカパリブ、ニラパリプ、ベリパリブ、及びタラゾパリブを含む、インビトロヒト血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるPARP阻害剤/テトラサイクリンのさらなる試験;
実施例9:試験化合物リスト中のロサルタン、アムロジピン、及びアトルバスタチンを含む、インビトロヒト血管平滑筋細胞血管石灰化モデルにおけるPARP阻害剤/テトラサイクリン及び他の一般的な心血管薬のさらなる試験。
血管平滑筋細胞(VSMC)は、ストレス下にあるとき、その周囲の細胞外マトリックスを石灰化する。VSMC組織のインビトロモデルを用いて、ストレス下のVSMCが、ポリ(ADPリボース)(PAR)を任意の認識できる量で産生するかどうかを決定した。
PARの細胞外沈着と鉱物形成の誘発との間の機構的関連性を考慮して、PARP阻害剤が血管石灰化を阻害するかどうかを試験することを決定した。
ウシVSMCを96ウェルプレートに播種し、M199/20%FCS中で1日培養した。次いで、細胞を0.5~100μMの阻害剤濃度でインキュベートした(M199培地+5%FBS中)。細胞を阻害剤とともに7日間インキュベートし、2~3日ごとに培地-/+阻害剤を交換した。次いで、MTTアッセイを行った。ストックビヒクルDMSOは、0.1%以下のDMSOで、阻害剤に対応する濃度で試験した。
結果を以下の表1に示し、図4A及び図4Bにグラフで示す。示された値は、各々2連で、3回の実験の平均を表す。図4A及び図4Bにおいて、エラーバーは、3回の実験の標準誤差(SE)を表す。以下の表の網掛けされた値は、NA対照(阻害剤なし)と比較して統計学的に有意であると判断される;p≦0.01(ANOVA+post-hoc LSD試験)。
ヒト単球-マクロファージ(HMM)で同様の設定の毒性実験を行った。HMMは培養では増殖しないので、分裂細胞(bVSMC)と非分裂細胞(HMM)との間の比較は、毒性に起因する効果と増殖に起因する効果とを区別するのに時として役立ち得る。さらに、化合物の意図される使用のために、それらがヒトマクロファージに毒性ではないことを確立することが重要である。
結果を以下の表2に示し、図5A及び図5Bにグラフで示す。前述のように、示された値は、各々2連で、3回の実験の平均を表す。図5A及び図5Bにおいて、エラーバーは、3回の実験の標準誤差(SE)を表す。以下の表の網掛けされた値は、NA対照(阻害剤なし)と比較して統計学的に有意であると判断される;p≦0.01(ANOVA+post-hoc LSD試験)。
方法
bVSMCに関し、GAD培地(10mM β-グリセロリン酸塩/0.1mM L-アスコルビン酸-2-リン酸塩/10nMデキサメタゾン)モデルを用いて、bVSMCにおいて鉱化を誘発した。それ故、M199/20%FCS培養培地を用いた組織培養プレートに細胞を播種し、一晩培養した。翌日、細胞を培地(M199/5%FBS)のみ+/-阻害剤、又はGAD培地(10mM β-グリセロリン酸塩/0.1mM L-アスコルビン酸-2-リン酸塩/10nMデキサメタゾン)+/-阻害剤のいずれかで処置した。
アリザリンレッドS染色は、組織カルシウム沈着物に対する視覚的/組織学的染色である。細胞を4%パラホルムアルデヒド/PIPES緩衝液(pH7.2)中で簡単に固定し、続いてアリザリンレッドS(2%アリザリンレッドS/DIW pH4.2)で5分間染色する。DIW中で洗浄することによって、余分な染色を除去する。カルシウム鉱物沈着物は、明るい赤橙色に染色される。
o-クレゾールフタレインアッセイは、細胞/組織溶解物中のCa2+濃度を測定するための分光光度法である。石灰化実験の後、細胞を簡単に洗浄して培地を除去し、100 lの0.1N HClを各ウェルに添加して任意の鉱物沈着物を溶解する。次いで、試料中のCa2+濃度を、約0.02~270gCa2+/mlの濃度範囲のCaCl2標準曲線を用いて、o-クレゾールフタレインアッセイで分光光度的に(570nmで)測定する。
市販のBioRad DCタンパク質アッセイは、タンパク質と銅-酒石酸塩複合体との反応及びその後のフォリン試薬との反応としても公知であるLowry法に基づく。石灰化実験の後、細胞を簡単に洗浄して培地を除去し、100 lの可溶化溶液(0.1M NaOH/1%SDS/DIW)を各ウェルに添加して細胞を溶解する。続いて、溶解物のタンパク質濃度を、BSA(ウシ血清アルブミン)を標準として用いて、供給者の指示に従ってBioRad DCアッセイで決定する。
アリザリンレッドS染色で処置したプレートの写真を図6に示す。培地のみ(NA)で処置した細胞では、アリザリンによる赤色染色は見られなかったことは明らかである。これは、培養物の石灰化がほとんど又は全く起こらなかったことを示している。
方法
インビトロモデルは、実施例4で使用したモデルと同じである:GAD培地(10mM β-グリセロリン酸塩/0.1mM L-アスコルビン酸-2-リン酸/10nMデキサメタゾン)を添加して、細胞外マトリックスを産生するようにウシ血管平滑筋細胞(bVSMC)を培養する。
MTT細胞生存率アッセイ
7日間インキュベートしたbVSMCの細胞生存率の結果は以下の表3に示され、図10にグラフで示されている。同様に、9日間インキュベートしたbVSMCの細胞生存率の結果は表4に示され、図11にグラフで示されている。各場合において、示された値は3回の実験の平均を表す。図10及び図11において、エラーバーは、3回の実験の標準偏差(SD)を表す。
7日間インキュベートしたbVSMCについてのCa2+濃度結果は以下の表5に示され、図12にグラフで示されている。同様に、9日間インキュベートしたbVSMCのCa2+濃度結果は以下の表6に示され、図13にグラフで示されている。各場合において、示された値は3連での実験の平均を表す。図12及び図13において、エラーバーは3連での実験の標準偏差(SD)を表す。
ミノサイクリンは石灰化に対して用量依存性の効果を示し、この薬物が血管石灰化プロセスに直接的な効果を有することと一致している。従って、ミノサイクリンは、血管石灰化の阻害剤として有望である。
実施例5において実施された実験により、ミノサイクリンは1μMの低い濃度で石灰化を阻害することができ、より低濃度でも有効である可能性があることが示された。ミノサイクリンの分子量は457g/molであるので、1μMの濃度は0.46μg/mLに等しい。
方法
インビトロウシ血管平滑筋細胞モデルにおける血管石灰化の阻害に関して陽性の結果及び結論を考慮して、本発明者らは、インビトロヒト血管平滑筋細胞モデルで実験を続けた。
図17に示すように、本発明者らは、o-クレゾールフタレインアッセイにより、Ca2+沈着物を定量することができた。これは、DMSO群(陰性対照)のカルシウム含有量が非常に低かったことを示している。逆に、DMSO Ca+P群(陽性対照)では、カルシウムレベルが大きく上昇した。PJ34、ミノサイクリン、及びシロスタゾールは全て、カルシウムレベルを低下させるようであった。
方法
初代hVSMCを、FBS(M199/5%FBS)を含有するM199培地で培養した。それらを公知の細胞密度で播種し、24時間増殖させた後、対照(DMSOのみ)又は石灰化培地(2.7mMカルシウム+2.5mMリン酸塩を含有するDMSO)+/-阻害剤で処置した。8日後、Ca2+沈着物の定量のためのo-クレゾールフタレインアッセイ及びタンパク質含有量のためのBioRadタンパク質アッセイを用いて、石灰化を評価した。
プレートの近接写真を図24に示し、アリザリンレッドS染色で処置したプレートの写真を図23に示す。図23では、DMSO群(陰性対照)の細胞では、石灰化が最小限であり、アリザリンに起因する赤色染色が最小限しか見られないことが明らかである。これは、培養物の石灰化がほとんど又は全く起こらなかったことを示している。
方法
初代hVSMCを、FBS(M199/5%FBS)を含有するM199培地中で培養した。それらを公知の細胞密度で播種し、24時間増殖させた後、対照(DMSOのみ)又は石灰化培地(2.7mMカルシウム+2.5mMリン酸塩を含有するDMSO)+/-化合物で処置した。8日後、Ca2+沈着物の定量のためのo-クレゾールフタレインアッセイ及びタンパク質含有量のためのBioRadタンパク質アッセイを用いて、石灰化を評価した。
図25に示されるように、本発明者らは、o-クレゾールフタレインアッセイにより、Ca2+沈着物を定量することができた。これは、DMSO群(陰性対照)のカルシウム含有量が非常に低かったことを示している。逆に、DMSO Ca+P群(陽性対照)では、カルシウムレベルが大きく上昇した。
結果により、発達中の骨及び病的血管石灰化の両方において、細胞外ポリ(ADPリボース)と細胞外マトリックスの石灰化領域との間に強い場所的相関があることが示され、このことは、ポリ(ADPリボース)と細胞外マトリックス内の石灰化沈着物の構築との間に直接的な機構的関係が存在する可能性があることを示唆している。
Claims (11)
- ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤又は薬学的に許容されるその塩若しくは溶媒和物を含む、血管中膜石灰化又は内膜アテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善用の医薬組成物であって、前記PARP阻害剤が、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、タラゾパリブ、ミノサイクリン、シロスタゾール、及びN-(6-オキソ-5,6-ジヒドロフェナントリジン-2-イル)-(N,N-ジメチルアミノ)アセトアミド塩酸塩(PJ34)からなる群から選択される、医薬組成物。
- 血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善用である、請求項1に記載の医薬組成物。
- メンケベルグ動脈硬化症又は尿毒症性細小動脈石灰化症(CUA)の治療、予防、又は改善用である、請求項2に記載の医薬組成物。
- 慢性腎疾患、糖尿病、老化、副甲状腺機能亢進症、高リン酸血症、ビタミンD障害、ビタミンK障害、骨粗鬆症、川崎病、CD73の欠乏による動脈石灰化(ACDC)、乳児全身性動脈石灰化症(GACI)、特発性基底核石灰化症(IBGC)、弾性線維性仮性黄色腫(PXE)、関節リウマチ、シングルトン-マーテン症候群、及び/又はβ-サラセミアに罹患している対象における血管中膜石灰化の治療、予防、又は改善用である、請求項2又は3に記載の医薬組成物。
- 内膜アテローム硬化性石灰化の治療、予防、又は改善用である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 少なくとも20、少なくとも40、少なくとも60、少なくとも80、又は少なくとも100のAgatstonスコアを有する患者におけるアテローム硬化性石灰化の治療用である、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記PARP阻害剤が、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、タラゾパリブ、ミノサイクリン、及びシロスタゾールからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記PARP阻害剤が、ミノサイクリンである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記PARP阻害剤が、1mg~10000mg若しくは2mg~2000mg、5mg~1000mg、10mg~200mg、15mg~100mg、又は20mg~50mgの1日用量として投与される、請求項1~8のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記PARP阻害剤が、1日2回の用量として投与され、各用量が、1mg~5000mg、2mg~1000mg、3mg~500mg、4mg~100mg、5mg~50mg、又は10mg~25mgである、請求項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 各用量が、10mg~25mgである、請求項10に記載の医薬組成物。
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