CN113940935A - 奥拉帕尼的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，公开了奥拉帕尼的新用途。具体公开的包括下述：奥拉帕尼在制备PDGFRβ磷酸化抑制剂和/或PDGFRβ下游信号通路抑制剂中的应用；奥拉帕尼在制备抑制抑癌蛋白表达下降和/或抑制细胞周期蛋白表达上升制剂中的应用；奥拉帕尼在制备防治血管损伤疾病药物中的应用；奥拉帕尼在制备防治血管再狭窄疾病制剂中的应用。本发明中奥拉帕尼对PDGFRβ有抑制作用，因此奥拉帕尼可以抑制平滑肌表型转换，从而预防和/或治疗血管损伤后再狭窄；奥拉帕尼并无通常心血管药物或其他平滑肌表型转换抑制剂的细胞毒作用，因此可以预期其安全性；其可以作为治疗平滑肌参与的相关疾病如血管再狭窄、肿瘤等疾病的药物而广泛应用。

Description

奥拉帕尼的新用途
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及奥拉帕尼的一些新用途。
背景技术
奥拉帕尼，英文名称为Olaparib；CAS：763113-22-0；化学名1-(环丙甲酰基)-4-[5-[(3,4-二氢-4-氧代-1-酞嗪基)甲基]-2-氟苯甲酰]哌嗪。是一种有机物，化学式为C24H23FN4O3，白色粉末。其分子量为434.46。
奥拉帕尼在目前已有的研究中主要作为一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(PARP inhibitor，简称PARP抑制剂)，即选择性的PARP1/2抑制剂。奥拉帕尼通过高度选择性与PARP1和/或PARP2的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+(nicotinamide adenine dinucleotide+,NAD+)结合，阻止PARP与DNA的分离，导致癌细胞无法进行后续的DNA修复，肿瘤细胞里聚集大量的基因组损害(genomic damage)，使肿瘤细胞得以自毁(self-destruct)，最终达到治疗肿瘤的目的。因此上述药物均被广泛应用于卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌等肿瘤相关的研究中。
动脉粥样硬化是冠状动脉粥样硬化性心脏病等心血管疾病的基本病理过程，己经严重危害人类的健康，而经皮冠状动脉成形术(Percutaneous translnminal coronaryangioplasty,PTCA)技术的应用，挽救了因冠心病发生心肌梗死的病人的生命。随着此项技术的推广和实施，相关的并发症也越来越多的被人们发现。血管成形术后支架内再狭窄是其中较为严重的并发症之一，也是血管再狭窄常见的类型。血管再狭窄(Vascularrestenosis)是目前限制经皮冠状动脉血管成形术、冠状动脉搭桥术的主要原因。血管再狭窄的关键病理生理过程是新内膜的增生和收缩重塑。
正常情况下，位于血管中膜的血管平滑肌细胞(VSMC)通过收缩控制血管的管径和张力。成熟的VSMCs几乎不增殖并保持较低的合成活性。它们呈现收缩表型且稳定的表达平滑肌收缩标志蛋白，如平滑肌α肌动蛋白(smooth muscle alpha actin，SMαactin)、平滑肌22α、平滑肌肌球蛋白重链等。与其他成熟的细胞不同，当血管损伤或局部环境发生变化时，VSMCs表现出极大的表型和功能可塑性，即由分化/收缩表型转换为去分化表型。伴随着VSMCs表型转换，细胞收缩标志物表达降低而增殖、迁移和合成基质等能力增强。研究发现，VSMCs表型转换是动脉粥样硬化、高血压及血管成形术后再狭窄等众多血管疾病发生、发展的关键步骤。
血管再狭窄是一个复杂的病理过程，虽然目前使用药物洗脱支架已有效改善了血管成形术后再狭窄的问题，但是目前人们越来越多的顾虑是对于药物洗脱支架应用后的长期影响，例如长期药物的残留是否影响患者的身体健康等问题。因此，有效地解决血管再狭窄这类临床问题，能够极大地扩展血管成形术的应用，从而更好的将血流重运术用于血管增生性疾病等患者身上，维护人类健康。
目前应用于科研中的抑制血管损伤后再狭窄的药物有数种，其中最为常见的有：血管紧张素转换酶(简写为ACE)抑制剂螺普利和西拉普利，药物涂层支架(DES)使用的涂层药物[如抗栓剂(如肝素、水蛭素)、抗炎症药物(如地塞米松、雌激素)、抗细胞增殖剂(如雷帕霉素、西罗莫司、紫杉醇]等。已有的研究表明奥拉帕尼可以通过促进细胞凋亡，在肿瘤疾病中发挥治疗作用，其在血管损伤后再狭窄中的作用尚无研究。
发明内容
针对上述问题，本发明提供奥拉帕尼的新用途，主要为了进一步研究奥拉帕尼的新用途，以及其在血管相关疾病用的应用，弥补了现有的一些治疗手段的缺失。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
奥拉帕尼在制备防治血管疾病药物中的应用。
一些方式中，所述血管疾病包括血管损伤疾病、血管再狭窄疾病、动脉粥样硬化、高血压疾病；
优选的，所述血管再狭窄包括血管损伤再狭窄、PCI再狭窄、支架内再狭窄、旁路移植后再狭窄。
奥拉帕尼在制备PDGFRβ磷酸化抑制剂和/或PDGFRβ下游信号通路抑制剂中的应用。
一些方式中，PDGFRβ磷酸化抑制剂和/或PDGFRβ下游信号通路抑制剂中，奥拉帕尼的有效作用浓度为1-10μM或10mg/kg/d。
奥拉帕尼在制备抑制平滑肌细胞表型转换制剂中的应用，优选的，所述平滑肌细胞为血管平滑肌细胞，所述血管平滑肌表型转换包括收缩型向分泌型转换。
奥拉帕尼在制备抑制细胞划痕闭合制剂和/或抑制细胞增殖迁移制剂中的应用。
一些方式中，所述细胞增殖迁移为PDGF-BB诱发型细胞增殖迁移和/或细胞过度增殖；
优选的，所述细胞为平滑肌细胞，其中，平滑肌细胞过度增殖由血管损伤导致。
奥拉帕尼在制备抑制抑癌蛋白表达下降和/或促进抑癌蛋白表达和/或抑制细胞周期蛋白表达上升制剂中的应用；优选的，抑癌蛋白表达下降、细胞周期蛋白表达上升均由PDGF-BB引起，所述抑癌蛋白包括p21蛋白、p27蛋白。
奥拉帕尼在制备抑制收缩基因αSMA表达量下降制剂中的应用。
防治血管损伤疾病的药物，其有效成分为奥拉帕尼，优选的，所述血管损伤疾病为血管再狭窄。
本发明的有益效果是：
奥拉帕尼对PDGFRβ有抑制作用，因此奥拉帕尼可以抑制平滑肌表型转换，从而预防和/或治疗血管损伤后再狭窄，奥拉帕尼能够直接抑制VSMC的表型转换。奥拉帕尼并无通常心血管药物或其他平滑肌表型转换抑制剂的细胞毒作用，因此可以预期其安全性。其可以作为治疗平滑肌参与的相关疾病如血管再狭窄、肿瘤等疾病的药物而广泛应用。
附图说明
图1为利用油红-苏木精(HE)染色实验检测大鼠颈动脉结扎后的血管形态，图中a为假手术+载体处理组，b为结扎+载体处理组，c为结扎+奥拉帕尼处理组处理后；
图2为不同浓度的奥拉帕尼和载体(DMSO)利用EdU实验检测VSMC细胞增殖情况；
图3为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予奥拉帕尼(1,5,10μM)和载体(DMSO)刺激，图中为不同浓度的奥拉帕尼及载体后利用PCR实验检测细胞周期蛋白和抑癌蛋白的表达，VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，细胞周期蛋白表达上升，抑癌蛋白表达下降，给予奥拉帕尼刺激后，细胞周期蛋白表达下降，抑癌蛋白表达上升；
图4为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予奥拉帕尼(1,5,10μM)和载体(DMSO)刺激，图中为不同浓度的奥拉帕尼及载体检测Caspase 3表达及活性，未见明显变化；
图5为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予奥拉帕尼(1,5,10μM)和载体(DMSO)刺激，图中为不同浓度的奥拉帕尼利用transwell实验检测细胞迁移情况；
图6为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予奥拉帕尼(1,5,10μM)和载体(DMSO)刺激，图中为不同浓度的奥拉帕尼利用划痕实验检测细胞增殖迁移情况；
图7中大鼠颈动脉结扎后，分别给予大鼠载体和10mg/kg·d奥拉帕尼处理，图中为不同浓度的奥拉帕尼利用免疫荧光实验检测收缩基因αSMA表达情况；
图8为VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予奥拉帕尼(1，5，10μM)和载体(DMSO)刺激，图中为不同浓度的奥拉帕尼利用蛋白印迹实验检测PDGFRβ磷酸化水平情况。
具体实施方式
本部分第一方面对本发明做进一步介绍：
奥拉帕尼的新用途至少涉及下述一些应用：
(i)奥拉帕尼在制备PDGFRβ磷酸化的抑制剂中的应用。
(ii)奥拉帕尼在制备PDGFRβ下游信号通路的抑制剂中的应用。
前述i、ii中提供了一种新的PDGFRβ磷酸化抑制剂、PDGFRβ下游信号通路抑制剂，进一步增加了相关抑制剂家族成员。为相关机理的调节提供了新的作用物质。
一些方式中，PDGFRβ磷酸化抑制剂和/或PDGFRβ下游信号通路抑制剂中，奥拉帕尼的用药浓度为1-10μM或10mg/kg/d。其用药浓度单位设定一种方式参考现有药物的规定方式。
前述PDGFRβ磷酸化抑制剂可用于治疗PDGFRβ磷酸化引起的疾病、PDGFRβ下游信号通路抑制剂可用于治疗PDGFRβ下游信号通路过表达引起的疾病，比如血管损伤疾病；抑制剂无论用于PDGFRβ磷酸化引起的疾病还是PDGFRβ下游信号通路过表达引起的疾病，凡是药物具有奥拉帕尼，且作为PDGFRβ磷酸化抑制剂、PDGFRβ下游信号通路抑制剂使用均应在本发明保护范围内。
(iii)奥拉帕尼在制备PDGF-BB促进细胞增殖作用抑制剂和/或PDGF-BB促进细胞迁移作用抑制剂中的应用。
PDGF-BB促进细胞增殖作用抑制剂可用于治疗PDGF-BB诱发细胞过度增殖疾病，PDGF-BB促进细胞迁移作用抑制剂可用于治疗PDGF-BB促进细胞迁移引发的疾病。
(iv)奥拉帕尼在制备抑制抑癌蛋白表达下降或促进抑癌蛋白表达升高制剂中的应用。
(v)奥拉帕尼在制备抑制细胞周期蛋白表达上升制剂中的应用。
在一些情况中，抑癌蛋白表达下降、细胞周期蛋白表达上升均由PDGF-BB引起，所述抑癌蛋白包括p21蛋白、p27蛋白。并且iv中，其还可以用于治疗癌症，尤其针对p21蛋白、p27蛋白诱发或起到主导作用癌症具有较好的治疗效果。
(vi)奥拉帕尼在制备防治血管损伤疾病药物中的应用。其中，血管损伤疾病首先应该包含现有已经明确的相关疾病，同时还应当包含本发明中新涉及一些引起血管异常的疾病。
(vii)奥拉帕尼在制备抑制细胞划痕闭合制剂和/或抑制细胞增殖迁移制剂中的应用；其中细胞壁裂型损伤等都与细胞划痕等同，主要针对物理性裂型损伤。其一些用途可以在部分需要控制细胞划痕恢复速度的情景中进行应用，比如部分涉及商业性涉及细胞裂型损伤的细胞研究行为。
(viii)奥拉帕尼在制备抑制收缩基因αSMA表达量下降制剂中的应用。
在收缩基因αSMA表达量较低时，奥拉帕尼用于抑制收缩基因αSMA表达量下降，其与奥拉帕尼用于促进收缩基因αSMA表达也等同，目的是为了维护收缩基因αSMA正常的表达量，或在一些情况中适度提高表达量。
(ix)奥拉帕尼在制备抑制平滑肌细胞表型转换制剂中的应用；在一些情况中，平滑肌细胞为血管平滑肌细胞，所述血管平滑肌表型转换包括收缩型向分泌型转换。
(x)奥拉帕尼在制备防治血管再狭窄疾病制剂中的应用；在一些情况中，所述血管再狭窄包括血管损伤再狭窄、PCI再狭窄、支架内再狭窄、旁路移植后再狭窄。
(xi)奥拉帕尼在制备抑制平滑肌细胞过度增殖制剂中的应用，在一些情况中，平滑肌细胞过度增殖由血管损伤导致。
(xii)PDGF-BB在制备促进平滑肌细胞划痕闭合制剂和/或促进细胞迁移制剂中的应用；其中细胞壁裂型损伤等都与细胞划痕等同，主要针对物理性裂型损伤。其一些用途可以在部分需要控制细胞划痕恢复速度中进行应用。
(xiii)防治血管损伤疾病的药物，其有效成分为奥拉帕尼，优选的，所述血管损伤疾病为血管再狭窄。
(xiv)奥拉帕尼在制备防治血管疾病药物中的应用。一些方式中，所述血管疾病包括血管损伤疾病、血管再狭窄疾病、动脉粥样硬化、高血压疾病，其他多种VSMCs表型转换引起的血管疾病也应当等同落入本发明范围内。
本文中和/或表示两者共存或择其一。
前述的制剂、抑制剂一些表现形式为药物，或者在制药过程作为有效成分添加。用于防治与本发明所针对疾病相关的药物中含有奥拉帕尼时，也应当视为对奥拉帕尼的应用而落在本发明范围内。其在使用过程中可通过口服或注射等，其应用方式为作为药物的组分或其主要有效成分。同样作为其他一些补充辅助制剂也在本范围内。
本部分第二方面结合一些具体的项目案例进行说明：
实验例1
本实施例测试使用的奥拉帕尼购自Selleck公司，目录号：S1060别名：Ku-0059436。分别采用下述步骤中的方法检测如下实验中VSMC的表型转换情况。
对C57BL/6大鼠行颈动脉结扎损伤或假手术损伤后，分别腹腔注射奥拉帕尼(10mg/kg·d)和载体(DMSO)。14天后，老鼠被安乐死，对受伤的血管进行血管切除手术。用质量浓度为4％的甲醛固定石蜡包埋后，将血管切段。图1分别为假手术+载体处理组、结扎+载体处理组、结扎+奥拉帕尼处理组处理后，利用油红-苏木精(HE)染色实验检测大鼠颈动脉结扎后的血管形态。结果如图1所示。其中图1从左至右分别为假手术+载体处理组、结扎+载体处理组、结扎+奥拉帕尼处理组大鼠颈动脉平均厚度统计图。由图1可知，与假手术+载体处理组相比，大鼠行颈动脉结扎后，颈动脉厚度增长，即血管损伤导致血管内皮细胞过度增殖；而奥拉帕尼可抑制血管损伤导致的血管内皮细胞过度增殖。
实验例2
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的奥拉帕尼(1μM,5μM,10μM)和载体DMSO刺激。图2为不同浓度的奥拉帕尼利用EdU实验检测VSMC细胞增殖情况。图2中第一列为DAPI染色细胞核，第二列为EdU染色细胞核，第三列为前两列的融合图；而第一行为载体处理组，第二行为PDGF-BB和载体处理组，第三行为PDGF-BB和1μM的奥拉帕尼处理组，第四行为PDGF-BB和5μM的奥拉帕尼处理组，第五行为PDGF-BB和10μM的奥拉帕尼处理组。由图2可知，PDGF-BB处理VSMC细胞后，EdU阳性的细胞增多，进一步用奥拉帕尼处理后，EdU阳性的细胞减少，且随着奥拉帕尼浓度增大，EdU阳性的细胞量减少。综上，PDGF-BB处理VSMC细胞后，可促进VSMC细胞的增殖，而奥拉帕尼可抑制PDGF-BB引起的细胞增殖，且随着奥拉帕尼的浓度增大，抑制作用增强。
EdU细胞增殖实验：将大鼠来源的原代细胞(VSMC)接种于96孔板中，分别使用不同浓度(1μM,5μM,10μM)的奥拉帕尼和载体DMSO处理细胞4h。48h后，以上四组处理用PDGF-BB(30ng/ml)刺激48h(对照组为等体积的DSMO)，EdU的掺入分析按照制造商的说明进行，结果用Olympus cellSens Entry拍摄。
实验例3
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的奥拉帕尼(1μM,5μM,10μM)和载体DMSO进行刺激，收集细胞，提取蛋白后，利用聚合酶链式反应技术(PCR)实验检测细胞周期蛋白和抑癌蛋白的表达，结果如图3所示。VSMC细胞在不同处理下，细胞周期蛋白(PCNA、CyclinD1)和抑癌蛋白(P27、P21)的表达。由图3可知，给予PDGF-BB处理后，VSMC细胞中细胞周期蛋白表达上升，抑癌蛋白表达下降；给予奥拉帕尼刺激后，细胞周期蛋白表达下降，抑癌蛋白表达上升；而细胞凋亡有关的蛋白表达量无明显变化。
实验例4
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的奥拉帕尼(1μM,5μM，10μM)和载体DMSO进行刺激，收集细胞，提取蛋白后，利用Caspase 3表达及活性试剂盒(BIOMOL)实验检测细胞凋亡水平，结果如图4所示。由图4可知，不同浓度的奥拉帕尼对细胞凋亡无明显影响。
实验例5
VSMC细胞给予PDGF-BB(30ng/ml)处理后，分别给予不同浓度的奥拉帕尼(1μM,5μM，10μM)和载体DMSO进行刺激，利用transwell实验检测细胞迁移情况。结果如图5所示。由图5可知，PDGF-BB促进细胞的迁移，而奥拉帕尼抑制了细胞的迁移，且随着浓度的增加，抑制作用增强。
Transwell法测定细胞迁移：VSMC经过奥拉帕尼预处理4h，播种到上气室，
Figure BDA0003296140890000101
DMEM和体积浓度比为10％的胎牛血清和PDGF-BB(30ng/ml)放置到下气室中。24h后，下气室用质量浓度为4％的甲醛固定细胞20分钟，质量浓度为0.1％的结晶紫染色20分钟。使用Olympus cellSens通道对迁移的细胞进行拍照。
实验例6
VSMC细胞给予PDGF-BB处理后(30ng/ml)，分别给予不同浓度的奥拉帕尼(1μM,5μM，10μM)和载体DMSO进行刺激，利用划痕实验检测细胞增殖迁移情况，结果如图6所示。由图6可知，PDGF-BB促进细胞划痕的闭合率，而奥拉帕尼抑制了该促进作用，且随着奥拉帕尼浓度的增加，对细胞划痕的闭合的抑制作用增强。
细胞划痕实验：将VSMC接种于6孔板中，培养至80％密度。细胞单层用1ml的移液管尖端划伤。细胞与不同浓度的奥拉帕尼预孵育4h后，用PDGF-BB(30ng/ml)刺激48h(对照组为等体积的DSMO)，然后在含有体积浓度比为10％的胎牛血清的DMEM中培养。使用OlympuscellSens entry观察细胞，使用Image J程序测量伤口闭合率。
实验例7
分别对大鼠颈动脉结扎后，给予大鼠载体DMSO和10mg/kg·d奥拉帕尼处理，利用免疫荧光实验检测收缩基因αSMA表达情况，组织切片用SMα-actin一抗(体积比为1：100)4oC孵育过夜，然后用FITC结合的荧光二抗37oC孵育2h。核酸用DAPI 37oC染色15min。切片最终用Olympus cellSens entry观察成像。观察颈动脉形态，结果如图7所示。图7中第一列为假手术加空载处理组，第二列为手术加空载处理组，第三列为手术加奥拉帕尼处理组，而第一行为颈动脉αSMA的免疫荧光染色，第二行为DAPI对颈动脉的细胞核进行染色，第三行为前两行的融合图。由图7可知，大鼠行颈动脉结扎后，颈动脉壁加厚，而颈动脉中收缩基因αSMA的表达量下降；进一步用奥拉帕尼处理后，颈动脉壁厚度下降，收缩基因αSMA的表达量上升。血管损伤后，血管壁增厚，收缩基因αSMA的表达量下降。
实验例8
VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，分别给予不同浓度的奥拉帕尼(1μM,5μM,10μM)和载体DMSO进行刺激，利用蛋白印迹实验检测PDGFRβ磷酸化水平情况后，结果如图8所示。由图8可知VSMC细胞给予PDGF-BB处理后，PDGFRβ磷酸化水平上升；进一步使用奥拉帕尼处理后，PDGFRβ磷酸化水平下降，且随着奥拉帕尼浓度的增加，PDGFRβ磷酸化水平下降。因此，PDGF-BB促进了PDGFRβ的磷酸化，而奥拉帕尼抑制了PDGFRβ的磷酸化，且随着奥拉帕尼浓度的增加，该抑制作用加强。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (9)

1.奥拉帕尼在制备防治血管疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血管疾病包括血管损伤疾病、血管再狭窄疾病、动脉粥样硬化、高血压疾病；
优选的，所述血管再狭窄包括血管损伤再狭窄、PCI再狭窄、支架内再狭窄、旁路移植后再狭窄。
3.奥拉帕尼在制备PDGFRβ磷酸化抑制剂和/或PDGFRβ下游信号通路抑制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，PDGFRβ磷酸化抑制剂和/或PDGFRβ下游信号通路抑制剂中，奥拉帕尼的有效作用浓度为1-10μM或10mg/kg/d。
5.奥拉帕尼在制备抑制平滑肌细胞表型转换制剂中的应用，优选的，所述平滑肌细胞为血管平滑肌细胞，所述血管平滑肌表型转换包括收缩型向分泌型转换。
6.奥拉帕尼在制备抑制细胞划痕闭合制剂和/或抑制细胞增殖迁移制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞增殖迁移为PDGF-BB诱发型细胞增殖迁移和/或细胞过度增殖；
优选的，所述细胞为平滑肌细胞，其中，平滑肌细胞过度增殖由血管损伤导致。
8.奥拉帕尼在制备抑制抑癌蛋白表达下降和/或促进抑癌蛋白表达和/或抑制细胞周期蛋白表达上升制剂中的应用；优选的，抑癌蛋白表达下降、细胞周期蛋白表达上升均由PDGF-BB引起，所述抑癌蛋白包括p21蛋白、p27蛋白。
9.奥拉帕尼在制备抑制收缩基因αSMA表达量下降制剂中的应用。
防治血管损伤疾病的药物，其特征在于，其有效成分为奥拉帕尼，优选的，所述血管损伤疾病为血管再狭窄。
防治血管疾病的药物，其特征在于，其有效成分为奥拉帕尼，优选的，所述血管疾病包括血管损伤疾病、血管再狭窄疾病、动脉粥样硬化、高血压疾病。
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